JP2001089493A - Ｉｌ−１２産生抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＩＬ−１２の産生を効果的に抑制できるＩＬ
−１２産生抑制剤を提供する。 【解決手段】 ケラタン硫酸オリゴ糖又はその誘導体を
有効成分とする。ケラタン硫酸オリゴ糖は、好ましく
は、少なくとも下記式で表される二糖を繰返し構成単位
として含むことを特徴とする。 Gal(6S)-GlcNAc(6S) （式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセ
チルグルコサミン残基を、6Sは6位のヒドロキシル基が6
-O-硫酸エステルとなっていることを、-はグリコシド結
合をそれぞれ表す）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インターロイキン
１２（ＩＬ−１２）産生抑制剤およびＩＬ−１２産生抑
制剤の有効成分として有用なケラタン硫酸オリゴ糖の誘
導体に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＩＬ−１２は、３５ｋＤおよび４０ｋＤ
の二つのポリペプチド鎖が結合してなる７０ｋＤの糖タ
ンパク質（ｐ７０）からなるサイトカインであり、生体
の免疫機能の調節において中心的役割を果たしているこ
とが知られている（笠倉新平編、「サイトカイン」、第
２版改定新版、第207〜225頁、株式会社日本医学館発
行、1997年6月29日）。

【０００３】ＩＬ−１２は、ヘルパーＴ細胞のＴヘルパ
ー１細胞サブセット（Ｔｈ１）の分化誘導に働くため、
Ｔｈ１の活性化が関連する自己免疫疾患では、病態の進
行に促進的に働くことが知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＩＬ−１２
の産生を効果的に抑制できるＩＬ−１２産生抑制剤を提
供することを目的とする。また本発明は、ＩＬ−１２産
生抑制剤の有効成分を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ケラタン
硫酸オリゴ糖およびその誘導体にＩＬ−１２産生を抑制
する作用があることを見い出し、本発明を完成した。

【０００６】本発明は、ケラタン硫酸オリゴ糖またはそ
の誘導体を有効成分とする、ＩＬ−１２産生抑制剤（以
下、本発明抑制剤ともいう）を提供する。

【０００７】本発明抑制剤におけるケラタン硫酸オリゴ
糖は、好ましくは、下記式で表される二糖のいずれかを
繰返し構成単位として少なくとも１単位以上含む。 Gal(6S)-GlcNAc(6S) および Gal(6S)-GlcNAc （式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセ
チルグルコサミン残基を、6Sは6位のヒドロキシル基が6
-O-硫酸エステルとなっていることを、-はグリコシド結
合をそれぞれ表す）

【０００８】さらに好ましくは、ケラタン硫酸オリゴ糖
は、下記式(1)〜(3)で表されるものから選ばれるもので
ある。

【０００９】

【化４】 Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) 式(1) Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) 式(2) Gal(6S)β1-4GlcNAc 式(3) （式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセ
チルグルコサミン残基を、6Sは6位のヒドロキシル基が6
-O-硫酸エステルとなっていることを、β1-4はβ1,4グ
リコシド結合を、β1-3はβ1,3グリコシド結合をそれぞ
れ表す）

【００１０】本発明抑制剤において、ケラタン硫酸オリ
ゴ糖の誘導体は、好ましくは、ヒドロキシル基における
アシル化誘導体であり、より好ましくは、式(4)で示さ
れるものである。

【００１１】

【化５】 （式中、Ｘ¹〜Ｘ⁵は、それぞれ独立して、水素原子また
はアシル基であり、Ｘ¹〜Ｘ⁵の少なくとも一つはアシル
基であり、Ｙは水素原子またはＳＯ₃Ｍであり、Ｍは、
それぞれ独立して、水素原子、又は電離していてもよい
１価〜３価の金属もしくは１価〜３価の塩基であり、波
線で示した結合はα−グリコシド配位またはβ−グリコ
シド配位を示す。）

【００１２】一般式(4)において、好ましくは、Ｘ¹〜Ｘ
⁵がいずれも炭素数１〜１０のアシル基であり、Ｍがア
ルカリ金属である。

【００１３】また本発明は、上記一般式(4)で示され
る、ケラタン硫酸オリゴ糖の誘導体（以下、本発明誘導
体ともいう）を提供する。

【００１４】本発明誘導体は、好ましくは、一般式(4)
において、Ｘ¹〜Ｘ⁵がいずれも炭素数１〜１０のアシル
基であり、Ｍはアルカリ金属である。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明抑制剤において用いる「ケ
ラタン硫酸オリゴ糖」は、ケラタン硫酸の基本構造（ガ
ラクトース残基またはガラクトース−６−Ｏ−硫酸残基
と、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはＮ−アセチル
グルコサミン−６−Ｏ−硫酸残基とが交互にグリコシド
結合した構造）を少なくとも含む二糖以上のオリゴ糖で
ある限りにおいて特に限定されない。ケラタン硫酸オリ
ゴ糖は、例えばケラタン硫酸を分解して得られる生成物
であってもよく、また例えばＮ−アセチルラクトサミン
が２単位以上結合してなるオリゴ糖等を硫酸化して得ら
れる生成物であってもよい。

【００１６】このようなケラタン硫酸オリゴ糖の中で
も、ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖（ケラタ
ン硫酸由来のオリゴ糖）が好ましく、ケラタン硫酸をエ
ンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン
硫酸分解酵素で分解して得られる分解生成物がより好ま
しい。

【００１７】なお、このケラタン硫酸オリゴ糖は、シア
ル酸残基及び／又はフコース残基を含んでいてもよい。
通常には、シアル酸残基は、α２，３又はα２，６グリ
コシド結合でガラクトース残基に結合し、フコース残基
は、α１，３グリコシド結合でＮ−アセチルグルコサミ
ン残基に結合する。

【００１８】通常には、ケラタン硫酸オリゴ糖は、Ｎ−
アセチルグルコサミン残基を還元末端に有する二〜十糖
のオリゴ糖であり、Ｎ−アセチルグルコサミン残基の６
位のヒドロキシル基は硫酸化されていてもされていなく
てもよく、ガラクトース残基の６位のヒドロキシル基は
硫酸化されているものがより好ましい。

【００１９】さらに好ましくは、ケラタン硫酸オリゴ糖
は、Gal(6S)-GlcNAc(6S)またはGal(6S)-GlcNAc（式中、
Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグル
コサミン残基を、6Sは6位のヒドロキシル基が6-O-硫酸
エステルとなっていることを、-はグリコシド結合をそ
れぞれ表す）で表される二糖を繰返し構成単位として少
なくとも１単位以上含むケラタン硫酸オリゴ糖である。

【００２０】さらに好ましくは、前記ケラタン硫酸オリ
ゴ糖は、式(1)で表されるオリゴ糖（以下、Ｌ４Ｌ４と
もいう）、式(2)で表されるオリゴ糖（以下、Ｌ４とも
いう）及び式(3)で表されるオリゴ糖（以下、Ｌ３とも
いう）から選ばれる。

【００２１】

【化６】 Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) 式(1) Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) 式(2) Gal(6S)β1-4GlcNAc 式(3) （式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセ
チルグルコサミン残基を、6Sは6位のヒドロキシル基が6
-O-硫酸エステルとなっていることを、β1-4はβ1,4グ
リコシド結合を、β1-3はβ1,3グリコシド結合をそれぞ
れ表す）

【００２２】本発明に用いられるケラタン硫酸オリゴ糖
は、電離した状態のもの、プロトンが付加した構造のも
のを包含する。またケラタン硫酸オリゴ糖の薬学的に許
容される塩も包含する。

【００２３】本明細書において、ケラタン硫酸オリゴ糖
の「誘導体」とは、通常には、ケラタン硫酸オリゴ糖の
ヒドロキシル基の水素原子の少なくとも一つ（好ましく
は全ヒドロキシル基の１０％以上）が、アシル基、好ま
しくはＯ−アシル基により置換されたもの（部分または
完全Ｏ−アシル化誘導体）であり、その薬学的に許容さ
れる塩も包含する。

【００２４】薬学的に許容される塩とは、例えば、ナト
リウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属
塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウ
ム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン
塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基
との塩のうち、薬学的に許容されるものであるが、これ
らに限定されるものではない。

【００２５】ケラタン硫酸オリゴ糖のヒドロキシル基の
水素原子を置換するアシル基は、好ましくは炭素数１〜
１０のアシル基、より好ましくは炭素数１〜１０の脂肪
族又は芳香族のアシル基、すなわちヘテロ原子を含むこ
ともあるアルカノイル基又はアロイル基であり、その例
としては、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチ
ル、トリフルオロアセチル、メトキシアセチル、プロピ
オニル、ｎ−ブチリル、（Ｅ）−２−メチルブテノイ
ル、イソブチリル、ペンタノイル、ベンゾイル、ｏ−
（ジブロモメチル）ベンゾイル、ｏ−（メトキシカルボ
ニル）ベンゾイル、２，４，６−トリメチルベンゾイ
ル、ｐ−トルオイル、ｐ−アニソイル、ｐ−クロロベン
ゾイル、ｐ−ニトロベンゾイルなどの基が挙げられる。
ケラタン硫酸オリゴ糖が複数のアシル基を有する場合に
は、それらのアシル基は互いに同一でも異なっていても
よい。

【００２６】ケラタン硫酸オリゴ糖の還元末端糖の１位
のヒドロキシル基の水素原子がアシル基により置換され
ている場合、そのＯ−アシル基の配位は、α−グリコシ
ド配位またはβ−グリコシド配位のいずれでもよいが、
α−グリコシド配位であることが好ましい。

【００２７】アシル化されたケラタン硫酸オリゴ糖は、
有機溶媒、脂質に対する溶解性の向上、生体膜透過性の
増大、経口投与した場合の消化管吸収量の増大等の利点
を有する。

【００２８】本発明抑制剤において、ケラタン硫酸オリ
ゴ糖の誘導体は、好ましくは、上記式(4)で示されるも
のである。なお、上記式(4)においてＭは、それぞれ独
立して、水素原子、又は電離していてもよい１価〜３価
の金属もしくは１価〜３価の塩基であり、電離している
場合は、スルホン酸基はマイナスイオンの状態になる。
さらに好ましくは、Ｘ¹〜Ｘ⁵のすべてがアセチル基であ
る。特に好ましいものは、下記式(5)で示される誘導体
である。

【００２９】

【化７】 （式中、Ａｃはアセチル基、Ｙは水素原子又はＳＯ₃Ｎ
ａ、波線で示した結合は、α−グリコシド配位またはβ
−グリコシド配位を示す。）

【００３０】本発明抑制剤中に含有されるケラタン硫酸
オリゴ糖またはその誘導体は、単一の種からなっていて
も、混合物であってもよい。例えば上記式(5)中の波線
で示した部分がα−グリコシド配位である物質の精製品
であってもよく、β−グリコシド配位である物質の精製
品であってもよく、これらの混合物であってもよい。

【００３１】本発明に使用されるケラタン硫酸オリゴ糖
は、例えばケラタン硫酸、好ましくは高硫酸化ケラタン
硫酸の緩衝溶液にエンド-β-N-アセチルグルコサミニダ
ーゼ型ケラタン硫酸分解酵素、例えばバチルス属細菌由
来のケラタナーゼ（II）（特開平２−５７１８２号公
報）、またはバチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株
由来のケラタン硫酸分解酵素（国際公開第WO96/16166
号）を作用させて分解した後、得られた分解物を分画す
ることにより得ることができる。得られたオリゴ糖は通
常の分離精製方法、例えば、エタノール沈殿、ゲル濾過
および陰イオン交換クロマトグラフィーにより、目的の
オリゴ糖を分離精製することができる。このような製造
方法の例は、国際公開第WO96/16973号に記載されてい
る。なお、原料となるケラタン硫酸は、主としてガラク
トースまたはガラクトース−６−Ｏ−硫酸とＮ−アセチ
ルグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン−６−
Ｏ−硫酸との二糖の繰り返し構造で構成され、動物種お
よび器官などによって硫酸含量が異なっているが、通常
はサメなどの軟骨魚類、クジラ、ウシなどの哺乳動物の
軟骨、骨や角膜などの生原料から製造されるものを用い
ることができる。

【００３２】原料として使用されるケラタン硫酸は、通
常入手できるものであればよく、特に限定されないが、
構成糖であるガラクトース残基が硫酸化された高硫酸化
ケラタン硫酸（構成二糖あたり１．５〜２分子の硫酸基
を含む高硫酸化ケラタン硫酸をケラタンポリ硫酸という
こともある）を用いることが好ましい。また、ガラクト
ース残基の硫酸基の位置として、６位が好ましい。この
ような高硫酸化ケラタン硫酸は、たとえば、サメなどの
軟骨魚類のプロテオグリカンから取得できる。また、市
販されているものを使用することもできる。

【００３３】また、このようにして得られたケラタン硫
酸オリゴ糖の硫酸基含量を、糖鎖の公知の脱硫酸化法や
硫酸化法によって適宜調整したものを、本発明に使用さ
れるケラタン硫酸オリゴ糖として用いてもよい。

【００３４】ケラタン硫酸オリゴ糖のヒドロキシル基の
水素原子のアシル基による置換は、糖のヒドロキシル基
の保護のために通常に行われるアシル化方法に従って行
うことができる。例えば、導入すべきアシル基の反応性
誘導体（アシル基に対応するカルボン酸の無水物（例え
ば、アセチル基を導入する場合は、無水酢酸、プロパノ
イル基を導入する場合は、無水プロピオン酸）、ハロゲ
ン化物など）と、適当な反応溶媒（ピリジン、ジオキサ
ン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、クロロホルム、ジクロ
ロメタン、メタノール、エタノール、水、およびこれら
の混合物など）中でケラタン硫酸オリゴ糖を常法によっ
て反応させることによってアシル基を導入することがで
きる。必要に応じて、ピリジン等の塩基触媒の存在下で
反応させることもできる。

【００３５】必要により、アシル化の程度を調整しても
よく、この調整は、上記のアシル化方法において部分的
にアシル化を行うか、または、アシル化されたケラタン
硫酸オリゴ糖からアシル基を部分的に除去することによ
って行うことができる。

【００３６】アシル基の除去は、メタノール性アンモニ
ア、濃アンモニア水、ナトリウムメトキシド、ナトリウ
ムエトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど
を用いて加水分解することによって行うことができる。
得られた誘導体は、逆相高速液体クロマトグラフィー等
で精製することができる。

【００３７】本発明抑制剤の有効成分であるケラタン硫
酸オリゴ糖またはその誘導体は、医薬として使用できる
程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を含
まないものであることが好ましい。

【００３８】本発明抑制剤は、ＩＬ−１２産生を抑制す
るのに有効であるので、ＩＬ−１２産生の抑制を目的と
する限り、適用可能な疾患は限定されない。ＩＬ−１２
産生の抑制が有効な疾患の例としては、ＩＬ−１２がそ
の病勢の進行に促進的に働く、Ｔｈ１の活性化が病因と
なる疾患がある。このような疾患として、具体的には、
接触性皮膚炎、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、アレルギー
性脳脊髄膜炎、インスリン依存性糖尿病、糖尿病、橋本
氏病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、シェーグレン
症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、サルコイドーシ
ス、乾癬、リポ多糖誘発肝壊死、半月体形成性腎炎、全
身性エリテマトーデスなどが挙げられる。従って本発明
抑制剤は、これらの疾患の処置剤としての思想も包含す
る。

【００３９】本発明抑制剤は、純然とした治療目的のみ
ならず、疾患の予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の
改善）等を目的として適用することができる。

【００４０】本発明においては、対象となる疾患の性質
や進行状況、投与方法などに応じて、任意の剤形を適宜
選択することができる。

【００４１】すなわち、本発明抑制剤は注射（静脈内、
筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経鼻、経口、経皮、
吸入などにより投与することができ、これらの投与方法
に応じて適宜製剤化することができる。選択し得る剤形
も特に限定されず、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁
液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒
剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローショ
ン剤、パスタ剤、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、ス
プレー剤、吸入散剤等から広く選択することができる。
また、これらの製剤調製にあたり、慣用の賦形剤、安定
化剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧調整剤、pH調整
剤、その他着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成
分を使用することができる。

【００４２】本発明抑制剤中の有効成分であるケラタン
硫酸オリゴ糖またはその誘導体の配合量ならびに本発明
抑制剤の投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使
用目的、患者の具体的症状、患者の体重、年齢、性別等
に応じて個別的に決定されるべき事項であり、特に限定
されないが、ケラタン硫酸オリゴ糖の臨床量としては成
人１日１回あたり５０〜５０００mgが例示される。

【００４３】なお本発明抑制剤の有効成分であるケラタ
ン硫酸オリゴ糖の安全性については、国際公開第WO96/1
6973号において示されており、またその誘導体について
も後述の実施例から安全性が推定される。

【００４４】

【実施例】以下に本発明を、実施例により具体的に説明
する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲
が限定されるべきものではない。

【００４５】

【実施例１】 Ｌ４のアセチル化物の合成 Ｌ４の二ナトリウム塩（WO96/16973に記載の方法で製造
したもの）を脱イオン水に溶解し、カチオン交換樹脂(D
owex 50W-X4、H⁺-form；ダウケミカル製)カラムに通し
て酸遊離型とし、直ちに氷冷した。これに対して、引き
続き氷冷下におき、10倍脱イオン水希釈した水酸化テト
ラ−ｎ−ブチルアンモニウムを1.1倍 Ｌ４-硫酸基当量
滴下した。約１時間攪拌後、溶液を低温下にて減圧濃縮
し、Sephadex-LH20カラム(ファルマシア社)に通して粗
精製後、水溶液から凍結乾燥し、Ｌ４−ジ（テトラ−ｎ
−ブチルアンモニウム）塩を得た。

【００４６】乾燥したＬ４−ジ（テトラ−ｎ−ブチルア
ンモニウム）塩を100mg/mlの濃度でピリジンに溶解し、
室温にて攪拌しながら無水酢酸(L4-総ヒドロキシル基量
に対して1.5倍当量)を滴下して添加した。室温にて２４
時間攪拌後、溶媒を低温下で減圧留去し、メタノール／
ジエチルエーテル溶媒系にて繰り返し再沈殿して粗Ｌ４
アセチル化物−ジ（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）
塩を得た。これを陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー(LiChroprep NH₂；メルク社製)にてナトリウム塩に交
換し、引き続きゲル濾過クロマトグラフィー(Cellulofi
ne GCL-25；生化学工業株式会社販売)にて精製後凍結乾
燥して、式(5)で示されるＬ４のペンタ−Ｏ−アセチル
化物（以下、AcL4ともいう）を、α−グリコシド配位体
とβ−グリコシド配位体の混合物として得た。またα-
グリコシド配位体とβ-グリコシド配位体の分離は陰イ
オン交換クロマトグラフィー(LiChroprep RP-18；メル
ク社製)で行い、α−グリコシド配位体を取得した。AcL
4（α−グリコシド配位体）の¹H-NMRスペクトルおよび
¹³C-NMR（DEPT）スペクトルを以下に示す。

【００４７】¹ H-NMRスペクトル¹ H-NMR（400MHz、D₂O、TSP（δ_H＝0.00ppm）） δ_H＝1.97ppm（s,3H,COCH₃ ）、2.02（s,3H,COCH₃ ）、2.
17（s,3H,COCH₃ ）、2.18（s,3H,COCH₃ ）、2.217（s,3H,
COCH₃ ）、2.220（s,3H,COCH₃ ）、4.07-4.17（m,4H,H-4
A,H-5A,H-6B,H-6'B）、4.22-4.28（m,3H,H-5B,H-6A,H-
6'A）、4.40-4.44（dd,1H,H-2A）、4.91-4.93（d,1H,H-
1B）、5.00-5.04（dd,1H,H-2B）、5.20-5.23（dd,1H,H-
3B）、5.26-5.31（dd,1H,H-3A）、5.485-5.493（d,1H,H
-4B）、6.09-6.10（d,1H,H-1A）

【００４８】¹³ C-NMR（DEPT）スペクトル¹³ C-NMR（100MHz、D₂O、TSP（δ_C＝0.00ppm）） δ_C＝22.86ppm（2C,OCOCH₃）、23.04（OCOCH₃）、23.08
（OCOCH₃）、23.43（OCOCH₃）、24.47（NHCOCH₃）、53.
09（C-2A）、67.98（C-6B）、68.36（C-6A）、70.61（C
-4B）、72.62（C-2B）、73.34（C-5B）、73.56（2C,C-3
A,C-5A）、74.27（C-3B）、77.80（C-4A）、93.38（C-1
A）、102.96（C-1B）

【００４９】なお、上記データ中、「A」はＮ−アセチ
ルグルコサミン残基を、「B」はガラクトース残基を示
す。

【００５０】Amberlite IR-120カラム（シグマ社）を0.
1M HClで洗浄した後、蒸留水で平衡化した。蒸留水50ml
に溶解した５ｇのＬ４をカラムにアプライし、蒸留水で
溶出した。15mlずつ分取した溶出画分のpHを測定し、酸
性を示す画分を集めた。ピリジンを加えてpH 6.5に調整
し、ロータリーエバポレーターで過剰のピリジンを除去
した後、凍結乾燥した。

【００５１】以下の実施例で用いたＬ４（二ナトリウム
塩）およびＬ４Ｌ４（四ナトリウム塩）はいずれも国際
公開第WO96/16973号に記載の方法で製造したものを用い
た。また、Ｌ３（一ナトリウム塩）は以下の方法で製造
したものを用いた。

【００５２】Ｌ４のジピリジニウム塩５ｇを塩化アセチ
ルとメタノールの混合溶液中で反応させ、脱硫酸化し
た。反応後の溶液を蒸留水で平衡化したムロマックカラ
ム（室町化学工業）(3×21cm)にアプライした。0 Ｍ(1
L)から2.0 Ｍ(1L)のNaCl濃度勾配をカラムに負荷し、溶
出液を16mlずつ分取した。溶出画分のヘキソース含量を
測定し、部分脱硫酸化Ｌ４の溶出位置を確認した。

【００５３】部分脱硫酸化Ｌ４を含む画分を集めて減圧
濃縮し、蒸留水で平衡化したSephadex G-10カラム（ア
マシャムファルマシアバイオテク）により脱塩した。脱
塩標品を凍結乾燥した後、β-ガラクトシダーゼ（生化
学工業株式会社）45単位を含む100mMのクエン酸リン酸
緩衝液に溶解させ、37℃で45時間保温することにより、
混入するGalβ1-4GlcNAc(6S)を分解した。

【００５４】反応溶液を蒸留水で平衡化したムロマック
カラム(3×32cm)にアプライした。0M (1L)から1.5 M(1
L)のNaCl濃度勾配をカラムに負荷し、溶出液を19mlずつ
分取した。溶出画分のヘキソース含量を測定し、Ｌ３の
溶出位置を確認した。

【００５５】Ｌ３を含む画分を集めて減圧濃縮し、Seph
adex G-10カラムにより脱塩した。脱塩したＬ３溶液
は、Dowex 59wx4カラム（ダウケミカル）を用いてナト
リウム塩に交換し、再びムロマックカラム（2.2×52c
m）にアプライした。0 M(1L)〜0.75 M(1L)のNaCl濃度勾
配をカラムに負荷し、溶出液を15mlずつ分取した。溶出
画分をキャピラリー電気泳動で分析し、Ｌ３の溶出位置
を確認した。

【００５６】Ｌ３を含む画分を集め、電気透析装置（Mi
cro Acilyzer、旭化成工業株式会社）によりNaClを除去
した後、5mlに減圧濃縮した。濃縮溶液は400μl（Ｌ３
約20mg）ずつ数回に分けて、３ＭNaClで平衡化した高速
液体クロマトグラフィーDAISOPakカラム（ダイソー）(2
×50cm)にアプライした後、３ＭNaClで溶出した。

【００５７】Ｌ３を含む溶出画分を分取して減圧濃縮
し、蒸留水で平衡化したSephadex G-10カラム（2.2×11
4cm）により脱塩し、再び減圧濃縮した。濃縮溶液を分
子量カット１万の限外ろ過膜でろ過してエンドトキシン
を除去した後、凍結乾燥して、以下の実施例で用いた。

【００５８】

【実施例２】 Ｌ４の投与による血漿ＩＬ−１２の減少 血漿ＩＬ−１２量を、Ｌ４で処置したまたは処置しない
ＭＲＬ lpr/lprマウスを用いて調べた。ＭＲＬ lpr/lpr
マウス由来のマクロファージは顕著にＩＬ−１２を産生
することが知られており、また、その血清ＩＬ−１２量
は高い（J. Exp. Med., 183, pp.1447-1459(1996)）。

【００５９】ＭＲＬ lpr/lpr系マウス、並びに、正常コ
ントロールとしてＣ５７ＢＬ／６系マウスおよびＩＣＲ
系マウスを日本チャールスリバー株式会社から入手し、
数週間予備飼育を行った後、群分けを行った。眼窩静脈
叢より採血し、血漿中クレアチニン値（ＣＲＥ）を第一
の指標として、その平均値および標準偏差が群間で差が
ないように割り付けた。また、血漿中尿素窒素値（ＢＵ
Ｎ）、白血球数（ＷＢＣ）、血小板数（ＰＬＴ）および
体重についてもなるべく群間で差がないように割り付け
た。群構成は以下の通りとした。

【００６０】

【表１】 ──────────────────────────────────── 群 動物 試験物質 投与量 投与濃度 投与液量 投与経路 動物数 投与期間 (mg/kg) (mg/ml) (ml/kg) 雄 ──────────────────────────────────── １ ＭＲＬ ＤＷ − − 5.0 p.o. ９ ４週間 ２ ＭＲＬ Ｌ４ 1.6 16 0.1 i.n. ９ ４週間 ３ ＭＲＬ Ｌ４ 80 16 5.0 p.o. ９ ４週間 ４ ＭＲＬ Ｌ４ 160 32 5.0 p.o. ９ ４週間 ５ C57BL/6 無処置 − − − − ６ − ６ ＩＣＲ 無処置 − − − − ６ − ──────────────────────────────────── ＤＷ＝蒸留水、p.o.＝経口投与、i.n.＝経鼻（鼻粘膜）投与

【００６１】試験物質の投与は群分けの翌日から行っ
た。蒸留水に試験物質を所定の投与濃度で溶解し、この
溶液を投与した。投与回数および期間は３回／週の間歇
投与で４週間（計１２回）とした。

【００６２】経口投与は、滅菌済の1 mlディスポーザブ
ル注射筒および滅菌済み経口ゾンデを用いて常法により
行った。経鼻投与は、マイクロピペットおよび滅菌済み
のチップを用いて常法により行った。観察および測定は
以下のように行った。

【００６３】（１）一般状態 投与開始から剖検までの２９日間の観察期間中、毎日、
１日１回以上、一般状態および死亡状況について観察し
た。

【００６４】（２）体重 群分け時、投与開始日および投与開始日より１週間毎に
測定した。

【００６５】（３）血液学的検査 多項目自動血球計数装置（Sysmex K-2000; 東亜医用電
子）を用い、白血球数（ＷＢＣ）を、群分け時および剖
検前日に眼窩静脈叢から採血し測定した。

【００６６】（４）剖検 最終観察終了時に剖検し、主要諸器官について異常の有
無を肉眼的に観察した。また、肝臓、腎臓、脾臓、腸間
膜・頸部リンパ節の重量を測定した。途中死亡例につい
ても同様に剖検した。

【００６７】（５）血中サイトカイン 群分け時および剖検前日に眼窩静脈叢から採血し、ＩＬ
−１２の血漿中濃度を、IL-12 p70 ELISAキット（Endog
en,Inc.）を用いて測定した。

【００６８】上記で得られた測定値については、平均値
および標準偏差を算出し、ウィリアムズの多重比較検定
法によって、統計学的有意性を検討した。結果は以下の
通りであった。

【００６９】（１）一般状態 変化は認められなかった。

【００７０】（２）体重 いずれの群においても順調な推移が認められた。

【００７１】（３）血液学的検査 低用量のＬ４投与群で、ＷＢＣの有意な増加抑制が認め
られた。群１、２、３および４の剖検前日の結果を図１
に示す。図中、＊はｐ＜０．０５の水準で有意であるこ
とを示す。

【００７２】（４）剖検 異常は認められなかった。器官重量にも有意な相違は認
められなかった。

【００７３】（５）血中サイトカイン Ｌ４投与群においてＩＬ−１２の増加抑制が認められ
た。群１、２、３および５の剖検前日の結果を図２に示
す。図中、＊および＊＊は、それぞれｐ＜０．０５およ
びｐ＜０．０１の水準で有意であることを示す。なお群
５(C57BL/6)は、正常なマウスのレベルを示すものであ
る。

【００７４】この結果から、Ｌ４はＩＬ−１２産生を抑
制する作用を有することが示された。

【００７５】

【実施例３】 Ｌ４アセチル化物の投与による効果 ９週齢のＭＲＬ lpr/lpr系マウス、Ｃ５７ＢＬ／６系マ
ウスおよびＩＣＲ系マウスを日本チャールスリバー株式
会社から入手した。予備飼育期間を６週間とし、群構成
は以下の通りとした。

【００７６】

【表２】 ──────────────────────────────────── 群 動物 試験物質 投与量 投与濃度 投与液量 投与経路 動物数 投与期間 (mg/kg) (mg/ml) (ml/kg) 雌 ──────────────────────────────────── １ ＭＲＬ ＤＷ − − 5.0 p.o. ９ ６週間 ２ ＭＲＬ AcＬ４ 2.0 0.4 5.0 p.o. ９ ６週間 ３ ＭＲＬ AcＬ４ 4.0 0.8 5.0 p.o. ９ ６週間 ４ ＭＲＬ AcＬ４ 8.0 1.6 5.0 p.o. ９ ６週間 ５ ＭＲＬ Ｌ４ 3.2 32.0 0.1 i.n. ９ ６週間 ６ C57BL/6 無処置 − − − − ６ − ７ ＩＣＲ 無処置 − − − − ６ − ──────────────────────────────────── ＤＷ＝蒸留水、AcＬ４＝Ｌ４アセチル化物、p.o.＝経口投与、i.n.＝経鼻（鼻粘 膜）投与

【００７７】蒸留水に試験物質を所定の投与濃度で溶解
し、この溶液を投与した。投与回数および期間は３回／
週の間歇投与で６週間（計１９回）とした。観察は投与
開始から剖検までの４５日間とした。他の条件・方法等
は実施例２と同様とした。結果は以下の通りであった。

【００７８】（１）一般状態 変化は認められなかった。

【００７９】（２）体重 いずれの群においても順調な推移が認められた。

【００８０】（３）血液学的検査 Ｌ４経鼻投与群、およびＬ４アセチル化物投与群で、Ｗ
ＢＣの増加抑制が認められた。群１〜６の剖検前日の結
果を図３に示す。図中、＊はｐ＜０．０５の水準で有意
であることを示す。

【００８１】（４）血液生化学的検査 臨床化学自動分析装置（COBAS MIRA S; 日本ロシュ）を
用いて、血漿中クレアチニン値（ＣＲＥ）および血漿中
尿素窒素値（ＢＵＮ）について群分け時および剖検前日
に眼窩静脈叢から採血し測定した。

【００８２】その結果、低用量のＬ４アセチル化物投与
群及びＬ４投与群で、ＣＲＥおよびＢＵＮの有意な低下
が認められた。群１〜６の剖検前日の結果を図４に示
す。図中、＊および＊＊は、それぞれｐ＜０．０５およ
びｐ＜０．０１の水準で有意であることを示す。

【００８３】この結果から、Ｌ４、Ｌ４アセチル化物
は、腎疾患（例えば腎炎（糸球体腎炎等）、腎症（ルー
プス腎症等））の治療剤、予防剤としても有用であるこ
とが示された。

【００８４】（５）剖検 異常は認められなかった。器官重量にも有意な相違は認
められなかった。

【００８５】（６）血中サイトカイン Ｌ４経鼻投与群においてＩＬ−１２の増加抑制が認めら
れた。群１、５および６の剖検前日の結果を図５に示
す。図中、＊＊は、ｐ＜０．０１の水準で有意であるこ
とを示す。

【００８６】この結果からも、Ｌ４はＩＬ−１２産生を
抑制する作用を有することが確認された。

【００８７】

【実施例４】 マクロファージにおけるＬ４処理による
ＩＬ−１２ ｐ７０産生の減少 ８〜３９週齢のＭＲＬ lpr/lpr系マウスの腹腔に５〜７
ｍｌの氷冷ハンクス液を注入し、５分後に回収すること
により常在性腹腔細胞を採取した。採取した細胞を、９
６穴平底プレートで、ＲＰＭＩ培地により、３７℃、５
％ＣＯ₂の条件下一晩培養した。培養後、浮遊細胞を除
き、付着細胞を腹腔マクロファージとして実験に用い
た。

【００８８】リポ多糖（ＬＰＳ）（List Biological La
boratories, Inc.）により細胞を２４時間処理すること
でＩＬ−１２産生を刺激した。細胞培養上清のＩＬ−１
２のｐ７０の濃度を、IL-12 p70 ELISAキット（Endoge
n,Inc.）を用いて測定することにより、ＩＬ−１２の産
生を評価した。測定値については、平均値および標準偏
差を算出し、特にことわらない限りウィリアムズの多重
比較検定法によって統計学的有意性の検討を行った。実
験は以下の通りである。

【００８９】（１）ＬＰＳおよびＬ４で同時に処理 種々の濃度のＬ４およびＬＰＳ（100 ng/ml）を含む培
地中で２４時間刺激し、ＩＬ−１２産生を評価した。

【００９０】（２）予めＬＰＳで刺激した後にＬ４で処
理 100 ng/mlのＬＰＳで、０、２または６時間マクロファ
ージを処理した後、1000 ng/mlのＬ４を含む新しい培地
または新しい培地のみ（Ｌ４(-)）に交換し（これによ
り前処理により産生されたＩＬ−１２が除かれる）、培
地交換の２４時間後にＩＬ−１２産生を評価した。

【００９１】（３）予めＬ４で処理した後にＬＰＳで刺
激 先ず、種々の濃度のＬ４によりマクロファージを２４時
間処理した後、100 ng/mlのＬＰＳを含む培地に交換
し、培地交換の２４時間後にＩＬ−１２産生を評価し
た。

【００９２】ＬＰＳおよびＬ４で同時に処理した場合の
結果を図６に示す。Ｌ４は100 ng/mlのＬＰＳで刺激し
た群において用量依存的なＩＬ−１２産生の抑制効果を
示した。この結果は、８週齢のマウスを用いても３９週
齢のマウスを用いても同様であった（図６）。また、別
の系のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系マウス）を用いても同
様であった（図７）。図６及び図７において、＊および
＊＊はそれぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１の水準
で有意であることを示す。

【００９３】予めＬＰＳで刺激した後、Ｌ４で処理した
場合の結果を図８に示す。図中、＃は検出不能であるこ
と、＊はスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．０５の
水準で有意であることを示す。ＬＰＳで２時間および６
時間の前処理を行ったマクロファージでも、Ｌ４による
ＩＬ−１２産生の抑制が認められた。

【００９４】これらの結果から、ＬＰＳによる刺激の後
であっても、Ｌ４がＩＬ−１２産生を抑制できることが
示された。

【００９５】予めＬ４で処理した後にＬＰＳで刺激した
場合の結果を図９に示す。図中、＊はｐ＜０．０５の水
準で有意であることを示す。Ｌ４の前処理によりＩＬ−
１２産生が抑制されることが明らかである。高用量（10
0 ng/ml以上）では、ほぼ完全にＩＬ−１２産生が抑制
された。また、正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６系マウス）
を用いても（但し、Ｌ４による前処理を３６時間とし
た）同様であった（図１０）。図１０中、＊はｐ＜０．
０５の水準で有意であることを示す。

【００９６】1000 ng/mlのＬ４で２４時間前処理したマ
クロファージまたはＬ４で前処理しないマクロファージ
を、100 ng/mlのＬＰＳで２４時間処理した場合（Ｌ４
前処理）のＩＬ−１２産生と、1000 ng/mlのＬ４と共
に、または、Ｌ４なしで100 ng/mlのＬＰＳで処理した
場合（同時処理）のＩＬ−１２産生とを比較した。結果
を図１１に示す。図１１中、＊および＊＊はスチューデ
ントのｔ検定においてそれぞれｐ＜０．０５およびｐ＜
０．０１の水準で有意であることを示す。

【００９７】図１１のデータから、同時投与に比して、
Ｌ４前処理の方がより効率的にＩＬ−１２産生を抑制し
ていること分かる。

【００９８】また、Ｌ４Ｌ４（四ナトリウム塩）をＬ４
の代わりに用いても同様の結果が得られた。種々の濃度
のＬ４Ｌ４の存在下、100 ng/mlのＬＰＳで２４時間刺
激した結果を図１２に示す。

【００９９】

【実施例５】 慢性関節リウマチ患者の滑膜細胞におけ
るＬ４処理によるＩＬ−１２ ｐ７０産生の減少 ヒト慢性関節リウマチ患者から採取した滑膜細胞を、50
0ng/mlのＬＰＳ、50単位/mlのリコンビナント マウスイ
ンターフェロン(IFN)-γ(recombinant mouse IFN-γ)お
よび10％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地
(SIGMA社)に1x10⁶個/mlとなるように懸濁し、細胞液を
調製した。

【０１００】９６穴平底プレートに上記細胞液100μlを
添加し、さらにＲＰＭＩ１６４０培地中の、最終濃度の
２倍となるように濃度を調整したＬ４溶液を100μl添加
し、37℃、５％ ＣＯ₂の条件下で２４時間培養した。

【０１０１】その後、プレートを遠心して培養上清を回
収し、上清中のIL-12濃度を前記と同様に測定した。結
果を図１３に示す。

【０１０２】図１３から、Ｌ４の添加によってＩＬ−１
２の産生が抑制される傾向が見られ、1000ng/mlのＬ４
によって滑膜細胞のＩＬ−１２産生は約１／２となっ
た。

【０１０３】

【実施例６】 マクロファージにおけるＬ３処理による
ＩＬ−１２ ｐ４０産生の減少 C3H/HeNマウス腹腔中に、氷冷したリン酸緩衝生理食塩
液(PBS)を注入した。マウスの腹部をマッサージした
後、PBSを回収して遠心してマクロファージを得た。得
られたマクロファージを、200ng/mlのＬＰＳ、２単位/m
lのリコンビナントマウスインターフェロン(IFN)-γ(re
combinant mouse IFN-γ)および10％ウシ胎仔血清を含
有するＲＰＭＩ１６４０培地(SIGMA社)に1x10⁶個/mlと
なるように懸濁し、細胞液を調製した。

【０１０４】９６穴平底プレートに上記細胞液100μlを
添加し、さらにＲＰＭＩ１６４０培地中の、最終濃度の
２倍となるように濃度を調整したＬ３溶液を100μl添加
し、37℃、５％ ＣＯ₂の条件下で２４時間培養した。

【０１０５】その後、プレートを遠心して培養上清を回
収し、上清中のIL-12濃度を前記と同様に測定した。結
果を図１５に示す。

【０１０６】図１５から明らかな通り、Ｌ３は用量依存
的にマクロファージのＩＬ−１２産生を抑制した。

【０１０７】実施例２〜６のデータから、ケラタン硫酸
オリゴ糖またはその誘導体がＩＬ−１２産生を抑制でき
ることが明らかである。特に、予め投与しておくこと
で、その後のＩＬ−１２産生を抑制できること（予防効
果があること）が明らかである。

【０１０８】

【発明の効果】ＩＬ−１２産生抑制剤は、生体の免疫機
能の調節におけるＩＬ−１２の役割を研究するための研
究用試薬として有用である。また、ＩＬ−１２がその病
勢の進行に促進的に働く疾患の治療や予防のための医薬
として使用できる。本発明のＩＬ−１２産生抑制剤は、
天然物由来の物質を素材としており、その安全性も高
い。

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｌ４の投与後のＭＲＬ lpr/lprマウスの血中
の白血球（ＷＢＣ）数を示す。

【図２】 Ｌ４の投与後のＭＲＬ lpr/lprマウスの血漿
中のＩＬ−１２量を示す。

【図３】 Ｌ４の投与後のＭＲＬ lpr/lprマウスの血中
のＷＢＣ数を示す。

【図４】 Ｌ４の投与後のＭＲＬ lpr/lprマウスの血漿
ＣＲＥおよびＢＵＮ量を示す。

【図５】 Ｌ４の投与後のＭＲＬ lpr/lprマウスの血漿
中のＩＬ−１２量を示す。

【図６】 ８週齢および３９週齢のＭＲＬマウス由来の
腹腔マクロファージにおける、Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７
０産生抑制効果を示す。

【図７】 Ｃ５７ＢＬ６／７マウス由来の腹腔マクロフ
ァージにおける、Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７０産生抑制効
果を示す。

【図８】 ＭＲＬマウス由来の腹腔マクロファージにお
ける、Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７０産生抑制効果を示す。

【図９】 ＭＲＬマウス由来腹腔マクロファージにおけ
る、Ｌ４のＩＬ−１２ｐ７０産生抑制効果を示す。

【図１０】 Ｃ５７ＢＬ６／７マウス由来腹腔マクロフ
ァージにおける、Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７０産生抑制効
果を示す。

【図１１】 ＭＲＬマウス由来腹腔マクロファージにお
ける、Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７０産生抑制効果を示す。

【図１２】 ＭＲＬマウス由来腹腔マクロファージにお
ける、Ｌ４Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７０産生抑制効果を示
す。

【図１３】 ヒト慢性関節リウマチ患者由来滑膜細胞に
おける、Ｌ４のＩＬ−１２ ｐ７０産生抑制効果を示
す。

【図１４】 C3H/HeNマウス由来腹腔マクロファージに
おける、Ｌ３のＩＬ−１２産生抑制効果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 徐 和平 イギリス国 スコットランド アバーディ ーン エービー24 １ティーエックス 25 エフ スクール・ロード (72)発明者 宮内 聡 東京都武蔵村山市中央１−122−14 (72)発明者 生沼 明美 東京都日野市程久保２−24−22 (72)発明者 南澤 俊和 埼玉県所沢市東所沢２−８−11 コーポク レマチス２−102

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ケラタン硫酸オリゴ糖又はその誘導体を
   有効成分とする、ＩＬ−１２産生抑制剤。
2. 【請求項２】 ケラタン硫酸オリゴ糖が、下記式で表さ
   れる二糖のいずれかを繰返し構成単位として少なくとも
   １単位以上含むことを特徴とする、請求項１記載の抑制
   剤。 Gal(6S)-GlcNAc(6S) および Gal(6S)-GlcNAc （式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセ
   チルグルコサミン残基を、6Sは6位のヒドロキシル基が6
   -O-硫酸エステルとなっていることを、-はグリコシド結
   合をそれぞれ表す）
3. 【請求項３】 ケラタン硫酸オリゴ糖が、下記式(1)〜
   (3)で表されるものから選ばれることを特徴とする、請
   求項２記載の抑制剤。 【化１】 Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) 式(1) Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) 式(2) Gal(6S)β1-4GlcNAc 式(3) （式中、Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセ
   チルグルコサミン残基を、6Sは6位のヒドロキシル基が6
   -O-硫酸エステルとなっていることを、β1-4はβ1,4グ
   リコシド結合を、β1-3はβ1,3グリコシド結合をそれぞ
   れ表す）
4. 【請求項４】 ケラタン硫酸オリゴ糖の誘導体が、ヒド
   ロキシル基におけるアシル化誘導体である、請求項１記
   載の抑制剤。
5. 【請求項５】 ケラタン硫酸オリゴ糖の誘導体が下記式
   (4)で示されることを特徴とする、請求項１記載の抑制
   剤。 【化２】 （式中、Ｘ¹〜Ｘ⁵は、それぞれ独立して、水素原子また
   はアシル基であり、Ｘ¹〜Ｘ⁵の少なくとも一つはアシル
   基であり、Ｙは水素原子またはＳＯ₃Ｍであり、Ｍは、
   それぞれ独立して、水素原子、又は電離していてもよい
   １価〜３価の金属もしくは１価〜３価の塩基であり、波
   線で示した結合はα−グリコシド配位またはβ−グリコ
   シド配位を示す。）
6. 【請求項６】 Ｘ¹〜Ｘ⁵がいずれも炭素数１〜１０のア
   シル基であり、Ｍがアルカリ金属であることを特徴とす
   る請求項５記載の抑制剤。
7. 【請求項７】 下記式(4)で示される、ケラタン硫酸オ
   リゴ糖の誘導体。 【化３】 （式中、Ｘ¹〜Ｘ⁵は、それぞれ独立して、水素原子また
   はアシル基であり、Ｘ¹〜Ｘ⁵の少なくとも一つはアシル
   基であり、Ｙは水素原子またはＳＯ₃Ｍであり、Ｍは、
   それぞれ独立して、水素原子、又は電離していてもよい
   １価〜３価の金属もしくは１価〜３価の塩基であり、波
   線で示した結合はα−グリコシド配位またはβ−グリコ
   シド配位を示す。）
8. 【請求項８】 Ｘ¹〜Ｘ⁵がいずれも炭素数１〜１０のア
   シル基であり、Ｍがアルカリ金属であることを特徴とす
   る請求項７記載の誘導体。