JP2001103965A - 軟骨細胞分化と軟骨修復のための脂肪組織由来の間質細胞の使用 - Google Patents
軟骨細胞分化と軟骨修復のための脂肪組織由来の間質細胞の使用Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 In vitroで培養した脂肪由来の間質細胞
を軟骨系統の細胞に分化させるように方向付ける方法と
成分を提供すること。 【解決手段】 培養単層か、あるいは3次元構造形態の
生物学的に適合可能な格子またはマトリックスかのいず
れかにおいて脂肪間質細胞の軟骨生成を誘導する、単独
であるいはほかの栄養成分と組み合わせて使用すること
ができるさまざまな軟骨誘導薬剤を提供する。In vivo
での軟骨の修復を含めていくつかのヒトの病態と疾患の
治療用に分化させた軟骨細胞の使用法が開示される。
を軟骨系統の細胞に分化させるように方向付ける方法と
成分を提供すること。 【解決手段】 培養単層か、あるいは3次元構造形態の
生物学的に適合可能な格子またはマトリックスかのいず
れかにおいて脂肪間質細胞の軟骨生成を誘導する、単独
であるいはほかの栄養成分と組み合わせて使用すること
ができるさまざまな軟骨誘導薬剤を提供する。In vivo
での軟骨の修復を含めていくつかのヒトの病態と疾患の
治療用に分化させた軟骨細胞の使用法が開示される。
Description
【０００１】
【発明分野】本発明は、軟骨系統の細胞に分化するよ
う、in vitroで培養された脂肪組織由来の間質細胞を方
向付ける方法と成分に関する。さらに詳細には本発明
は、ヒトおよびほかの種における病理学的状態の治療上
の処置に関して、受容者または宿主に移植するに先立っ
て、あるいは移植する時点でこうした方向付けをされた
系統の誘導に関する。
う、in vitroで培養された脂肪組織由来の間質細胞を方
向付ける方法と成分に関する。さらに詳細には本発明
は、ヒトおよびほかの種における病理学的状態の治療上
の処置に関して、受容者または宿主に移植するに先立っ
て、あるいは移植する時点でこうした方向付けをされた
系統の誘導に関する。
【０００２】
【発明の背景】間葉幹細胞（MSC）は、脂肪、骨、軟
骨、弾性組織、筋肉、線維性結合を含む間葉性または結
合組織の特定タイプに分化することが可能である、組織
骨髄、血液、皮膚および骨膜でみられる生成多分化能性
芽細胞または胚芽様細胞である。これらの細胞が入る特
定の分化経路は、成長因子、サイトカイン、および／ま
たは宿主組織により確定される局所的な微小環境状態な
どの機械的影響または内在性の生物活性因子からのさま
ざまな影響、あるいはそれらの両方による。
骨、弾性組織、筋肉、線維性結合を含む間葉性または結
合組織の特定タイプに分化することが可能である、組織
骨髄、血液、皮膚および骨膜でみられる生成多分化能性
芽細胞または胚芽様細胞である。これらの細胞が入る特
定の分化経路は、成長因子、サイトカイン、および／ま
たは宿主組織により確定される局所的な微小環境状態な
どの機械的影響または内在性の生物活性因子からのさま
ざまな影響、あるいはそれらの両方による。
【０００３】出生前の生物体においては特殊化結合組織
細胞への間葉幹細胞（MSC）の分化がうまく確立されて
いる。例えば、胚芽性ニワトリ、マウスまたはヒト体肢
芽間葉細胞は軟骨、骨およびそのほかの結合組織に分化
する(S. Subtelney とU. Abbott編『第39回発生生物学
会年次総会（39th Annual Symposium of the Societyfo
r Developmental Biology）』のなかのCaplan A. I.執
筆部分、3768頁、ニューヨーク、Alan R Liss 社刊、19
81年; Elmer ら、(1981) Teratology, 24:215-223; Hau
schka S. D. (1974) Developmental Biology (1974) 3
7: 345-368; Solurshら (1981) Developmental Biolog
y, 83:9-19; Swallaら(1986) Developmental Biology,
116:31-38)。さらに、クローンラット頭蓋冠細胞系統も
また、筋肉、脂肪、軟骨、骨に分化することを示してい
る（Goshimaら(1991)Clin Orthop Rel Res. 269:274-28
3）。出生後生物体における間葉幹細胞（MSC）の存在
は、胚芽後細胞がいくつかの中胚葉表現型に分化するの
を示す目的では広範には研究が行われてはこなかった。
行われた数少ない研究には、拡散チャンバーで容器に入
れることとin vivoでの移植と、その後の骨髄細胞によ
る骨と軟骨の形成が含まれる（Ashtonら (1980) Clin
Orthop Rel Res.,151：294-307；Bruderら(1990) Bon
e Mineral,11:141-151, 1990）。最近では、ニワトリ骨
膜由来の細胞が分離され、培養培地で増殖され、また、
in vitroでの高密度状態下で軟骨と骨への分化を示した
（Nakaharaら (1991) Exp Cell Res.,195:492-503）。
ラット骨髄由来間葉細胞が、in vivoに移植された場合
に、骨芽細胞と軟骨細胞に分化する能力を有しているこ
とが示されている（Dennisら(1991)Cell Transpl, 1:23
32;Goshimaら(1991)Clin Orthop Rel Res. 269:274-28
3）。米国特許第5,908,784号を付与されたJohnsoneらに
よる文献は、生物化学的にまた表現型的に軟骨細胞に類
似している細胞に分化する、皮膚から得られた間葉細胞
の能力を示している。
細胞への間葉幹細胞（MSC）の分化がうまく確立されて
いる。例えば、胚芽性ニワトリ、マウスまたはヒト体肢
芽間葉細胞は軟骨、骨およびそのほかの結合組織に分化
する(S. Subtelney とU. Abbott編『第39回発生生物学
会年次総会（39th Annual Symposium of the Societyfo
r Developmental Biology）』のなかのCaplan A. I.執
筆部分、3768頁、ニューヨーク、Alan R Liss 社刊、19
81年; Elmer ら、(1981) Teratology, 24:215-223; Hau
schka S. D. (1974) Developmental Biology (1974) 3
7: 345-368; Solurshら (1981) Developmental Biolog
y, 83:9-19; Swallaら(1986) Developmental Biology,
116:31-38)。さらに、クローンラット頭蓋冠細胞系統も
また、筋肉、脂肪、軟骨、骨に分化することを示してい
る（Goshimaら(1991)Clin Orthop Rel Res. 269:274-28
3）。出生後生物体における間葉幹細胞（MSC）の存在
は、胚芽後細胞がいくつかの中胚葉表現型に分化するの
を示す目的では広範には研究が行われてはこなかった。
行われた数少ない研究には、拡散チャンバーで容器に入
れることとin vivoでの移植と、その後の骨髄細胞によ
る骨と軟骨の形成が含まれる（Ashtonら (1980) Clin
Orthop Rel Res.,151：294-307；Bruderら(1990) Bon
e Mineral,11:141-151, 1990）。最近では、ニワトリ骨
膜由来の細胞が分離され、培養培地で増殖され、また、
in vitroでの高密度状態下で軟骨と骨への分化を示した
（Nakaharaら (1991) Exp Cell Res.,195:492-503）。
ラット骨髄由来間葉細胞が、in vivoに移植された場合
に、骨芽細胞と軟骨細胞に分化する能力を有しているこ
とが示されている（Dennisら(1991)Cell Transpl, 1:23
32;Goshimaら(1991)Clin Orthop Rel Res. 269:274-28
3）。米国特許第5,908,784号を付与されたJohnsoneらに
よる文献は、生物化学的にまた表現型的に軟骨細胞に類
似している細胞に分化する、皮膚から得られた間葉細胞
の能力を示している。
【０００４】成人骨髄微小環境は、こうした仮定的な中
胚葉幹細胞の潜在的供給源である。成人の骨髄から分離
された細胞は、間質細胞、間質幹細胞、間葉幹細胞(MS
C)、間葉線維芽細胞、細網‐内皮細胞、Westen-Bainton
細胞を含め、さまざまな名称で呼ばれている（Gimbleら
(1996年11月) Bone 19(5):421-8）。In vitroでの研究
では、これらの細胞が、複数の中胚葉または間葉系統経
路に沿って分化できることが示されている。これらに限
定されるわけではないが、これらの細胞には脂肪細胞が
含まれる（Gimbleら (1992) J.Cell Biochem. 50:73-8
2, 軟骨細胞；Caplanら (1998) J Bone Joint Surg. Am
80 (12): 1745-57;造血支持細胞、Gimbleら (1992) J.
Cell Biochem. 50:73-82; 筋細胞、Prockopら (1999)
J. Cell Biochem. 72(4):570-85; 筋細胞、Charbordら
(1999) Exp. Hematol. 27(12):1782-95; 骨芽細胞、Ber
esford ら (1993) J. Cell Physiol. 154:317-328）。
骨髄は骨、軟骨、筋肉、脂肪細胞、そのほかの間葉誘導
臓器再生のための間質幹細胞の供給源と考えられてき
た。これらの細胞使用に対する制約があるが、その主な
ものは、骨髄生検の手法に伴う困難と危険と、この供給
源から得られる幹細胞の産生量の少なさにある。
胚葉幹細胞の潜在的供給源である。成人の骨髄から分離
された細胞は、間質細胞、間質幹細胞、間葉幹細胞(MS
C)、間葉線維芽細胞、細網‐内皮細胞、Westen-Bainton
細胞を含め、さまざまな名称で呼ばれている（Gimbleら
(1996年11月) Bone 19(5):421-8）。In vitroでの研究
では、これらの細胞が、複数の中胚葉または間葉系統経
路に沿って分化できることが示されている。これらに限
定されるわけではないが、これらの細胞には脂肪細胞が
含まれる（Gimbleら (1992) J.Cell Biochem. 50:73-8
2, 軟骨細胞；Caplanら (1998) J Bone Joint Surg. Am
80 (12): 1745-57;造血支持細胞、Gimbleら (1992) J.
Cell Biochem. 50:73-82; 筋細胞、Prockopら (1999)
J. Cell Biochem. 72(4):570-85; 筋細胞、Charbordら
(1999) Exp. Hematol. 27(12):1782-95; 骨芽細胞、Ber
esford ら (1993) J. Cell Physiol. 154:317-328）。
骨髄は骨、軟骨、筋肉、脂肪細胞、そのほかの間葉誘導
臓器再生のための間質幹細胞の供給源と考えられてき
た。これらの細胞使用に対する制約があるが、その主な
ものは、骨髄生検の手法に伴う困難と危険と、この供給
源から得られる幹細胞の産生量の少なさにある。
【０００５】脂肪組織は、多分化能性間質幹細胞の供給
源として骨髄に代わりうる潜在能力を提供する。脂肪組
織は、容易に入手可能であり、また多くの個人に豊富に
ある。肥満は、米国においては1つの疫学的比率を有す
る状態にあり、成人の50％以上が体重をベースにした推
奨BMI値を超過している。脂肪細胞は外来患者をベース
にして実施される脂肪吸引法により収集できる。これ
は、広範な大多数の患者に受入れ可能である美容上の効
果については比較的に非侵襲的な手法である。脂肪細胞
は補充が可能な細胞集団であることがよく報告されてい
る。脂肪吸引法またはほかの手法による外科的な除去後
であっても、個人においては時間の経過に伴って脂肪細
胞の再生が通常みられる。このことから、脂肪細胞には
自己新生の能力がある間質幹細胞を含んでいることが示
唆される。
源として骨髄に代わりうる潜在能力を提供する。脂肪組
織は、容易に入手可能であり、また多くの個人に豊富に
ある。肥満は、米国においては1つの疫学的比率を有す
る状態にあり、成人の50％以上が体重をベースにした推
奨BMI値を超過している。脂肪細胞は外来患者をベース
にして実施される脂肪吸引法により収集できる。これ
は、広範な大多数の患者に受入れ可能である美容上の効
果については比較的に非侵襲的な手法である。脂肪細胞
は補充が可能な細胞集団であることがよく報告されてい
る。脂肪吸引法またはほかの手法による外科的な除去後
であっても、個人においては時間の経過に伴って脂肪細
胞の再生が通常みられる。このことから、脂肪細胞には
自己新生の能力がある間質幹細胞を含んでいることが示
唆される。
【０００６】病理上、脂肪由来の間質幹細胞が複数の間
葉系統に沿って分化できることが示唆されている。もっ
とも一般的な柔組織腫瘍、脂肪肉腫は脂肪細胞様細胞か
ら発生する。混合起源の柔組織腫瘍は比較的一般的であ
る。これらには、脂肪組織、筋肉（平滑筋なしは骨格
筋）、軟骨、および／または骨に関する要素が含まれて
いる。骨髄内にある骨形成細胞が脂肪細胞または脂肪の
細胞に分化できるのと同じように、骨髄外脂肪細胞は骨
芽細胞を形成することができる（Halvorsen WO 99/2844
4）。
葉系統に沿って分化できることが示唆されている。もっ
とも一般的な柔組織腫瘍、脂肪肉腫は脂肪細胞様細胞か
ら発生する。混合起源の柔組織腫瘍は比較的一般的であ
る。これらには、脂肪組織、筋肉（平滑筋なしは骨格
筋）、軟骨、および／または骨に関する要素が含まれて
いる。骨髄内にある骨形成細胞が脂肪細胞または脂肪の
細胞に分化できるのと同じように、骨髄外脂肪細胞は骨
芽細胞を形成することができる（Halvorsen WO 99/2844
4）。
【０００７】軟骨は、その重量の70％〜80％を構成する
水により、高度に水和された構造になっている。残りの
20％〜30％はII型コラーゲンとプロテオグリカンを含
む。コラーゲンは通常、軟骨の乾燥重量の70％を占める
（Rubin & Farber編『病理学(“Pathology”)』1369‐1
371頁、J. B. Lippincott社刊、ペンシルバニア州、198
8年）。プロテオグリカンは、そこから多糖類の長い鎖
が伸びる中央タンパク質コアからなる。これらの多糖類
は、グリコサミノグリカンと呼ばれ、これには以下のも
のが含まれる。すなわち、コンドロイチン-4-硫酸、コ
ンドロイチン-6-硫酸、ケラタン硫酸である。軟骨は、
内在的に産生され、かつ分泌された細胞外マトリックス
内に分散している軟骨形成細胞からなる特徴的な構造的
機構を有する。軟骨細胞を含むマトリックスにおける腔
は軟骨小腔と呼ばれる。骨とは異なり、軟骨は神経化さ
れておらず、また血管またはリンパ系が通っていない
（Clemente『グレイ解剖学（“Gray's Anatomy”）』、
第30版増補版、Lea & Febiger社刊、1984年）。
水により、高度に水和された構造になっている。残りの
20％〜30％はII型コラーゲンとプロテオグリカンを含
む。コラーゲンは通常、軟骨の乾燥重量の70％を占める
（Rubin & Farber編『病理学(“Pathology”)』1369‐1
371頁、J. B. Lippincott社刊、ペンシルバニア州、198
8年）。プロテオグリカンは、そこから多糖類の長い鎖
が伸びる中央タンパク質コアからなる。これらの多糖類
は、グリコサミノグリカンと呼ばれ、これには以下のも
のが含まれる。すなわち、コンドロイチン-4-硫酸、コ
ンドロイチン-6-硫酸、ケラタン硫酸である。軟骨は、
内在的に産生され、かつ分泌された細胞外マトリックス
内に分散している軟骨形成細胞からなる特徴的な構造的
機構を有する。軟骨細胞を含むマトリックスにおける腔
は軟骨小腔と呼ばれる。骨とは異なり、軟骨は神経化さ
れておらず、また血管またはリンパ系が通っていない
（Clemente『グレイ解剖学（“Gray's Anatomy”）』、
第30版増補版、Lea & Febiger社刊、1984年）。
【０００８】軟骨の3つのタイプが哺乳動物には存在し
ており、硝子軟骨、線維性軟骨、弾性軟骨が含まれてい
る（RubinとFarber、同上）。硝子軟骨は、硬い、弾性
成分を有する、筋張った塊からなり、半透明であってか
つ色は真珠様の青みがかっているものである。硝子軟骨
は関節の関節表面上で支配的にみられる。これはまた、
骨端板、肋軟骨、気管軟骨、鰓弓軟骨、鼻軟骨において
もみられる。線維軟骨は、引張強度を軟骨に与えている
Ｉ型コラーゲンの原線維を含んでいる以外は基本的には
硝子軟骨と同じである。コラーゲン線維は束になって並
んでおり、その束の間に軟骨細胞が位置している。線維
軟骨は椎間板の線維輪、腱および靭帯挿入、半月板、恥
骨結合、関節包でよくみられる。弾性軟骨もまた、エラ
スチン線維を含んでいる以外は硝子軟骨とほぼ同じであ
る。硝子軟骨よりもさらに不透明で、かつさらに柔軟で
曲げやすい。これらの特性は、軟骨のマトリックスに埋
め込まれている弾性線維により部分的に規定される。典
型的には、弾性軟骨は耳、喉頭蓋、喉頭の翼に存在して
いる。
ており、硝子軟骨、線維性軟骨、弾性軟骨が含まれてい
る（RubinとFarber、同上）。硝子軟骨は、硬い、弾性
成分を有する、筋張った塊からなり、半透明であってか
つ色は真珠様の青みがかっているものである。硝子軟骨
は関節の関節表面上で支配的にみられる。これはまた、
骨端板、肋軟骨、気管軟骨、鰓弓軟骨、鼻軟骨において
もみられる。線維軟骨は、引張強度を軟骨に与えている
Ｉ型コラーゲンの原線維を含んでいる以外は基本的には
硝子軟骨と同じである。コラーゲン線維は束になって並
んでおり、その束の間に軟骨細胞が位置している。線維
軟骨は椎間板の線維輪、腱および靭帯挿入、半月板、恥
骨結合、関節包でよくみられる。弾性軟骨もまた、エラ
スチン線維を含んでいる以外は硝子軟骨とほぼ同じであ
る。硝子軟骨よりもさらに不透明で、かつさらに柔軟で
曲げやすい。これらの特性は、軟骨のマトリックスに埋
め込まれている弾性線維により部分的に規定される。典
型的には、弾性軟骨は耳、喉頭蓋、喉頭の翼に存在して
いる。
【０００９】哺乳動物関節の関節骨の表面は関節軟骨に
より覆われている。関節軟骨は、反対側の骨表面との直
接接触を防ぎ、また互いに向かい合わせにある関節骨の
ほとんど摩擦のない動作が可能になる（Clemente、同
上）。関節軟骨欠損の２つのタイプが哺乳動物ではよく
みられ、全厚ならびに部分厚欠損がある。身体損傷の程
度だけではなく、各病変のタイプが喚起する修復応答の
性質においても異なる。
より覆われている。関節軟骨は、反対側の骨表面との直
接接触を防ぎ、また互いに向かい合わせにある関節骨の
ほとんど摩擦のない動作が可能になる（Clemente、同
上）。関節軟骨欠損の２つのタイプが哺乳動物ではよく
みられ、全厚ならびに部分厚欠損がある。身体損傷の程
度だけではなく、各病変のタイプが喚起する修復応答の
性質においても異なる。
【００１０】全厚関節軟骨欠損には、関節軟骨、その下
に横たわっている肋軟骨下骨組織、関節軟骨と肋軟骨下
骨の間に位置している軟骨の石灰化層に対する損傷が含
まれる。全厚欠損は典型的には関節の重篤な損傷の間、
または変性関節疾患の後期の間、例えば、骨関節炎の間
に起こる。肋軟骨下骨へ損傷により引き起こされる修復
反応は通常、全厚欠損の部位での線維軟骨の形成という
結果を生じる。しかし、線維軟骨は関節軟骨の生物機械
的特性を欠いており、基本的には長期間にわたって関節
に存続することはない。
に横たわっている肋軟骨下骨組織、関節軟骨と肋軟骨下
骨の間に位置している軟骨の石灰化層に対する損傷が含
まれる。全厚欠損は典型的には関節の重篤な損傷の間、
または変性関節疾患の後期の間、例えば、骨関節炎の間
に起こる。肋軟骨下骨へ損傷により引き起こされる修復
反応は通常、全厚欠損の部位での線維軟骨の形成という
結果を生じる。しかし、線維軟骨は関節軟骨の生物機械
的特性を欠いており、基本的には長期間にわたって関節
に存続することはない。
【００１１】部分厚関節軟骨欠損は軟骨組織自体に限ら
れる。こうした欠損には通常、軟骨の関節表面の裂溝、
裂が含まれる。部分厚欠損は、関節内の軟骨組織の疲労
を順次引き起こす関節の機械的配置により起こる。神経
と血管がないため、部分厚欠損は修復反応を誘導せず、
またしたがって治癒することが少ない。無痛ではある
が、部分厚欠損はしばしば、全厚欠損へと変性する。
れる。こうした欠損には通常、軟骨の関節表面の裂溝、
裂が含まれる。部分厚欠損は、関節内の軟骨組織の疲労
を順次引き起こす関節の機械的配置により起こる。神経
と血管がないため、部分厚欠損は修復反応を誘導せず、
またしたがって治癒することが少ない。無痛ではある
が、部分厚欠損はしばしば、全厚欠損へと変性する。
【００１２】本発明により、ヒト脂肪組織由来の間質細
胞が3次元フォーマットにおいて関連付けられる場合に
は、ある種の軟骨誘導性薬剤または因子とin vitroで接
触させるときに、軟骨生成経路に沿って関与しまた分化
するように誘導できることが観察されている。3次元フ
ォーマットは、本発明のin vitroでの軟骨生成には非常
に重要であり、また細胞は好適には、例えば、固形化ま
たはペレット化した細胞塊として、あるいはアルギナー
トマトリックスに一緒に濃縮される。本発明は、軟骨系
統に沿って成人ヒト骨髄外脂肪組織間質細胞の分離、分
化、特徴付けのための諸方法と成分の実施例を呈示す
る。本発明のin vitroでのプロセスは、invivoに起こっ
ていることを繰り返しているものと考えられ、また哺乳
動物においてin vivoに軟骨の修復を促進するのに使用
できる。
胞が3次元フォーマットにおいて関連付けられる場合に
は、ある種の軟骨誘導性薬剤または因子とin vitroで接
触させるときに、軟骨生成経路に沿って関与しまた分化
するように誘導できることが観察されている。3次元フ
ォーマットは、本発明のin vitroでの軟骨生成には非常
に重要であり、また細胞は好適には、例えば、固形化ま
たはペレット化した細胞塊として、あるいはアルギナー
トマトリックスに一緒に濃縮される。本発明は、軟骨系
統に沿って成人ヒト骨髄外脂肪組織間質細胞の分離、分
化、特徴付けのための諸方法と成分の実施例を呈示す
る。本発明のin vitroでのプロセスは、invivoに起こっ
ていることを繰り返しているものと考えられ、また哺乳
動物においてin vivoに軟骨の修復を促進するのに使用
できる。
【００１３】
【発明の概要】本発明は、皮下、乳房、性腺、または大
網の脂肪組織から誘導された間質細胞を完全に機能的な
軟骨細胞に定常的ならびに定量的に誘導するための方法
と成分を提供する。本方法は、（１）成熟した軟骨細胞
の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化
させることができる軟骨誘導薬剤と、（２）抗生物質
と、（３）ウシ胎児血清またはウマ血清などの栄養分補
給と、（４）アスコルビン酸または関連のあるビタミン
Ｃ類似体と、（５）細胞のグルココルチコイド受容体を
活性化させることができるグルココルチコイドまたはほ
かの化学的薬剤とを有するか、またはそれらにより補給
された化学的に規定されている培養培地に500〜20,000
細胞/cm2の密度で置かれた、分離された脂肪組織由来の
間質細胞のインキュベーションを含む。
網の脂肪組織から誘導された間質細胞を完全に機能的な
軟骨細胞に定常的ならびに定量的に誘導するための方法
と成分を提供する。本方法は、（１）成熟した軟骨細胞
の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化
させることができる軟骨誘導薬剤と、（２）抗生物質
と、（３）ウシ胎児血清またはウマ血清などの栄養分補
給と、（４）アスコルビン酸または関連のあるビタミン
Ｃ類似体と、（５）細胞のグルココルチコイド受容体を
活性化させることができるグルココルチコイドまたはほ
かの化学的薬剤とを有するか、またはそれらにより補給
された化学的に規定されている培養培地に500〜20,000
細胞/cm2の密度で置かれた、分離された脂肪組織由来の
間質細胞のインキュベーションを含む。
【００１４】本発明はまた、DMEMまたはα-MEMまたはRP
MI1640などの培地において間質細胞をペレット化するこ
とにより、あるいは（１）成熟した軟骨細胞の表現型に
つながる任意の細胞の形質導入を活性化させることがで
きる軟骨誘導薬剤と、（２）抗生物質と、（３）ウシ胎
児血清またはウマ血清などの栄養分補給と、（４）アス
コルビン酸または関連のあるビタミンＣ類似体と、
（５）細胞のグルココルチコイド受容体を活性化させる
ことができるグルココルチコイドまたはほかの化学的薬
剤とを培地に補給することにより、軟骨細胞の脂肪組織
由来の間質細胞への分化方法を提供する。
MI1640などの培地において間質細胞をペレット化するこ
とにより、あるいは（１）成熟した軟骨細胞の表現型に
つながる任意の細胞の形質導入を活性化させることがで
きる軟骨誘導薬剤と、（２）抗生物質と、（３）ウシ胎
児血清またはウマ血清などの栄養分補給と、（４）アス
コルビン酸または関連のあるビタミンＣ類似体と、
（５）細胞のグルココルチコイド受容体を活性化させる
ことができるグルココルチコイドまたはほかの化学的薬
剤とを培地に補給することにより、軟骨細胞の脂肪組織
由来の間質細胞への分化方法を提供する。
【００１５】本発明はまた、３次元構造において軟骨形
成を支持することができるカルシウムアルギナート（ca
lcium alginate）またはほかの生体適合性のある格子あ
るいはマトリックス中に細胞を懸濁することにより、軟
骨細胞の脂肪組織由来の間質細胞への分化方法を提供す
る。
成を支持することができるカルシウムアルギナート（ca
lcium alginate）またはほかの生体適合性のある格子あ
るいはマトリックス中に細胞を懸濁することにより、軟
骨細胞の脂肪組織由来の間質細胞への分化方法を提供す
る。
【００１６】本発明は、間質細胞に調節遺伝子を運び入
れるウイルスベクターの形質導入のため、間質細胞に調
節遺伝子を運び入れるプラスミドベクターのトランスフ
ェクションのため、これらの遺伝子によりコードされる
機能的タンパク質の追跡と検出のため、生きている生物
体中にこうした細胞の再導入するための生物機械的キャ
リアを開発するために、脂肪組織由来の間質細胞の分化
と機能を方向付けるこうした培養状態と薬剤との能力を
測定するための方法を提供する。
れるウイルスベクターの形質導入のため、間質細胞に調
節遺伝子を運び入れるプラスミドベクターのトランスフ
ェクションのため、これらの遺伝子によりコードされる
機能的タンパク質の追跡と検出のため、生きている生物
体中にこうした細胞の再導入するための生物機械的キャ
リアを開発するために、脂肪組織由来の間質細胞の分化
と機能を方向付けるこうした培養状態と薬剤との能力を
測定するための方法を提供する。
【００１７】本発明はさらに、こうした軟骨細胞を修復
のために軟骨欠損領域に導入するための方法を提供す
る。
のために軟骨欠損領域に導入するための方法を提供す
る。
【００１８】本方法と成分は、前十字靭帯裂傷、全厚関
節軟骨欠損、部分厚関節軟骨欠損に限らないが、それら
を含む分化細胞関連疾患状態および外傷に対して妥当性
を備えた化合物およびタンパク質の薬剤発見に使用する
方法を有する。
節軟骨欠損、部分厚関節軟骨欠損に限らないが、それら
を含む分化細胞関連疾患状態および外傷に対して妥当性
を備えた化合物およびタンパク質の薬剤発見に使用する
方法を有する。
【００１９】 〔発明の詳細な説明〕本発明は、軟骨細胞への脂肪組織
由来の間質細胞の分化と培養のための方法と成分を提供
する。本発明の方法により産生された細胞は、研究、移
植、ヒトの疾患および外傷の修復と治療用の組織工学的
産物開発のために完全に分化させた、また機能的な細胞
の供給源を提供する際に有用である。したがって、1つ
の態様では、本発明は、増殖と、機能的な軟骨細胞への
間質細胞の分化を支持することができる培地を含む組成
中で間質細胞を培養することを含む軟骨細胞の脂肪組織
由来の間質細胞への分化方法を提供する。本発明はさら
に、修復のために軟骨欠損領域にこれら軟骨細胞を導入
するための方法を提供する。
由来の間質細胞の分化と培養のための方法と成分を提供
する。本発明の方法により産生された細胞は、研究、移
植、ヒトの疾患および外傷の修復と治療用の組織工学的
産物開発のために完全に分化させた、また機能的な細胞
の供給源を提供する際に有用である。したがって、1つ
の態様では、本発明は、増殖と、機能的な軟骨細胞への
間質細胞の分化を支持することができる培地を含む組成
中で間質細胞を培養することを含む軟骨細胞の脂肪組織
由来の間質細胞への分化方法を提供する。本発明はさら
に、修復のために軟骨欠損領域にこれら軟骨細胞を導入
するための方法を提供する。
【００２０】「脂肪間質細胞」とは、脂肪組織を起源と
する間質細胞をいう。「脂肪」という言葉は、任意の脂
肪の組織を意味する。脂肪組織は、茶色または白色脂肪
組織であり、皮下、大網または内臓、乳房、性腺、また
はほかの脂肪組織部位から誘導される。好適には、脂肪
は皮下の白色脂肪組織である。こうした細胞は初代細胞
培養または不死化細胞系統を含むことが考えられる。脂
肪組織は脂肪組織を有する任意の生物体由来のものと考
えられる。好適には、脂肪組織が哺乳動物のもので、も
っとも好適には脂肪組織はヒト由来のものである。都合
の良い脂肪組織の供給源は、吸引脱脂手術から得られる
ものであるが、脂肪組織の供給源または脂肪組織の分離
の方法は本発明にとっては非常に重要なものではない。
間質細胞を対象者に自家移植することを所望する場合に
は、脂肪細胞はその対象者から分離される。
する間質細胞をいう。「脂肪」という言葉は、任意の脂
肪の組織を意味する。脂肪組織は、茶色または白色脂肪
組織であり、皮下、大網または内臓、乳房、性腺、また
はほかの脂肪組織部位から誘導される。好適には、脂肪
は皮下の白色脂肪組織である。こうした細胞は初代細胞
培養または不死化細胞系統を含むことが考えられる。脂
肪組織は脂肪組織を有する任意の生物体由来のものと考
えられる。好適には、脂肪組織が哺乳動物のもので、も
っとも好適には脂肪組織はヒト由来のものである。都合
の良い脂肪組織の供給源は、吸引脱脂手術から得られる
ものであるが、脂肪組織の供給源または脂肪組織の分離
の方法は本発明にとっては非常に重要なものではない。
間質細胞を対象者に自家移植することを所望する場合に
は、脂肪細胞はその対象者から分離される。
【００２１】「軟骨細胞（軟骨の細胞）」とは、II型コ
ラーゲン、硫酸コンドロイチン、硫酸ケラチン、平滑筋
の特性を有する形態学的マーカーに限らないがそれらを
含め、培養において観察され、またII型コラーゲンを分
泌することができる円形形態学的なもの（rounded morp
hology）を含むがそれに限定されず、in vitroでの軟骨
の血行力学による組織またはマトリックスの生成を含む
がそれに限定されない、軟骨細胞の特徴のある生物化学
的マーカーの発現を可能にする細胞をいう。
ラーゲン、硫酸コンドロイチン、硫酸ケラチン、平滑筋
の特性を有する形態学的マーカーに限らないがそれらを
含め、培養において観察され、またII型コラーゲンを分
泌することができる円形形態学的なもの（rounded morp
hology）を含むがそれに限定されず、in vitroでの軟骨
の血行力学による組織またはマトリックスの生成を含む
がそれに限定されない、軟骨細胞の特徴のある生物化学
的マーカーの発現を可能にする細胞をいう。
【００２２】組織培養での間質細胞を支持することがで
きるいずれかの培地が使用される。線維芽細胞の増殖を
支える培地調剤法には、それらに限らないが、ダルベッ
コ変法イーグル培地（DMEM）、α改変最少必須培地（α
-MEM）、ローズウエルパーク記念研究所培地（Roswel P
ark Memorial Institute Media）1640（RPMI培地1640）
などが含まれる。典型的には、0〜20％の胎児ウシ血清
（FBS）または1〜20％のウマ血清が、間質細胞または軟
骨細胞あるいはそれらの両方の増殖を支えるために上記
の培地に加えられる。規定された培地も、間質細胞と軟
骨細胞用のFBSのなかで必要な成長因子、サイトカイ
ン、ホルモンがその増殖培地で適当な密度で同定され、
また供給される場合には、使用することができるであろ
う。本発明の方法において有用な培地には、間質細胞に
対して分裂促進する抗生物質または分化を可能にする化
合物を含むがそれらに限定されない、関心の対象である
1つまたはそれ以上の化合物が含みうる。細胞は湿り気
を加えたインキュベータのなかで31℃〜37℃の間の温度
で増殖される。二酸化炭素含有量が2％〜10％の間で維
持され、また酸素含有量は1％〜22％の間で維持され
る。細胞は、4週間までの間、この環境におかれる。
きるいずれかの培地が使用される。線維芽細胞の増殖を
支える培地調剤法には、それらに限らないが、ダルベッ
コ変法イーグル培地（DMEM）、α改変最少必須培地（α
-MEM）、ローズウエルパーク記念研究所培地（Roswel P
ark Memorial Institute Media）1640（RPMI培地1640）
などが含まれる。典型的には、0〜20％の胎児ウシ血清
（FBS）または1〜20％のウマ血清が、間質細胞または軟
骨細胞あるいはそれらの両方の増殖を支えるために上記
の培地に加えられる。規定された培地も、間質細胞と軟
骨細胞用のFBSのなかで必要な成長因子、サイトカイ
ン、ホルモンがその増殖培地で適当な密度で同定され、
また供給される場合には、使用することができるであろ
う。本発明の方法において有用な培地には、間質細胞に
対して分裂促進する抗生物質または分化を可能にする化
合物を含むがそれらに限定されない、関心の対象である
1つまたはそれ以上の化合物が含みうる。細胞は湿り気
を加えたインキュベータのなかで31℃〜37℃の間の温度
で増殖される。二酸化炭素含有量が2％〜10％の間で維
持され、また酸素含有量は1％〜22％の間で維持され
る。細胞は、4週間までの間、この環境におかれる。
【００２３】培地中に補給することができる抗生物質に
は、ペニシリンとストレプトマイシンを含むがそれらに
限定されない。化学的に規定された培養培地におけるペ
ニシリンの濃度は、約10〜約200単位/mlである。化学的
に規定された培養培地におけるストレプトマイシンの濃
度は、約10〜約200 μg/mlである。
は、ペニシリンとストレプトマイシンを含むがそれらに
限定されない。化学的に規定された培養培地におけるペ
ニシリンの濃度は、約10〜約200単位/mlである。化学的
に規定された培養培地におけるストレプトマイシンの濃
度は、約10〜約200 μg/mlである。
【００２４】本発明で使用することができるグルココル
チコイドには、ヒドロコルチゾンとデキサメタゾンを含
むがそれらに限定されない。培地におけるデキサメタゾ
ンの濃度は約1〜約100 nMである。培地におけるヒドロ
コルチゾンの濃度は約1〜約100 nMである。
チコイドには、ヒドロコルチゾンとデキサメタゾンを含
むがそれらに限定されない。培地におけるデキサメタゾ
ンの濃度は約1〜約100 nMである。培地におけるヒドロ
コルチゾンの濃度は約1〜約100 nMである。
【００２５】本出願で用いられているように、「軟骨誘
導薬剤」または「軟骨誘導因子」という用語は、in vit
roの軟骨生成誘導または軟骨細胞の産生に効果を及ぼす
ように、ヒト脂肪組織由来の間質細胞に適用することが
できる、何らかの天然または合成の、有機または無機化
学的、生物化学的化合物、それらの化合物の組み合わせ
または混合物または何らかの機械的、そのほかの物理的
装置、容器、影響や力をいう。軟骨誘導製剤は好適に
は、(i)デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、(i
i)骨形態形成タンパク質（bone morphogenic protein）
（好適にはBMP-2またはBMP-4）、TGF-β1、TGF-β2、TG
F-β3、インスリン様成長因子（IGF）、血小板由来成長
因子（PDGF）、表皮性成長因子（EGF）、酸性線維芽細
胞成長因子（aFBF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFB
F）、肝細胞成長因子(HGF)、角膜実質細胞成長因子（KG
F）、骨形成タンパク質（OP-1、OP-2、OP-3）、インヒ
ビンＡまたは軟骨形成刺激活性因子（CSA）、(iii)I型
コラーゲンなどのコラーゲン性細胞外マトリックスの組
成物（とくにゲルの形態で）、(iv)レチン酸などのビタ
ミンＡ類似体から構成されるグループから個別に、ある
いは組み合わせて、選択される。
導薬剤」または「軟骨誘導因子」という用語は、in vit
roの軟骨生成誘導または軟骨細胞の産生に効果を及ぼす
ように、ヒト脂肪組織由来の間質細胞に適用することが
できる、何らかの天然または合成の、有機または無機化
学的、生物化学的化合物、それらの化合物の組み合わせ
または混合物または何らかの機械的、そのほかの物理的
装置、容器、影響や力をいう。軟骨誘導製剤は好適に
は、(i)デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、(i
i)骨形態形成タンパク質（bone morphogenic protein）
（好適にはBMP-2またはBMP-4）、TGF-β1、TGF-β2、TG
F-β3、インスリン様成長因子（IGF）、血小板由来成長
因子（PDGF）、表皮性成長因子（EGF）、酸性線維芽細
胞成長因子（aFBF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFB
F）、肝細胞成長因子(HGF)、角膜実質細胞成長因子（KG
F）、骨形成タンパク質（OP-1、OP-2、OP-3）、インヒ
ビンＡまたは軟骨形成刺激活性因子（CSA）、(iii)I型
コラーゲンなどのコラーゲン性細胞外マトリックスの組
成物（とくにゲルの形態で）、(iv)レチン酸などのビタ
ミンＡ類似体から構成されるグループから個別に、ある
いは組み合わせて、選択される。
【００２６】トランスフォーミング成長因子βの濃度
は、約1〜約100 ng/mlである。レチン酸の濃度は、約0.
1〜約1 μg/mlである。
は、約1〜約100 ng/mlである。レチン酸の濃度は、約0.
1〜約1 μg/mlである。
【００２７】間質細胞分裂促進因子である化合物の例と
しては、トランスフォーミング成長因子β、線維芽細胞
成長因子、骨形態形成タンパク質、間質細胞分化因子を
含むがそれらに限定されず、デキサメタゾン、ヒドロコ
ルチゾン、トランスフォーミング成長因子β、線維芽細
胞成長因子、骨形態形成タンパク質などを含むがそれら
に限定されない。
しては、トランスフォーミング成長因子β、線維芽細胞
成長因子、骨形態形成タンパク質、間質細胞分化因子を
含むがそれらに限定されず、デキサメタゾン、ヒドロコ
ルチゾン、トランスフォーミング成長因子β、線維芽細
胞成長因子、骨形態形成タンパク質などを含むがそれら
に限定されない。
【００２８】好適には、脂肪組織由来の間質細胞は最終
的に分化した細胞が導入される対象者の脂肪組織から分
離される。しかし、間質細胞は対象者と同じかまたは異
なる種のいずれかの生物体から分離されうる。脂肪組織
を有するいずれかの生物体であれば、潜在的な候補とな
ることができる。好適には、その生物体は哺乳動物であ
り、もっとも好適な生物体はヒトである。
的に分化した細胞が導入される対象者の脂肪組織から分
離される。しかし、間質細胞は対象者と同じかまたは異
なる種のいずれかの生物体から分離されうる。脂肪組織
を有するいずれかの生物体であれば、潜在的な候補とな
ることができる。好適には、その生物体は哺乳動物であ
り、もっとも好適な生物体はヒトである。
【００２９】本発明はまた、３次元構造において軟骨形
成を支持することができるカルシウムアルギナートまた
は別の生体適合性のある格子あるいはマトリックス中に
細胞を懸濁することにより、軟骨細胞中に脂肪由来の間
質細胞を分化させて入れるための方法を提供する。格子
の材料の例としては、（１）1％〜4％の濃度でのカルシ
ウムアルギナート、架橋されたLグルクロン酸およびDマ
ンヌロン酸の多糖類、（２）フィブリン、（３）II型コ
ラーゲン、または（４）アガロースゲルが含まれる。細
胞を含む格子またはマトリックスは、（１）成熟した軟
骨細胞の表現型につながる任意の細胞形質導入経路を活
性化させることができる軟骨誘導薬剤と、（２）抗生物
質と、（３）ウシ胎児血清またはウマ血清などの栄養分
補給と、（４）アスコルビン酸または関連のあるビタミ
ンＣ類似体と、（５）細胞のグルココルチコイド受容体
を活性化させることができるグルココルチコイドまたは
ほかの化学的薬剤とを含む培養培地に移される。
成を支持することができるカルシウムアルギナートまた
は別の生体適合性のある格子あるいはマトリックス中に
細胞を懸濁することにより、軟骨細胞中に脂肪由来の間
質細胞を分化させて入れるための方法を提供する。格子
の材料の例としては、（１）1％〜4％の濃度でのカルシ
ウムアルギナート、架橋されたLグルクロン酸およびDマ
ンヌロン酸の多糖類、（２）フィブリン、（３）II型コ
ラーゲン、または（４）アガロースゲルが含まれる。細
胞を含む格子またはマトリックスは、（１）成熟した軟
骨細胞の表現型につながる任意の細胞形質導入経路を活
性化させることができる軟骨誘導薬剤と、（２）抗生物
質と、（３）ウシ胎児血清またはウマ血清などの栄養分
補給と、（４）アスコルビン酸または関連のあるビタミ
ンＣ類似体と、（５）細胞のグルココルチコイド受容体
を活性化させることができるグルココルチコイドまたは
ほかの化学的薬剤とを含む培養培地に移される。
【００３０】脂肪組織由来の間質細胞は、プラスミド、
ウイルス、または代替的ベクターの方法を使用して、関
心の対象である核酸に、安定的にまたは一時的にトラン
スフェクションまたは形質導入されることが考えられ
る。関心の対象となっている核酸には、軟骨にみられる
細胞外マトリックス組成物の産生を向上させるこれらの
コード遺伝子産物を含むがそれに限定されない。例とし
ては、トランスフォーミング成長因子β、骨形態形成タ
ンパク質、アクチビン、インスリン様成長因子を含む。
ウイルス、または代替的ベクターの方法を使用して、関
心の対象である核酸に、安定的にまたは一時的にトラン
スフェクションまたは形質導入されることが考えられ
る。関心の対象となっている核酸には、軟骨にみられる
細胞外マトリックス組成物の産生を向上させるこれらの
コード遺伝子産物を含むがそれに限定されない。例とし
ては、トランスフォーミング成長因子β、骨形態形成タ
ンパク質、アクチビン、インスリン様成長因子を含む。
【００３１】間質細胞に調節遺伝子を運び入れるウイル
スベクターの形質導入は、10：1〜2000：1の間の複合感
染（ウイルス単位：細胞）で塩化セシウムバンディング
またはほかの方法により精製されるウイルスベクター
（アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイル
ス、またはほかのベクター）により行うことができる。
細胞は、1時間〜24時間の間、ポリエチレンイミンまた
はリポフェクタミンTMなどのカチオン界面活性剤の非存
在下または存在下で、無血清培地または血清を含む培地
でウイルスに曝される（Byk ら(1998) Human Gene Ther
apy 9:2493-2502;Sommer B. ら (1999) Calcif. Tissue
Int. 64:45-49）。
スベクターの形質導入は、10：1〜2000：1の間の複合感
染（ウイルス単位：細胞）で塩化セシウムバンディング
またはほかの方法により精製されるウイルスベクター
（アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイル
ス、またはほかのベクター）により行うことができる。
細胞は、1時間〜24時間の間、ポリエチレンイミンまた
はリポフェクタミンTMなどのカチオン界面活性剤の非存
在下または存在下で、無血清培地または血清を含む培地
でウイルスに曝される（Byk ら(1998) Human Gene Ther
apy 9:2493-2502;Sommer B. ら (1999) Calcif. Tissue
Int. 64:45-49）。
【００３２】間質細胞に調節遺伝子を運び入れるプラス
ミドベクターのトランスフェクションは、リン酸カルシ
ウムDNA沈殿法またはカチオン界面活性剤法（リポフェ
クタミンTM、DOTAP）または生体適合性ポリマー中に直
接プラスミドDNAベクターの組込みによる3次元培養を使
用することにより、単層培養の細胞中に導入することが
できる（Bonadio J. (1999) Nat. Med. 5:753-759）。
ミドベクターのトランスフェクションは、リン酸カルシ
ウムDNA沈殿法またはカチオン界面活性剤法（リポフェ
クタミンTM、DOTAP）または生体適合性ポリマー中に直
接プラスミドDNAベクターの組込みによる3次元培養を使
用することにより、単層培養の細胞中に導入することが
できる（Bonadio J. (1999) Nat. Med. 5:753-759）。
【００３３】これらの遺伝子によりコードされる機能的
なタンパク質の追跡と検出のために、ウイルスまたはプ
ラスミドDNAベクターには、緑色蛍光タンパク質または
βガラクトシダーゼ酵素のように容易に検出可能なマー
カー遺伝子などが含まれ、緑色蛍光タンパク質とβガラ
クトシダーゼ酵素は両方とも組織化学的手段により追跡
することが可能である。
なタンパク質の追跡と検出のために、ウイルスまたはプ
ラスミドDNAベクターには、緑色蛍光タンパク質または
βガラクトシダーゼ酵素のように容易に検出可能なマー
カー遺伝子などが含まれ、緑色蛍光タンパク質とβガラ
クトシダーゼ酵素は両方とも組織化学的手段により追跡
することが可能である。
【００３４】生きている生物体への間質細胞再導入用の
生物機械的なキャリアの開発に関して言うと、キャリア
には、カルシウムアルギナート、アガロース、I、II、I
V型コラーゲン、またはほかのコラーゲンイソ型タンパ
ク質、フィブリン、ポリ格子またはポリグリコール酸、
ヒアルロン酸誘導体、あるいはその他の物質（PerkaC.
ら(2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:305-311; Sechri
est VFら (2000) J.Biomed. Mater. Res. 49:534-541;
Chu CR ら(1995) J. Biomed. Mater. Res. 29:1147-115
4; Hendrickson DAら (1994) Orthop. Res. 12:485-49
7）が含まれるがこれらに限定されない。
生物機械的なキャリアの開発に関して言うと、キャリア
には、カルシウムアルギナート、アガロース、I、II、I
V型コラーゲン、またはほかのコラーゲンイソ型タンパ
ク質、フィブリン、ポリ格子またはポリグリコール酸、
ヒアルロン酸誘導体、あるいはその他の物質（PerkaC.
ら(2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:305-311; Sechri
est VFら (2000) J.Biomed. Mater. Res. 49:534-541;
Chu CR ら(1995) J. Biomed. Mater. Res. 29:1147-115
4; Hendrickson DAら (1994) Orthop. Res. 12:485-49
7）が含まれるがこれらに限定されない。
【００３５】本発明のもう1つの目的は、軟骨細胞への
脂肪組織由来の間質細胞の分化を促進させる化合物の同
定法と研究法を提供することである。分化を促進する化
合物は、部分または全軟骨欠損、骨関節炎、外傷性軟
骨、口蓋裂または中隔偏位を含む先天性欠損の形成外科
の治療において価値を有するものであると考えられる。
諸方法には、その後に関心の対象となっている新規な化
合物に曝すことができる軟骨細胞として脂肪組織由来の
間質細胞を維持する3次元でのin vitro培養の開発が含
まれるが、それに限定されない。
脂肪組織由来の間質細胞の分化を促進させる化合物の同
定法と研究法を提供することである。分化を促進する化
合物は、部分または全軟骨欠損、骨関節炎、外傷性軟
骨、口蓋裂または中隔偏位を含む先天性欠損の形成外科
の治療において価値を有するものであると考えられる。
諸方法には、その後に関心の対象となっている新規な化
合物に曝すことができる軟骨細胞として脂肪組織由来の
間質細胞を維持する3次元でのin vitro培養の開発が含
まれるが、それに限定されない。
【００３６】あらゆる化合物が軟骨細胞への脂肪組織由
来の間質細胞の分化に影響を与える能力について調査さ
れうる。調査される化合物に適合可能な適当なビヒクル
は、当業者には公知のものであり、また、現時点の最新
版の『レミントンの薬学科学（Remington's Pharmaceut
ical Sciences）』(1995年、Mack Publishing社刊、ペ
ンシルバニア州イーストン市)にみることができるが、
その内容は本出願に引用することにより本発明の一部を
なすものとする。
来の間質細胞の分化に影響を与える能力について調査さ
れうる。調査される化合物に適合可能な適当なビヒクル
は、当業者には公知のものであり、また、現時点の最新
版の『レミントンの薬学科学（Remington's Pharmaceut
ical Sciences）』(1995年、Mack Publishing社刊、ペ
ンシルバニア州イーストン市)にみることができるが、
その内容は本出願に引用することにより本発明の一部を
なすものとする。
【００３７】本発明の特徴と長所は、本発明を制限する
ものとして解釈されるべきではない以下の実施例を参照
することでさらに明確に理解されることであろう。
ものとして解釈されるべきではない以下の実施例を参照
することでさらに明確に理解されることであろう。
【００３８】［実験］ ［軟骨細胞への脂肪組織由来の間質細胞の分化］ ［実施例1：デキサメタゾンを使用したin vitroでの軟
骨形成］間質細胞は、1999年1月29日に出願された米国
特許出願第09/240,029号「ヒト前脂肪細胞から脂肪細胞
への分化の方法と成分（“Methods and Composition of
the Differentiation of Human Preadipocytes into Ad
ipocytes”）」に説明されている方法によりヒト皮下脂
肪細胞から分離される。これらの細胞は500〜20,000細
胞/cm2の密度で置かれる。本発明は、in vitroでの前軟
骨濃縮の創成がヒト脂肪細胞から誘導された間葉前駆体
細胞における軟骨形成を促進することを企図している。
これは、以下の方法を含む方法により達成されるがそれ
らに限定されない。 （１）増殖平板細胞とともに使用されるために開発され
たペレット培養システム（Katoら(1988) PNAS 85: 9552
-9556; Ballock と Redi, J. Cell Biol. (1994)126
(5): 1311-1318）であって、培養培地に置かれた軟骨細
胞の軟骨表現型の発現を維持するのに使用されてきたペ
レット培養システム（Solursh (1991) J.Cell Biochem.
45: 258-260）。 （２）細胞と細胞との接触を防ぎ、軟骨細胞の表現型の
維持または獲得を促進する特徴を有する円形形態を維持
するためにカルシウムアルギナートの中で細胞を維持す
るアルギナート懸濁法。
骨形成］間質細胞は、1999年1月29日に出願された米国
特許出願第09/240,029号「ヒト前脂肪細胞から脂肪細胞
への分化の方法と成分（“Methods and Composition of
the Differentiation of Human Preadipocytes into Ad
ipocytes”）」に説明されている方法によりヒト皮下脂
肪細胞から分離される。これらの細胞は500〜20,000細
胞/cm2の密度で置かれる。本発明は、in vitroでの前軟
骨濃縮の創成がヒト脂肪細胞から誘導された間葉前駆体
細胞における軟骨形成を促進することを企図している。
これは、以下の方法を含む方法により達成されるがそれ
らに限定されない。 （１）増殖平板細胞とともに使用されるために開発され
たペレット培養システム（Katoら(1988) PNAS 85: 9552
-9556; Ballock と Redi, J. Cell Biol. (1994)126
(5): 1311-1318）であって、培養培地に置かれた軟骨細
胞の軟骨表現型の発現を維持するのに使用されてきたペ
レット培養システム（Solursh (1991) J.Cell Biochem.
45: 258-260）。 （２）細胞と細胞との接触を防ぎ、軟骨細胞の表現型の
維持または獲得を促進する特徴を有する円形形態を維持
するためにカルシウムアルギナートの中で細胞を維持す
るアルギナート懸濁法。
【００３９】ヒト脂肪細胞由来の細胞は、上述されてい
るように分離される。ペレット培養に関しては、10％の
ウシ胎児血清、50 ng/mlのアスコルビン酸-2-リン酸、1
00 nMのデキサメタゾン(DEX)を加えたDMEMを入れた滅菌
された15 ml円錐形のポリプロピレン試験管で、200,000
細胞のアリコートが、10分間、500 gで遠心分離され
た。その後3週間、5％のCO2中で、37℃にてインキュベ
ーションされる。アルギナート培養に関しては、細胞は
1.2％のカルシウムアルギナートに入れた100万細胞/ml
の密度で懸濁され、10％のウシ胎児血清、50 ng/mlのア
スコルビン酸-2-リン酸、100 nMのデキサメタゾン(DEX)
を加えたDMEMで維持される。その後に3週間、5％のCO2
中で37℃にてインキュベーションされる。2〜4週間後
に、細胞は分離され、適当な抗体試薬で免疫組織化学に
より、または、細胞外マトリックスにおける硫酸化プロ
テオグリカンの存在を検出するためにトルイジン青によ
り染色することにより軟骨細胞系統マーカーに関して固
定され、分析される。
るように分離される。ペレット培養に関しては、10％の
ウシ胎児血清、50 ng/mlのアスコルビン酸-2-リン酸、1
00 nMのデキサメタゾン(DEX)を加えたDMEMを入れた滅菌
された15 ml円錐形のポリプロピレン試験管で、200,000
細胞のアリコートが、10分間、500 gで遠心分離され
た。その後3週間、5％のCO2中で、37℃にてインキュベ
ーションされる。アルギナート培養に関しては、細胞は
1.2％のカルシウムアルギナートに入れた100万細胞/ml
の密度で懸濁され、10％のウシ胎児血清、50 ng/mlのア
スコルビン酸-2-リン酸、100 nMのデキサメタゾン(DEX)
を加えたDMEMで維持される。その後に3週間、5％のCO2
中で37℃にてインキュベーションされる。2〜4週間後
に、細胞は分離され、適当な抗体試薬で免疫組織化学に
より、または、細胞外マトリックスにおける硫酸化プロ
テオグリカンの存在を検出するためにトルイジン青によ
り染色することにより軟骨細胞系統マーカーに関して固
定され、分析される。
【００４０】代表的な軟骨細胞マーカータンパク質、コ
ラーゲンIIを検出する抗体により得られた結果を図１〜
３に示す。細胞は、コラーゲンIIタンパク質の細胞内の
存在について免疫蛍光法により陽性に染色されたペレッ
ト培養（図2）またはカルシウムアルギナート（図３）
で維持される。これらの結果は、図1に示されるよう
に、単層培養において3週間の間維持されている脂肪組
織由来の細胞の同定分析と対照されるが、ここでは染色
されたものは全くみつかっていない。軟骨細胞マーカー
タンパク質、コラーゲンVIを検出する抗体試薬による免
疫組織化学的な結果を図４に示す。脂肪組織由来の間質
細胞は、1.2％のカルシウムアルギナートのなかで維持
され、またトランスフォーミング成長因子β（10ng/m
l）の存在下または非存在下で、10％のウシ胎児血清、5
0 ng/mlのアスコルビン酸-2-リン酸、100 nMデキサメタ
ゾン(DEX)を加えたDMEMのなかで維持される。その後２
週間、5％のCO2中で37℃にてインキュベーションされ
る。免疫組織化学法により、トランスフォーミング成長
因子βの存在下では維持されているこれらの細胞を取り
囲むコラーゲンVIタンパク質が濃縮されて析出している
が、トランスフォーミング成長因子βの非存在下ではそ
のような現象がないことが明らかになった。
ラーゲンIIを検出する抗体により得られた結果を図１〜
３に示す。細胞は、コラーゲンIIタンパク質の細胞内の
存在について免疫蛍光法により陽性に染色されたペレッ
ト培養（図2）またはカルシウムアルギナート（図３）
で維持される。これらの結果は、図1に示されるよう
に、単層培養において3週間の間維持されている脂肪組
織由来の細胞の同定分析と対照されるが、ここでは染色
されたものは全くみつかっていない。軟骨細胞マーカー
タンパク質、コラーゲンVIを検出する抗体試薬による免
疫組織化学的な結果を図４に示す。脂肪組織由来の間質
細胞は、1.2％のカルシウムアルギナートのなかで維持
され、またトランスフォーミング成長因子β（10ng/m
l）の存在下または非存在下で、10％のウシ胎児血清、5
0 ng/mlのアスコルビン酸-2-リン酸、100 nMデキサメタ
ゾン(DEX)を加えたDMEMのなかで維持される。その後２
週間、5％のCO2中で37℃にてインキュベーションされ
る。免疫組織化学法により、トランスフォーミング成長
因子βの存在下では維持されているこれらの細胞を取り
囲むコラーゲンVIタンパク質が濃縮されて析出している
が、トランスフォーミング成長因子βの非存在下ではそ
のような現象がないことが明らかになった。
【００４１】軟骨形成に関連する代表的な遺伝子マーカ
ーを検出するポリメラーゼ連鎖反応の結果を、図5に図
示する。脂肪組織由来の間質細胞は、1.2％のカルシウ
ムアルギナート（Alg）で、または単層（単一）培養で
維持され、また、4週間の間、トランスフォーミング成
長因子β（10 ng/ml）に関してTGFβマイナスの非存在
下、またはTGFβプラスの存在下で10％のウシ胎児血
清、50 ng/mlのアスコルビン酸-2-リン酸、100 nMのデ
キサメタゾン(DEX)を加えたDMEM中で維持される。全て
のRNAは個々の培養株から分離され、I型またはVI型コラ
ーゲン、プロテオグリカンリンクタンパク質、アグレカ
ン、またはアクチンに対して特異的なプライマーにより
ポリメラーゼ連鎖反応において使用された。コラーゲン
マーカーとアクチンはすべての増殖条件下で検出され
た。しかし、リンクmRNAは、アルギナート懸濁液条件下
でもっとも豊富であり、またアグレカンはTGFβの存在
下のアルギナート条件下でのみ存在した。
ーを検出するポリメラーゼ連鎖反応の結果を、図5に図
示する。脂肪組織由来の間質細胞は、1.2％のカルシウ
ムアルギナート（Alg）で、または単層（単一）培養で
維持され、また、4週間の間、トランスフォーミング成
長因子β（10 ng/ml）に関してTGFβマイナスの非存在
下、またはTGFβプラスの存在下で10％のウシ胎児血
清、50 ng/mlのアスコルビン酸-2-リン酸、100 nMのデ
キサメタゾン(DEX)を加えたDMEM中で維持される。全て
のRNAは個々の培養株から分離され、I型またはVI型コラ
ーゲン、プロテオグリカンリンクタンパク質、アグレカ
ン、またはアクチンに対して特異的なプライマーにより
ポリメラーゼ連鎖反応において使用された。コラーゲン
マーカーとアクチンはすべての増殖条件下で検出され
た。しかし、リンクmRNAは、アルギナート懸濁液条件下
でもっとも豊富であり、またアグレカンはTGFβの存在
下のアルギナート条件下でのみ存在した。
【００４２】これらの結果から、in vitro細胞凝縮を作
成する組み合わせにより、また適当な許容因子を加える
ことにより、われわれは皮下脂肪組織由来の細胞におけ
る軟骨形成と合致する軟骨細胞マーカーの発現を産生す
ることができることが示されている。
成する組み合わせにより、また適当な許容因子を加える
ことにより、われわれは皮下脂肪組織由来の細胞におけ
る軟骨形成と合致する軟骨細胞マーカーの発現を産生す
ることができることが示されている。
【００４３】［実施例2：合成軟骨パッチの作成］増殖
後、軟骨形成潜在能力をまだ有している軟骨形成細胞
は、軟骨特異的な細胞外マトリックス成分の分泌を刺激
するため、固定に依存しない様式（anchorage-independ
ent manner）で、すなわち、細胞接触表面、細胞接着表
面を有するウェルのなかで培養されることが考えられ
る。
後、軟骨形成潜在能力をまだ有している軟骨形成細胞
は、軟骨特異的な細胞外マトリックス成分の分泌を刺激
するため、固定に依存しない様式（anchorage-independ
ent manner）で、すなわち、細胞接触表面、細胞接着表
面を有するウェルのなかで培養されることが考えられ
る。
【００４４】これまでは、固定依存様式（anchorage-de
pendent manner）で増殖的に拡張された軟骨形成細胞は
通常、軟骨特異的II型コラーゲンと硫酸化プロテオグリ
カンを分泌するそれらの能力を脱分化し、また喪失す
る。（Mayne ら(1984) Exp. Cell. Res. 151(1):171-8
2; Mayne ら(1976) PNAS 73(5):1674-8; Okayama ら(19
76) PNAS 73(9):3224-8; Pacificiら (1981)J. Biol. C
hem. 256(2):1029-37; Pacificiら (1980) Cancer Res.
40 (7): 2461-4; Pacificiら (1977) Cell 4:891-9; v
on der Markら (1977) Nature 267 (5611):531-2; West
ら (1979) Cell 17(3):491-501; Oegama ら(1981) J. B
iol. Chem. 256(2):1015-22; Benyaら (1982) Cell 30
(1):215-24）。
pendent manner）で増殖的に拡張された軟骨形成細胞は
通常、軟骨特異的II型コラーゲンと硫酸化プロテオグリ
カンを分泌するそれらの能力を脱分化し、また喪失す
る。（Mayne ら(1984) Exp. Cell. Res. 151(1):171-8
2; Mayne ら(1976) PNAS 73(5):1674-8; Okayama ら(19
76) PNAS 73(9):3224-8; Pacificiら (1981)J. Biol. C
hem. 256(2):1029-37; Pacificiら (1980) Cancer Res.
40 (7): 2461-4; Pacificiら (1977) Cell 4:891-9; v
on der Markら (1977) Nature 267 (5611):531-2; West
ら (1979) Cell 17(3):491-501; Oegama ら(1981) J. B
iol. Chem. 256(2):1015-22; Benyaら (1982) Cell 30
(1):215-24）。
【００４５】細胞接触表面への細胞の接着を阻止する細
胞接触表面を有するウェルに接種し、またそのなかで培
養された場合には、未分化軟骨形成細胞はその細胞が再
分化し、軟骨特異的コラーゲンと硫酸化プロテオグリカ
ンを分泌することを開始し、それにより、in vitroにお
ける合成軟骨のパッチを形成することがみつかっている
（米国特許第5,902,741号と第5,723,331号）。
胞接触表面を有するウェルに接種し、またそのなかで培
養された場合には、未分化軟骨形成細胞はその細胞が再
分化し、軟骨特異的コラーゲンと硫酸化プロテオグリカ
ンを分泌することを開始し、それにより、in vitroにお
ける合成軟骨のパッチを形成することがみつかっている
（米国特許第5,902,741号と第5,723,331号）。
【００４６】さらに、事前形成したウェル中で細胞を培
養することにより、所定の厚さと容量を有する合成軟骨
パッチを製造することができることが判明している。し
かし、結果的に生じる軟骨のパッチの容量はウェルの容
量だけではなく、そのウェルに接種された軟骨形成細胞
の数にも依存することが分かっている。最適所定容量の
軟骨は、前述のいずれか、または両方のパラメータを変
更することにより、ルーチンの実験を行うことによって
作成することができる。
養することにより、所定の厚さと容量を有する合成軟骨
パッチを製造することができることが判明している。し
かし、結果的に生じる軟骨のパッチの容量はウェルの容
量だけではなく、そのウェルに接種された軟骨形成細胞
の数にも依存することが分かっている。最適所定容量の
軟骨は、前述のいずれか、または両方のパラメータを変
更することにより、ルーチンの実験を行うことによって
作成することができる。
【００４７】［Ａ．事前形成ウェルの作成］細胞接触表
面、細胞接着表面に事前形成ウェルを作成するいくつか
のアプローチが使用可能である。
面、細胞接着表面に事前形成ウェルを作成するいくつか
のアプローチが使用可能である。
【００４８】ウェルの細胞接触表面は、細胞接触表面へ
の軟骨形成細胞の接着を阻止する分子で被膜される。好
適な被膜試薬には、シリコンをベースにした試薬、ジク
ロロジメチルシランまたはポリテトラフルオロエチレン
を主成分とした試薬、例えば、Teflon.RTMが含まれる。
シリコンを主成分とした試薬、とくにジクロロジメチル
シランによる被膜材料に関する手順は当業者には周知で
ある。これについては、例えば、Sambrookら『分子クロ
ーニング：ラボマニュアル（“Molecular Cloning: A L
aboratory Manual”）』、Cold Spring Harbor Laborat
ory Press社刊、1989年を参照のこと。これは本出願に
引用することにより本発明の一部をなすものとする。
ウェルの表面に細胞が付着するのを防ぐほかの生体適合
性を有する試薬であれば、本発明の実施において有用で
あると考えられる。
の軟骨形成細胞の接着を阻止する分子で被膜される。好
適な被膜試薬には、シリコンをベースにした試薬、ジク
ロロジメチルシランまたはポリテトラフルオロエチレン
を主成分とした試薬、例えば、Teflon.RTMが含まれる。
シリコンを主成分とした試薬、とくにジクロロジメチル
シランによる被膜材料に関する手順は当業者には周知で
ある。これについては、例えば、Sambrookら『分子クロ
ーニング：ラボマニュアル（“Molecular Cloning: A L
aboratory Manual”）』、Cold Spring Harbor Laborat
ory Press社刊、1989年を参照のこと。これは本出願に
引用することにより本発明の一部をなすものとする。
ウェルの表面に細胞が付着するのを防ぐほかの生体適合
性を有する試薬であれば、本発明の実施において有用で
あると考えられる。
【００４９】代替的には、ウェルは細胞それ自体の付着
は許容しない柔軟で型作成可能な生体適合性を有する材
料から型をとることが可能である。こうした細胞の付着
を防ぐ好適な材料には、アガロース、ガラス、未処理細
胞培養プラスチックとポリテトラフルオロエチレン、す
なわち、Teflon.RTMが含まれるがそれらに限定されな
い。未処理細胞培養プラスチック、すなわち静電気電荷
を有する材料により処理されていない、またはそうした
材料で作られていないプラスチックは市販されていて入
手可能であり、例えば、Falcon Labware社、Becton Dic
kinson社、Lincoln Park社（ニュージャージー州）から
購買可能である。しかし、前述の材料に限定することは
意図していない。軟骨形成細胞の付着を本質的に阻止す
る生体適合性を有する柔軟または型を作成することが可
能な、いずれかのほかの材料は本発明の実施に有用であ
ると考えられる。
は許容しない柔軟で型作成可能な生体適合性を有する材
料から型をとることが可能である。こうした細胞の付着
を防ぐ好適な材料には、アガロース、ガラス、未処理細
胞培養プラスチックとポリテトラフルオロエチレン、す
なわち、Teflon.RTMが含まれるがそれらに限定されな
い。未処理細胞培養プラスチック、すなわち静電気電荷
を有する材料により処理されていない、またはそうした
材料で作られていないプラスチックは市販されていて入
手可能であり、例えば、Falcon Labware社、Becton Dic
kinson社、Lincoln Park社（ニュージャージー州）から
購買可能である。しかし、前述の材料に限定することは
意図していない。軟骨形成細胞の付着を本質的に阻止す
る生体適合性を有する柔軟または型を作成することが可
能な、いずれかのほかの材料は本発明の実施に有用であ
ると考えられる。
【００５０】ウェルの大きさと形状は、修復される関節
軟骨欠損の大きさと形状により決めることができる。例
えば、ウェルは25 cm2の断面の表面積を有することが企
図されている。これは、成人、ヒト大腿軟骨の平均的な
断面の表面積である。したがって、合成軟骨の単一断片
は、大腿軟骨全体を再び表面加工するために、本発明に
より作成することが予期される。ウェルの深さは好適に
は約0.3 cmよりも深く、また好適には深さ約0.6 cmであ
る。成人関節にある天然の関節軟骨の厚さは通常約0.3
cmである。したがって、ウェルの深さは、約0.3 cmの軟
骨パッチが形成可能となるのに十分な寸法とすべきであ
る。しかし、ウェルはその軟骨パッチを覆う増殖培地を
包み込むのに十分な深さのものとすべきである。
軟骨欠損の大きさと形状により決めることができる。例
えば、ウェルは25 cm2の断面の表面積を有することが企
図されている。これは、成人、ヒト大腿軟骨の平均的な
断面の表面積である。したがって、合成軟骨の単一断片
は、大腿軟骨全体を再び表面加工するために、本発明に
より作成することが予期される。ウェルの深さは好適に
は約0.3 cmよりも深く、また好適には深さ約0.6 cmであ
る。成人関節にある天然の関節軟骨の厚さは通常約0.3
cmである。したがって、ウェルの深さは、約0.3 cmの軟
骨パッチが形成可能となるのに十分な寸法とすべきであ
る。しかし、ウェルはその軟骨パッチを覆う増殖培地を
包み込むのに十分な深さのものとすべきである。
【００５１】本発明により作成される軟骨の大きな断片
は、損傷を受けた軟骨の外科的修復を行う外科医により
事前に選択された大きさと形状に「トリミング（採寸し
て切断する）」することが企図されている。トリミング
は、当業者には周知の手順を使用して、鋭利な切断用
具、すなわち、小刀、ハサミ、または断端に適する関節
鏡装置を使用することにより行われる。
は、損傷を受けた軟骨の外科的修復を行う外科医により
事前に選択された大きさと形状に「トリミング（採寸し
て切断する）」することが企図されている。トリミング
は、当業者には周知の手順を使用して、鋭利な切断用
具、すなわち、小刀、ハサミ、または断端に適する関節
鏡装置を使用することにより行われる。
【００５２】事前形成ウェルは好適には、無菌状態下で
アガロースゲルの塊になかで型取りされる。アガロース
は、事前形成ウェルを素早くかつ容易に型取りするのに
使用することができる経済的で、生体適合性があり、柔
軟かつ型を作成することが可能な材料である。上述され
ているように、ウェルの寸法は、所望され、結果的に決
まった軟骨栓の大きさによる。
アガロースゲルの塊になかで型取りされる。アガロース
は、事前形成ウェルを素早くかつ容易に型取りするのに
使用することができる経済的で、生体適合性があり、柔
軟かつ型を作成することが可能な材料である。上述され
ているように、ウェルの寸法は、所望され、結果的に決
まった軟骨栓の大きさによる。
【００５３】自然形成ウェルは、溶解したLTアガロース
（BioRad社、カリフォルニア州リッチモンド市）の高温
溶液を、シリンダーを含む組織培養株に注ぎ込むことに
より、作成することが考えられる。シリンダーは形成さ
れるウェルの形状を映す寸法を有する。ウェルの大きさ
と形状は熟練した技術者により選択され、修復される関
節軟骨欠損の形状による。一旦アガロースがシリンダー
のまわりで冷やされ、固形化されると、そのシリンダー
が鉗子により注意深く外される。シリンダーの除去によ
り露呈される組織培養皿の表面は溶解アガロースにより
覆われる。これによりウェルの底を密封し、またウェル
の基底部にある細胞接着表面を提供する。新たに加えら
れた溶解したLTアガロースが冷却されて、固形化される
と、その結果生じる事前形成ウェルは培養ならびに増殖
された軟骨形成細胞の再分化を刺激するのに適当なもの
となる。しかし、代替的な方法が、本発明の実施におい
ては有用である事前形成ウェルを作成するのに使用でき
ることが分かっている。
（BioRad社、カリフォルニア州リッチモンド市）の高温
溶液を、シリンダーを含む組織培養株に注ぎ込むことに
より、作成することが考えられる。シリンダーは形成さ
れるウェルの形状を映す寸法を有する。ウェルの大きさ
と形状は熟練した技術者により選択され、修復される関
節軟骨欠損の形状による。一旦アガロースがシリンダー
のまわりで冷やされ、固形化されると、そのシリンダー
が鉗子により注意深く外される。シリンダーの除去によ
り露呈される組織培養皿の表面は溶解アガロースにより
覆われる。これによりウェルの底を密封し、またウェル
の基底部にある細胞接着表面を提供する。新たに加えら
れた溶解したLTアガロースが冷却されて、固形化される
と、その結果生じる事前形成ウェルは培養ならびに増殖
された軟骨形成細胞の再分化を刺激するのに適当なもの
となる。しかし、代替的な方法が、本発明の実施におい
ては有用である事前形成ウェルを作成するのに使用でき
ることが分かっている。
【００５４】［Ｂ．軟骨パッチの増殖］懸濁液中の増殖
軟骨形成細胞は事前形成ウェルに接種され、またそのな
かで培養される。細胞は細胞培養培地を加えることによ
って希釈され、約1ｘ105〜1ｘ109軟骨形成細胞/mlの細
胞密度にされる。1つの好適な細胞培養培地は、10％の
ウシ胎児血清により補給されるDMEMを含む。
軟骨形成細胞は事前形成ウェルに接種され、またそのな
かで培養される。細胞は細胞培養培地を加えることによ
って希釈され、約1ｘ105〜1ｘ109軟骨形成細胞/mlの細
胞密度にされる。1つの好適な細胞培養培地は、10％の
ウシ胎児血清により補給されるDMEMを含む。
【００５５】ウェルに軟骨形成細胞を接種してから約4
時間以内に、それらの細胞は細胞の凝縮栓を形成するた
めに融合される。約4〜10日後に、細胞は軟骨特異的硫
酸化プロテオグリカンとII型コラーゲンを分泌しはじめ
る。培養期間を延長した後、ウェルのなかで軟骨形成細
胞により発現したコラーゲンは主にII型コラーゲンであ
る。しかし、4時間以内に形成された細胞の凝縮栓はウ
ェルから取り除かれ、軟骨欠損に外科的に移植される。
未分化軟骨形成細胞が引き続き、生体内で再分化され
て、それによって合成軟骨がその関節内で形成されるこ
とが期待される。
時間以内に、それらの細胞は細胞の凝縮栓を形成するた
めに融合される。約4〜10日後に、細胞は軟骨特異的硫
酸化プロテオグリカンとII型コラーゲンを分泌しはじめ
る。培養期間を延長した後、ウェルのなかで軟骨形成細
胞により発現したコラーゲンは主にII型コラーゲンであ
る。しかし、4時間以内に形成された細胞の凝縮栓はウ
ェルから取り除かれ、軟骨欠損に外科的に移植される。
未分化軟骨形成細胞が引き続き、生体内で再分化され
て、それによって合成軟骨がその関節内で形成されるこ
とが期待される。
【００５６】軟骨細胞分化または刺激因子を、プロテオ
グリカンまたはコラーゲンあるいはそれらの両方に特異
的な関節軟骨の産生を向上させるため、または刺激する
ために、事前形成ウェル中の軟骨形成細胞に加えること
が企図されている（『軟骨細胞の生物学的調節（“Biol
ogical Regulation of the Chondrocytes”）』、CRCPr
ess社刊、Boca Raton, Ann arbor, London, Tokyo, 199
2のなかのLuytenとReddi執筆部分、227〜236頁）。好適
な成長因子には、トランスフォーミング成長因子β（TG
F-β）、インスリン様成長因子（IGF）、血小板由来成
長因子(PDGF)、表皮性成長因子（EGF）、酸性線維芽細
胞成長因子（aFBF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFB
F）、肝細胞成長因子（HGF）、角化細胞成長因子(KG
F)、骨形態形成因子(BMPs)、すなわち、BMP-1、BMP-2、
BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6と、骨形成タンパク質(OP
s)、すなわち、OP-1、OP-2、OP-3が含まれるが、それら
に限定されない。TGF-β、IGF、PDGF、EGF、 aFBF、bFB
F、HGF、KGF、BMPsの好適な濃度は約1〜100 ng/mlの範
囲である。DMPとOpsの好適な濃度は、約1〜約500 ng/ml
の範囲である。
グリカンまたはコラーゲンあるいはそれらの両方に特異
的な関節軟骨の産生を向上させるため、または刺激する
ために、事前形成ウェル中の軟骨形成細胞に加えること
が企図されている（『軟骨細胞の生物学的調節（“Biol
ogical Regulation of the Chondrocytes”）』、CRCPr
ess社刊、Boca Raton, Ann arbor, London, Tokyo, 199
2のなかのLuytenとReddi執筆部分、227〜236頁）。好適
な成長因子には、トランスフォーミング成長因子β（TG
F-β）、インスリン様成長因子（IGF）、血小板由来成
長因子(PDGF)、表皮性成長因子（EGF）、酸性線維芽細
胞成長因子（aFBF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFB
F）、肝細胞成長因子（HGF）、角化細胞成長因子(KG
F)、骨形態形成因子(BMPs)、すなわち、BMP-1、BMP-2、
BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6と、骨形成タンパク質(OP
s)、すなわち、OP-1、OP-2、OP-3が含まれるが、それら
に限定されない。TGF-β、IGF、PDGF、EGF、 aFBF、bFB
F、HGF、KGF、BMPsの好適な濃度は約1〜100 ng/mlの範
囲である。DMPとOpsの好適な濃度は、約1〜約500 ng/ml
の範囲である。
【００５７】しかし、これらの特定の成長因子は限定的
なものではない。軟骨特異的プロテオグリカンとコラー
ゲンの産生を刺激または誘導することができるいずれか
のポリペプチド成長因子は本発明の実施において有用で
ある。
なものではない。軟骨特異的プロテオグリカンとコラー
ゲンの産生を刺激または誘導することができるいずれか
のポリペプチド成長因子は本発明の実施において有用で
ある。
【００５８】さらに、軟骨特異的プロテオグリカンとコ
ラーゲンの産生を向上するかまたは刺激するために、事
前形成ウェルのなかの軟骨形成細胞に、アスコルビン酸
を加えることが企図されている。アスコルビン酸の好適
な濃度は、約1〜約1000 μg/mlの範囲である。
ラーゲンの産生を向上するかまたは刺激するために、事
前形成ウェルのなかの軟骨形成細胞に、アスコルビン酸
を加えることが企図されている。アスコルビン酸の好適
な濃度は、約1〜約1000 μg/mlの範囲である。
【００５９】［実施例3：関節軟骨欠損の外科的修復］
哺乳動物における軟骨欠損は関節鏡検査時に、または関
節の開放手術時に視覚的に容易に確認可能である。軟骨
欠損はまた、コンピュータ補助断層撮影法（CATスキャ
ン）、Ｘ線検査、磁気共鳴画像(MRI)、滑液または血清
マーカーの分析により、あるいはほかの当業者には公知
の手法により推論的に同定できる。その欠損の治療は、
本出願に開示されている諸方法と成分を使用して関節鏡
または開放手術手順時に効果を発揮できる。
哺乳動物における軟骨欠損は関節鏡検査時に、または関
節の開放手術時に視覚的に容易に確認可能である。軟骨
欠損はまた、コンピュータ補助断層撮影法（CATスキャ
ン）、Ｘ線検査、磁気共鳴画像(MRI)、滑液または血清
マーカーの分析により、あるいはほかの当業者には公知
の手法により推論的に同定できる。その欠損の治療は、
本出願に開示されている諸方法と成分を使用して関節鏡
または開放手術手順時に効果を発揮できる。
【００６０】したがって、一旦欠損が確認されたら、そ
の欠損は以下のステップにより治療できる。すなわち、
（1）本出願で開示されている方法により作成された合
成関節軟骨の移植片が所定の部位に外科的に移植され、
（2）所定の部位に合成関節軟骨を一体化できる。
の欠損は以下のステップにより治療できる。すなわち、
（1）本出願で開示されている方法により作成された合
成関節軟骨の移植片が所定の部位に外科的に移植され、
（2）所定の部位に合成関節軟骨を一体化できる。
【００６１】合成軟骨パッチは最適には、パッチが欠損
部に移植される場合には、移植される組織の各端部がそ
の欠損部の各端部に直接接触するような大きさと形状を
有する。さらに付け加えると、合成軟骨パッチは、外科
手術時に所定の箇所に固定される。これは、生体内で分
解可能な縫合、すなわち、(Ethicon、Johnson＆Johnson
社)により、またはそのパッチとその欠損部の間の領域
に生体接着剤を適用することにより、あるいはそれらの
両方により、その欠損部中にパッチを外科的に固定する
ことでその効果を発揮する。好適な生体接着剤には、フ
ランス特許第2,448,900号、フランス特許第2,448,901
号、スペイン特許出願第88401961.3号に開示されている
ものに類似のフィブリン‐トロンビン接着剤、および米
国特許第5,197,973号に開示されているものに類似の合
成生体接着剤が含まれるが、それらに限定されない。し
かし、縫合の代替的なタイプと生体適合性のある接着剤
は本発明の実施において有用である。
部に移植される場合には、移植される組織の各端部がそ
の欠損部の各端部に直接接触するような大きさと形状を
有する。さらに付け加えると、合成軟骨パッチは、外科
手術時に所定の箇所に固定される。これは、生体内で分
解可能な縫合、すなわち、(Ethicon、Johnson＆Johnson
社)により、またはそのパッチとその欠損部の間の領域
に生体接着剤を適用することにより、あるいはそれらの
両方により、その欠損部中にパッチを外科的に固定する
ことでその効果を発揮する。好適な生体接着剤には、フ
ランス特許第2,448,900号、フランス特許第2,448,901
号、スペイン特許出願第88401961.3号に開示されている
ものに類似のフィブリン‐トロンビン接着剤、および米
国特許第5,197,973号に開示されているものに類似の合
成生体接着剤が含まれるが、それらに限定されない。し
かし、縫合の代替的なタイプと生体適合性のある接着剤
は本発明の実施において有用である。
【００６２】いくつかの例では、損傷を受けた関節軟骨
は合成軟骨パッチ移植の前に外科的に切除されることが
考えられる。さらに、関節軟骨欠損に対する合成軟骨パ
ッチの接着は、トランスグルタミナーゼによる欠損の治
療により促進される（Ichinoseら(1990)J. Biol. Chem.
265(3):134411-13414; 『トランスグルタミナーゼ
（“Transglutaminases”）』、Martinuse‐Nijhoff社
刊、ボストン、のなかのNajjarら(1984)の執筆部分）。
最初に、軟骨欠損部を例えば、綿様のものを使用するこ
とにより、またトランスグルタミナーゼの溶液を充填す
ることにより乾燥させる。その溶液はその後に例えば、
吸引により除去されるが、軟骨上にトランスグルタミナ
ーゼを含んでいるフィルムをおいて置く。合成軟骨パッ
チは上述の方法によりその欠損部中にその後に移植され
る。
は合成軟骨パッチ移植の前に外科的に切除されることが
考えられる。さらに、関節軟骨欠損に対する合成軟骨パ
ッチの接着は、トランスグルタミナーゼによる欠損の治
療により促進される（Ichinoseら(1990)J. Biol. Chem.
265(3):134411-13414; 『トランスグルタミナーゼ
（“Transglutaminases”）』、Martinuse‐Nijhoff社
刊、ボストン、のなかのNajjarら(1984)の執筆部分）。
最初に、軟骨欠損部を例えば、綿様のものを使用するこ
とにより、またトランスグルタミナーゼの溶液を充填す
ることにより乾燥させる。その溶液はその後に例えば、
吸引により除去されるが、軟骨上にトランスグルタミナ
ーゼを含んでいるフィルムをおいて置く。合成軟骨パッ
チは上述の方法によりその欠損部中にその後に移植され
る。
【００６３】さらに、合成軟骨はヒト関節軟骨欠損の修
復に有用である。したがって、軟骨形成細胞は、ヒト脂
肪組織由来の間質細胞、すなわちヒト皮下脂肪組織から
分化されることが考えられる。
復に有用である。したがって、軟骨形成細胞は、ヒト脂
肪組織由来の間質細胞、すなわちヒト皮下脂肪組織から
分化されることが考えられる。
【００６４】関節軟骨欠損の修復に効果を発揮する外科
手術は、当業者には周知のものである。これについて
は、例えば、その内容開示が本出願に参考文献として組
み入れられている『軟骨細胞の生物学的調節（“Biolog
ical Regulation of the Chondrocytes”）』、CRC Pre
ss社刊、Boca Raton, Ann arbor, London, Tokyo, 199
2、のLuytenとReddi執筆部分、227〜236頁）を参照のこ
と。
手術は、当業者には周知のものである。これについて
は、例えば、その内容開示が本出願に参考文献として組
み入れられている『軟骨細胞の生物学的調節（“Biolog
ical Regulation of the Chondrocytes”）』、CRC Pre
ss社刊、Boca Raton, Ann arbor, London, Tokyo, 199
2、のLuytenとReddi執筆部分、227〜236頁）を参照のこ
と。
【００６５】上記の部分には、ヒト脂肪組織由来の間質
細胞が肥厚性軟骨細胞に分化する培養システムを示して
いる。すべての構成要素が規定されるため、そのシステ
ムは、軟骨形成の進行に関して、成長因子などの効果を
研究するために使用することができる。In vitroシステ
ムは、これらの細胞集団が骨形成ならびに脂肪細胞の潜
在能力を有することを示すために、われわれならびにほ
かの人々により使用されてきた。われわれはここでこの
集団が軟骨形成能力を有していることを示す。これは臨
床上の軟骨修復に適用可能である。
細胞が肥厚性軟骨細胞に分化する培養システムを示して
いる。すべての構成要素が規定されるため、そのシステ
ムは、軟骨形成の進行に関して、成長因子などの効果を
研究するために使用することができる。In vitroシステ
ムは、これらの細胞集団が骨形成ならびに脂肪細胞の潜
在能力を有することを示すために、われわれならびにほ
かの人々により使用されてきた。われわれはここでこの
集団が軟骨形成能力を有していることを示す。これは臨
床上の軟骨修復に適用可能である。
【００６６】本発明はまた、間質細胞が3次元フォーマ
ットにおいて関連性を有しているinvitroでの軟骨誘導
性薬剤をこうした細胞に接触させることにより、ヒト脂
肪組織由来間質細胞における軟骨形成を誘導するための
プロセスを提供する。
ットにおいて関連性を有しているinvitroでの軟骨誘導
性薬剤をこうした細胞に接触させることにより、ヒト脂
肪組織由来間質細胞における軟骨形成を誘導するための
プロセスを提供する。
【００６７】本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物の軟骨
組織の修復において脂肪誘導間質細胞からin vitroで分
化させた軟骨細胞を使用するためのプロセスを提供す
る。
組織の修復において脂肪誘導間質細胞からin vitroで分
化させた軟骨細胞を使用するためのプロセスを提供す
る。
【００６８】上記の方法において、間質細胞は好適に分
離され、化学的に規定された環境において増殖ヒト脂肪
組織由来の間質細胞を培養し、また、3次元細胞塊、例
えば、パッケージ細胞または遠心分離細胞ペレットの形
態などで、密に細胞が互いに接近する状態に濃縮され
る。さらに、その接触は好適には10％の血清、50 ng/ml
のアスコルビン酸-2-リン酸、10‐7Mのデキサメタゾン
を加えたDMEMを含む化学的に規定された培地のなかで、
ヒト脂肪組織由来の間質細胞のペレットを培養すること
を含む。分化細胞はその後に、軟骨を修復するために外
科手術部位に導入される。そのシステムのすべての構成
要素は規定されているため、このシステムは、ヒトなら
びにウマを含む哺乳動物における軟骨修復用製品とし
て、使用することができる。
離され、化学的に規定された環境において増殖ヒト脂肪
組織由来の間質細胞を培養し、また、3次元細胞塊、例
えば、パッケージ細胞または遠心分離細胞ペレットの形
態などで、密に細胞が互いに接近する状態に濃縮され
る。さらに、その接触は好適には10％の血清、50 ng/ml
のアスコルビン酸-2-リン酸、10‐7Mのデキサメタゾン
を加えたDMEMを含む化学的に規定された培地のなかで、
ヒト脂肪組織由来の間質細胞のペレットを培養すること
を含む。分化細胞はその後に、軟骨を修復するために外
科手術部位に導入される。そのシステムのすべての構成
要素は規定されているため、このシステムは、ヒトなら
びにウマを含む哺乳動物における軟骨修復用製品とし
て、使用することができる。
【図１】図１は、単層培養由来のヒト脂肪間質細胞にお
けるII型コラーゲンの免疫検出を示す。上のパネルでは
位相差顕微鏡法が使用されており、下のパネルでは免疫
蛍光法が使用されている。
けるII型コラーゲンの免疫検出を示す。上のパネルでは
位相差顕微鏡法が使用されており、下のパネルでは免疫
蛍光法が使用されている。
【図２】ペレット培養由来のヒト脂肪間質細胞における
II型コラーゲンの免疫検出を示す。上のパネルでは位相
差顕微鏡法が使用されており、下のパネルでは免疫蛍光
法が使用されている。
II型コラーゲンの免疫検出を示す。上のパネルでは位相
差顕微鏡法が使用されており、下のパネルでは免疫蛍光
法が使用されている。
【図３】アルギナート培養由来のヒト脂肪間質細胞にお
けるII型コラーゲンの免疫検出を示す。上のパネルでは
位相差顕微鏡法が使用されている。下のパネルでは免疫
蛍光法が使用されている。
けるII型コラーゲンの免疫検出を示す。上のパネルでは
位相差顕微鏡法が使用されている。下のパネルでは免疫
蛍光法が使用されている。
【図４】図４は、TGF‐βの非存在下（対照実験）、TGF
‐βの存在下で2週間アルギナートマトリックス中で細
胞が培養されたときのVI型コラーゲン発現を示す。
‐βの存在下で2週間アルギナートマトリックス中で細
胞が培養されたときのVI型コラーゲン発現を示す。
【図５】図５は、細胞が単層として増殖された場合、ま
たはVI型コラーゲン、リンクタンパク質、アグレカン、
I型コラーゲン、アクチンを含む、異なったタンパク質
の発現のためのアルギナートにおいて増殖された場合の
ウエスタンブロットの結果を示す。
たはVI型コラーゲン、リンクタンパク質、アグレカン、
I型コラーゲン、アクチンを含む、異なったタンパク質
の発現のためのアルギナートにおいて増殖された場合の
ウエスタンブロットの結果を示す。
フロントページの続き (72)発明者 ウィリアム・オー・ウィルキソン アメリカ合衆国ノースカロライナ州27503, バハマ，ギャロップ・レイン 9706 (72)発明者 ジェフリー・エム・ギンブル アメリカ合衆国ノースカロライナ州27516, チャペル・ヒル，グレンモア・ロード 216
Claims (18)
- 【請求項１】 (i)成熟した軟骨細胞の表現型につなが
る任意の細胞の形質導入経路を活性化させることができ
る軟骨誘導薬剤と、(ii)抗生物質と、(iii)1〜20％のウ
シ胎児血清または1〜20％のウマ血清、またはほかの生
物学的なタンパク質あるいは合成タンパク質の等価の組
み合わせなどの栄養分補給と、(iv)アスコルビン酸また
は関連のあるビタミンＣ類似体と、（v）グルココルチ
コイドとにより補給されているかまたはこれらを有する
化学的に規定された培養培地を含むことを特徴とする、
脂肪組織由来の間質細胞の軟骨細胞への分化用培地。 - 【請求項２】 前記軟骨誘導薬剤または間質細胞分裂促
進因子が、グルココルチコイド、トランスフォーミング
成長因子βスーパーファミリーの一員、コラーゲン性細
胞外マトリックス分子、ビタミンＡ類似体からなる群か
ら個別にまたは組み合わせて選択されることを特徴とす
る請求項１に記載の培地。 - 【請求項３】 前記抗生物質がペニシリンであることを
特徴とする請求項１に記載の培地。 - 【請求項４】 前記抗生物質がストレプトマイシンであ
ることを特徴とする請求項１に記載の培地。 - 【請求項５】 前記ペニシリンの濃度が約10〜約200単
位/mlであることを特徴とする請求項３に記載の培地。 - 【請求項６】 前記ストレプトマイシンの濃度が約10〜
約200μg/mlであることを特徴とする請求項４に記載の
培地。 - 【請求項７】 前記グルココルチコイドがヒドロコルチ
ゾンであることを特徴とする請求項２に記載の培地。 - 【請求項８】 前記グルココルチコイドがデキサメタゾ
ンであることを特徴とする請求項２に記載の培地。 - 【請求項９】 前記デキサメタゾンの濃度が約1〜約100
nMであることを特徴とする請求項８に記載の培地。 - 【請求項１０】 ヒドロコルチゾンの濃度が約1〜約100
nMであることを特徴とする請求項７に記載の培地。 - 【請求項１１】 前記トランスフォーミング成長因子β
が、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質4、
TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、IGF、PDGF、EGF、aFBF、b
FBF、HGF、KGF、インヒビンＡ、軟骨形成刺激因子（cho
ndrogenic stimulating factor）からなる群から選択さ
れることを特徴とする請求項２に記載の培地。 - 【請求項１２】 前記トランスフォーミング成長因子β
の濃度が約1〜100 ng/mlであることを特徴とする請求項
１１に記載の培地。 - 【請求項１３】 TGF-β1を約1 ng/ml〜10 ng/mlの濃度
でさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方
法。 - 【請求項１４】 前記コラーゲン性細胞外マトリックス
分子がI型コラーゲンであることを特徴とする請求項２
に記載の培地。 - 【請求項１５】 前記ビタミンＡ類似体がレチン酸であ
ることを特徴とする請求項２に記載の培地。 - 【請求項１６】 前記レチン酸の濃度が約0.1 ng/ml〜
約1 μg/mlであることを特徴とする請求項１５に記載の
培地。 - 【請求項１７】 ａ） ダルベッコ変法イーグル培地(D
MEM)またはアルファ改変最少必須培地（α-MEM）または
ローズウエルパーク記念研究所培地1640（RPMI培地164
0）のような培地を含む無菌試験管中で、50,000〜500万
の間の細胞数で2〜20分間500Xgで遠心分離することによ
り、前記間質細胞をペレット化するステップと、 ｂ） 分化用培地に500〜20,000細胞/cm2の密度で分離
された間質細胞を置くステップと、 ｃ） (i) 成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意
の細胞の形質導入経路を活性化させることができる軟骨
誘導薬剤と、 (ii) 抗生物質と、 (iii) 1〜20％のウシ胎児血清または1〜20％のウマ血
清、またはほかの生物学的なタンパク質または合成タン
パク質の等価の組み合わせなどにより補給される栄養分
と、 (iv) アスコルビン酸または関連のあるビタミンＣ類似
体と、 (v) グルココルチコイドまたは細胞のグルココルチコ
イド受容体を活性化させることができるほかの化学的薬
剤とを前記培地に補給するステップと、 （ｄ） 約31℃〜37℃にて約3〜4週間、5％のCO2と1％
から20％の間の酸素中で該細胞をインキュベーションす
るステップとを含むことを特徴とする脂肪組織由来の間
質細胞の軟骨細胞への分化方法。 - 【請求項１８】 a) 3次元形態において軟骨形成を支
えるカルシウムアルギナートまたは他の生体適合性のあ
る格子またはマトリックス中に50万〜1000万細胞／ｍｌ
という密度で間質細胞を懸濁するステップと、 b) 35 mmの培養皿に細胞を移し、 (i) 成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞
の形質導入経路を活性 化させることができる軟骨誘導薬剤と、(ii) 抗生物質
と、 (iii) 1〜20％のウシ胎児血清または1〜20％のウマ血
清、またはそのほかの生物学的タンパク質または合成タ
ンパク質の等価の組み合わせにより補給される栄養分
と、 (iv) アスコルビン酸または関連のあるビタミンＣ類似
体と、 (v) グルココルチコイド、または細胞のグルココルチ
コイド受容体を活性化させることができるほかの化学的
薬剤とを有するかまたはこれらによって補給される化学
的に規定されている培養培地を含む分化用培地に500〜2
0,000細胞/cm2の密度で細胞を置くステップと、 c) 約31℃〜37℃にて約3〜4週間、5％のCO2と1％〜20
％の酸素中で該細胞をインキュベーションするステップ
とを含むことを特徴とする脂肪組織由来の間質細胞の軟
骨細胞への分化方法。
Applications Claiming Priority (4)
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|---|---|---|---|
| US14985099P | 1999-08-19 | 1999-08-19 | |
| US60/149850 | 2000-05-17 | ||
| US09/573989 | 2000-05-17 | ||
| US09/573,989 US6429013B1 (en) | 1999-08-19 | 2000-05-17 | Use of adipose tissue-derived stromal cells for chondrocyte differentiation and cartilage repair |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP4294207B2 JP4294207B2 (ja) | 2009-07-08 |
Family
ID=26847093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000250009A Expired - Fee Related JP4294207B2 (ja) | 1999-08-19 | 2000-08-21 | 軟骨細胞分化と軟骨修復のための脂肪組織由来の間質細胞の使用 |
Country Status (9)
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