JP2000516591A

JP2000516591A - 皮膚化粧組成物における免疫調節薬としてのオリゴ糖の使用

Info

Publication number: JP2000516591A
Application number: JP10508650A
Authority: JP
Inventors: ラディスラ、ロベール; アレクサンドル、ロベール; ドミニク、カステーリ
Original assignee: ロック
Priority date: 1996-07-31
Filing date: 1997-07-30
Publication date: 2000-12-12
Also published as: FR2751876A1; KR20000029754A; SK12199A3; PL331478A1; NZ333985A; EP0954322A1; RU99104398A; WO1998004270A1; CN1228705A; BR9710630A; HUP9903904A2; FR2751876B1; HUP9903904A3; AU3457697A; CA2262564A1; CZ29599A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、免疫調節剤の製造のための、2〜6の配糖体残基を含んでなり、かつ、その非還元末端位にガラクトース残基を有する少なくとも１種のオリゴ糖、または疎水性残基で置換されたそのようなオリゴ糖の誘導体、の使用に関する。本発明はまた、皮膚化粧組成物および過剰反応皮膚の美容処理に関する。

Description

【発明の詳細な説明】皮膚化粧組成物における免疫調節薬としてのオリゴ糖の使用本発明は、免疫学の分野で有用な化合物、詳しくは、アレルギーや種々の不耐性現象の原因である過敏性反応の治療用化合物、に関する。感染性病原体、毒素または新生物に対する免疫防御は、外来の天然抗原（すなわちアレルゲン）の認識とその外来抗原の除去を目的とした細胞性伝達物質または体液性伝達物質の活性化を介して作動する。しかしながら、このメカニズムは、それが強すぎる場合、もしくは本来有害ではない環境抗原と遭遇した際に起こる場合は望ましくないことがあり、これは器官移植または組織移植中の場合も同様である。アレルギーを原因とする免疫反応は、下記の４タイプに分類されている。タイプＩ：マスト細胞がそれらのFc受容体によりIgE抗体に結合しており、抗原の固定がマスト細胞の脱顆粒と伝達物質（ヒスタミン、SRS-A、ECF-A）の放出を誘発する。タイプII：特異的抗体（IgGまたはIgM）が標的細胞の表面の抗原と反応し、これがK細胞の直接的作用によるか、または補体の活性化によるかのいずれかで細胞溶解を引き起こす。タイプIII：抗体（IgGまたはIgM）が抗原と補体を伴い、組織中に沈着する免疫複合体を形成し、多核性好中球の白血球走化性因子の産生を誘導し、局所炎症を生じる。タイプIV：抗原に感作したＴリンパ球がこれと反応してリンホカインを放出する。リンホカインは炎症反応を誘発し、マクロファージの流入を引き起こす。このように、細胞性伝達物質または体液性伝達物質を伴う、特に抗体の分泌を伴う、免疫においては、リンパ球が重要な細胞となる。アレルギー症は１種以上の免疫反応の発現であると考えられる。これらの反応はまた、「過剰反応」といわれる皮膚で見られる衛生品やケア製品に対する不耐性反応の原因ともなる可能性がある。これらの現象は、内在性の遺伝因子、および、環境によって誘導された後天的な過敏性、によるものである。意外にも、これらの過敏性現象は、2〜6の配糖体(oside)残基を含んでなり、かつ、その非還元末端位にガラクトース残基を有するオリゴ糖、または疎水性残基で置換されたそのようなオリゴ糖の誘導体、により、制御可能であった。本発明は、免疫調節組成物、詳しくは過敏性反応の治療もしくは予防を意図した組成物、の製造のための、2〜6の配糖体残基を含んでなり、かつ、その非還元末端位にガラクトース残基を有するオリゴ糖、またはそれらの誘導体、の使用、に関する。特に適切なオリゴ糖は、メリビオース、ラクトースおよび疎水性残基の付加により得ることのできるそれらの誘導体、からなる群より選択できた。疎水性置換基は特に、直鎖または分枝C₁-C₁₈アルキル、C₁-C₁₈アルキルアミン、所望により置換されていてもよい直鎖または分枝C₁-C₁₈カルボン酸、直鎖または分枝、第一級、第二級または第三級C₁-C₁₈アミド、およびC₁-C₁₈アリールアルキルを意味するものと理解される。本発明の実施に適したオリゴ糖誘導体は、特に、下記のカテゴリ−ａ）〜ｄ）の１つに属することができ、ここで、このオリゴ糖は下記の一般式に相当するものである。ガラクトース-ｎ（αまたはβ）-（Ｈｅｘ）ｐ［式中、ｎは１、２、３、４または６位を表し、Ｈｅｘはα-またはβ-結合ヘキソースまたはペントースを表し、ｐは１〜５の間の数である］ａ）−下式(I)および(II)に相当するグリコシド。・(I)オリゴ糖 1-O-R（式中、Rは1〜18個の炭素原子からなる直鎖または分枝アルキル残基である）、・(II)オリゴ糖 1-O-R-O-1-オリゴ糖（式中、R=(CH₂)_m、mは2〜10である）。ｂ）−下記式(III)および(IV)（式中、オリゴ糖は好ましくはラクトース、メリビオースまたはスタチオースである）の１つに従うアシル化されたオシルアミン、 −以下の式の１つに相当するアシル化されたオシルアミン、・(III)オリゴ糖 1-NH-CO-R（式中、Rは0、1または2個の二重結合を含有する、2〜18個の炭素原子からなるアルキル残基である）、・(IV)オリゴ糖 1-NH-CO-R-CO-NH-1-オリゴ糖（式中、R=(CH₂)_m、mは2〜 8である）。ｃ）−下記(V)および(VI)のオリゴ糖の酸化により得られるアルドン酸によりアシル化されたアルキルアミン。・(V)オリゴ糖 -CO-NH-R（式中、Rは式(III)の定義に同じ）、・(VI)オリゴ糖 CO-NH-R-NH-CO-オリゴ糖（式中、Rは式(III)の定義に同じ）。ｄ）−または、脂肪族モノ−またはジアミンを伴い、かつ、下記式(VII)および(VIII)の１つに相当する、オリゴ糖により形成されたシッフ塩基の還元生成物。・(VII)Gal-(Hex)_n-X-HN-R、・(VIII)Gal−(HeX)_n-X-HN-R-NH-X-(Hex)_n-Gal （式中、Hexはヘキソースまたはペントースであり、nは0、1または2、Xは1-NH₂- ヘキシトール、かつRは(III)の定義に同じ、である）。特に有利な方法によれば、前記で定義したようなオリゴ糖またはその誘導体を用い、さらに外用局所経路による投与に適した医薬上許容される賦形剤を含有する組成物が製造されよう。実際に出願者は、過敏症を伴う疾患に関与する反応が、エラスチン、特にκ- エラスチン、の分解から生じるペプチドの、特異的リンパ球受容体上での固定と関係があることを見出した。これらの受容体の活性化は、細胞溶解酵素、β-グルクロニダーゼ、エラスターゼ、および超酸化物イオンやヒドロキシルラジカルを生じる過酸化水素などのフリーラジカル、の遊離を誘引する。これらの生成物は、高分子の細胞外マトリックス、フィブロネクチン、コラーゲンおよびヒアルロナンの分解を伴う可能性がある。エラスチンペプチドの固定も同様に、リンパ球の増殖を刺激する。これらの現象はアトピー起源、特にアトピー性皮膚炎または過敏症反応、蕁麻疹およびアレルギー性接触皮膚炎、の免疫アレルギー反応、に重要な役割を果たす。「過敏な」あるいは過剰反応といわれる皮膚を有する患者の人口はさらに多い。このような皮膚は赤くなったり、刺激を受けたりしやすく、その反応性の閾値は他の皮膚に比べて低くなっている。患者は、紅斑に伴い皮膚に不快感を感じ、細かな落屑が起こる可能性もある。本発明のオリゴ糖を含有する組成物の使用により、これら総ての症状が改善される、もしくは抑制されさえすると考えられる。メリビオース、ラクトース、またはそれらの誘導体は、部分的または全面的に、細胞増殖、特に先立って刺激されたリンパ球の増殖、を抑制する。それらはまた、潜在化および細胞溶解酵素の遊離を阻害することもできる。これら組成物は、香料やアレルギー性薬品を含まないビヒクル中に配合されることが好ましいと考えられる。これら組成物は、水剤、ゲル剤、ローション剤、クリーム剤、Ｗ／ＯまたはＯ／Ｗ乳剤、複合乳剤の形態であってもよいし、リポソーム形態であってもよい。それらは、好ましくは皮膚軟化剤または刺激の少ない界面活性剤を用いて当業者により適用されよう。該組成物は特に、皮膚および／または粘膜の不耐性および／またはアレルギー反応の治療または予防に適する。特に、本発明の組成物はフリーラジカルの形成を防ぐ、または減らすことを意図したものである。オリゴ糖またはそれらの誘導体は、ヒアルロン酸、ビタミンE、G.ビローバ(G. biloba)のグリコール抽出物、ソルビトール、グルコースアミノグリカン、アルギン酸塩などのような、皮膚を保護および／または水和することが可能な他の薬剤、と合せてもよい。それらはまた、皮膚に滋養を与えるための植物油、および／または例えば、キャット・グレープ、ムクゲ、エンバク、リンデン、カモミール、スイートクローバー、ナギイカダ(Ruscus)、プロシアニドールス(procyanid ols)、α-ビスアボロール(α-bisabolol)、ココナッツ油、18-β-グリシルヒチン酸の抽出物などの活性皮膚軟化剤および軟膏と合してもよい。本発明のもう１つの態様のよれば、前記に定義したようなオリゴ糖およびそれらの誘導体が、さらに非経口または腸内経路による投与に適した医薬上許容される賦形剤を含む組成物の製造に用いられる。本発明のオリゴ糖の効力は、細胞介在性の免疫反応に対するそれらの驚くべき活性に基づいている。本発明に従い製造された組成物は特に、リンパ球が介在する過敏性反応の治療または予防に有用である。それらは特に、アトピー、多形成紅斑、乾燥皮膚炎、紅斑性狼瘡、天疱瘡、皮膚炎、乾癬、湿疹の中から選択される病状の治療または予防を意図したものである。非還元末端位にガラクトース残基を有するオリゴ糖、および疎水性残基で置換されたそれらの誘導体は、別の活性素(active principle)により誘発させることが可能な過敏性反応を制限するアジュバントとして利用することができる。本発明はまた、2〜6の配糖体残基を含んでなり、かつ、その非還元末端位にガラクトース残基を有する少なくとも１種のオリゴ糖、または疎水性残基で置換されたそのようなオリゴ糖の誘導体を含有する組成物を、化粧品に許容されるビヒクルの形態で局所経路により塗布することを特徴とする、過剰反応皮膚の美容処理方法に関する。本法を実施するために特に好ましい化合物は、メリビオース、ラクトースおよび疎水性残基の付加により得ることができるそれらの誘導体である。以下の諸例は本発明を例示するためのものである。これらの例では、以下の図面を参照する。図１： κ-エラスチンによるリンパ球増殖の刺激活性に関するラクトースおよびメリビオースによる阻害。ラクトースおよびメリビオースの濃度は、1μ ｇ/ml、10μｇ/ml、100μｇ/ml、1mg/mlおよび2mg/mlである。図２： 2μｇ/mlのκ-エラスチンで刺激されるリンパ球によるエラスチン活性の発現に関するラクトースおよびメリビオースによる阻害。培地中の活性。図３： 2μｇ/mlのκ-エラスチンで刺激されるリンパ球のカテプシンＧ活性の発現に関するラクトースおよびメリビオースによる阻害。培地中の活性。［例１］＜１．方法＞リンパ球の単離これらの実験のために使用したリンパ球は、ヒト循環血液、同様に扁桃切除後のヒト扁桃、を起源として得た。末梢リンパ球の単離は以下のように行う。5ml の血液を、二層に分離する前に注意深く(15mlの遠心分離試験管中の)Ficoll-paq ue plus(Pharmacia)上に沈積させ、次いで周囲温度(20℃)にて3000rpm(すなわち 600g)で40分間遠心分離した。リンパ球および単球を含む層を回収し、10mlのRPM I培地と混合し、20℃にて2200rpm(すなわち400g)で10分間遠心分離する。この沈渣を0.5mlのRPMIに再懸濁し、次いでさらに4.5mlのRPMIを加え、新たに20℃にて 1500rpm(すなわち400g)で10分間遠心分離を行う。最終沈渣を10mlのRPMI中に取り、細胞を計数した。単球およびマクロファージは、プラスティック表面への付着により除去した(CO₂/O₂インキュベーター中で2時間インキュベーション)。多核細胞(PMN)の単離 3000rpm(すなわち600g)における最初の遠心分離の後に、赤血球およびPMNを含む残渣をDPBS(ダルベッコの改変リン酸緩衝塩水）中の1%ポリビニルアルコール( PVA)(沈渣の容積の2倍の容積)に再懸濁し、次いで周囲温度にて20分間放置して沈殿させる。次いで上清を4℃にて400gで5分間遠心分離し、PVAを除去する目的で、PMNを活性化させないよう穏やかに攪拌しながらDPBSを用いて沈渣を洗浄し、次いで4℃にて400gで遠心分離する。得られた上清を除去する。浸透圧ショックにより赤血球を溶解させ、次いで浸透圧平衡を再確立させるために過剰のDPBS を加える。4℃、400gにて5分間の遠心分離の後に、PMNを含有する沈渣を少量のR PMI中に取り出す。細胞を計数し、0℃にて1M NaCl中の0.1% Triton X-100を20分間にわたって加え、次いで0℃にて20分間遠心分離することにより、細胞を溶解させて、細胞溶解酵素(エラスターゼ、カテプシン)を遊離させることができる。この上清が酵素を含有する。ヒト扁桃を起源とするリンパ球の調製 10mlのRPMI中で、用時摘出した扁桃を無菌条件下で細片に切断する。大きな組織片を除去するために、この組織懸濁液を目の粗いフィルター上で濾過する。懸濁液を試験管に入れ、周囲温度にて15分間、沈殿させる。その上清をFicoll-paque plus上に取り、血液由来のリンパ球に関して記載したように遠心分離する。単球を血液由来のリンパ球に関して記載したように除去する。リンパ球を含む沈渣を再懸濁し、記載したように2回にわたる遠心分離の後に細胞を計数する。扁桃を起源として得られたリンパ球は、約50%がＴ型であり、50%がＢ型である。血液起源のリンパ球は、約80%がＴ型であり、20%がＢ型である。リンパ球の培養前記したように単離したリンパ球は、24-ウェルコスタープレート中で、10%牛胎仔血清(AGTC)、2mMグルタミン(Gibco)、ペニシリンおよびストレプトマイシン (500U/ml、0.25mg/ml)、およびフィトヘマグルチニン(SIGMA)5μｇ/mlからなるR PMI 1640培地(Eurobio)中、500μｌの細胞懸濁/ウェル(5×10⁵細胞/mlまたは2.5 ×10⁵細胞/ml)で培養する。細胞培養条件下(37℃、CO₂/O₂インキュベーター)で4 日間培養した後に、細胞懸濁液をピペットで回収し、20℃にて400ｇで10分間遠心分離して、細胞沈渣を0.5mlのRPMI(FCSを含まない)中に取り、振盪により分散させ、次いでFCSを含まない10mlのRPMIの添加後、再び20℃にて1500rpm(すなわち400g)で10分間遠心分離する。前記したようにさらに2回洗浄した後、沈渣をFC Sを含有しない10mlのRPMIに取り、再び細胞を24-ウェルコスタープレート中で培養する。エラスチンペプチドの作用 κ-エラスチン(75kD、Solabia)の無菌溶液を指示濃度(例えば2μｇ/ml)で、FC Sを含まない培地中における、37℃、2.5時間の培養に戻した、細胞に加える。インキュベーション後、プレートを穏やかに振盪し、細胞をピペットで回収して計数する。懸濁液を4℃にて1500rpm(すなわち400g)で10分間遠心分離し、その上清を1mlのエッペンドルフ管に1管あたり500μｌの割合で分注し、直ちに酵素測定を行わない場合は-40℃で保存する。細胞沈渣を抽出緩衝液(0.1%Triton X-100、 1M NaCl、0.02% NaN₃、0.01% Brij 35、pH8)中に、1mlあたり10⁶細胞の濃度で再懸濁して、0℃にて1600gで15分間振盪し、前記のように遠心分離して得られた上清をエッペンドルフ管に再び分注し、酵素測定用として-40℃で保存する。白血球エラスターゼ−タイプの酵素活性の測定エラスターゼ−タイプの酵素活性の測定に使用される合成基質はMe-O-Suc-Ala -Ala-Pro-Val-pNAである。50μｌの培養培地または20μｌの細胞溶解物を緩衝液 (100mM tris-HCl、0.05%CaCl₂、0.02% NaN₃、0.01% Brij 35、pH8)と混合して19 0μｌとし、次いで10μｌの85mM基質溶液(N-メチルピロリドン中)と混合して総量200μｌとする。直ちに410nmにおける光学濃度を測定し、次いで37℃にて4、2 4、48および72時間にわたるインキュベーション後も測定する。エラスターゼ活性は加水分解された基質(nM)/10⁶細胞/時間で表す。カテプシンＧの酵素活性の測定 1mlのN-メチルピロリドン(40nM)中の25mgの基質Me-O-Suc-Ala-Ala-Pro-Met-pN Aを、上記と同じ条件で使用する。＜２．結果＞Ａ）エラスチンペプチドのリンパ球増殖に対する作用白血球へのエラスチンペプチドの添加により引き起こされたカルシウムの通過は、一連の細胞機能の引き金となる細胞内シグナルの指標であると考えられる。これらの一つは、細胞の増殖の開始である。これはエラスチンペプチドの存在下のヒト皮膚繊維芽細胞において起こることが示されている(Ghuysen-Itard et al ,C.R．Acad．Sci.，1992，315：473-478)。表1に報告した結果は、リンパ球の増殖に類似した刺激が認められたことを示している。表１最大刺激は2μｇ/mlのエラスチンペプチドで認められ、10μｇ/mlのエラスチンペプチドでは少し弱い刺激が認められる。Ｂ）エラスチンペプチドによるタンパク分解活性の遊離 PMNまたはリンパ球を2μｇ/mlのκ-エラスチン存在下、培養条件下でインキュベートした場合、細胞抽出物および細胞溶解物中においてエラスターゼおよびカテプシン活性の緩やかな増加を測定することができる。この増加は、初老のアテローム性動脈硬化症患者由来の細胞においてより顕著である。かかる増加は、κ -エラスチン不在下においては認められない。エラスチンペプチドを添加すると、培養培地(塩析酵素)および細胞抽出物(細胞結合酵素)においても同様に、エラスターゼならびにカテプシンＧの、タンパク分解活性が増加するが、この作用は培養上清における酵素活性の遊離についてより著しいことがある。Ｃ）細胞生存に対するエラスチンペプチドの作用この実験は、前記したような培養条件下で、フィトヘマグルチニン(PHA)存在下で行う。ヒト扁桃を起源として得たリンパ球懸濁液(5ml中2.5×106細胞)5mlエアリコートを試験管に分注し、κ-エラスチン(BPM、PM<10kDa)の濃度を増加させながら加える：0.1μｇ/ml、2μｇ/ml、10μｇ/ml、500μｇ/ml１、1および2mg/ml。培養条件下で4日間のインキュベーションの後に、細胞を回収して計数する。表２は細胞の損失を、加えたエラスチンペプチド濃度の関数として表している。表２エラスチンペプチドは高濃度（細胞増殖を刺激する濃度および細胞溶解酵素の塩析濃度より1000倍高い）で細胞障害活性を発揮することが明らかである。［例２］リンパ球のエラスチン受容体が介在する反応におけるラクトースおよびメリビオースの効果１）細胞増殖の阻害図１に示したように、ラクトースおよびメリビオースの濃度の増加は段階的にエラスチンペプチドの増殖刺激効果を抑制し、次いで、5.84×10^-3mM当量の、試験した最強濃度(1および2mg/ml)で正味の増殖阻害が起こる。最も強い増殖阻害は、ラクトースに対しては16〜30％、そしてメリビオースに対しては26〜58％のオーダーである。２）エラスチン受容体によって誘導されるタンパク質分解酵素の塩析におけるラクトースおよびメリビオースの効果前記に示したように、タンパク質分解酵素の活性における40〜120％の増加は、培養培地においても、また2μｇ/mlのκ−エラスチンの存在下で培養されたヒトリンパ球の細胞溶解物においても、観察される。細胞溶解酵素活性の遊離の刺激は、メリビオース1μｇ/mlから効果的に阻害される。この阻害はエラスターゼに対しても、カテプシンＧに対しても同様に証明することができる。ラクトースもまた有効であるが、メリビオースの有効性より弱い（図２および図３）。［例３］ヒトリンパ球の部分母集団におけるエラスチン受容体の定量化＜方法＞使用抗体： −一次抗体：マウスで生産された67kDエラスチン/ラミニン抗-受容体抗体（ウシ）(タイプ：IgM)(Elastin Produce Company) −二次抗体：ローダミン(TRITC)で標識した、ヤギで生産されたマウス抗-IgG+ IgM(H+L)抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories)（蛍光顕微鏡用） −二次抗体：抗-IgM抗体(r−フィコエリトリンで標識した、ヤギで生産されたマウスのF(ab')₂(Chemicon))（フローサイトメトリー用）プロトコール：ａ）蛍光顕微鏡法ヒトリンパ球を扁桃（例１に記載）より単離し、5μｇ/mlのフィトヘマグルチニン(それらを活性化する)の存在下、10%ウシ胎児血清(FCS)を含むRPMI1640培地中で、高分子量(75kD)κ-エラスチン２μｇ/mlとともに確実に培養する。37℃にて48〜120時間のインキュベーションの後、リンパ球を2%FCSを含有するRPMI培地で3回洗浄し、次いで遠心分離する（400g、4℃にて10分間）。次に、細胞を計数し、細胞密度を2%FCSを含有するRPMI培地で10⁷細胞/mlに調節する。次いで、多量(100μｌ)のヒトリンパ球の細胞懸濁液（およそ10⁶細胞）を一次抗体溶液10μｌ（1:100に希釈）とともに30分間、氷浴内でインキュベートする。 1.5mlの冷RPMIを2%FCSに加え、次いで細胞を冷却遠心機で4℃にて洗浄する（400 gで10分間）。二次抗体溶液（TRITCへ会合）（冷RPMI中に1:200希釈）をこのプラグに加える。懸濁液を穏やかに振盪した後、4℃にて30分間インキュベートする。次いで、1 .5mlの冷RPMIを2%FCSに加え、その懸濁液を400g、4℃にて10分間遠心分離する。この最後の洗浄の終了時に、デカンテーションにより上清を除去した後、リンパ球を残りの培地に再懸濁する。次いで、スライド上に塗抹標本を作成し、風乾する。無水エタノールで５分間固定した後、そのスライドをPBSの数種の浴槽中に浸漬することにより再水和させ、緩衝化グリセロール（9容量のグリセロールと１容量のPBS）中に包埋する。この固定後手法は免疫蛍光の明度を増大させる。標識細胞を同定するため、紫外線照射下および可視光を選択して顕微鏡の視野を調べる。ｂ）蛍光定量法この最後の洗浄の終了時に、リンパ球を１mlのPBSに懸濁し、その細胞を細胞蛍光定量法によって分析する。特徴的な細胞集団は以下である。 −全Ｔリンパ球(CD3+) −「ヘルパー」Ｔリンパ球(CD4+) −サプレッサ−Ｔリンパ球(CD8+) −Ｂリンパ球(CD20+) −Ｔ活性化リンパ球(CD25+) −記憶Ｔリンパ球(CDA+/CD45RO+) −顆粒球(CD15+) ＜使用標識の説明＞ＣＤ３ CD3複合体は総ての成熟ヒトＴ細胞で発現する。それはＴ細胞受容体と非共有結合的に会合した5鎖(γ、σ、ε、ζ、η)からなる16〜28kDの間の分子量を有し、活性化シグナルの伝達に関与している。ＣＤ４ CD4(T4)はCD4+細胞の、抗原または標的細胞を提示する細胞との相互作用の間に、クラスII-MHC分子を認識する。それは免疫グロブリン・スーパーファミリーに属する、59kDの糖タンパク質であり、Ｔリンパ球の「ヘルパー/インデューサー」サブ集団に見られる（末梢血液のリンパ球の45%）。ＣＤ８ CD8分子(T8、30/32kD)は２種のペプチド鎖からなる糖タンパク質である。それはＴリンパ球の細胞障害/サプレッサーサブ集団に見られる（末梢血液のリンパ球の20-35%）。それはまた、NK細胞において、また末梢血液の「ヌル」細胞の30 %においても存在する。ＣＤ１５ CD15抗原(3FAL、X-ハプテン、SSEA)はラクト-N-フコペントースIII(200-185kD )である。少なくとも5つの主要なCD15の抗原が多核細胞の表面上（ヒト循環顆粒球のおよそ90%）に、また循環単球の一部(30-60%)に存在する。この抗原は正常なリンパ球の表面にはない。ＣＤ２０ CD20抗原は35/37kDのリンタンパク質である。それは扁桃および骨髄の末梢血液の総ての正常Ｂ細胞に存在する。ＣＤ２５ CD25分子はインターロイキン-2の低親和性受容体に相当する。それは55kDの糖タンパク質であり、それは活性化リンパ球(ＴおよびＢ)によるばかりでなく、活性化マクロファージによっても発現する。ＣＤ４５ＲＯこれは180kDのトランスメンブラン糖タンパク質（イソ型低分子量の白血球共通抗原）(LCA)である。それはＴリンパ球、胸腺細胞、顆粒球、単球（マクロファージ表面上にはない）の表面上、およびＢリンパ球の小集団上、に存在する。 CD45ROを発現するＴリンパ球は、記憶Ｔリンパ球（あるいは感作Ｔ細胞）（末梢血液のＴリンパ球の45%）である。 CD4+/CD45RO+細胞は「ヘルパー」シグナルを生じる。これらはIL-2およびIFN- γの初期のプロデューサーである。抗-CDx抗体（シグマ製品、Serotec、抗-CD25抗体を除く）を用いる標識については、100μｌのリンパ球懸濁液（標識済みあるいは非標識）を細胞密度10⁷細胞 /mlでエラスチンの67kD抗-受容体抗体とともに採取する。 10mlの抗-CDx抗体を加え、その懸濁液を20℃にて30分間インキュベートする（抗-CD25抗体を除く：0℃にてインキュベーションを行う）。次いで、2mlのPBSを加える。2回の洗浄後（400g、20℃にて10分間、2回遠心分離）、細胞プラグを取り除き、0.5mlのPBSを加え、懸濁液を細胞蛍光定量法により分析する。同様に、細胞の標識をイソ型-同種マウス免疫グロブリン（非特異的ミエローマタンパク質）によって行う（対照用）。＜結果＞ａ）蛍光顕微鏡法活性化したリンパ球におけるエラスチン受容体の証明分析したリンパ球−67kDのエラスチン／ラミニン受容体を発現したもの−の一部は、前記の実験条件下で特異的免疫蛍光を示す（陽性細胞）。培養４日目の陽性細胞のパーセンテージは蛍光顕微鏡により評価する： −2μｇ/mlのκ-エラスチンの存在下で培養した細胞：28.52±12.60% −κ-エラスチンを用いずに培養した細胞：28.09±10.91% ２つのシリーズ間で有意な差はなく、PHAによる活性化はエラスチン受容体を発現させる有意な刺激剤である。培養5日目の陽性細胞のパーセンテージ： −2μｇ/mlのκ-エラスチンの存在下で培養した細胞：77.2±6.7% ラクトースまたはメリビオースでの細胞洗浄の効果： −2μｇ/mlのκ-エラスチンの存在下で培養し、次いで、細胞培養の終了時に1 mg/mlのラクトース溶液で洗浄した細胞：26.6±6.7%(P<0.001)。洗浄前、77.2%の細胞が陽性 −2μｇ/mlのκ-エラスチンの存在下で５日培養し、次いで、細胞培養の終了時に1mg/mlのメリビオース溶液で洗浄した細胞：18.3±9.7%(P<0.001)。二次抗体のみ用い（陰性対照）、一次抗体は用いずにインキュベートした蛍光細胞は、蛍光を示さない。このように、メリビオースはラクトースよりもリンパ球エラスチン受容体の67kDサブユニットの脱着に関してより効果的であることが明らかである。用いた実験条件の下で、ラクトースは受容体の66%を、メリビオースは76%を脱着する。ｂ）細胞蛍光定量法表３種々の培養日数におけるエラスチン受容体を発現するヒトリンパ球のパーセンテージ D0：リンパ球を単離した日。 D2、D3、D5：リンパ球の単離後第2日、第3日、第5日。この実験から、刺激剤としてのPHAとともに細胞をインキュベートすることにより、エラスチン受容体の発現が段階的に誘導されることが明らかである。この誘導はエラスチンペプチドの存在下でも刺激される。しかしながら、この刺激は培養開始5日目までに有意ではなくなる。これらの条件下では、およそ2/3のリンパ球(≧66%)がそれらの表面でエラスチン受容体を発現する。 −二重標識の結果表４エラスチン受容体を発現する部分母集団の特性を決定するためのリンパ球の二重標識実験CDx+R67kD=抗CDx抗体と67kDエラスチン受容体の抗サブユニット抗体とで同時に標識した細胞。注：細胞はいくつかの受容体を同時に発現できるので、パーセンテージの合計は 100%にならない。この実験では、エラスチンペプチドの存在下、また不在下でエラスチン受容体を発現するリンパ球のサブクラスの特性を二重標識により求めた。依然として陰性であるCD15+細胞を除いて、検討した大部分のリンパ球のサブクラスはエラスチン受容体を発現することが明らかである。しかしながら、この CD15標識はPMNおよび一部の単球に相当する。この発現は、エラスチンペプチドの存在下でエラスチン受容体の発現を強力に増強させるCD4+およびCD45RO+リンパ球上のエラスチンペプチドの存在により重要な様式で刺激されるに過ぎない。問題はヘルパー細胞および記憶細胞と考えられる細胞の部分母集団の場合である。このように、正の反作用によるエラスチン受容体の、その活性化後のその固有の合成への連結は、これらの細胞に特異的であると考えられる。［例４］リンパ球における低分子量のκ−エラスチンの細胞障害作用に対する防御１）リンパ球の単離例１に記載の方法に従い、リンパ球を単離。細胞懸濁液を、5mMグルタミンおよび10%FCSを含有するRPMIで、10⁶細胞/2mlの濃度となるよう希釈する。２）細胞培養 (D0) リンパ球を、RPMI1640培地を補給した24ウェルのコースタープレート（10⁶細胞/2mlの細胞懸濁液500μｌ／ウェル）で培養する。細胞の分配は以下の通りである。 − κ-エラスチンを含有しない細胞懸濁液10ml。 − 2μｇ/mlのκ-エラスチンを含有する細胞懸濁液10ml、および、2mg/mlのκ-エラスチンを含有する細胞懸濁液10ml。（κ-エラスチンを含有し、ラクトースおよびメリビオースを含有しない対照）。 − 2mg/mlのκ-エラスチンおよび1mg/mlのメリビオースを含有する細胞懸濁液10ml。 − 2mg/mlのκ-エラスチンおよび1mg/mlのラクトースを含有する細胞懸濁液1 0ml。 − 1mg/mlのメリビオースを含有する細胞懸濁液10ml。 − 1mg/mlのラクトースを含有する細胞懸濁液10ml。３）死細胞のパーセンテージを求めるための、トリパンブルー存在下での細胞の計数培養５日目(D4)、細胞懸濁液を回収し、マラセズ(Malassez)細胞で0.1%トリパンブルー(Sigma)の存在下で細胞を計数する。トリパンブルーの毒性のため、計数は染料を添加した直後に計数する。＜結果＞表は、エラスチンペプチドの存在下の死細胞のパーセンテージおよびラクトースおよびメリビオースによる細胞死の防御を示す。この防御は100%に近い。2mg/ mlのエラスチンを含有する場合、κ-エラスチンを含まない対照と比較した）過剰死亡率は32.1%である。ラクトースまたはメリビオースの存在下でのこの過剰死亡率は1.3%である（96%の防御）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年７月２１日（１９９８．７．２１）【補正内容】請求の範囲１．オリゴ糖およびそのオリゴ糖誘導体が下記の通りである、細胞性免疫反応に関与する免疫調節剤の製造のための、2〜6の配糖体残基を含んでなり、かつ、その非還元末端位にガラクトース残基を有する少なくとも１種のオリゴ糖、または疎水性残基で置換されたそのようなオリゴ糖の誘導体、の使用。［ここで、オリゴ糖は、下記一般式を有し：ガラクトース-ｎ（αまたはβ）-（Ｈｅｘ）ｐ（式中、ｎは１、２、３、４または６位を表し、Ｈｅｘはα-またはβ-結合ヘキソースまたはペントースを表し、ｐは１〜５の間の数である）、そのオリゴ糖誘導体は下記カテゴリーａ）〜ｄ）から選択される：ａ）下式(I)および(II)に相当するグリコシド。・(I)オリゴ糖 1-O-R(式中、Rは1〜18個の炭素原子からなる直鎖または分枝アルキル残基である）、・(II)オリゴ糖 1-O-R-O-1-オリゴ糖（式中、R=(CH₂)_m、mは2〜10である）。ｂ）下記式(III)および(IV)の１つに従うアシル化されたオシルアミン。・(III)オリゴ糖 1-NH-CO-R(式中、Rは0、1または2個の二重結合を含有する、2〜18個の炭素原子からなるアルキル残基である）、・(IV)オリゴ糖 1-NH-CO-R-CO-NH-1-オリゴ糖（式中、R=(CH₂)_m、mは2〜8 である）。ｃ）下記(V)および(VI)のオリゴ糖の酸化により得られるアルドン酸によりアシル化されたアルキルアミン。・(V)オリゴ糖 -CO-NH-R(式中、Rは式(III)の定義に同じ）、・(VI)オリゴ糖 CO-NH-R-NH-CO-オリゴ糖（式中、Rは式(III)の定義に同じ）。ｄ）脂肪族モノ-またはジアミンを伴い、かつ、下記式(VII)および(VIII)の１つに相当する、オリゴ糖により形成されたシッフ塩基の還元生成物。・(VII)Gal-(Hex)_n-X-HN-R、・(VIII)Gal-(Hex)_n-X-HN-R-NH-X-(Hex)_n-Gal （式中、Hexはヘキソースまたはペントースであり、nは0、1または2、Xは1-NH₂- ヘキシトールであり、かつRは(III)の定義に同じ）］。２．薬剤がリンパ球における低分子量のκ-エラスチン細胞障害作用に対して防御を付与する、細胞性免疫反応に関与する免疫調節剤の製造のための請求項１に記載の使用。３．過敏性反応の治療または予防を意図し、かつ、細胞性免疫反応に関与する、組成物の製造のための、2〜6の配糖体残基を含んでなり、かつ、その非還元末端位にガラクトース残基を有する少なくとも１種のオリゴ糖、または疎水性残基で置換されたそのようなオリゴ糖の誘導体（該オリゴ糖およびそれらの誘導体は請求項１に記載のものである）、の使用。４．オリゴ糖が、メリビオースおよびラクトース、請求項１に記載のオリゴ糖誘導体、からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。５．組成物がさらに、外用局所経路による投与に適した医薬上許容される賦形剤を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。６．組成物がさらに、非経口または腸内経路による投与に適した医薬上許容される賦形剤を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。７．リンパ球が介在する過敏性反応の治療または予防を意図した組成物の製造のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。８．組成物が、皮膚および／または粘膜の不耐性および／またはアレルギー反応の治療または予防を意図したものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。９．組成物が、フリーラジカルの形成を防ぐ、または減らすことを意図したものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。１０．組成物が、アトピー、乾癬、多形成紅斑、乾燥皮膚炎、紅斑性狼瘡、天疱瘡、皮膚炎および湿疹の中から選択される病状の治療または予防を意図したものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。１１．活性素に対する過敏性反応を制限するアジュバントと合せた少なくとも１種の活性素を含み、かつ、そのアジュバントが2〜6の配糖体残基を含んでなり、かつ、その非還元末端位にガラクトース残基を有するオリゴ糖、または疎水性残基で置換されたそのようなオリゴ糖の誘導体（該オリゴ糖およびその誘導体は請求項１に記載のものである）、であることを特徴とする皮膚化粧組成物。１２． 2〜6の配糖体残基を含んでなり、かつ、その非還元末端位にガラクトース残基を有する少なくとも１種のオリゴ糖、または疎水性残基で置換されたそのようなオリゴ糖の誘導体（該オリゴ糖およびその誘導体は請求項１に記載のものである）を含有する組成物を、化粧品に許容されるビヒクルの形態で局所経路により塗布することを特徴とする、過剰反応皮膚の美容処理方法。１３．メリビオースまたは疎水性残基の付加により得ることができるメリビオースの誘導体、を含有する組成物を、化粧品に容されるビヒクルの形態で局所投与により塗布することを特徴とする美容処理方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/02 Ａ６１Ｐ 37/02 Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｚ // Ｃ０７Ｈ 3/04 Ｃ０７Ｈ 3/04 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞性免疫反応に関与する免疫調節剤の製造のための、2〜6の配糖体残基を含んでなり、かつ、その非還元末端位にガラクトース残基を有する、少なくとも１種のオリゴ糖、または疎水性残基で置換されたそのようなオリゴ糖の誘導体、の使用。２．過敏性反応の治療または予防を意図し、かつ、細胞性免疫反応に関与する、組成物の製造のための、2〜6の配糖体残基を含んでなり、かつ、その非還元末端位にガラクトース残基を有する、少なくとも１種のオリゴ糖、または疎水性残基で置換されたそのようなオリゴ糖の誘導体、の使用。３．オリゴ糖が、メリビオース、ラクトースおよび疎水性残基の付加により得ることができるそれらの誘導体、からなる群より選択される、請求項１および２のいずれか一項に記載のオリゴ糖の使用。４．直鎖または分枝C₁-C₁₈アルキル、C₁-C₁₈アルキルアミン、直鎖または分枝、所望により置換されていてもよいC₁-C₁₈カルボン酸、直鎖または分枝、第一級、第二級または第三級C₁-C₁₈アミド、およびC₁-C₁₈アリールアルキル、の中から選択される、疎水性残基により置換された誘導体を用いる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴ糖の使用。５．組成物がさらに、外用局所経路による投与に適した医薬上許容される賦形剤を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴ糖の使用。６．組成物がさらに、非経口または腸内経路による投与に適した医薬上許容される賦形剤を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴ糖の使用。７．リンパ球が介在する過敏性反応の治療または予防を意図した組成物の製造のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴ糖の使用。８．組成物が、皮膚および／または粘膜の不耐性および／またはアレルギー反応の治療または予防を意図したものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴ糖の使用。９．組成物が、フリーラジカルの形成を防ぐ、または減らすことを意図したものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。１０．組成物が、アトピー、乾癬、多形成紅斑、乾燥皮膚炎、紅斑性狼瘡、天疱瘡、皮膚炎および湿疹の中から選択される病状の治療または予防を意図したものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。１１．活性素に対する過敏性反応を制限するアジュバントと合せた少なくとも１種の活性素を含み、かつ、そのアジュバントが2〜6の配糖体残基を含んでなり、かつ、その非還元末端位にガラクトース残基を有するオリゴ糖、または疎水性残基で置換されたそのようなオリゴ糖の誘導体、であることを特徴とする皮膚化粧組成物。１２． 2〜6の配糖体残基を含んでなり、かつ、その非還元末端位にガラクトース残基を有する少なくとも１種のオリゴ糖、または疎水性残基で置換されたそのようなオリゴ糖の誘導体、を含有する組成物を、化粧品に許容されるビヒクルの形態で局所経路により塗布することを特徴とする、過剰反応皮膚の美容処置方法。１３．オリゴ糖が、メリビオース、および疎水性残基の付加により得ることができるその誘導体、からなる群より選択される、請求項１２に記載の美容処理方法。