CZ29599A3

CZ29599A3 - Použití oligosacharidů jako imunomodulátorů v dermatokosmetických přípravcích

Info

Publication number: CZ29599A3
Application number: CZ99295A
Authority: CZ
Inventors: Ladislav Robert; Alexandre Robert; Dominique Castelli
Original assignee: Roc
Priority date: 1996-07-31
Filing date: 1997-07-30
Publication date: 1999-06-16
Also published as: AU3457697A; EP0954322A1; KR20000029754A; SK12199A3; RU99104398A; JP2000516591A; WO1998004270A1; CA2262564A1; NZ333985A; FR2751876A1; PL331478A1; FR2751876B1; HUP9903904A3; BR9710630A; CN1228705A; HUP9903904A2

Description

POUŽITÍ OLIGOSACHARIDŮ JAKO IMUNOMODULÁTORŮ V DERMATOKOSMETICKÝCH PŘÍPRAVCÍCH

OBLAST TECHNIKY

Navrhovaný vynález popisuje směsi použitelné v oboru imunologie a to konkrétně pro léčbu reakcí přecitlivělosti odpovědných za alergie a různé projevy netolerance.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Imunitní reakce proti infekčním agens, toxinům nebo zhoubnému bujení je založen na rozeznání cizorodé povahy antigenu (nebo alergenů) a aktivace buněčných nebo humorálních mediátorů určených k likvidaci cizorodého antigenu. Přesto, tento mechanismus může být občas nežádoucí, a to pokud je příliš silný, nebo je zaměřený proti antigenům které nejsou v podstatě nijak Škodlivé; to je zejména v případech orgánových transplantací nebo tkáňových štěpů.

Imunologické reakce vedoucí k alergii jsou rozděleny do 4 kategorií:

Typ I; Mastocyty navážou svými Fc receptory protilátky třídy IgE; Navázání antigenu pak spustí degranulaci mastocytů a vylití mediátorů (histamin, SRS-A, ECF-A).

Typ II: Specifické protilátky (IgG a IgM) reagují s antigenem na povrchu cílové buňky, což způsobí cytolýzu buď přímou aktivací zabij ečských buněk, nebo aktivací komplementu.

Typ III: Protilátky (IgG a IgM) vytvoří s antigenem a komplementem imunokomplexy které se usazují v tkání a aktivují produkci chemotaktických faktorů pro polynukleární neutrofily, což vede ke vzniku lokálního zánětu.

Typ IV: T lymfocyty senzitivní pro určitý antigen po reakci s ním začnou tvořit lymfokiny. Lymfokiny indukují zánětlivou reakci a způsobují nahromadění makrofágů.

Lymfocyty jsou tedy klíčové buňky zodpovědné jak za buněčné tak humorálníreakce imunitního systému, zejména pak za sekreci protilátek.

Alergické predispozice mohou být tedy dány jedním nebo několika typy imunitních reakcí.

Tyto reakce mohou být v zásadě reakce intolerance na hygienické a ošetřující produkty, pozorované v kůži a nazývané „hyperreaktivní“.

Tento projev způsobený faktory prostředí vznikne díky daným genetickým faktorům a získané hypersenzitivitě.

• * · · · ·

PODSTATA VYNÁLEZU

Žadatel zjistil, že projev hypersenzitivity může být kontrolován pomocí oligosacharidů, obsahujících od 2 do 6 osidových skupin a majících galaktózový zbytek v neredukující terminální pozici, nebo deriváty těchto sacharidů substituované hydrofóbnírni residui. Navrhovaný vynález popisuje použití oligosacharidů, obsahujících od 2 do 6 osidových skupin a majících galaktózový zbytek v neredukující terminální pozici, nebo derivátů těchto sacharidů, pro přípravu imunomodulačních přípravků a to konkrétně přípravků pro léčbu nebo prevenci reakcí přecitlivělosti.

Konkrétní vhodné oligosacharidy mohou být odvozeny od melibiosy, laktosy a jejich derivátů získaných přidáním hydrofobních skupin.

Hydrofobními substituenty jsou míněny zejména lineární nebo větvené Ci-C_1? alkyly, Ci-Cix alkylaininy, lineární nebo větvené, dokonce i substituované Ci-Cis karboxylové kyseliny, lineární nebo větvené, primární, sekundární nebo terciální Ci-Cix amidy a Ci-Cie arylalkyly. Oligosacharidové deriváty přizpůsobené pro použití v navrhovaném vynálezu by měly zapadat do jedné z kategorií zmíněné dále, kde obecný vzorec oligosacharidů by měl odpovídat následujícímu vzorci

Galaktosa - „ (a nebo β) - (Hex),,

Kde: n představuje polohu 1,2,3,4 nebo 6

Hex představuje a- nebo β- napojenou hexosu nebo pentosu p je Číslo mezi 1 a 5

a) - glykosidy odpovídající vzorci.

• (I) oligosacharid 1-O-R, kde R je lineární nebo větvený alkylový zbytek o 1 až 18 uhlíkových atomech • (II) oligosacharid RO-R-O-1 -oligosacharid, kde R=(CH2)_m, kdy m leží mezi 2 a 10

b) - osylamin alkylovaný dle jednoho z následujících vzorců, kde preferovaný oligosacharid je laktóza, melibióza nebo stachióza:

- alkylovaný osylamin odpovídající jednomu z následujících vzorců:

• (III) oligosacharid 1-NH-CO-R, kde R akylový zbytek o 2 až 18 uhlíkových atomech, obsahující 0, 1 nebo 2 dvojné vazby • (IV) oligosacharid 1-NH-CO-R-CO-NH-1-oligosacharid, kde R (CH2),„, kdy m leží mezi 2 a 8

e) -alkylamin acylovaný kyselinou aldonovou, získanou oxidací oligosacharidů • · · · · · » • (V) oligosacharid CO-NH-R, kde R je stejné jako u vzorce (III) • (VI) oligosacharid CO-NH-R-NH-CO -oligosacharid, kde R je stejné jako u vzorce (ΙΠ)

d) - nebo redukční produkt Schiffovy báze tvořený oligosacharidy s alifatickými mono- nebo diaminy a odpovídající následujícímu vzorcům:

• (VII) Gal (Hex)_n-X-HN-R • (Vlil) Gal-(Hex)_n-X-HN-R-NH-X-(Hex)n Gal, kde: Hex je hexóza nebo pentóza n = 0, 1 nebo 2 X l-NH₂-hexitol R je stejné jako u vzorce (III).

Podle konkrétní nejvýhodnější metody, oligosacharidy nebo jejieh deriváty, tak, jak jsou definované výše, budou použity pro přípravu přípravků obsahujících navíc farmaceuticky přijatelný exeipient nevhodný pro aplikaci běžnou externí cestou.

Ve skutečnosti navrhovatel objevil, že reakce zapojené v projevech spojených s hypersenzitivitou, mohou být v korelaci s fixací peptidů vedoucích k degranulaci elastinu, zejména k- elastinu, na specifický lymfocytární receptor.

Aktivace těchto receptorů spustí sekreci lytických enzymů, β-glucuronidázy, elastázy a volných radikálů jako je například superoxidový iont nebo peroxid vodíku, který dává vzniknout hydroxylovým radikálům. Tyto produkty mohou ovlivnit degradaci makromolekul mezibuněěné hmoty, fibronektin, kolagen a hyaluronan. Navázání elastinových peptidů tedy stimuluje proliferaci lymfocytů.

Tento fenomén hraje důležitou roli v imunoalergických reakcích atopického původu, zejména atopické dermatitidy nebo anafylaktickýeh reakcí, urtikarie a alergické kontaktní dermatitidy. Jedinci, jejichž kůže je přecitlivělá nebo hyperreaktivní, se v populaci vyskytují častěji a častěji.

Jejich kůže snadno reaguje zrudnutím a bolestí a jejich nárůst reaktivity je nižší vzhledem ke zdravé kůži.

Jedinec pak zažívá nepříjemné pocity spojené s erythemou a lehkým svěděním.

Všechny tyto symptomy mohou být zmírněny nebo dokonce potlačeny za použití přípravku obsahujícího oligosacharidy dle navrhovaného vynálezu. Melibiosa, laktosa nebo jejieh deriváty Částečně nebo zcela potlačují buněčnou proliferaci dokonce i v případě dříve stimulovaných lymfocytů, mohou dokonce inhibovat potencializaci a sekreci lytickýeh enzymů.

Přípravek by měl být vytvořen na takovém základě, který neobsahuje žádný parfemační nebo alergenní agens. Přípravek může být ve formě roztoku, gelu, oleje, krému, V/O nebo Q/\^!emulze nebo několika emulzí v liposomální formě. Může být upravená odborníkem v oboru, zejména použitím změkčovadel nebo slabých surfaktantů.

Přípravek je přizpůsoben zejména pro léčbu nebo prevenci intolerance á/nebo alergické reakce v kůži a/nebo na membránách sliznic.

Konkrétně přípravek dle navrhovaného vynálezu je určen pro prevenci nebo snížení formování a vzniku volných radikálů.

Oligosacharidy nebo jejich deriváty mohou být spojeny s dalšími látkami, které jsou schopny kůži chránit a/nebo hydratovat, jako je kyselina hyaluronová, vitamin E, glykolový extrakt z G. biloba, sořbitol, glukozaminoglykany, algináty atd. Mohou být také asociovány s rostlinnými oleji vyživujícími pokožku a/nebo s aktivními změkčovadly, jako je například extrakt z planého vína, althaey, ovsa, lípy, heřmánku, sladkého jetele, rostlin rodu Ruscus, prokyanidol, a-bisabolol, kokosový olej, kyselina 18-P-glycyrrhetinová.

Podle jiného aspektu navrhovaného vynálezu jsou oligosacharidy a jejich deriváty tak jak jsou definovány výše použity pro přípravu směsi, která dále obsahuje farmaceuticky přijatelný excipient, určený pro podání parenterální nebo enterální cestou.

Účinnost těchto oligosacharidů dle navrhovaného vynálezu je založená na jejich překvapivém vlivu na imunitní reakce mediované buňkami.

Přípravky připravené dle navrhovaného vynálezu jsou konkrétně použitelné pro léčbu nebo prevenci hypersenziti vních reakcí mediováných lymfocyty.

Konkrétně jsou určeny pro léčbu nebo prevenci symptomů těchto chorob většina atopií, polymorfní erythema, xerodermatitida, lupus erythematosus, pemphigus, dermatitidy, lupenka _a ekzémy.

Oligosacharidy s galaktózovými skupinami v neredukující terminální pozici a jejich deriváty substituované hydrofóbními skupinami, mohou být použity jako adjuvans, omezující reakce hypersenzitivity, které jsou vyvolány jiným aktivním postupem.

Vynález tedy popisuje způsob kosmetického ošetření hyperreaktivní pokožky charakterizovaného tím, že přípravek obsahuje alespoň jeden oligosacharid obsahující od 2 do 6 osidových skupin, a mající galaktózovou skupinu v neredukující terminální pozici, nebo • · deriváty těchto oligosacharidů substituované hydrofóbními skupinami a je podáván v kosmeticky přijatelném nosiči povrchovou cestou.

Konkrétní preferované látky vhodné pro zavedení do praxe jsou melibiosa, laktosa a jejich deriváty získané přidáním hydrofobních skupin.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Příklady které následují jsou určené pouze pro ilustraci vynálezu. V těchto příkladech jsou odkazy k následujícím obrázkům.

Obr. 1: Inhibice proliferační aktivity lymfocytů stimulovaných κ -elastinem pomocí laktosy a melibiosy. Koncentrace laktosy a melibiosy jsou 1 pg/ml, 10 pg/ml, 100 gg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml.

Obr. 2: Inhibice exprese elastické aktivity u lymfocytů stimulovaných 2 gg/ml κ-elastin, pomocí laktosy a melibiosy. Aktivita je měřena v kultuře.

Obr. 3: Inhibice exprese kat epsinu G u lymfocytů stimulovaných 2 pg/rnl κ-elastin. Aktivita je měřena v kultuře.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

PŘÍKLAD 1.

.Metodiky

Izolace lymfocytů

Lymfocyty použité pro tyto experimenty byly získány z periferní lidské krve a/nebo z lidských mandlí po tonsilektomii. Izolace periferních lymfocytů probíhala následovně: 5 ml krve bylo na vrst véno (v 15 ml centrifugačních zkumavkách) na Picoll - paque plus (Pharmacia) tak, aby se nezamíchaly dvě fáze, poté byla centrifugována při 3000 rpm (zhruba 600 g) po dobu 40 minut a při pokojové teplotě (20 °C). Vrstva obsahující lymfocyty a monoeyty byla odebrána a smíchána s 10 ml RPMI media a centrifugována při 2200 rpm (zhruba 400 g) po dobu 10 minut při 20 °C. Sediment je resuspendován v 0,5 ml RPMI, poté je přidáno dalších 4,5 ml RPMI a znovu centrifugováno při 1500 rpm (zhruba 400 g) po dobu 10 minut při 20 °C. Konečný sediment je resuspendován v 10 ml RPMI a jsou v něm spočítány buňky. Monoeyty a makrofágy jsou eliminovány pomocí adheze na plastikový povrch (inkubace 2 hod v CO2/O2 inkubátoru).

··· · • · · · « • · · · < · · '· · ···· • · · · · ·· ··««·· « · ···· · · ······· · · ·· · · · ·

Separace polynukleárních buněk (PMN)

Po první centrifugací při 300 rpm (zhruba 600 g) zbytek obsahující červené částečky a PMN je resuspendován v 1 % polyvinyl alkoholu (PVA) v DPBS (Dulbecco's modified phosphate buffered šalině), dva objemy na jeden objem sedimentu, a potom je roztok ponechán sedimentovat 20 minut při pokojové teplotě. Supernatant je poté centriťugován 5 minut při 400 g a 4 °C, sediment je velmi opatrně omyt DPBS tak, aby byl odstraněn PVA , ale nebyly aktivovány PMN, poté následuje centrifugace při 400 g a 4 °C. Supernatant je eliminován. Červené krvinky jsou lyžované osmotiekým šokem a poté je přidáno DPBS tak, aby se znova ustanovila osmotická rovnováha. Po centrifugaci při 400 g po dobu 5 minut ve 4 °C, je sediment obsahující PMN resuspendován v malém objemu RPMI. Buňky jsou spočítány a mohou být lyžovány tak, aby se uvolnily lytické enzymy (elastáza a katepsin) přidáním 0,1 % tritonu X-100 v 1M NaCl v 0 °C po dobu 20 minut, poté následuje centrifugace při 0 °C po dobu 20 minut. Supernatant obsahuje enzymy.

Preparace lymfocytů z lidských mandlí.

Čerstvě vyjmuté mandle jsou rozstříhány na malé kousky ve sterilních podmínkách v deseti ml RPMI. Tkáňová suspenze je filtrována přes hrubý filtr tak, aby byly odstraněny větší zbytky tkáně. Suspenze je přenesená do zkumavky a ponechána sedimentovat po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Supernatant je přenesen na Ficoll-paque plus a centrifugován tak, jak je popsáno u lymfocytů získávaných z krve. Monocyty jsou stejně tak eliminovány jako v případě lymfocytů izolovaných z krve. Sediment obsahující lymfocyty je resuspendován a buňky spočítány po dvou centrifugacích, tak jak je popsáno výše. Lymfocyty získané izolací z mandlí jsou přibližně z 50 % typu T a z 50 % typu B. Lymfocyty získávané z krve jsou přibližně z 80 % typu T a z 20 % typu B.

Kultura lymfocytů'

Lymfocyty izolované tak, jak je popsáno výše jsou inkubované ve 24 jamkové destičce Costar, 500 μΐ buněčné suspenze na jamku (5x10⁵ buněk na ml nebo 2,5 x TO⁵ buněk) v RPMI 1640 (eurobio) obsahující 10 % fetálního hovězího séra (ATGC), 2 mM glutamin (Gibco), penicilín a streptomycin ( 500 U/ml, 0,25 mg/ml ), a phytohemaglutinin (Sigma) 5 μ g/ml. Po inkubaci po dobu čtyř dnů v podmínkách buněčné kultury (37 °C , CO2/O2 inkubátor) je buněčná suspenze sebrána pipetou, centrifugována při 400 g po dobu deseti minut a 20 °C a buněčný sediment je resuspendován v 0,5 ml RPMI (bez FCS) promíchána protřepáním a po dalším » · · · · · · přidáním 10 ml RPMI bez FCS je eentrifugována opět při 1500 rpm (400 g) po dobu deseti minut ve 20 °C. Po dalších dvou promytích tak, jak je popsáno výše je sediment resuspendován v 10 ml RPMI bez FCS a buňky jsou opět přeneseny do kultury na 24 jamkové destičky Costar.

«'·

Inkubace s peptidy elastinu

Sterilní roztok κ-elastinu (75 kD, Solabia) je přidán k buňkám do kultury v konkrétní koncentraci (například 2 pg/ml) a inkubován v médiu bez FCS po dobu 2,5 hod při 37 °C. Po inkubaci jsou destičky opatrně promíchány, buňky jsou sebrány pipetou a spočítány. Suspenze je eentrifugována po dobu deseti minut při 4 °C při 1500 rpm (zhruba 400 g), a supernatant je rozdělen do 1 ml zkumavek eppendorf na 0,5 ml alikvóty a zamražen při - 40 °C dokud nebude použit pro okamžité stanovení enzymatické aktivity. Buněčný sediment je resuspendován v extrakčním pufru (0,1 % triton X-100, 1 M NaCl, 0,02 % NaNa, 0,01 % Brij 35 pil 8), 1 ml na 10⁶ buněk, a centrifugován 15 minut při 1600 g při 0 °C a stejně jako je popsáno výše je zí skaný supernatant rozplněn do zkumavek eppendorf a ponechán v - 40 °C až do určení enzymatické aktivity.

Určení enzymatické aktivity enzymů typu elastáz u leukocytů

Syntetický substrát použitý pro určení enzymatické aktivity enzymů typu elastáz je Mc-O-SucAla-Ala-Pro-Val-pNA. 50 μΐ média nebo 20 μΐ buněčného lyzátu je smícháno s pufrem (100 mM tris-HCl, 0,05 % CaCl₂, 0,02 % NaN₃, 0,01 % Brij 35 pH 8 ) do 190 μΐ, pak je přidáno 10 μΐ 85 mM roztoku substrátu (v N-Methylpyrolidon) na doplnění do celkového objemu 200 μΐ. Optická denzita je okamžitě změřena při 410 nm a poté po 4, 24, 48 a 72 hodinové inkubaci v 37 °C. Aktivita elastázy je určena v nM substrátu hydrolyzovaného na 10⁶ buněk za hodinu.

Určení enzymatické aktivity katepsinu G mg substrátů Me-O-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA v 1 ml N-methylpyrrolidonu (40 nM) je použito za stejných podmínek jako je popsáno výše.

2. Závěry

a) Efekt elastinových peptidů na proliferaci lymfocytů φ 99 9 9 9 99 9 99 «·

Ο · 9 · · 9 9 « · · · ·

Ο · · · · · 9 9 · 9

9 9 9 · * · ······

9 9 9 9 9 · « ··· ···· ·· ·· 99 99

Zvýšení hladiny vápníku vyvolané přidáním elastinových peptidů k bílým krevním buňkám může být bráno jako důkaz spuštění intracelulární signalizace pro řadu buněčných funkcí.

Jednou z nich je vstup buněk do proliferačního cyklu. Bylo prokázáno, že to nastává v případě lidských kožních fibroblastů v přítomnosti elastinových peptidů (Ghuisen-Itait et all, C.R. Acad. Sci.,1992, 315:473-478) Závěry uvedené v tabulce 1 ukazují, že stimulace odpovídající proliferaci lymfocytů byla prokázána.

Tabulka 1.

Koncentrace κ-elastinu	Počet experimentů	Procenta stimulace průměr ± směrodatná odchylka
2 pg/ml	6	62,67 ±37,90
10 pg/ml	13	35,76 ±29,50

Maximální stimulace byla pozorována při 2 pg/ml elastinových peptidů a o něco slabší -stimulace byla prokázána při koncentraci 10 pg/ml elastinových peptidů.

b) Zvýšení proteolytické aktivity pomocí elastinových peptidů

Pokud jsou polymorfonukleáry nebo lymfocyty inkubovány v kultuře v přítomnosti 2 pg/ml kelastinu, pak u buněčného extraktu a lyzátu je pozorován stoupající nárůst elastázoyé a katepsinové aktivity. Tento nárůst je více znatelný u buněk získaných ze starších arteriosklerotických jedinců. Nárůst této aktivity není pozorován v nepřítomnosti κ-elastinu. Přidání elastinových peptidů zvýší proteolytickou aktivitu jak v buněčné kultuře v médiu (vysolené enzymy) tak v buněčném extraktu (enzymy navázané na buňku), jak pro elastázu, tak pro katepsin G, ačkoliv tento efekt může být spíše vysvětlován zvýšením enzymatické aktivity v supernatantu buněčné kultury.

c) Efekt elastinových peptidů na buněčné přežívání

Tento experiment probíhal v podmínkách buněčné kultury ták jak byly popsány výše, v přítomnosti phytohemaglutininu (P1IA). 5 ml alikvotů lymfocytární suspenze (2,5 x 10⁶ buněk v 5 ml) získaných izolací ž lidských mandlí bylo rozděleno do testovacích zkumavek spolu se zvyšující se koncentrací κ-elastinu (BPM, PM < 10 kDa): 1 pg/ml, 2 pg/ml, 10 pg/ml, 500 pg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml.

Po čtyřech dnech inkubace ve standartních kultivačních podmínkách byly buňky sebrány a spočítány. Tabulka 2 ukazuje ztrátu buněk jako funkci koncentrace přidaných elastinových peptidů.

Tabulka 2

Koncentrace elastinových peptidů v pg/ml	Procenta úbytku buněk určená počítáním v Trypanové modři
0	5,3
I	5,0
2	2,5
10	17,4
100	19,6
500 1ΠΠΠ	28,9 on 2
1 vuv 2000	3y,3 39,1

Ukázalo se, že elasti nové peptidy mají vyšší cytotoxickou aktivitu při vyšších koncentracích (tisíckrát vyšší než koncentrace stimulující buněčnou proliferaci a než vysolené lytické enzymy).

PŘIKLAD 2: Efekt laktosy a melibiosy na reakce mediované elastinovým receptorem lymfocytů

1) Inhibice buněčné proliferace

Jak bylo ukázáno na obr. 1 vzrůstající koncentrace laktosy a melibiosy progresivně potlačují stimulaci růstu vyvolanou elastinovými peptidy, následovanou inhibicí proliferace při nejvyššich testovaných koncentracích (1 a 2 mg/ml) což odpovídá 5,84 x IO'³ inM roztoku. Nej silněj ší inhibice proliferace je v rozmezí od 16 do 30 % pro laktózu a od 26 do 58 % pro melibiózu.

2) Efekt laktosy a melibiosy na vysolené proteolytické enzymy spouštěné pomoci elastinového receptorů.

Jak bylo ukázáno výše nárůst od 40 do 120 % v aktivitě proteolytických enzymů je pozorován v buněčném médiu stejně jako v buněčném lyzátu lidských lymfocytů kultivovaných v • * ···· • · přítomnosti 2 pg/ml κ-elastinu. Stimulace zvýšení lytieké enzymatické aktivity je inhibováno efektivně melibiosou již od koncentrace I pg/ml. Tato inhibice může být prokázána jak pro elastázovou aktivitu tak pro aktivitu katepsinu G. Stejně tak laktosa je v tomto případě účinná však s poněkud slabším efektem než melibiosa (obr. 2 a 3).

PŘÍKLAD 3; Kvantifikace elastinových receptonů v subpopulacích lidských lymfocytů

Metodiky

Použité protilátky;

primární protilátka: anti 67 kD receptor pro elastin/laminin protilátka (bovinní), třídy IgM, produkovaná na myších (Elastín Products Company).

- sekundární protilátka; myší anti-IgG +IgM (H+L) protilátka produkovaná na kozách, značená rhodaminem (TRITC) (Jackson Immunoresearch Laboratories), pro fluorescenční mikroskopii.

sekundární protilátka; myší anti IgM protilátka F(ab )2, produkovaná ná kozách, značená r-phycoerythrinem (Chemicon), pro průtokovou cytometrii.

Protokol:

a) Fluorescenční mikroskopie

Lidské lymfocyty izolovaně z lidských mandlí (tak jak bylo popsáno v př. 1) jsou kultivovány v přítomnosti 5 pg/ml phytohemaglutininu (tak, aby byly aktivovány) a část z nich byla kultivovány s 2 pg/ml κ-elastinu o vysoké molekulové váze (75 kD) v médiu RPMI 1640 s 10 % fetálního hovězího séra (FCS). Po inkubaci trvající 48 až 120 h ve 37°C byly lymfocyty promyty 3x v RPMI médiu obsahujícím 2 % FCS a poté centrifugovány při 400 g, 10 minut ve 4 °C. Poté byly buňky spočteny a rozředěny na koncentraci 10⁷ buněk/ml v RPMI médiu obsahujícím 2 % FCS.

Část (100 μΐ) buněčné suspenze lidských lymfocytů (zhruba 10^ň buněk) bylo inkubováno s 10 μΐ roztoku první protilátky (naředěně 1:100) po dobu 30 minut v ledové lázni. Buňky byly promyty 1,5 ml ledového RPMI s 2 % FCS a centrifugovány v předchlazené centrifuze při 4 °C (400 g, 10 minut).

Roztok sekundární protilátky (konjugované s TRITC, rozředěné v ledovém RPMI 1:200) je přidán k peletě. Po jemném promíchání je suspenze inkubována 30 minut ve 4 °C. Poté je přidáno 1,5 ml ledového RPMI s 2 % FCS a suspenze je centrifiigována při 400 g a 4 °C po dobu 10 minut.

Po ukončení posledního promytí jsou lymfocyty resuspendovány v reziduálním médiu, poté, Co byl supernatant odstraněn dekantací. Poté jsou na sklíčkách udělány roztěry a ponechány vyschnout na vzduchu. Po fixaci v čistém ethanolu po dobu 5 minut jsou vzorky rehydratovány imerzně v několika lázních PBS a zality glycerolem-s PBS (9 objemů glycerolu na 1 objem ► · · · • · · · ·9 f \ *1 /“xol/Tfc/4 r\, z*a#4« 'nrttniurt íAnnrvnt . » *-% <-^4-1» . <-**/%*« z·, zs i ijo.y. jl αιυ |a/oivuiu pivvvuuia z-vysujc jaanvai uiíumviíuvi tovciivc.

Pro identifikace značených buněk jsou preparáty pozorovány střídavě pod viditelným světlem i pod UV.

b) Fluorimetrie

Po posledním promytí jsou lymfocyty resuspendovány v 1 ml PBS a buňky jsou analyzovány cytofluorometricky.

Byly pozorovány následující charakterizované buněčné populace:

• Celkové T lymfocyty (CD3+) • Pomocné T lymfocyty, T helpery (CD4 +) • Supresorové T lymfocyty (CI)8 +) • B lymfocyty (CD20 +) • Aktivované T lymfocyty (CD25 +) • Paměťové T lymfocyty (CDA +/CD45RO i) • Granulocyty (CI) 15 +)

Popis použitých znaků:

CD3

Komplex CD3 je exprimován všemi zralými lidskými T buňkami. Jeho molekulová váha je mezi 16 a 28 kD a je složen z pěti řetězců (γ,σ,ε,ξ,η) asociovaných s T buněčným receptorem nekovalentních interakcí. Je zapojen v přenosu aktivačního signálu.

CD4

CD4 (T4) molekula rozeznává MHC molekuly II. třídy během interakce CI)4 tbuněk s buňkami prezentujícími antigen nebo cílovými buňkami. Jedná se o glykoprotein o molekulové váze 59 kD náležející do superrodiny imunoglobulínů. Nachází se na subpopulaci T lymfocytů patřících do skupiny pomocných buněk (helper/inducer) což je zhruba 45 % lymfocytů periferní krve.

·· ··

CD8

Molekula GD8 (T8, 30/32 kD) je glykoprotein tvořený dvěma peptidovými řetězci. Nachází se na populaci cytotoxických/supresorových T lymfocytů což je 20 až 35 % lymfocytů periferní krve. Je také přítomný na NK buňkách a na 30 % tzv. nulových buněk v periferní krvi.

CD15

CD 15 antigen (31 AL, X-hapten, SSEA) je lakto-N-fukopenthosa III (200 až 185 kD) alespoň 5 hlavních antigenů CD15 je přítomných na povrchu polynukleárních buněk (což je zhruba 90 % lidských granulocytů v oběhu) a na části cirkulujících monocytů (30 až 60%). Tento antigen se nenachází na povrchu normálních lymfocytů.

CD20

Antigen CD20 je fosfoprotein o molekulové váze 35 až 37 kD. Je přítomný na všech normálních B buňkách v periferní krvi, v uzlinách a v kostní dřeni.

CD25

Molekula CD25 odpovídá nízkoafinnímu receptoru pro interleukin 2. Jedná se o glykoprotein s molekulovou vahou 55 kD exprimovaný aktivovanými lymfocyty (T a B), ale také aktivovanými makrofágy.

CD45RO

Jedná se o transmembránový glykoprotein s molekulovou váhou 180 kD (izoformy s nižší molekulovou váhou se nazývají běžný leukocytární antigen, EGA). Je přítomný na povrchu T lymfocytů, thymocytů, granulocytů, monocytů (není však přítomen na povrchu makrofágů) a na malé populaci B lymfocytů. T lymfocyty expriinuj ící CD45RO jsou paměťové T lymfocyty (nebo indukované T buňky) což je zhruba 45 % T lymfocytů v periferní krvi.

CD4 +/GD45RO + buňky produkují tzv. pomocné signály. Jedná se zejména o časnou produkci

IL-2 a IFN-γ.

Pro značení pomocí antiCDx protilátek (všechno Sigma, kromě antiCD25 protilátky od

Serotecu) bylo odebráno vždy 100 μΐ lymfocytární suspenze (buď již značené nebo ne) zároveň s 67 kD protilátkou proti receptoru elastinu a buněčné hustotě 10⁷ buněk/ml.

4 ♦·· ► 4 * · · • 4 4 4 • 4 4 ·

4 4 4

4 4 4 4 4 4

4

K suspenzi bylo přidáno 10 μΐ antiCDx protilátky a inkubace probíhala 30 minut ve 20 °C (pouze v případě antiCD25 protilátky inkubace probíhala při 0 °C). Poté byly přidány 2 ml

PBS. Po dvou promytích (dvě centrifugace při 400 g ve 20 °C po dobu 10 minut) je buněčná peleta sebrána, resuspendována v 0,5 ml PBS a analyzována cytofluorometricky. Specifíta značení byla vždy ověřena pomocí izotypovč podobného myšího imunoglobulinu (nespecifický myelomový protein).

Závěry:

a) Fluorescenční mikroskopie

Důkaz přítomnosti elastinového receptoru na aktivovaných leukocytech

Část analyzovaných lymfocytů, ty které exprimují 67 kD elastin/laminin receptor, vykazují specifickou imunoíluorescenci za experimentální ch podmínek popsaných výše (pozitivní buňky).

Procentové zastoupení pozitivních buněk v kultuře ve čtvrtém dni inkubace, tak, jak bylo stanoveno fluorescenční mikroskopií:

- buňky kultivované v přítomnosti 2 pg/ml κ-elastinu: 28,52 ± 12,6 %

- buňky kultivované bez κ-elastinu 28,09 ± 10,91 %

V tomto případě nebyl prokázán signifikantní rozdíl mezi těmito dvěma skupinami, aktivace buněk pomocí PHA je pravděpodobně dostatečný signál pro expresi elastinového receptoru.

Procentově zastoupení pozitivních buněk v kultuře pátý den inkubace

- buňky kultivované v přítomnosti 2 pg/inl κ-elastinu: 77,2 ± 6,7 %

Ovlivnění buněk po omyti laktosou nebo melibiosou:

- buňky kultivované v přítomnosti 2 pg/ml κ-elastinu a na konec promyté v kultuře jedním pg/mí laktosy: 26,6 ± 6,7 % (p

Před promytím bylo 77,2 % buněk pozitivních

- buňky inkubované pět dní v přítomnosti 2 pg/rnl κ-elastinu a na konee promyté v kultuře jedním pg/ml melibiosy: 18,3 .19,7 % (p 0,001).

ftft ftftftft ftftftft

Buňky inkubované pouze se sekundární protilátkou bez přítomnosti první protilátky (negativní kontrola) nevykazují žádnou fluorescenci. To dokazuje, že melibiosa je efektivnější než laktosa pro vysycení 67 kD pod jednotky lymfocytárního elastinového receptoru: laktosa vysytí % receptoru a melibiosa 76 % za experimentálních podmínek, jak byly popsány výše.

• 9 4 «

• ft

b) Gytofluorometrie

Tabulka 3

Procentové zastoupení lidských lymfocytů exprimujících elastinový receptor po několika inkubačních obdobích.

DO: Den, kdy byly lymfocyty separovány

D2, D3, D 5: Druhý, třetí a pátý den po separaci lymfocytů.

%procento pozitivních buněk

Den	Bez κ-elastinu	Počet experimentů	S 2 pg/ml κ-elastinu	P
DO	1,12 + 0,2%	6	1,15 + 0,1%	-
D2	22,33 ± 5,2 %	5	23,02 + 3,2%	-
D3	29,7 ± 0,8 %	7	32,40 + 3,5 %	0,178
D5	59,91+4,9%	10	66,42 ±1,19%	0,006

Z tohoto experimentu vyplývá, že,inkubace buněk s PHA stimuluje progresivně expresi elastinového receptoru. Tato indukce je dále stimulována v přítomnosti elastinových peptidů. Přesto míra této stimulace není zřetelná do začátku pátého dne inkubace v kultuře. Za těchto podmínek přibližně dvě třetiny lymfocytů (více než 66 %) exprimuje elastinový receptor na svém povrchu.

Výsledky dvojího značení:

Tabulka 4

Použití dvojího značení lymfocytů pro identifikaci subpopulací lymfocytů exprimujících elastinový receptor % buněk exprimujících elastinový receptor (67 kD) + značení CDx

ΦΦ

	bez K-elastinu	s K-elastinem
R67kD +	59,9	66,4
CD4 i R67kD 4	26,5	45,7
CD8 i R67kD t	11,9	16,1
CD15 4R67kD4	0,0	0,0
CD20 + R67kD4-	36,7	36,3
CD25 + R67kD +	39,6	46,9
CD45RO 4 R67kD t	26,6	41,1

CDx + R67 kD = buňky značené zároveň protilátkou antiCDx a protilátkou proti podjednotce 67 kD elaštinovéhoreceptoru.

Poznámka: Součet procent dohromady nedá 100 %, protože buňky zároveň exprimují několik receptorů.

V tomto experimentu byla pomoci dvojího značení zjišťována přesná charakteristika lymfocytárních subpopulací exprimujících elastinový receptor v přítomnosti anebo v absenci elastinových peptidů.

Bylo zjištěno, že většina testovaných lymfocytárních subpopulací exprimuje elastinový receptor, s výjimkou CD 15 4-buněk, které zůstávají negativní. CD 15 značení tedy odpovídá pólymorfonukleárům a monocytům.

Tato exprese je ve značné míře stimulována přítomností elastinových peptidů, v jejichž přítomnosti CD4 + a CD45RO + značně zvyšují expresi elaštinového receptoru. V tomto případě se jedná o subpopulace, které byly rozeznány jako pomocné a paměťové buňky. Zdá se, že pozitivní zpětná vazba, vedoucí po aktivaci elaštinového receptoru k jeho vlastní syntéze, by mohla být specifická pro tyto buňky.

·· ··>·

• ·

PŘÍKLAD 4: Ochrana lymfocytů proti cytotoxickému efektu κ-elastinu o nízké molekulové váze

1) Izolace lymfocytů

Lymfocyty byly izolovány stejně jako bylo popsáno v příkladu 1. Buněčná suspenze je naředěná RPMI médiem obsahujícím 5 mM glutaminu a 10 % FCS tak, aby koncentrace buněk byla 10^{3 * * 6} buněk/2 ml

2) Buněčná kultura

Lymfocyty byly inkubovány ve dvacetičtyř jamkové Costar destičce (500 μΐ buněčné suspenze/jamku v koncentraci 10⁶ buněk/2 ml) v kompletním RPMI 1640 médiu. Distribuce buněk byla následující:

ml buněčné suspenze bez κ-elastinu ml buněčné suspenze s 2 μg/ml κ-elastinu a 10 ml buněčné suspenze s 2 pg/rnl kelastinu (kontrola s κ-elastinem, ale bez laktosy a melibiosy) ml buněčné suspenze s 2 pg/ml κ-elastinu + 1 mg/ml melibiosy 10 ml buněčně suspenze s 2 pg/ml κ-elastinu + 1 mg/ml laktosy

- 10 ml buněčné suspenze + 1 mg/ml melibiosy

- 10 ml buněčné suspenze + 1 mg/ml laktosy

3) Počítání buněk v přítomnosti Trypanové modři pro určení životnosti buněk

Pátý den kultivace byla buněčná suspenze sebrána, buňky spočteny v Malassezově komůrce v přítomnosti 0,1 % Trypanové modři (Sigma), pouze mrtvé buňky budou naznačeny

Trypanovou modří na modro. Počítání bylo prováděno okamžitě po přidání Trypanové modři, aby se eliminoval její toxický vliv.

• Β · · · · • Β · · · · · Β Β

Β « Β · β

Β Β .Β · · ♦

Závěry:

Inkubace	počet buněk/ml	% mrtvých buněk (Trypanová modř)
bez κ-elastinu	5,8 ±0,6	9,2 + 0,4
s κ-elastinem, 2 pg/ml (kontrola)	10,23 + 3,5	6,6 ±1,3
s κ-elastinem, 2 mg/ml	3,6 + 1,0	41,3 + 3,1
r-· s laktózou, 1 mg/ml	7,7 + 1,5	14,5 ± 1,9
s melibiózou, 1 mg/ml	7,26+1,3	15,4 + 1,6
s κ-elastinem, 2 mg/ml t 1 mg/ml, laktózy	8, 8 ±0,7	10,6 + 2,3
s κ-elastinem, 2 mg/ml + 1 mg/ml, melibiózy	8,8+1,6	10,5 i 0,9

Tabulka ukazuje procentové zastoupení mrtvých buněk v kultuře po inkubaci s elastinovými peptidy a ochranný efekt laktosy a melibiosy, který zabraňuje smrti buněk. Jeho efektivita se blíží 100 %: rozdíl v životnosti buněk (v porovnání s kontrolou bez κ-elastinu) inkubovaných v přítomnosti 2 mg/ml elastinových peptidů je 32,1 %. V přítomnosti laktosy nebo melibiosy je , zvýšení počtu mrtvých buněk pouze 1,3 % (96 % ochráněno).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití alespoň jednoho oligosacharidů, vyznačujícího se tím, že obsahuje od 2 do 6 osidových skupin, a majícího galaktózovou skupinu v neredukující terminální pozici, nebo deriváty těchto oligosacharidů substituované hydrofobními skupinami, kdy řečené oligosacharidy glykosidy odpovídající následujícímu vzorci:

galaktóza-n (a nebo β)-(Ηεχ)ρ kde : n představuje pozici 1,2,3,4 nebo 6,

Hex představuje a- nebo β- napojenou hexózu nebo pentózu p je číslo mezi 1 a 5 a deriváty těchto oligosacharidů patřící do jedné z následujících kategorií:

a) - glykosidy odpovídající následujícím vzorcům:

• (I) oligosacharid 1-O-R, kde R je lineární nebo větvený alkylový zbytek o 1 až 18 uhlíkových atomech • (Π) oligosacharid 1-O-R-O-l-oligosacharid, kde R=(CH₂)_m, kdy m leží mezi 2 a 10

b) - osylamin alkylovaný dle jednoho z následujících vzorců, kde preferovaný oligosacharid je laktóza, melibióza nebo stachióza:

- alkylovaný osylamin odpovídající jednomu z následujících vzorců:

• (ΠΙ) oligosacharid 1-NH-CO-R, kde R akylový zbytek o 2 až 18 uhlíkových atomech, obsahující 0,1 nebo 2 dvojné vazby • (IV) oligosacharid 1-NH-CO-R-CO-NH-l-oligosacharid, kde R=(CH2)_m, kdy m leží mezi 2 a 8

c) - alkylamin acylovaný kyselinou aldonovou, získanou oxidací oligosacharidů • (V) oligosacharid CO-NH-R, kde R je stejné jako u vzorce (III)

- · (VI) oligosacharid CO-NH -R- NH-CO -oligosacharid, kde R je stejné jako u vzorce (ΠΙ)

d) - nebo redukční produkt Schiffovy báze tvořený oligosacharidy s alifatickými mononebo diaminy a odpovídající následujícímu vzorcům:

• (VII) Gal-(Hex)_n-X-HN-R • (VIII) Gal-(Hex)_n-X-HN-R-NH-X-(Hex)_n-Gal, kde: Hexjehexózanebopentóza n - 0, 1 nebo 2 ··· ···· ·· ·· ·· ··

X = l-NH2-hexitol R je stejné jako u vzorce (ΠΙ), pro přípravu imunomodulaČních léčiv ovlivňujících buněčné imunitní reakce.
2. Použití oligosacharidů, dle nároku 1, pro přípravu imunomodulaČních přípravků ovlivňujících buněčné imunitní reakce, vyznačujících se tím, že zajišťují ochranu lymfocytů proti cytotoxickému efektu κ-elastinu o nízké molekulové váze.
3. Použití alespoň jednoho oligosacharidů obsahujícího od 2 do 6 osidových skupin, a majícího galaktózovou skupinu v neredukující terminální pozici, nebo deriváty těchto oligosacharidů substituované hydrofóbními skupinami, dle nároku 1, vyznačujícího se tím, že jsou použity pro přípravu přípravku určeného pro léčbu nebo prevenci hypersenzitivních reakcí a ovlivňujícího buněčné imunitní reakce.
4. Použití oligosacharidů, dle nároku 1 a 3, vyznačující se tím, že oligosacharid je buď melibiosa nebo laktosa, a nebo jejich deriváty tak jak byly definovány v nároku 1.
5. Použití oligosacharidů, dle nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že přípravek obsahuje navíc . farmaceuticky přijatelný excipient, přizpůsobený k externímu povrchovému užití.
6. Použití oligosacharidů, dle nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že přípravek obsahuje navíc farmaceuticky přijatelný excipient určený k podání parenterální nebo enterální cestou.
7. Použití oligosacharidů, dle nároku 1 až 6, vyznačující se tím, že jsou použity pro přípravu přípravku určeného pro léčbu nebo prevenci hypersenzitivních reakcí mediovaných lymfocyty.
8. Použití oligosacharidů, dle nároku 1 až 7, vyznačující se tím, že přípravek je určen pro léčbu nebo prevenci intolerance a/nebo alergických reakcí na kůži a/nebo na mukózních membránách.
9. Použití oligosacharidů, dle nároku 1 až 8, vyznačující se tím, že přípravek je určen pro prevenci nebo snížení vzniku volných radikálů.
10. Použití oligosacharidů, dle nároku 1 až 8, vyznačující se tím, že přípravek je určen pro léčbu nebo prevenci symptomů následujících chorob většina atopií, pemphigus, polymorfní erythema, xerodermatitida, lupus erythematosus, lupenka, dermatitidy a ekzémy.

• · . κ
11. Dermatokosmetický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu aktivní složku ve spojení s adjuvans, omezující hypersenzitivní reakce na aktivním principu a tím, že adjuvans je oligosacharidu obsahující od 2 do 6 osidových skupin, a majícího galaktózovou skupinu v neredukující terminální pozici, nebo deriváty těchto oligosacharidů tak jak byly definovány v nároku 1.
12. Způsob kosmetické léčby hyperreaktivní pokožky, vyznačující se tím, že přípravek obsahuje alespoň jeden oligosacharid obsahující od 2 do 6 osidových skupin, a majícího galaktózovou skupinu v neredukující terminální pozici, nebo deriváty těchto oligosacharidů substituované hydrofóbními skupinami, tak jak jsou definovány v nároku 1, a je podáván povrchově v kosmeticky přijatelné podobě.
13. Způsob kosmetické léčby dle nároku 12, vyznačující se tím, že oligosacharid patří do skupiny tvořené melibiosou a nebo jejími deriváty, které je možné získat přidáním hydrofóbních skupin a je podáván povrchově v kosmeticky přijatelné podobě.