【発明の詳細な説明】
製パン特性を向上させた形質転換コムギ 発明の分野
本発明は、遺伝的に形質転換されたイネ科植物、特に製パン特性が改善された
形質転換コムギに関する。
発明の背景
パンを製造できるという小麦粉のユニークな特徴は、デンプン質の胚乳に貯蔵
されたグルテンタンパク質、特にグルテンおよびパン生地の弾力性を決定するの
に重要な高分子量グルテンサブユニット（HMW-GS）の弾力性および伸長性と密接
に関連している。栽培品種のコムギの品質は、含まれるHMW-GSの数および組成に
よって決まる。
プロラミンは、穀粒の胚乳中から新しく発見された貯蔵タンパク質の一群であ
る（Shewry，1995）。コムギのプロラミンは、グリアジンおよびグルテニンの二
群に分けられる。小麦粉を水と混合してパン生地を作る際に、これらはともに連
続的なタンパク性の網目状構造を形成する。グルテンタンパク質は、天然に見い
だされる最大のタンパク質分子である（Wrigley，1996）。製パンに重要なパン
生地の弾力性（強度）および伸長性（粘凋性）は、それぞれグルテニンおよびグ
リアジンと密接に関連している。他の穀物の貯蔵タンパク質では見られない、コ
ムギグルテンのこれらのユニークな特徴は、相対分子量が1,000万を超えるに至
る、グルテニンポリマーの巨大なサイズと関連があると考えられる（Wrigley，
前記）。栽培品種のコムギは、グルテンの弾力性が低い（弱い）ため、他の点で
は望ましい農学的な特徴を有してはいるが、製造されるパンの品質が落ちる。そ
のような場合、異なる栽培品種の小麦粉を混合して、製パンに適するようにブレ
ンドすることが必要となる。多くの生化学者および遺伝学者により、製パンに関
する小麦粉の品質は、とりわけHMW-GS群のタンパク質によって左右されることが
示されてきた。HMW-GSは、高分子量のｘ型および低分子量のｙ型のサブユニット
に細分される。ｘ型およびｙ型サブユニットをコードする２つの遺伝子は、固く
連鎖したペアとして、４媒体パンコムギの１Ａ，１Ｂおよび１Ｄ染色体に存在し
遺伝する（Payne，1987）。このため、栽培品種のコムギはすべて、６種類のHMW
-GS遺伝
子を含んではいるが、転写されない遺伝子が存在することから、３，４または５
種のサブユニットのみが存在する（1Ay遺伝子は、全てのパンコムギ変種で転写
されない）。ある栽培品種中に存在するHMW-GSの数および組成は、そのグルテン
の品質と密接な関連がある。各HMW-GSは、総抽出タンパク質の約２％を占めるた
め、HMW-GSは種子の総タンパク質量の10％近くを占める可能性がある（Seilmeie
rら,1991;Halfordら,1992）。しかしながら、HMW-GS遺伝子は互いに密接に連鎖
しているため、伝統的な交配法によってそれらを操作することは困難である（Fl
avellら，1989）。このため、最近コムギの形質転換が成功して(Vasil，1994)HM
W-GS遺伝子のコピーを付加的に導入することにより、コムギのグルテンの品質を
改良する試みが可能となった（Flavellら，1989；Shewryら，1995）。ごく最近
、雑種型HMW-GS Dy10:Dx5の遺伝子構築物を含むトランスジェニック・コムギ（B
ob White種）の種子には、内因性のHMW-GS遺伝子のものと同レベルの雑種HMW-GS
が貯蔵されていることが示された。Bob Whiteの胚乳には、Ax2*，Bx7，By9，Dx5
，およびDy10の５つの雑種HMW-GSが含まれている（BlechlおよびAnderson，1996
）。このことから、Dx5およびDy10遺伝子がコードする天然のタンパク質と導入
されたDy10およびDx5遺伝子により形成された雑種HMW-GSとを区別するために、
雑種遺伝子構築を用いることが必要であった。
製パンの品質が向上したコムギ、およびそのようなコムギを製造する方法に対
する需要は、常に存在する。このため、発現すると製パンの晶質が向上するよう
に、異種性のHMW-GS遺伝子で形質転換し、改良されたコムギを製造することが望
ましいと考えられる。
発明の簡単な概要
本発明は、異種性のHMW-GS遺伝子を用いてコムギを形質転換することにより、
製パン特性を向上させたコムギを製造する方法である。本発明は、天然では1Ax1
遺伝子をもたない栽培品種である、コムギのBob White種(Triticum aestivum L.
)の幼若な培養胚に、バイオリスティック爆撃法によって、HMW-GS1Ax1遺伝子を
導入する例を示している。1Ax1遺伝子は良質な製パンと関連があるが、Bob Whit
eを含む（BlechlおよびAnderson,1996）多くの栽培品種には存在しないことが
知られている（Halfordら,1992;Payneら、1997）。独立に形質転換された系列か
ら選択した21のうち20が、選択可能なbar遺伝子を、および9つが1Ax1遺伝子を発
現していた。異なるトランスジェニック系列間で産生されるHMW-GS 1Ax1タンパ
ク質の量は、総タンパク質の0.6%〜2.3%のばらつきがあり、総HMW-GSタンパク質
として最大71%までの増加を示した。トランスジェニック植物は、正常で稔性を
有し、メンデルの法則に従ったトランスジーンの分離を示した。HMW-GS 1Ax1の
蓄積は一定であり、R3種子世代まで安定であった。これは、5つ以上のHMW-GS遺
伝子を発現しているコムギを作り出した最初の例である。驚くべきことに、５つ
という遺伝子数を超えて付加した異種性遺伝子は、天然の遺伝子発現を抑制する
ことなく発現されることが見出された。従って、本明細書中で例示するように、
本発明により、当業者には、コムギの製パン品質に影響を及ぼす所望の異種性HM
W-GS遺伝子でコムギを形質転換させることによってHMW-GSの量及び質の双方を予
測可能に操作することが可能となる。
図面の簡単な説明
図１
HMW-GS 1Ax1をコードする遺伝子で形質転換されたコムギ栽培晶種Bob Whiteの
R2種子の一つに由来するタンパク質のSDS-PAGE。棒線はHMW-GSサブユニットの位
置を示す；矢印は1Ax1サブユニットの位置を示す。上段の数字は、1Ax1遺伝子を
発現している9つの独立した形質転換系列に対応する。HMW-GS 1Ax1は形質転換し
ていないBob White種には存在しない（レーンｃ）。46kDa以下のタンパク質は示
していない。タンパク質分子量標準を右に示す。
図２
159系列（最も発現量が高いもの）および235系列（最も発現量が低いもの）の
一つの種子のタンパク質のSDS-PAGEにより、R1、R2、およびR3の種子においてHM
W-GS 1Ax1の蓄積が一定であることを示す。cレーンに示すように、HMW-GS 1Ax1
は形質転換していないBob Whiteには存在しない。タンパク質分子量標準を左に
示す。
図３
R2においてHMW-GS 1Ax1遺伝子発現がホモ接合となった29系列の７つの種子一
粒
ずつに由来するタンパク質のSDS-PAGEo棒線はHMW-GSの位置を示す；1Ax1サブユ
ニットの位置は矢印で示している。HMWGS 1Ax1は形質転換していないBob White
には存在しない（左から２番目のレーン）。図２と同様に、タンパク質分子量標
準を左レーンに示す。
図４
28、31、87、85、25、30、51、および62系列、ならびに形質転換していない対
照個体（nc）のゲノムDNA（20μｇ）をXba Iで消化し、1Ax1プローブでハイブリ
ダイズしたサザンブロット法。内因性HMW-GS遺伝子に由来する２つのハイブリダ
イズするバンドの大きさをkb（右欄）で示す。
図５
235、233、217、および159系列、形質転換していない対照個体（nc）のゲノム
DNA、ならびにpHMW1Ax1プラスミドのDNA（pc）をXba Iで消化し（右）、または
消化せずに（左）、1Ax1プローブでハイブリダイズしたサザンブロット；消化し
ていない検体では10μｇのDNAを、消化した検体では25μｇのDNAを用いた。内因
性HMW-GS遺伝子に由来する２つのハイブリダイズするバンドの大きさをkb（右欄
）で示す。
発明の詳細な説明
胚乳に存在するHMW-GS 1Ax1の量は、パン生地の弾力性/強度と正の相関を示す
（Halfordら,1992;Branlard,1987）。HMW-GS遺伝子を慣例的な交配によって操作
することは可能ではあるが、これらの遺伝子が強く連鎖しているために、予測不
可能であり、困難で、複雑であることが示されている（Flavellら,1989）。本発
明により、HMW-GSの質的および量的な変化をもたらす遺伝的な形質転換によって
付加的にHMW-GS遺伝子を導入および発現させることにより、コムギの製パン品質
を向上させる際の障害を克服することが可能となる。本明細書の実施例で用いて
いるように、1Ax1遺伝子はコムギのBob White種には存在しないため、SDS-PAGE
法によって、形質転換していない対照には存在しない新しく追加されたバンドと
して、コムギでのトランスジーンの発現を検出できる。独立に形質転換されてR1
でHMW-GS 1Ax1遺伝子を発現している9つの系列の大多数は、R2の種子抽出物中で
も同じ程度の発現を示していた（表２）。独立のトランスジェニック系列におい
て
、HMW-GS 1Ax1の量を含む、HMW-GSの蓄積の相対的なレベルの相違は、３世代を
通して安定であることが、密度計測法による解析で確認された（表２）。barお
よび1Ax1遺伝子は、これらを発現している８つの系列の全てで共分離されていた
。このことは、1Ax1およびbarを発現している全ての系列において、組み込みが
単一遺伝子座で起こっており、２つの系列（25および87）を除く全てで、これら
２つの遺伝子がメンデルの法則に従って遺伝することを示している。穀類のゲノ
ム内へのトランスジーンの組み込みは、複数の遺伝子座にも単一の遺伝子座にも
起こることは、すでに記載されている（Christouら、1989；Spencerら、1992；S
rivastavaら、1996）。HMW-GS 1Ax1を発現している９つの系列のうち８つのサザ
ンブロットによる解析の結果から、全ての系列において複数コピーの1Ax1トラン
スジーンが組み込まれていることが示唆される（図４，５）。これまでのところ
、8系列が、R2においてホモ接合であることが確認された。全ての系列において
、以降の世代においてもトランスジーンの発現は維持されていた。トランスジェ
ニックタンパク質の産生量は、各系列によって異なり、全抽出タンパク質の0.6
〜2.3%であった。導入した1Ax1遺伝子が高レベルで発現したこと、および少なく
とも３世代に渡って安定であったことから、コムギおよびその他の穀類の胚乳組
織において、トランスジェニックタンパク質を発現させるために天然のHMW-GS遺
伝子プロモーターを効果的に用いられることが示唆される。従って、タンパク質
をコードする異種性DNA断片を発現させるために1Ax1プロモーターを用いること
は、本発明の範囲に含まれている。SDS-PAGE法の密度計測スキャン解析では、正
確な定量的データを得られないが、それでも導入したHMW-GS遺伝子の効果を評価
するためには有用である。本明細書で示した方法により、1Ax1遺伝子導入後に、
全HMW-GSが最大71%まで増加した。驚くべきことに、ほとんどの系列において、
トランスジェニックの1Ax1サブユニットの蓄積は、その他のHMW-GSを犠牲にして
はいないことが結果から示された(85および233系列では1Ax1の発現は中程度に過
ぎなかったが、それでもその他のHMW-GSを犠牲にしており、全HMW-GS量は形質転
換していない対照の範囲内であった)。
本発明は、HMVV-GSポリペプチドをコードする遺伝子によって植物を形質転換
することを通して、コムギのような植物の製パン特性を増強および増大させるた
め
の方法に関する。本発明はまた、HMW-GSトランスジーンまたはその断片もしくは
変異体を保有する、形質転換およびトランスジェニック植物、植物材料、および
種子に関する。好ましい態様においては、複数のコピーのHMW-GSトランスジーン
がゲノムに挿入され、植物細胞において発現される。本発明はまた、本発明に係
る植物および種子から調製されるパンなども包含する。
このため、これらの開示に従い、当業者は、HMW-GS遺伝子の総数を増加させる
ことが可能であり、これによりHMW-GSの蓄積量を増やすことができ、それが製パ
ン品質を向上させる結果となることは、明らかである。さらに、本発明は、当技
術分野において周知の方法で変異遺伝子をコムギおよびその他の植物／穀類に導
入することによって、HMW-GSの構造を変化させ、HMW-GSの組成を定型的に操作し
、それが製パン品質に影響を与える機会をもたらす。さらに、本明細書の指示に
従えば、当技術分野において周知の方法によって、（例えば制限酵素部位で挿入
することによって）ヌクレオチドを付加したり、(例えばBal31エキソヌクレアー
ゼを用いることによって）ヌクレオチドを除去したりすることによりHMW-GS遺伝
子を改変することができ、タンパク質をコードする変異体または断片を得ること
ができる。
このように、本明細書の指示に従えば、当業者にとっては、HMW-GS 1Ax1遺伝
子または良質の製パンに関するその他のあらゆるHMW-GS遺伝子を、メンデルの遺
伝法則に従う単一優性遺伝子として、コムギゲノムに安定に組み込み、発現させ
、および継代させうる方法および可能性が提供される。以下の実施例では、特に
、天然のHMW-GSプロモーターの制御下において、コムギの栽培品種であるBob Wh
iteで、新たに、多量のHMW-GS 1Ax1が産生されることを示す。これらの実施例は
、当業者であれば、本明細書の開示に従って適切なHMW-GS遺伝子を導入して形質
転換を行うことにより、予測通りおよび定型的に、コムギ胚乳の組成を、ひいて
は人類および工業的使用に適するように変えることができることを示している。
同様にして、トウモロコシ、コメ、およびその他の穀類の組成も、本明細書の指
示ならびに既知の形質転換および選択技術に従って、改変することができる。本
明細書で特に例示した方法以外の形質転換法も、本発明の方法として用いること
ができ、それらも本発明の範囲に含まれていることは理解されるべきである。
以下に本発明を実施する過程を示す実施例を記述する。これらの実施例を、制
限的なものとして解釈すべきではない。特に記載のない限り、全ての百分率は重
量で、およびすべての溶媒の混合比は容量で示す。引用した各参照文献に記述さ
れている方法は、特に指定した箇所の参照として、本明細書に組み入れられる。実施例１−コムギの形質転換およびプラスミド
バイオリスティック粒子加速装置(PDS1000/He，Bio-Rad)で、既述（Taylorら
，1993；Vasilら，1993；Altpeterら，1996；この方法は、参照として本明細書
に組み入れられる）に従い、Triticum aestivum L．（Bob White種）の幼若胚に
爆撃することにより、形質転換を行った。プラスミドpAHC25およびpHMW1Ax1を約
１：１のモル比（各DNAとも5μｌずつ）で混合し、同時に形質転換した。プラス
ミドpAHC25は、選択可能なbar遺伝子およびGUSレポーター遺伝子（uidA）を、い
ずれもトウモロコシのユビキチンプロモーター制御下に含んでいる（Vasilら，1
993；Altpeterら，1996；ChristensenおよびQuail，1996）。プラスミドpHMW1Ax
1はコムギのHMw-GS 1Ax1遺伝子を含んでおり、それ自体の胚乳特異的プロモータ
ー（Halfordら，1992）により発現が誘導される。トランスジェニック系列は、
既述のビアラフォス含有培地で選択した（Altpeterら，1996）。至適条件以下で
の爆撃および選択条件のもとで、7650個の胚を用いて（９回の実験により）、全
部で21系列の独立したトランスジェニックコムギ系列（うち20系列がPATを発現
している）が得られ、全体としての形質転換効率は0.3％であった。実施例２−HMW-GS 1Ax1およびbarの同時形質転換および発現
栽培品種のBob Whiteコムギの幼若胚を、pAHC25およびpHMW 1Ax1で同時に形質
転換した。ホスフィノトリシンアセチル転移酵素（PAT）活性の測定結果に基づ
いて、20の独立した形質転換系列を同定した。もう一つの系列（系列85）は、ビ
アラフォスでの選択では生存したがPAT活性が認められなかった12個体について
の別の実験で、サザンブロット解析により同定された（barおよび1Ax1の両方の
遺伝子が存在していた）。培養開始後３ヶ月以内に植物を土壌に植え替えた。21
の形質転換系列の各々が完全に稔性を有し、R1の種子を産生した。各系列の成熟
したR1の種子８粒から各々総タンパク質を抽出し、トランスジェニックのHMW-GS
1Ax1の蓄積を、SDS-PAGEにより解析した。図１〜３に示したように、HMW-GS 1A
x1タンパク
質は、対照のBob Whiteの種子には存在しない（対照のレーン）。このことから
、トランスジェニックの1Ax1サブユニットが存在することは、標準分子量マーカ
ーと比較して約126kDaに位置するタンパク質のバンドがあることで、９系列で明
確に検出できた（これらのうち2系列について、図２に示す）。pHMW 1Ax1と同時
に形質転換しPATを発現している20系列のうちで8系列が、1Ax1トランスジーンを
も発現しており、同時発現の頻度は40％であった。実施例３−PATの測定
選択の後、シリカゲルの薄層クロマトグラフィーで葉の抽出物中のPAT活性を
測定することにより（Spencerら，1990、この方法は参照として本明細書に組み
入れられる）、一次形質転換体を同定した。ただし、標識には、2.0μｌの[14C]
アセチル-CoA 43.2mCi/mmol（Sigma）を用いた。各検体の、総タンパク量25μｇ
に相当する反応生成物を用いた。実施例４−タンパク質の解析
乳鉢および乳棒を用いて、乾燥した成熟種子を個別に擦り潰し、タンパク質を
抽出物の調製を行った。各種子から得た10〜14mgの小麦粉を、200μｌの検体緩
衝液（2％SDS、5％β-メルカプトエタノール、0.001％ピロニンＹ、10％グリセ
ロール、0.063M Tris-HCI pH6.8）とともに２分間ボルテックスし、250rpmの回
転式振とう器で２時間インキュベートした。抽出物を遠心し（14,000rpm，10分
）上清を5分間煮沸してタンパク質を変性させた。タンパク質をSDS-PAGE（Laemm
li，1970）で分離した；すなわち、10％（w/v）アクリルアミド、0.8％（w/v）
ビスアクリルアミドを含む13cmのゲルに各検体を20〜30μｌずつのせて、抽出タ
ンパク質全てがゲル上にあり、1Ax1のバンドが相互に完全には分離しない他のHM
W-GSと分離されるように、色素マーカーの先端がゲル下端に達するまで泳動した
。ゲルを先ず色素の入っていない染色液で0.5〜1時間固定した後、クーマシーブ
リリアントブルーR-250で4〜6時間染色した（Neuhoffら，1988）。5％メタノー
ルおよび7％酢酸水溶液（v/v）中でバックが透明になるまで脱色して、タンパク
質のバンドを可視化した。ゲルは7％酢酸水溶液（v/v）中に保存した。染色した
ゲルをAlpha Innotech（San Leandro，CA）製のIS-1000デジタルイメージングシ
ステムを用いてスキャンした。各レーンおよびピークの値は、バンド間のバック
を差し引くこと
により補正した。各レーン毎に、約140kDa付近に位置する各HMW-GS 1Ax1のバン
ドの上端から、バックの強度を決定した。HMW-GS 1Ax1の存在量は、レーンの補
正値またはHMW-GSの補正値を基準に算出した。総HMW-GSレベルは、各レーンのタ
ンパク質含量を標準化して算出した。実施例５−DNAの解析
CTAB法（Lassnerら，1989、本方法は参照として本明細書に組み入れられる）
を用いて、PAT陽性植物体の葉からゲノムDNAを分離した。精製したDNA(20〜25μ
ｇ)をXba Iで消化し、0.8％アガロースゲルで電気泳動して、ハイボンドＮ膜（A
mersham）にブロットした。ハイブリダイゼーション用のプローブは、pHMW憎1Ax
1をEcoRIおよびHind IIIで消化して生じる、HMW-GS 1Ax1遺伝子のコーディング
領域に由来する2.2kbの断片からなり、ランダムプライマー標識キット（GIBC0-B
RL）を用いて作成した。ハイブリダイゼーションは、65℃で24時間行い、オート
ラジオグラフィーでシグナルを可視化した。実施例６−分離の解析
R1世代におけるトランスジーンbarの分離比を検討するため、21のトランスジ
ェニック系列の各々に由来する成熟胚20粒を、ビアラフォス添加培地：15g/lの
ショ糖，2.5g/lのゲルライトおよび3mg/lのビアラフォス（オートクレーブした
後、濾過滅菌して加えた）を添加した、1/2強度のMS-塩類およびビタミン類、pH
5.8（B3培地）（MurashigeおよびSkoog，1962；本方法は、参照として本明細書
に組み入れられる）で発芽させた。以後の各世代について、選択を行わなかった
1Ax1トランスジーンの発現を評価したところ、この遺伝子を発現している系列の
みが次世代へと継続した。B3培地でHMW-GS 1Ax1が蓄積する全ての系列のうち、
最大12個のR1個体に由来する20個の胚の発芽能を調べたところ、barがホモ接合
の系列が、R2の種子から同定された。共分離が起こったかどうかを検討するため
、barがホモ接合となった各系列の種子10粒について、個別にSDS-PAGEによりHMW
-GS 1Ax1の解析を行った。実施例７−分離の解析、共発現の安定性、およびHMW-GSの蓄積レベル
各系列の20個のR1および120〜240個のR2の種子から取り出した成熟胚（6〜12
個体／系列）を、ビアラフォス含有B3培地で発芽させ、以後の世代におけるトラ
ン
スジーンbar分離および発現について検討し、barがホモ接合となった個体を同定
した。16系列の発芽率は、単一の組み込み部位に関するメンデル型分離と、有意
な相異はなかった；系列25および87は、メンデル型分離を示さなかった（表１）
。系列62および228のR1の個体では、PATの発現が喪失していた。R0ではbar遺伝
子を保有してはいるが発現してはいない系列85は、B3培地では発芽しなかった。
これまでのところ、R2世代において、PATの発現がホモ接合となった7系列が同定
された。これら7系列において1Ax1遺伝子が共発現／分離していることは、SDS-P
AGEによる解析で確認された。系列85は、PAT活性は示さないが、HMW-GS 1Ax1を
蓄積していることが見いだされた；そのホモ接合の子孫も同定された。２系列（
系列87および235）で、トランスジェニックHMW-GS 1Ax1より移動速度の遅い、由
来不明の新たなポリペプチド（各々195kDaおよび156kDa）が見られた（図１、２
）；このポリペプチドは、後の世代にもまた存在していた。図１（レーン28〜23
5）は、９つの異なる系列間でのHMW-GS 1Ax1の蓄積レベルの違いを示す。ゲルの
濃度計測スキャンにより、各系列で産生されるHMW-GS 1Ax1タンパク質の量は、
総タンパク量の0.6〜2.3％の範囲でばらつくことが示された（表２）。最も強い
発現を示す系列（28、87、159）では、HMW-GS総量の32〜40％をトランスジェニ
ックのHMW-GS 1Ax1が占め、しかも天然のHMW-GSは少しも減少していないため、R
1およびR2の種子のHMW-GSレベルは、形質転換されていない対照の1.53〜1.71倍
となり、159系列ではR3の種子も同様であった（表２）。ホモ接合の系列内でのH
MW-GS 1Ax1の蓄積は、一様であった（図３）。異なる系列間のHMW-GS 1Ax1の相
対量の違いは、以降の世代にわたっておおむね一定であった。
aχ2検定による解析の結果、これらの系列に由来するR1の成熟胚の分離比は、３
：１から有意にずれてはいなかった（a=0.005）。R2およびR3世代の値は、図１および２に示した２つのゲルの平均値である。1,2
トランスジェニックHMW-GS 1Ax1のピークをレーン全体の合計値で割った値1
、または各レーン内の全てのHMW-GSピークの和2。3
全てのHMW-GSピーク値の和をタンパク量補正後に対照レーン（形質転換してい
ないBob White）の値で割ったもの。ここに示した値は全て、個々のHMW-GS 1Ax1
、HMW-GSまたは総タンパク質のピークをバックで補正したもの。
n.a.＝解析時に入手不可。実施例８−サザンブロット解析
対照の形質転換していないゲノムDNAをXbaＩで消化してサザンブロットし、pH
MW 1Ax1プラスミドの全長または小さいコーディング領域のいずれかで作成した
プローブを用いてハイブリダイゼーションすると、7.0および9.3kbの、２本の交
差反応するバンドが検出された（図４および５の対照のレーン）。制限酵素とし
てXbaＩを用いたのは、pHMW1Ax1には、コーディング領域の外側に１カ所だけ、X
baＩの認識部位が存在するためである。12のトランスジェニック系列（8系列が1
Ax1を発現しており、4系列はbar遺伝子のみを発現しているがpHMW1Ax1プラスミ
ドを同時に形質転換したもの）由来のゲノムDNAでサザンブロットを行った。Xba
Iで消化すると、1Ax1を発現している8系列のうち6系列（28、31、85、87、233、
235）が、明確に個別の組み込みパターンを示し（図４、５）、複数のプラスミ
ド
のコピーが不規則に挿入および／または短縮されて存在していた。1Ax1を発現し
いる系列のうち２系列（159および217）では、内因性のバンドと同じ移動度をも
つ7.0kbの濃いバンドが認められたが、これは9.3kbの第２の内因性バンドよりも
はるかに濃かった。このことから、複数のコピーが縦列に多数、一続きに存在し
ていることが示唆される。1Ax1を発現していない系列の中で、系列25は、明らか
に、1Ax1を発現している系列28および31と同様の組み込みパターンを示した。系
列30にはトランスジーンは存在していなかったが、一方で、系列51および62は、
陰性対照の個体と非常によく似てはいるが遥かに濃いパターンを示した。ゲノム
DNAにトランスジーンが組み込まれていることは、４つの1Ax1発現系列および形
質転換していない対照個体１系列の未消化のDNA 1.0μｇをハイブリダイゼーシ
ョンして比較することにより証明された（図５）。発現系列のハイブリダイゼー
ション・シグナルは、陰性対照のものより、明らかに濃かった。
本明細書で記述した実施例および態様は説明のみが目的であり、当業者はそれ
らから様々な改変または変化を導き出すと考えられるが、それらは本願の意図お
よび範囲、ならびに添付の請求の範囲に含まれるものであることが、理解されね
ばならない。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ
，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，
ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，Ｌ
Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ
，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，
ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ