SK12199A3

SK12199A3 - Use of an oligosaccharide as an immunomodulator in a dermato-cosmetic composition

Info

Publication number: SK12199A3
Application number: SK121-99A
Authority: SK
Inventors: Ladislas Robert; Alexandre Robert; Dominique Castelli
Original assignee: Roc Sa
Priority date: 1996-07-31
Filing date: 1997-07-30
Publication date: 2000-01-18
Also published as: RU99104398A; HUP9903904A2; FR2751876A1; AU3457697A; CZ29599A3; HUP9903904A3; EP0954322A1; FR2751876B1; WO1998004270A1; BR9710630A; CN1228705A; PL331478A1; NZ333985A; JP2000516591A; CA2262564A1; KR20000029754A

Description

POUŽITIE OLIGOSACHARIDOV AKO IMUNOMODULÁTOROV

V DERMATOKOZMETICKÝCH PRÍPRAVKOCH

OBLASŤ TECHNIKY

I

Navrhovaný vynález popisuje zmesi použiteľné v odbore imunológie a to konkrétne na liečbu reakcií precitlivenosti zodpovedných za alergie a rôzne prejavy netolerancie.

DOTERAJŠÍ STAV TECHNIKY

Imunitná reakcia proti infekčným činidlám, toxínom alebo zhubnému bujneniu je založená na rozpoznávaní cudzorodej povahy antigénu (alebo alergénu) a aktivácii bunkových alebo humorálnych mediátorov určených na likvidáciu cudzorodého antigénu. Aj napriek tomu, tento mechanizmus môže byť občas nežiadúci, a to pokiaľ je príliš silný, alebo je zameraný proti antigénom, ktoré nie sú v podstate nijako škodlivé, je to hlavne v prípadoch orgánových transplantácií alebo tkanivových štepov.

Imunologické reakcie smerujúce k alergii sú rozdelené do 4 kategórií :

Typ I : Mastocyty naviažu svojimi Fc receptormi protilátky triedy IgE, naviazanie antigénu potom spustí degranuláciu mastocytov a vyliatie mediátorov (histamín, SRS-A, ECF-A).

Typ II : Špecifické protilátky (IgG a IgM) reagujú s antigénom na povrchu cieľovej bunky, čo spôsobí cytolýzu buď priamou aktiváciou zabíjajúcich buniek, alebo aktiváciou komplementa.

Typ III : Protilátky (IgG a IgM) vytvoria s antigénom a komplementom imunokomplexy, ktoré sa usadzujú v tkanive a aktivujú produkciu chemotaktických faktorov pre polynukleárne neutrofily, čo vedie ku vzniku lokálneho zápalu.

Typ IV : T-lymfocyty senzitívne pre určitý antigén po reakcii s ním začnú tvoriť lymfokíny. Lymfokíny indukujú zápalovú reakciu a spôsobujú nahromadenie makrofágov. Lymfocyty sú teda klúčové bunky zodpovedné ako za bunkové, tak aj humorálne reakcie imunitného systému, predovšetkým za

I sekréciu protilátok. '

Alergické predispozície môžu byť teda dané jedným alebo niekoľkými typmi imunitných reakcií. Tieto reakcie môžu byť v zásade reakcie intolerancie na hygienické a ošetrujúce produkty, pozorované v koži a nazývané „hyperreaktívne. Tento prejav spôsobený faktormi prostredia vznikne vďaka daným genetickým faktorom a získanej hypersenzitivite.

PODSTATA VYNÁLEZU

Teraz bolo zistené, že prejav hypersenzitivity môže byť kontrolovaný pomocou oligosacharidov, obsahujúcich od 2 do 6 osidových skupín s galaktózovým zostatkom v neredukujúcej terminálnej pozícii, alebo derivátmi týchto sacharidov substituovaných hydrofóbnymi rezíduami.

Navrhovaný vynález popisuje použitie oligosacharidov, obsahujúcich od 2 do 6 osidových skupín s galaktózovým zostatkom v neredukujúcej terminálnej pozícii, alebo derivátov týchto sacharidov na prípravu imunomodulačných prípravkov, a to konkrétne na liečbu alebo prevenciu reakcií precitlivelosti.

Konkrétne vhodné oligosacharidy môžu byť odvodené od melibiózy, laktózy a ich derivátov získaných pridaním hydrofóbnych skupín.

Hydrofóbnymi substituentami sú predovšetkým lineárne alebo vetvené Ci-Ci₈ alkyly, Ci-Ci₈ alkylamíny, lineárne alebo vetvené, dokonca i substituované Ci~Ci₈ karboxylové kyseliny, lineárne alebo vetvené, primárne, sekundárne alebo terciálne

Cj-Cie amidy a Ci-Cie arylalkyly. Oligosacharidové deriváty prispôsobené na použitie v navrhovanom vynáleze by mali spadať do jednej z kategórie spomínanej ďalej, kde všeobecný vzorec oligosacharidov by mal zodpovedať nasledujúcemu vzorcu

Galaktóza - _n(oc alebo β) - (Hex)_pkde : n predstavuje polohu 1,2,3,4 alebo 6

Hex predstavuje a- alebo β- napojenú hexózu alebo pentózu p je číslo medzi 1 a 5

a) - glykozidy zodpovedajúce vzorcu :

• (I) oligosacharid 1-0-R, kde R je lineárny alebo vetvený alkylový zostatok s 1 až 18 uhlíkovými atómami • (II) oligosacharid 1-O-R-O-l-oligosacharid, kde

R=(CH₂)mz kedy m leží medzi 2 a 10

b) - osylamín alkylovaný podlá jedného z nasledujúcich vzorcov,

I kde preferovaným oligosacharidom je' laktóza, melibióza alebo stachióza :

- alkylovaný osylamín zodpovedajúci jednému z nasledujúcich vzorcov :

• (III) oligosacharid 1-NH-CO-R, kde R alkylový zostatok s 2 až 18 uhlíkovými atómami obsahujúci 0,1 alebo 2 dvojné väzby • (IV) oligosacharid 1-NH-CO-R-CO-NH-l-oligosacharid, kde R=(CH₂)_m, kedy m leží medzi 2 a 8

c) - alkylamín acylovaný kyselinou aldónovou, ziskanou oxidáciou oligosacharidu • (V) oligosacharid CO-NH-R, kde R je rovnaké ako u vzorca (III) • (VI) oligosacharid CO-NH-R-NH-CO-oligosacharid, kde R je rovnaké ako u vzorca (III)

d) - alebo redukčný produkt Schiffovej bázy tvorený oligosacharidmi s alifatickými mono- alebo diamínmi a zodpovedajúci nasledujúcemu vzorcu :

• (VII) Gal-(Hex)n-X-HN-R • (VIII) Gal-(Hex)n-X-HN-R-NH-X-(Hex)_n-Gal, kde: Hex je hexóza alebo pentóza n = 0,1 alebo 2 i X = l-NH₂~hexitol

R je rovnaké ako u vzorca (III).

Podlá konkrétnej najvýhodnejšej metódy, oligosacharidy alebo ich deriváty tak, ako sú definované vyššie, budú použité na prípravu prípravkov obsahujúcich navyše farmaceutický prijateľný nosič nevhodný na aplikáciu bežnou externou cestou.

V skutočnosti bolo zistené, že reakcie zapojené v prejavoch spojených s hypersenzitivitou môžu byť v korelácii s fixáciou peptidov vedúcich k degranulácii elastínu, predovšetkým κ-elastínu, na špecifický lymfocytárny receptor.

Aktivácia týchto receptorov spustí ‘ sekréciu lytických enzýmov, β-glukuronidázy, elastázy a voľných radikálov, ako je napríklad superoxidový ión alebo peroxid vodíka, ktorý podporuje vznik hydroxylových radikálov. Tieto produkty môžu ovplyvniť degradáciu makromolekúl medzibunkovej hmoty, fibronektín, kolagén a hyaluronan. Naviazanie elastínových peptidov teda stimuluje proliferáciu lymfocytov.

Tento fenomén zohráva dôležitú úlohu v imunoalergických reakciách atopického pôvodu, predovšetkým atopickej dermatitídy alebo anafylaktických reakcií, urtikarie a alergickej kontaktnej dermatitídy. Jedinci, ktorých koža je precitlivelá alebo hyperaktívna, sa v populácii vyskytujú častejšie a častejšie. Ich koža ľahko reaguje sčervenaním a bolesťou a ich nárast reaktivity je nižší vzhľadom ku zdravej koži. Jedinec potom zažíva nepríjemné pocity spojené s erytémou a ľahkým svrbením.

Všetky tieto symptómy môžu byť zmiernené alebo dokonca potlačené použitím prípravku obsahujúceho oligosacharidy podlá navrhovaného vynálezu. Melibióza, laktóza alebo ich deriváty čiastočne alebo úplne potlačujú bunkovú proliferáciu dokonca i v prípade skôr stimulovaných lymfocytov, môžu dokonca inhibovať potencializáciu a sekréciu lytických enzýmov.

Prípravok by mal byť vytvorený na takom základe, ktorý neobsahuje žiadny parfumačné alebo alergénne činidlo. Prípravok môže byť vo forme roztoku, gélu, oleja, krému, V/0 alebo 0/V emulzie alebo niekolkých emulzií v lipozomálnej forme. Môže byť upravený odborníkom v obore, predovšetkým použitím zmäkčovadiel alebo slabých povrchovo aktívnych látok.

Prípravok je prispôsobený predovšetkým na liečbu alebo prevenciu intolerancie a/alebo alergickej reakcie v koži a/alebo na membránach slizníc. Konkrétne prípravok podlá navrhovaného vynálezu je určený na prevenciu alebo zníženie formovania a vzniku voľných radikálov.

Oligosacharidy alebo ich deriváty môžu byť spojené s ďalšími látkami, ktoré sú schopné kožu chrániť a/alebo hydratovať, ako je kyselina hyalurónová, vitamín E, glykolový extrakt z G. biloba, sorbitol, glukózaminoglykány, algináty atď. Môžu byť tiež asociované s rastlinnými olejmi vyživujúcimi pokožku a/alebo s aktívnymi zmäkčovadlami, ako je napríklad extrakt z planého viniča, althaey, ovsa, lipy, harmančeka, sladkej ďateliny, rastlín rodu Ruscus, prokyanidol, abisabolol, kokosový olej, kyselina 18-p-glycyrretínová.

Podlá iného aspektu navrhovaného vynálezu sú oligosacharidy a ich deriváty, tak ako sú definované vyššie, použité na prípravu zmesi, ktorá ďalej obsahuje farmaceutický prijateľný nosič, určený na podanie parenterálnou alebo enterálnou cestou. Účinnosť týchto oligosacharidov podľa navrhovaného vynálezu je založená na ich prekvapivom vplyve na imunitný systém reakcie mediovanej bunkami.

Prípravky pripravené podlá navrhovaného vynálezu sú konkrétne použitelné na liečbu alebo prevenciu hypersenzitívnych reakcií mediovaných lymfocytmi. Konkrétne je určená na liečbu alebo prevenciu symptómov týchto chorôb väčšina atópii, polymorfná erytéma, xerodermatitída, lupus erytematosus, pemphigus, dermatitídy, lupienka a ekzémy.

Oligosacharidy s galaktózovými skupinami v neredukujúcej terminálnej pozícii a ich deriváty substituované hydrofóbnymi skupinami môžu byť použité ako adjuvans, obmedzujúci reakcie hypersenzitivity, ktoré sú vyvolávané iným aktívnym postupom.

Vynález teda popisuje spôsob kozmetického ošetrenia hyperreaktívnej pokožky charakterizovaný tým, že prípravok obsahuje aspoň jeden oligosacharid obsahujúci od 2 do 6 osidových skupín s galaktózovou skupinou v neredukujúcej terminálnej pozícii, alebo deriváty týchto oligosacharidov substituované hydrofóbnymi skupinami a je podávaný v kozmeticky prijateľnom nosiči povrchovou cestou.

Konkrétne preferované látky vhodné na zavedenie do praxe sú melibióza, laktóza a ich deriváty získané pridaním hydrofóbnych skupín.

PREHÍAD OBRÁZKOV NA VÝKRESOCH

Príklady, vynálezu. V obrázkom.

Obr. 1 : stimulovaných ktoré nasledujú, sú určené len na ilustráciu týchto príkladoch sú odkazy k nasledujúcim

Inhibícia proliferačnej aktivity K-elastínom pomocou laktózy a lymfocytov melibiózy.

Koncentrácie laktózy a melibiózy sú 1 gg/ml, 10 μς/ιηΐ, 100 gg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml.

Obr. 2 : Inhibícia expresie elastickej aktivity u lymfocytov stimulovaných 2 gg/ml κ-elastinu, pomocou laktózy a melibiózy. Aktivita je meraná v kultúre.

Obr. 3 : Inhibícia expresie katepsínu G u lymfocytov stimulovaných 2 gg/ml κ-elastínu. Aktivita je meraná v kultúre.

PRÍKLADY USKUTOČNENIA VYNÁLEZU

Príklad 1

1. Metodika

Izolácia lymfocytov

Lymfocyty použité na tieto experimenty boli získané z periférnej ľudskej krvi a/alebo z ľudských mandlí po tonsilektómii. Izolácia periférnych lymfocytov prebiehala nasledovne : 5 ml krvi bolo navrstvené (v 15 ml centrifugačných skúmavkách) na Ficoll-pague plus (Farmácia) tak, aby sa nezamiešali dve fázy, potom bola centrifugovaná pri 3000 rpm (asi 600 g) po dobu 40 minút a pri izbovej teplote (20 °C) . Vrstva obsahujúca lymfocyty a monocyty bola odobraná a zmiešaná s 10 ml RPMI média a centrifugovaná pri 2200 rpm (asi 400 g) po dobu 10 minút pri 20 °C. Sediment bol resuspendovaný v 0,5 ml RPMI, potom bolo pridaných ďalších 4,5 ml RPMI a znova centrifugované pri 1500 rpm (asi 400 g) po dobu 10 minút pri 20 °C. Konečný sediment bol resuspendovaný v 10 ml RPMI a boli v ňom spočítané bunky. Monocyty a makrofágy boli eliminované pomocou adhézie na plastikový povrch (inkubácia 2 hod v CO₂/O₂inkubátore).

Separácia polynukleárnych buniek (PMN)

Po prvej centrifugácii pri 300 rpm (asi 600 g) zostatok obsahujúci červené čiastočky a PMN bol resuspendovaný v 1 % polyvinylalkohole (PVA) v DPBS (Dulbecco's modified phosphatebuffered saline), dva objemy na jeden objem sedimentu, a potom bol roztok nechaný sedimentovať 20 minút pri izbovej teplote. Supernatant bol potom centrifugovaný 5 minút pri 400 g a 4 °C, sediment bol veľmi opatrne premytý DPBS tak, aby bol odstránený PVA, ale neboli aktivované PMN, potom nasledovala centrifugácia pri 400 g a 4 °C. Supernatant bol eliminovaný. Červené krvinky boli lyzované osmotickým šokom a potom bolo pridané DPBS tak, aby sa znova získala osmotická rovnováha. Po centrifugácii pri 400 g po dobu 5 minút vo 4 °C, bol sediment obsahujúci PMN resuspendovaný v malom objeme RPMI. Bunky boli spočítané a mohli byť lyzované tak, aby sa uvoľnili lytické enzýmy (elastáza a katepsín) pridaním 0,1 % tritonu X-100 v IM NaCl pri 0 °C po dobu 20 minút, potom nasledovala centrifugácia pri 0 °C po dobu 20 minút. Supernatant obsahoval enzýmy.

<

Preparácia lymfocytov z ľudských mandlí

Čerstvo vybraté mandle sú rozstrihané na malé kúsky v sterilných podmienkach v 10 ml RPMI. Tkaninová suspenzia je filtrovaná cez hrubý filter tak, aby boli odstránené väčšie zostatky tkaniva. Suspenzia bola prenesená do skúmavky a nechaná sedimentovať po dobu 15 minút pri izbovej teplote. Supernatant bol prenesený na Ficoll-pague plus a centrifugovaný tak, ako je popísané u lymfocytov získaných z krvi. Monocyty sú tiež eliminované tak, ako v prípade lymfocytov izolovaných z krvi. Sediment obsahujúci lymfocyty bol resuspendovaný a bunky spočítané po dvoch centrifugáciách, tak ako je popísané vyššie. Lymfocyty získané izoláciou z mandlí sú približne 50 % typu Ta 50 % typu B. Lymfocyty získané z krvi sú približne 80 % typu Ta 20 % typu B.

Kultúra lymfocytov

Lymfocyty izolované tak, ako je popísané vyššie, boli inkubované v 24 jamkovej doštičke Costar, 500 μΐ bunkovej suspenzie na jamku (5xl0⁵ buniek na ml alebo 2,5 x 10⁵ buniek) v RPMI 1640 (eurobio) obsahujúci 10 % fetálneho hovädzieho séra (ATGC), 2 mM glutamín (Gibco), penicilín a streptomycín (500

U/ml, 0,25 mg/ml), a fytohemaglutinín (Sigma) 5 gg/ml. Po inkubácii po dobu štyroch dní v podmienkach bunkovej kultúry (37 °C, CO2/O2 inkubátor) bola bunková suspenzia odobraná pinzetou, centrifugovaná pri 400 g po dobu 10 minút a 20 °c a bunkový sediment bol resuspendovaný v 0,5 ml RPMI (bez FCS) premiešaný potrepaním a po ďalšom pridaní 10 ml RPMI bez FCS bola centrifugovaná opäť pri 1500 rpm (400 g) po dobu 10 minút pri 20 °C. Po ďalších dvoch premytiach tak, ako je popísané vyššie, bol sediment resuspendovaný v 10 ml RPMI bez FCS a bunky boli opäť prenesené do kultúry na 24 jamkové doštičky Costar.

(

Inkubácia s peptidmi elastínu

Sterilný roztok κ-elastínu (75 kD, Solabia) bol pridaný k bunkám do kultúry v konkrétnej koncentrácii (napríklad 2 pg/ml) a inkubovaný v médiu bez FCS po dobu 2,5 hod pri 37 °C. Po inkubácii boli doštičky opatrne premiešané, bunky odoberané pipetou a spočítané. Suspenzia bola centrifugovaná po dobu 10 minút pri 4 °C pri 1500 rpm (asi 400 g), a supernatant bol rozdelený do 1 ml skúmaviek eppendorf na 0,5 ml alikvóty a zmrazený pri -40 °C dovtedy, kým nebude použitý na okamžité stanovenie enzymatickej aktivity. Bunkový sediment bol resuspendovaný v extrakčnom pufri (0,1 % triton X-100, 1 M

NaCl, 0,02 % NaN₃, 0,01 % Brij 35, pH 8), 1 ml na 10⁶ buniek, a centrifugovaný 15 minút pri 1600 g pri 0 °C a rovnako ako je popísané vyššie bol získaný supernatant doplnený do skúmaviek eppendorf a nechaný pri -40 °C až do určenia enzymatickej aktivity.

Určenie enzymatickej aktivity enzýmov typu elastáz u leukocytov

Syntetický substrát použitý na určenie enzymatickej aktivity typu elastáz je Me-O-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA. 50 μΐ média alebo 20 μΐ bunkového' lyzátu bolo zmiešaných s púfrom (100 mM tris-HCL, 0,05 % CaCl₂, 0,02 % NaN₃, 0,01 % Brij 35, pH 8) do 190 μΐ, potom bolo pridané 10 μΐ 85 mM roztoku substrátu (v N-Metylpyrolidón) na doplnenie celkového objemu 200 μΐ. Optický tlak je okamžite zmeraný pri 410 nm a potom po 4, 24, 48 a 72 hodinovej inkubácii pri 37 °c. Aktivita elastázy je určená v nM substráte hydrolyzovaného na 10⁶ buniek za hodinu.

Určenie enzymatickej aktivity katepsínu G mg substrátu Me-O-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA v 1 ml Nmetylpyrolidónu (40 nM) bolo použitých za rovnakých podmienok ako je popísané vyššie. ,

2. Závery

a) Efekt elastínových peptidov na proliferáciu lymfocytov

Zvýšenie hladiny vápnika vyvolané pridaním elastínových peptidov k bielym krvným bunkám môže byť uvažované ako dôkaz spustenia signalizácie pre rad bunkových funkcií. Jednou z nich je vstup buniek do proliferačného cyklu. Bolo dokázané, že sa to stáva v prípade kožných fibroblastov v prítomnosti elastínových peptidov (Ghuisen-Itart et all, C.R.Acad.Sci., 1992, 315:473-478). Závery uvedené v tabuľke 1 ukazujú, že stimulácia zodpovedajúca proliferácii lymfocytov bola dokázaná.

Tabuľka 1

Koncentrácia κ-elastínu	Počet experimentov	Percentá stimulácie priemer ± smerodajná odchýlka
2 pg/ml	6	62, 67 ± 37, 90
10 gg/ml	13	35, 76 ± 29, 50

Maximálna stimulácia bola pozorovaná pri 2 μς/πιΐ elastínových peptidov a o niečo slabšia stimulácia bola dokázaná pri koncentrácii 10 gg/ml elastínových peptidov.

b) Zvýšenie proteolytickej aktivity pomocou elastínových peptidov

Pokiaľ sú polymorfonukleáre alebo lymfocyty inkubované v kultúre za prítomnosti 2 gg/ml κ-elastínu, potom v bunkovom extrakte a v lyzáte je pozorovaný stúpajúci nárast elastázovej a katepsínovej aktivity. Tento nárast je viac viditeľný v bunkách získaných zo starších artériosklerotických jedincov. Nárast tejto aktivity nie je pozorovaný v neprítomnosti kelastínu. Pridanie elastínových peptidov zvýši proteolytickú aktivitu ako v bunkovej kultúre v médiu (vysolené enzýmy), tak v bunkovom extrakte (enzýmy naviazané na bunku), ako pre elastázu, tak pre katepsín G, aj keď tento efekt môže byť skôr vysvetľovaný zvýšením enzymatickej aktivity v supernatante bunkovej kultúry.

c) Efekt elastínových peptidov na bunkové prežívanie

Tento experiment bol uskutočnený v podmienkach bunkovej kultúry tak, ako bol popísaný vyššie, v prítomnosti fytohemaglutinínu (PHA). 5 ml alikvótov lymfocytárnej suspenzie (2,5 x 10⁶ buniek v 5 ml) získaných izoláciou z (Ľudských mandlí bolo rozdelených do testovacích skúmaviek spolu so zvyšujúcou sa koncentráciou κ-elastínu (BPM, PM < 10 kDa): 1 gg/ml, 2 pg/ml, 10 gg/ml, 500 gg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml.

Po štyroch dňoch inkubácie v štandardných kultivačných podmienkach boli bunky odoberané a spočítané. Tabuľka 2 ukazuje stratu buniek ako funkciu koncentrácie pridaných elastínových peptidov.

Tabuľka 2

Koncentrácia elastínových peptidov v gg/ml	Percentá úbytku buniek určené počítaním v Trypanovej modrej
0	5,3
1	5, 0
2	2,5
10	17,4
100	19, 6
500	28,9
1000	39,3
2000	39,1

Ukázalo sa, že elastínové peptidy majú vyššiu cytotoxickú aktivitu pri vyšších koncentráciách (tisíckrát vyššiu ako koncentrácia stimulujúca bunkovú proliferáciu a ako vysolené lytické enzýmy).

PRÍKLAD 2

Efekt laktózy a melibiózy na reakcie mediované elastínovým receptorom lymfocytov

1) Inhibícia bunkovej proliferácie

Ako bolo ukázané na obr. 1, vzrastajúca koncentrácia laktózy a melibiózy progresívne potlačujú stimuláciu rastu vyvolanú elastínovými peptidmi, nasledovanou inhibíciou proliferácie pri najvyšších testovaných koncentráciách (1 a 2 mg/ml), čo zodpovedá 5,84 x 10^-3 mM roztoku. Najsilnejšia inhibícia proliferácie je v rozmedzí od 16 do 30 % pre laktózu a od 26 do 58 % pre melibiózu.

2) Efekt laktózy a melibiózy na vysolené proteolytické enzýmy spúšťané pomocou elastínového receptora

Ako bolo ukázané vyššie, nárast od 40 do 120 % v aktivite proteolytických enzýmov je pozorovaný v bunkovom médiu rovnako ako v bunkovom lyzáte ľudských lymfocytov kultivovaných v prítomnosti 2 μg/ml κ-elastínu. Stimulácia zvýšenia lytickej enzymatickej aktivity je inhibovaná efektívne melibiózou už od koncentrácie 1 gg/ml. Táto inhibícia môže byť dokázaná ako pre elastázpvú aktivitu, tak aj pre aktivitu katepsínu G. Rovnako tak laktóza je v tomto prípade účinná, ale so slabším efektom ako melibióza (obr. 2 a 3).

PRÍKLAD 3

Kvantifikácia elastínových receptorov v subpopuláciách ľudských lymfocytov

Metodiky

Použité protilátky :

- primárna protilátka : anti 67 kD receptor pre elastín/laminín protilátka (bovinná), triedy IgM, produkovaná na myšiach (Elastin Products Company).

sekundárna protilátka : myšia anti-IgG + IgM (H+L) protilátka produkovaná na kozách, označená rodamínom (TRITC) (Jackson Immunoresearch Laboratories), pre fluorescenčnú mikroskopiu

- sekundárna protilátka : myšia anti IgM protilátka F(ab')₂/ produkovaná na kozách, označená r-fykoerytrínom (Chemicon), pre prietokovú cytometriu.

Protokol :

a) Fluorescenčná mikroskopia

Ľudské lymfocyty izolované z ludských mandlí (tak ako bolo popísané v príklade 1) sú kultivované v prítomnosti 5 pg/ml fytohemaglutinínu (tak, aby boli aktivované) a časť z nich bola kultivovaná s 2 gg/ml κ-elastínu o vysokej molekulovej váhe (75 kD) v médiu RPMI 1640 s 10 % fetálneho hovädzieho séra (FCS) . Po inkubácii trvajúcej 48 až 120 h pri 37 °C boli lymfocyty premyté 3x v RPMI médiu obsahujúcom 2 % FCS a potom centrifugované pri 400 g, 10 minút pri 4 °C. Potom boli bunky spočítané a rozdelené na koncentráciu 10⁷ buniek/ml v RPMI médiu obsahujúcom 2 % FCS.

Časť (100 μΐ) bunkovej suspenzie ludských lymfocytov (asi 10⁶ buniek) bola inkubovaná s 10 μΐ roztoku prvej protilátky (nariedenej 1:100) po dobu 30 minút v ľadovom kúpeli. Bunky boli premyté 1,5 ml ľadového RPMI s 2 % FCS a centrifugované v predchladenej centrifúge pri 4 °C (400 g, 10 minút).

Roztok sekundárnej protilátky (konjugovanej s TRITC, rozdelenej v ladovom RPMI 1:200) bol pridaný k pelete. Po jemnom premiešaní bola suspenzia inkubovaná 30 minút pri 4 °C. Potom bolo pridaných 1,5 ml ľadového RPMI s 2 % FCS a suspenzia bola centrifugované pri 400 g a 4 °C po dobu 10 minút.

Po ukončení posledného premytia boli lymfocyty resuspendované v reziduálnom médiu potom, ako bol supernatant odstránený dekantáciou. Potom sa na sklíčkach urobili roztery, ktoré sa nechali na vzduchu vyschnúť. Po fixácii v čistom etanole po dobu 5 minút boli vzorky rehydratované inverzne v niekoľkých kúpeľoch PBS a zaliate glycerolom s PBS (9 objemov glycerolu na 1 objem PBS). Táto posledná procedúra zvyšuje jasnosť imunofluorescencie. Na identifikáciu označených buniek boli preparáty pozorované striedavo pod viditeľným svetlom i pod UV.

b) Fluorimetria

Po poslednom premytí boli lymfocyty resuspendované v 1 ml PBS a bunky analyzované cytofluorometricky.

Boli pozorované nasledujúce charakterizované bunkové populácie • Celkové T lymfocyty (CD3 +) • Pomocné T lymfocyty, T helpery (CD4 +) • Supresorové T lymfocyty (CD8 +) • B lymfocyty (CD20 +) • Aktivované T lymfocyty (CD25 +) • Pamäťové T lymfocyty (CDA +/CD45RO+) • Granulocyty (CD15 +)

Popis použitých znakov :

CD3

Komplex CD3 je exprimovaný všetkými zrelými ľudskými T bunkami. Jeho molekulová váha je medzi 16 a 28 kD a je zložený z piatich reťazcov (γ,σ, ε,ξ,η) asociovaných s T bunkovým receptorom nekovalentných interakcií. Je zapojený v prenose aktivačného signálu.

CD4

CD4(T4) molekula rozoznáva MHC molekuly II. triedy počas interakcie CD4 +buniek s bunkami prezentujúcimi antigén alebo delovými bunkami. Ide o glykoproteín s molekulovou váhou 59 kD patriaci do superrodiny imunoglobulínov. Nachádza sa na subpopulácii T lymfocytov patriacich do skupiny pomocných buniek (helper/inducer), čo je asi 45 % lymfocytov periférnej krvi.

CD8

Molekula CD8 (T8, 30/32 kD) je glykoproteín tvorený dvoma peptidovými reťazcami. Nachádza sa na populácii cytotoxických/supresorových T lymfocytov, čo je 20 až 35 % lymfocytov periférnej krvi. Je tiež prítomný na NK bunkách a na 30 % tzv. nulových buniek v periférnej krvi.

I t

CD15

CD15 antigén (3FAL, X-haptén, SSEA) je lakto-N-fukopentóza III (200 až 185 kD) aspoň 5 hlavných antigénov CD15 je prítomných na povrchu polynukleárnych buniek (čo je asi 90 % ľudských granulocytov v obehu) a na časti cirkulujúcich monocytov (30 až 60 %) . Tento antigén sa nenachádza na povrchu normálnych lymfocytov.

CD20

Antigén CD20 je fosfoproteín s molekulovou váhou 35 až 37 kD. Je prítomný na všetkých normálnych B bunkách v periférnej krvi, v uzlinách a v kostnej dreni..

CD25

Molekula CD25 zodpovedá nízkoafinnému receptoru pre interleukín 2. Ide o glykoproteín s molekulovou váhou 55 kD exprimovaný aktivovanými lymfocytmi (T a B), ale tiež aktivovanými makrofágmi.

CD45RO

Ide o transmembránový glykoproteín s molekulovou váhou 180 kD (izoformy s nižšou molekulovou váhou sa nazývajú bežný leukocytárny antigén, LCA). Je prítomný na povrchu T lymfocytov, tymocytov, granulocytov, monocytov (nie je však prítomný na povrchu makrofágov) a na malej populácii B lymfocytov. T lymfocyty exprimujúce CD45RO sú pamäťové T lymfocyty (alebo indukované T bunky), čo je zhruba 45 % T lymfocytov v periférnej krvi.

CD4 +/CD45RO + bunky produkujú tzv. pomocné signály. Ide predovšetkým o častú produkciu IL-2 a IFN-γ.

Na značenie pomocou antiCDx protilátok (všetko Sigma, okrem antiCD25 protilátky od Serotecu) bolo odobraté vždy 100 μΐ lymfocytárnej suspenzie (buď už označenej alebo nie) zároveň s 67 kD protilátkou proti receptoru elastínu s bunkovou hustotou 10⁷ buniek/ml. K suspenzii bolo pridané 10 μΐ antiCDx protilátky a inkubácia prebiehala 30 minút pri 20 °C (len v prípade antiCD25 protilátky inkubácia prebiehala pri 0 °C) . Potom boli pridané 2 ml PBS. Po dvoch premytiach (dve centrifugácie pri 400 g pri 20 °C po dobu 10 minút) bola bunková peleta odobraná, resuspendovaná v 0,5 ml PBS a analyzovaná cytofluorometricky. Špecifita značenia bola vždy overená pomocou izotypovo podobného myšieho imunoglobínu (nešpecifický myelomový proteín).

Závery :

a) Fluorescenčná mikroskopia

Dôkaz prítomnosti elastínového receptora na aktivovaných leukocytoch

Časť analyzovaných lymfocytov, tie, ktoré exprimujú 67 kD

elastín/laminín	receptor,	vykazujú	špecifickú
imunofluorescenciu	za experimentálnych podmienok	popísaných
vyššie (pozitívne	bunky).
Percentuálne	zastúpenie	pozitívnych buniek	v kultúre
vo štvrtom dni	inkubácie,	tak, ako bolo	stanovené
fluorescenčnou mikroskopiou :

- bunky kultivované v prítomnosti 2 μg/ml κ-elastínu :

28,52 ± 12,6 %

- bunky kultivované bez κ-elastínu 28,09 ± 10,91 %

V tomto prípade nebol preukázaný signifikantný rozdiel medzi týmito dvoma skupinami, aktivácia buniek pomocou PHA je pravdepodobne dostatočným signálom pre expresiu elastínového receptora.

Percentuálne zastúpenie pozitívnych buniek v kultúre piaty deň inkubácie

- bunky kultivované v prítomnosti 2 μς/πιΐ κ-elastínu :

77,2 ± 6,7 % t

Ovplyvnenie buniek po premytí laktózou alebo melibiózou :

- bunky kultivované v prítomnosti 2 gg/ml κ-elastínu a nakoniec premyté v kultúre jedným μς/πιΐ laktózy :

26, 6 ± 6,7 % (p 0,001) .

Pred premytím bolo 77,2 % buniek pozitívnych

- bunky inkubované päť dní v prítomnosti 2 μg/ml κ-elastínu a nakoniec premyté v kultúre jedným μς/πιΐ melibiózy :

18,3 ± 9,7 % (p 0,001) .

Bunky inkubované len so sekundárnou protilátkou bez prítomnosti prvej protilátky (negatívna kontrola) nevykazujú žiadnu fluorescenciu. To dokazuje, že melibióza je efektívnejšia ako laktóza na nasýtenie 37 kD podjednotky lymfocytárneho elastínového receptora : laktóza nasýti 66 % receptora a melibióza 76 % za experimentálnych podmienok, ako boli popísané vyššie.

b) Cytofluorometria

Percentuálne zastúpenie ludských lymfocytov exprimujúcich elastínový receptor po niekolkých inkubačných obdobiach je znázornené v tabulke 3.

DO : Deň, kedy boli lymfocyty separované

D2, D3, D5 : Druhý, tretí a piaty deň po separácii lymfocytov :

Tabuľka 3 % percento pozitívnych buniek

Deň	Bez κ-	elastínu	Počet experimentov	S 2 pg/ml κ-elastínu	P
DO	1,12	± 0,2 %	6	1,15 ± 0,1 %	-
D2	22,33	± 5,2 %	5	23,02 ± 3,2 %	-
D3	29,7	± 0,8 %	7	32,40 ± 3,5 %	0,178
D5	59, 91	. ± 4,9 %	10	66, 42 ± 1,19 %	0, 006

Z tohto experimentu vyplýva, že inkubácia buniek s PHA stimuluje progresívne expresiu elastínového receptoraa. Táto indukcia je ďalej stimulovaná v prítomnosti elastínových peptidov. Aj napriek tomu miera tejto stimulácie nie je zreteľná do začiatku piateho dňa inkubácie v kultúre. Za týchto podmienok približne dve tretiny lymfocytov (viac· ako 66 %) exprimuje elastínový receptor na svojom povrchu.

Výsledky dvojitého značenia :

Tabuľka 4

Použitie dvojitého značenia lymfocytov na identifikáciu subpopulácii lymfocytov exprimujúcich elastínový receptor

i buniek exprimujúcich elastínový receptor	(67 kD)+značenie CDx s K-elastínom
	bez κ-elastínu
R67kD+	59,9	66, 4
CD4 + R67kD+	26, 5	45, 7
CD8 + R67kD+	11,9	16, 1
CD15 + R67kD+	0, 0	0, 0
CD20 + R67kD+	36, 7	36, 3
CD25 + R67kD+	39, 6	46, 9
CD45RO +R67kD+	26, 6	41,1

CDx + R67kD = bunky označené zároveň protilátkou antiCDx a protilátkou proti podjednotke 67kD elastínového receptora. Poznámka : Súčet % spolu nedáva 100 %, pretože bunky zároveň exprimujú niekoľko receptorov.

V tomto ' experimente bola pomocou dvojitého značenia zisťovaná presná charakteristika lymfocytárnych subpopulácií exprimujúcich elastínový receptor v prítomnosti alebo v absencii elastínových peptidov.

Bolo zistené, že väčšina testovaných lymfocytárnych subpopulácií exprimuje elastínový receptor, s výnimkou CD15 + buniek, ktoré zostávajú negatívne. CD15 značenie teda zodpovedá polymorfonukleárom a monocytom.

Táto expresia je v značnej miere stimulovaná prítomnosťou elastínových peptidov, v prítomnosti ktorých CD4 + a CD45RO + značne zvyšujú expresiu elastínového receptora. V tomto prípacje ide o subpopulácie, ktoré boli rozpoznané ako pomocné a pamäťové bunky. Zdá sa, že pozitívna spätná väzba, vedúca po aktivácii elastínového receptora k jeho vlastnej syntéze, by mohla byť špecifická pre tieto bunky.

Príklad 4

Ochrana lymfocytov proti cytotoxickému efektu κ-elastínu s nízkou molekulovou váhou

1) Izolácia lymfocytov

Lymfocyty boli izolované rovnako ako bolo popísané v príklade 1. Bunková suspenzia bola nariedená RPMI médiom obsahujúcim 5 mM glutamínu a 10 % FCS tak, aby koncentrácia buniek bola 10⁶ buniek/2 ml.

2) Bunková kultúra

Lymfocyty boli inkubované v dvadsaťštyri jamkovej Costar doštičke (500 μΐ bunkovej suspenzie/jamku v koncentrácii 10⁶ buniek/2 ml) v kompletnom RPMI 1640 médiu. Distribúcia buniek bola nasledujúca ;

- 10 ml bunkovej suspenzie bez κ-elastínu

- 10 ml	bunkovej	suspenzie	s 2 gg/ml κ-elastínu a	10 ml
bunkovej	suspenzie	i s 2 gg/ml κ-elastínu (kontrola	s K-
elastínom,	, ale bez	laktózy a	melibiózy)
- 10 ml	bunkovej	suspenzie	s 2 μς/πιΐ κ-elastínu + 1	mg/ml
melibiózy - 10 ml	bunkovej	suspenzie	s 2 μg/ml κ-elastínu + 1	mg/ml

laktózy

- 10 ml bunkovej suspenzie + 1 mg/ml melibiózy

- 10 ml bunkovej suspenzie + 1 mg/ml laktózy

3) Počítanie buniek v prítomnosti Trypanovej modrej na určenie životnosti buniek

Piaty deň kultivácie bola bunková suspenzia odobraná, bunky spočítané v Malassezovej komôrke v prítomnosti 0,1 %

Trypanovej modrej (Sigma), len mŕtve bunky boli označené Trypanovou modrou na modro. Počítanie bolo vykonávané okamžite po pridaní Trypanovej modrej, aby sa eliminoval jej toxický vplyv.

Závery :

Inkubácia	počet buniek/ml	% mŕtvych buniek
(Trypanová modra)
béz K-elastínu	5, 8 ± 0,6	9,2 ± 0,4
s κ-elastínom, 2 pg/ml (kontrola)	10,23 ± 3,5	6,6 ± 1,3
s κ-elastínom, 2 mg/ml	3, 6 ± 1,0	41,3 ± 3, 1
s laktózou, 1 mg/ml	7,7 ± 1,5	14,5 ± 1,9
s melibiózou, 1 mg/ml	7,26 ± 1,3	15,4 ± 1,6
s κ-elastínom, 2 mg/ml + 1 mg/ml,	8,8 ± 0,7	10,6 ± 2,3
laktózy	t 1	1
s κ-elastínom,2 mg/ml + 1 mg/ml,	8,8 ± 1,6	10,5 ± 0,9

melibiózy

Tabuľka ukazuje percentuálne zastúpenie mŕtvych buniek v kultúre po inkubácii s elastínovými peptidmi a ochranný efekt laktózy a melibiózy, ktorý zabraňuje smrti buniek. Jeho efektivita sa blíži 100 % : rozdiel v životnosti buniek (v porovnaní s kontrolou bez κ-elastínu) inkubovaných v prítomnosti 2 mg/ml elastínových peptidov je 32,1 %. V prítomnosti laktózy alebo melibiózy je zvýšenie počtu mŕtvych buniek len 1,3 % (96 % ochránených).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie aspoň jedného oligosacharidu, vyznačujúceho sa tým, že obsahuje od 2 do 6 osidových skupín, a majúceho galaktózovú skupinu v neredukujúcej terminálnej pozícii, alebo derivátov týchto oligosacharidov substituovaných hydrofóbnymi skupinami, pričom oligosacharidy glykozidy odpovedajú nasledujúcemu vzorcu galaktóza - n(a alebo P)-(Hex)_p kde : n predstavuje polohu 1,2,3,4 alebo 6

Hex predstavuje a- alebo β- napojenú hexózu alebo pentózu p je číslo medzi 1 a 5 a deriváty týchto oligosacharidov patriace do jednej z nasledujúcich kategórií :

a) - glykozidy odpovedajúce vzorcom :

• (I) oligosacharid 1-0-R, kde R je lineárny alebo vetvený alkylový zostatok s 1 až 18 uhlíkovými atómami • (II) oligosacharid 1-O-R-O-l-oligosacharid, kde R=(CH₂)_m, kde m leží medzi 2 a 10

b) - osylamín alkylovaný podlá jedného z nasledujúcich vzorcov, kde preferovaný oligosacharid je laktóza, melibióza alebo stachióza :

alkylovaný osylamín odpovedá jednému z nasledujúcich vzorcov :

• (III) oligosacharid 1-NH-CO-R, kde R je alkylový zostatok s 2 až 18 uhlíkovými atómami obsahujúci 0,1 alebo 2 dvojné väzby • (IV) oligosacharid 1-NH-CO-R-CO-NH-l-oligosacharid, kde R=(CH₂)_m, kde m leží medzi 2 a 8

c) - alkylamín acylovaný kyselinou aldónovou, získanou oxidáciou oligosacharidov • (V, oligosacharid CO-NH-R, kde R je rovnaké ako u vzorca (III) • (VI) oligosacharid CO-NH-R-NH-CO-oligosacharid, kde R je rovnaký ako u vzorca (III)

d) - alebo redukčný produkt Schiffovej bázy tvorený oligosacharidmi s alifatickými mono- alebo diamínmi a odpovedajúci nasledujúcim vzorcom :

• (VII) Gal- (Hex)_n-X-HN-R • (VIII) Gal- (Hex) _n-X-HN-R-NH-X- (Hex) „-Gal, kde: Hex je hexóza alebo pentóza n = 0,1 alebo 2

X = l-NH₂-hexitol

R je rovnaký ako u vzorca (III), na prípravu imunomodulačných liečiv ovplyvňujúcich bunkové imunitné reakcie.
2. Použitie oligosacharidov podlá nároku 1 na prípravu imunomodulačných prípravkov ovplyvňujúcich bunkové imunitné reakcie, vyznačujúce sa tým, že zaisťuje ochranu lymfocytov i · proti cytotoxickému efektu κ-elastínu s nízkou molekulovou váhou.
3. Použitie aspoň jedného oligosacharidu obsahujúceho od 2 do 6 osidových skupín, a majúceho galaktózovú skupinu v neredukujúcej terminálnej pozícii, alebo derivátov týchto oligosacharidov substituovaných hydrofóbnymi skupinami podlá nároku 1, vyznačujúce sa tým, že sú použité na prípravu prípravku na liečbu alebo prevenciu hypersenzitívnych reakcií a ovlyvňujúceho bunkové imunitné reakcie.
4. Použitie oligosacharidov podlá nároku 1 a 3, vyznačujúce sa tým, že oligosacharid je melibióza alebo laktóza alebo ich deriváty tak ako boli definované v nároku 1.
5. Použitie oligosacharidov podlá nárokov 1 až 4, vyznačujúce sa tým, že prípravok obsahuje naviac farmaceutický prijateľný nosič prispôsobený na externé povrchové použitie.

2^
6. Použitie oligosacharidov podlá nárokov 1 až 4, vyznačujúce sa tým, že prípravok obsahuje naviac farmaceutický prijateľný nosič určený na podanie parenterálnou alebo enterálnou cestou.
7. Použitie oligosacharidov podľa nárokov 1 až 6, vyznačujúce sa tým, že sú použité na prípravu prípravku určeného na liečbu alebo prevenciu hypersenzitívnych reakcií mediovaných lymfocytmi.
8. Použitie oligosacharidov podľa nárokov 1 až Ί, vyznačujúce sa tým, že prípravok je určený na liečbu alebo prevenciu intolerancie a/alebo alergických reakcií na koži a/alebo na mukóznych membránach.
9. Použitie oligosacharidov podlá nárokov 1 až 8, vyznačujúce sa tým, že prípravok je určený na prevenciu alebo zníženie vzniku voľných radikálov.

I
10. Použitie oligosacharidov podlá nárokov 1 až 8, vyznačujúce sa tým, že prípravok je určený na liečbu alebo prevenciu symptómov nasledujúcich chorôb väčšina atópií, pemphigus, polymorfná erytéma, xerodermatitída, lupus erythematosus, lupienka, dermatitídy a ekzémy.
11. Dermatokozmetický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aspoň jednu aktívnu zložku v spojení s adjuvans, obmedzujúcou hypersenzitívne reakcie na aktívnom princípe a tým, že adjuvans je oligosacharid obsahujúci od 2 do 6 osidových skupín, a majúci galaktózovú skupinu v neredukujúcej terminálnej pozícii, alebo deriváty týchto oligosacharidov tak ako boli definované v nároku 1.
12. Spôsob kozmetickej liečby hyperaktívnej pokožky, vyznačujúci sa tým, že prípravok obsahuje aspoň jeden oligosacharid obsahujúci od 2 do 6 osidových skupín, a má galaktózovú skupinu v neredukujúcej terminálnej pozícii, alebo

2Γ deriváty týchto oligosacharidov substituované hydrofóbnymi skupinami, tak jako sú definované v nároku 1, a je podávaný povrchovo v kozmeticky prijateľnej podobe.
13. Spôsob kozmetickej liečby podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že oligosacharid patrí do skupiny tvorenej melibiózou alebo jej derivátmi, ktoré je možné získať pridaním hydrofóbnych skupin a je podávaný povrchovo v kozmeticky prijateľnej podobe.