CN114686510A - 一种制备株型为收敛型的禾本科植物的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备株型为收敛型的禾本科植物的方法及其应用。本发明结合基于基因编辑的靶向改造技术，获得了株型收敛的禾本科植物，其与野生型植株相比收敛状态非常显著。本发明提供了有效和简便的促进植物收敛型生长的新方案，适用于在田间生产中通过密植增加产量，为植物的改良育种提供新的途径。

Description

一种制备株型为收敛型的禾本科植物的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域，更具体地，本发明涉及一种制备株型为收敛型的禾本科植物的方法及其应用。

背景技术

粮食是维系人类社会发展的基本物质基础。近年来，由于全球人口数量的急剧增加及气候环境的逐步恶化，人们日益增长的粮食需求与缓慢发展的粮食生产能力之间的矛盾日益突出。中国是一个水稻生产和消费大国，水稻对保障我国粮食安全具有重要作用。

进入二十一世纪以来，基因组测序技术的迅速发展和广泛应用产生了大量物种的精确基因组、转录组序列，为基因组学研究提供丰富数据的同时也促进了基因编辑技术的发展。基因编辑技术是直接在DNA水平对生物体进行修改的。相对于RNA干扰(RNAi)、蛋白质阻断剂等技术而言，它可以为生物体带来稳定长久的可遗传变异。2012年，Jinek等人发现将来源于产脓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的Ⅱ型CRISPR/Cas系统中的crRNA和tracrRNA连接起来所形成的single-guide RNA能介导Cas9蛋白对特定的 DNA分子进行切割，由此开始了RNA介导的DNA编辑技术新篇章。 CRISPR/Cas9系统是广泛存在于细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统，由 CRISPR重复序列和串联的Cas基因共同构成，其作用机理可分为三个阶段，第一是CRISPR高度可变间隔区的获得，第二是CRISPR基因座的转录和表达，第三是CRISPR/Cas系统的生效，即对外源遗传物质的干扰，其中引起切割的位点是PAMs(Protospacer-adjacent Motifs)区。在实际应用中，主要是通过设计该基因转录起点上游区段的sg-RNA引物以期实现对其启动子区域的破坏，抑制基因的转录表达；同时，为了确保对该基因功能的完全抑制，通常还会在编码区设计另一个敲除位点，以完全破坏基因结构。

早在2013年，Crispr/Cas9技术就被应用在植物基因功能的研究上。近年来随着Crispr/Cas9系统的不断完善以及基因编辑效率的不断提高，科学家们也开始将Crispr/Cas9技术应用在水稻种质资源的创新中。

农业生产中通常将水稻的产量归因于四大要素：每亩株数、每株穗数、每穗粒数以及千粒重，反映在表现型上为水稻株型、穗数、抽穗期、粒重等方面，这些表型都有了明确的相关基因。为了直接、快速地对种质进行正向改造，科学家们进行了诸多尝试。例如Li等在中花11(ZH11)中直接编辑直立穗基因DEP1和理想株型基因IPA1，得到了穗型紧凑、分蘖数异常分化的后代；Zhou等直接在3个水稻品种中敲除了粒型相关基因GS2，GS3以及每穗粒数相关基因Gnla；徐鹏等敲除粒重基因GW2、GW5和千粒重基因 TGW6并进行了聚合，得到了三隐性突变体，显著提升了粒长、粒宽和千粒重(Xu et al.,2019)；Ma等通过敲除水稻花器官发育相关基因OsSNB，同样得到了粒长、粒宽、千粒重增加的突变体，不仅创造出一种新的基因型，还提示了OsSNB可能具有调控粒型的功能。

除了对产量相关的基因进行改造，科学家们也对水稻品质相关的基因进行了编辑。水稻的品质主要受直链淀粉、支链淀粉和蛋白质含量影响，尤其是直链淀粉与支链淀粉的含量比例直接影响水稻的食用、加工品质，而水稻蜡质基因Wx与其直接相关。近年来，多个课题组通过敲除或编辑Wx基因顺式元件，成功将直链淀粉的含量进行微调，在不改变水稻遗传背景的前提下直接创制出该品种具有糯性的种质。

Crispr/Cas9技术不仅可以作为高等遗传学研究手段研究基因功能、治疗人类疾病，还可以利用这项技术来优中选优、优中造优，直接改良现有的农作物，提升育种效率。另外，随着Crispr/Cas9基因编辑系统及其衍生技术如单碱基编辑器ABE、CBE的不断发展和完善，可供科学家们进行基因编辑的工具越来越多，编辑位点、编辑方式也越来越多样化，各类原本不存在的基因型有可能也在此过程中被直接创制出来。同时，Crispr/Cas9技术不会向作物带入其他物种的基因，仅仅是基于自身的改造或聚合，并且仅通过一代杂交或回交就可以得到纯合的transgene-free后代，相较于常规的转基因技术，在生物安全的控制上有积极作用。目前，全球除欧盟外的许多国家或地区都已明确宣布不将经Crispr/Cas9编辑的生物纳入转基因生物管理。可以预见不久的将来，基因编辑将为作物育种带来革命性的变化，为世界粮食安全作出不可忽略的贡献。

尽管Crispr/Cas9作为生命科学领域的研究工作，为这一领域带来了很大的变化。然而在实际工作中，CRISPR-CAS还存在对靶点的结合不精确，对识别序列以后的切割操作不精确，对切割位点进行精确编辑也存在难点。例如，科学家在对人类胚胎的基因编辑操作尝试中就发现了很多非特异性切割。因此，在植物学领域中，找到精确的，真正实现植物种质调控的基于 Crispr/Cas9的系统还存在技术难度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备株型为收敛型的禾本科植物的方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种制备株型为收敛型的禾本科植物的方法，所述方法包括下调植物中Tac1的表达或活性。

在一个优选例中，所述的下调Tac1包括：在植物中敲除或沉默Tac1 基因；较佳地，包括：以基因编辑方法敲除Tac1基因，以特异性干扰Tac1 基因表达的干扰分子来沉默Tac1，或以同源重组方法敲除Tac1基因；较佳地，以基因编辑方法敲除Tac1基因。

在本发明的另一方面，提供一种Tac1的用途，用于作为下调靶点，以制备株型为收敛型的禾本科植物。

在本发明的另一方面，提供一种Tac1下调剂的用途，用于制备株型为收敛型的禾本科植物；较佳地，所述的Tac1下调剂通过下调Tac1，促进植物的株型为收敛型；较佳地，所述的Tac1下调剂包括：敲除或沉默Tac1 基因或抑制Tac1蛋白活性的下调剂；较佳地，包括：敲除Tac1基因的基因编辑试剂，特异性干扰Tac1基因表达的干扰分子，基于同源重组的敲除Tac1 基因的试剂。

在一个优选例中，所述基因编辑包括：靶向于选自下组的靶点进行基因编辑：3’-UTR区域；外显子区第1个外显子；5’-UTR区域。

在另一优选例中，对3’-UTR区域进行基因编辑时，sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

在另一优选例中，对外显子区第1个外显子进行基因编辑时，sgRNA 的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，对5’-UTR区域进行基因编辑时，sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述禾本科植物为表达Tac1蛋白或其同源物的植物；较佳地，所述禾本科植物包括选自：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草。

在本发明的另一方面，提供一种Tac1的用途，用于作为鉴定禾本科植物株型是否为收敛型的分子标记。

在本发明的另一方面，提供用于制备株型为收敛型的禾本科植物的基因编辑试剂，其为sgRNA试剂，其靶向于选自下组的靶点进行基因编辑： 3’-UTR区域；外显子区第1个外显子；5’-UTR区域；较佳地，对3’-UTR 区域进行基因编辑时，sgRNA的核苷酸序列如SEQID NO:2所示；对外显子区第1个外显子进行基因编辑时，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3 和SEQ ID NO:4所示；或，对5’-UTR区域进行基因编辑时，sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示。

在本发明的另一方面，提供用于制备株型为收敛型的禾本科植物的表达构建体或表达盒，其包括能在体内靶向于选自下组的靶点进行基因编辑的序列：3’-UTR区域；外显子区第1个外显子；5’-UTR区域；较佳地，所述的序列根据SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4，SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6而设计。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、针对OsTac1设计了三个高特异性的基因编辑靶点，分别在3’-UTR、外显子区(Gene Body)、启动子区。

图2、Crispr/Cas9双元载体pYLCRISPR/Cas9-MH的示意图。

图3、3’-UTR位点进行编辑后的测序结果，以及转基因植株与野生型植株的表型比较；其中WT：Wild Type，野生型，即五山丝苗；mu：mutation，即基因编辑后代，下同。

图4、外显子区进行编辑后的测序结果，以及转基因植株与野生型植株的表型比较。

图5、5’-UTR进行编辑后的测序结果，以及转基因植株与野生型植株的表型比较。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，结合基于基因编辑的靶向改造技术，获得了株型收敛的禾本科植物。本发明获得的植株与野生型相比收敛状态非常显著。本发明提供了有效和简便的促进植物收敛型生长的新方案，适用于在田间生产中通过密植增加产量，为植物的改良育种提供新的途径。

如本发明所用，所述的“株型收敛”是指植物的叶、穗、茎为更倾向于以直立向上(垂直于水平面)的状态生长，其叶片开张角度小。相对而言，直立的叶片可增加单位面积株数，提高叶面积指数，充分利用光能，提高了光能利用率，有助于提高亩产。

如本文所用，所述的“植物”包括表达Tac1或包含Tac1及其所参与的信号通路的植物。根据本领域的知识，表达Tac1的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制，可以实现如本发明所主张的技术效果。在一些优选方式中，所述的植物为作物，较佳地为禾谷类作物，所述禾谷类作物为具有籽粒(穗粒)的作物。所述的“禾谷类作物”可以是禾本科植物。较佳地，所述的禾本科植物包括：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草等。

如本文所用，术语“提高”、“改良”或“增强”是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与本文中定义的对照植物相比较，至少2％、3％、 4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、 30％更高的调节。

关于“对照植物”，选择合适的对照植物是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同或属于同一类的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。

本发明人的前期工作中，选取了17个具有代表性的水稻杂交组合，并对杂交产生的10074个F₂株系进行了连锁遗传分析和全基因组关联分析。发现在绝大多数基因位点在杂合状态下都表现为正向的部分显性效应 (partial dominance)，超显性或假超显性现象的位点很少。而这些表现出加性效应、部分显性效应、超显性效应的基因之所以能够被观测到，可能是由于等位基因的剂量效应造成的。

本发明人进一步的研究工作显示，直接调节某些杂种优势相关基因的剂量，可以直接在基因纯合的状态下得到表现型与杂交种相似的水稻种质。

在这些研究工作的基础上，本发明人采用Crispr/Cas9的手段，选取优良的三系杂交稻育种材料五山丝苗作为受体，对OsTac1进行了靶向编辑，获得了适于密植的水稻育种材料。

因此，本发明提供了一种制备株型为收敛型的禾本科植物的方法，包括下调植物中Tac1的表达或活性。

作为本发明的一种实施方式，可通过以适当方式敲除Tac1基因，从而下调植物中Tac1基因的表达。

作为本发明的一种实施方式，可采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除Tac1基因，改变植物的株型。合适的sgRNA靶位点，会带来更有效的基因编辑结果，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到合适的靶位点较为重要。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。本发明人经过反复研究，优选地以靶向于选自下组的靶点进行基因编辑：3’-UTR区域；外显子区第1个外显子；5’-UTR 区域。

作为本发明最为优选的实施方式，对3’-UTR区域进行基因编辑时， sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。结果显示，与野生型植株的株型相比，3’-UTR位点进行编辑、敲降了OsTac1的植株表现为株型更加收敛，性状改良非常显著。

对外显子区第1个外显子进行基因编辑时，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。结果显示，与野生型植株的株型相比，外显子区第1个外显子进行突变的植株表现为株型更加收敛，性状改良非常显著。

对5’-UTR区域进行基因编辑时，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5 和SEQ IDNO:6所示。结果显示，与野生型植株的株型相比，5’-UTR进行改造的植株表现为株型更加收敛，性状改良非常显著。

因此，本发明中，依托基因编辑技术，找到了有效的基因编辑靶点，实现了植物株型的显著性改良。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、基因编辑植物的建立

1、植物材料及基因编辑体系

水稻恢复系品种五山丝苗。

spCas9基因编辑体系。

2、OsTac1序列(SEQ ID NO:1)

>Os09t0529300-02class＝Sequence position＝chr09:20731589..20734728(-strand)

GAGCTACTGTCTGGCTTTCTCTTCTGGTTTCATATTGGTTCTAGAGAGATGGCTCTAAAGGTAC ACAGTTAGTTCATGCTGATACACCATTTGTCCGTGTATAGTGTATGCTGTAAAGTACAGGTC TTTGCAGTTTCTGTCTCTCTTAAACAAGTGCGTTGGATTCAACTCACTGTTCTTATATCTAAT GAGATTACTGGTGATTTATGTTTTTATGGCACTACCAGGTGTTCAATTGGCTGAATCGGAAGAAGCATTCTAATGTCGAGTATTGCACCATCAATGAGAACAAG GGTAAGGATACCAGGA TATCTCTCTTTTATGTACCACATGTTTTGTTGTTCTCATGTTGTCAACTCTTGTTTCTTCTCTT CTATTTTTTTTCCTGATGGAGTAGCCATGGAAGAGAAGGAAGACTCTCTGCGTGCAAGTGTGACTGAGCA AGACACTGAGGCCCTGCTGCTCCGTGATGTGCTTATTAATGGTATACTTGCAATTGGCACGCTGGGCCACAATGTA AACTCACTCTGTCCTGAGTCCTGTATTGAACAAGATGAGCCCATCATCATGTGTGATGAGAAAGTGGAACAAGAGA AGTGCGAAGAAGAAAAGGCTGAGGCTAAACAGGACACACCAGTTACAGCACCAAGTGAACCGGCATCTGCTCTTGA GCCTGCCAAGATGCACTCATCATCGATGAAAGAAGACAACTTCATGTGCTTTGTGAAGGAGGAAATCCTAATGCAT GGCATGGAAGTGGAAGATGTTCCTAACATCCAGGAACGACCACTTCTGATGTTAGAGAAGGTGGAGAAAGTGAGAA CTACACTTGCCGATCTATTTGCTGCAGAAGCATTCTCATCAAGTGATGCAGAGGATAAGTGTTACCCGAAAATCGT CATTGTTGCTGGGGCATCCACTTCAAAGCCTACGTCGTGCATGGAGAAGATGCATCACAAGAAGCCAACAAAACCA ACGTCAAAGCCGCTGAAGGCTACAAGAAAATTAAGTCGAGT ATGGTTTTCTTCGTCTCTGCTTTATTTGTTAAGCCTTGTTACATTATATTTTACTAGTCTGGAA TTTATTACACTTTGTTCCATGGTCAGTGCGCCACATCTTACACATATGTTTTACCATATAGCT ACAACTGGAGTAAGCATTATGCATCTAGCCAGTCTTTAGTGGTAAATGATCACTGACCTGGA ATGCACCTTTTTGGTTTTTGTCATCTGTAAAATAAGTAGGTCATGAGGAAGATGTTGGGGAAGAAGATCC ACCCAGAGCAGCTCAATGGACGTAGCAATGCAGAGGGCCCTGTCACTGCATAATGCTAGGTTTGTGGACAAAAGTTTCCTTTCTCTATCTGGCAATTTATTACCTAGAGTTTTTTT AAAGCTGTCTGTTGAACTATACAGGGCTCAAGGCCCTTGTGTTTTGCATACGATTTTGTACCTTTCC AAATTTTCTTGATTTTTACTTGGATTCCATTGTTTGTAATAAAATTAGGTTAATATCTGAGGTAGTATT TGCATAGAATGGATACCTTCTACCAAAGTTATATTTGTTTGTGGGTCCTAGAGCTAGCATGACCCA CGAATCACATTCAAGAATATAGTAATTCGTTTAGGCTACATTTCACTAGGAATAGAACATATGAATA TTCTCAGGTTTAATAAGGCAGATGCAAAAAAGAACTGAATAGCACAGGAAAGTAATTTTTCCATTTCAAGCTTCTCACAGTCAAAAACAAGTAATGGTTCAAAAATTGAATATTCTATCACCTGTTGCCTCCAT TTATGTGGAACTCACAAGAGGGTCTAAGTGCTGCTTGACACTCTGACCTGTATTTAAATAAAATGTT ATCACCTATTGCCTCTGCTTATTATTGGGATCTCAAAACACAATCTATTACTGTGTATGCCTTGGCA TTTTTTAAAATCTGAGCTGCCCCCTTATTCTTCACATTTTCTCAGAAAACCATATAAACttttagataaatg aagcttttattgatctcagacaattacatcaagttgatagaaccaaactaagaacacttctggcctctgataaTGGAACTGCTGTTTG TTTAAGTAGAAAGAATGGTGTGTGTATTTTAACGGTTGGTGATTGGGAATTGGGATGCAGTGACCA TGGAGACTGTGTTCTTCAGAATATTTTTAAGAAATAGTGTTTTCGGTGGATCCTATCATGGAACTGC CTATGGTGGAAAGAGCAATACGAGTTGAAACATATAGGGATTAGGAAGCATGGGTTCGGACTAAA ATGCATTCGTTCCTGCCATGATGCAAAGCTTCATTCGAAGCAAAATGAGCACATGCCATGGTACAG TGGCGTGCAACGAGCACTGCAATTGCACACGACGTGCATGTTCTGAAAAAGGCCAGTGGACACTA GACATGCAGCTAATCCTCTTTTGATGAATTCTATCATGAAACCAATGGATTCGTTGAAAATCTGAAC AAATTGATGGATTTGGTCCCAGCTGTAGAAAGGTTGGCAAACTCTTCTCGCTCCTGTATTATTGTA GGCTGGAGCTATGATGGACCAAATCATCAGAAGCAAATTTCACCATATATAAGCATCTACTTTTATC TTTTTCTCTATTTTAAAATGTGATCATAGTGAAGTTATATACATTCTATCTGCTTAACGCTCCACATT ATCCAAAAAAATGCATCACACTCCATATTGGGAACACGTTGGTGGTTCTGAACCAAAGTCGATCTC TTGATGCCAATTTTTTTTTTGAGCTGGTTGAGTAGTCGAACTGGGAACAATTACTGCTTGAGGCTAC AAAATTTCTGGCCGACAATACGTCTTGATCAGGAACTGACTAAAGAAATTCCCTTTCACCTTTTGCG GGATTTGTTGGATCCATCCTCACGCTTCGGATTCCTTGCTCAAGAGAAACATCCATGCATATCGTC GACAGCGTTCGTTCAGTCCTCTTCCTTTTGTTGTTGGTGCTGTTGTTATTATTGTTATTGTTATTGCT GCCTATTCGCTCGCCAGTGATGAAGAATAGTCCTGCCTATATTTGCCTGTAGTACATTGTAAAGCT ACAGTTGACGTGTCTTGTAAGACCCTTATTATTATTGTCCATACCACGACGTCTC

上述序列中，第1～48位为5’-UTR；下划线区为外显子；ATG至TAA 终止子之间的无划线区为内含子；第1329～3140位为3’-UTR。

2、spCas9基因编辑体系

如图1所示，经过深入的研究筛选，本发明人针对OsTac1获得了三个高特异性的基因编辑靶点，分别在3’-UTR、外显子区(Gene Body)、启动子区。

本发明人根据上述序列区特点，设计sg-RNA。

①编辑3’-UTR区域所用sgRNA(单靶点)：

ACTGCATAATGCTAGGTTTGTGG(SEQ ID NO:2)。

②编辑GeneBody区应用sgRNA(双靶点)：

TACTGTCTGGCTTTCTCTTCTGG(SEQ ID NO:3)；

GGCACTACCAGGTGTTCAATTGG(SEQ ID NO:4)。

③编辑5’-UTR应用sgRNA(双靶点)：

CCCACTGTCAGTGACTAGTCTGC(SEQ ID NO:5)；

TCGGTCTAATCATGTCTATATGG(SEQ ID NO:6)。

基因编辑系统用的是华南农业大学刘耀光课题组的编辑系统，双元载体骨架(LB-RB非T-DNA序列)为pCAMBIA-1300(ACCESSION: AF234296)(Ma X et al.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient， High-Efficiency Multiplex Genome Editing inMonocot and Dicot Plants.Mol Plant.20158(8):1274-84)。Crispr/Cas9双元载体pYLCRISPR/Cas9-MH的示意图如图2。

根据上述设计的sgRNA合成引物，引物经退火后形成双链，连入前述 CRISPR载体中，通过农杆菌介导的遗传转化法，转入野生型水稻五山丝苗中，通过分子生物学检测获得纯合突变植株。

实施例2、基因编辑植物的性状分析

本实施例中，进行转基因后代表型考察。

1、3’-UTR位点进行编辑

本发明人发现，在五山丝苗中对OsTac1的3’-UTR位点进行编辑后，转录本稳定性差，相当于敲降了OsTac1的表达量。序列测定显示，基因编辑后的植株，其比野生型缺失了2个碱基，如图3(上图)。

种植转基因植株，并与野生型植株进行比较，获得的表型如图3(下图) 所示。可见，与野生型植株的株型相比，3’-UTR位点进行编辑、敲降了OsTac1 的植株表现为株型更加收敛。

2、外显子区进行编辑

对五山丝苗OsTac1的外显子区第1个外显子进行突变，序列测定显示，基因编辑后的植株，其比野生型缺失了14个碱基，如图4(上图)。

种植转基因植株，并与野生型植株进行比较，获得的表型如图4(下图) 所示。可见，与野生型植株的株型相比，外显子区第1个外显子进行突变的植株表现为株型更加收敛。

3、5’-UTR进行编辑

对五山丝苗OsTac1的5’-UTR进行改造后，序列测定显示，基因编辑后的植株，其比野生型缺失了4个碱基，如图5(上图)。

种植转基因植株，并与野生型植株进行比较，获得的表型如图5(下图) 所示。可见，与野生型植株的株型相比，5’-UTR进行改造的植株表现为株型更加收敛。

根据上述，本发明通过靶向改造，获得了株型收敛的植物，在田间生产中可以通过密植增加产量。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 一种制备株型为收敛型的禾本科植物的方法及其应用

<130> 20A637

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3140

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L)

<400> 1

gagctactgt ctggctttct cttctggttt catattggtt ctagagagat ggctctaaag 60

gtacacagtt agttcatgct gatacaccat ttgtccgtgt atagtgtatg ctgtaaagta 120

caggtctttg cagtttctgt ctctcttaaa caagtgcgtt ggattcaact cactgttctt 180

atatctaatg agattactgg tgatttatgt ttttatggca ctaccaggtg ttcaattggc 240

tgaatcggaa gaagcattct aatgtcgagt attgcaccat caatgagaac aagggtaagg 300

ataccaggat atctctcttt tatgtaccac atgttttgtt gttctcatgt tgtcaactct 360

tgtttcttct cttctatttt ttttcctgat ggagtagcca tggaagagaa ggaagactct 420

ctgcgtgcaa gtgtgactga gcaagacact gaggccctgc tgctccgtga tgtgcttatt 480

aatggtatac ttgcaattgg cacgctgggc cacaatgtaa actcactctg tcctgagtcc 540

tgtattgaac aagatgagcc catcatcatg tgtgatgaga aagtggaaca agagaagtgc 600

gaagaagaaa aggctgaggc taaacaggac acaccagtta cagcaccaag tgaaccggca 660

tctgctcttg agcctgccaa gatgcactca tcatcgatga aagaagacaa cttcatgtgc 720

tttgtgaagg aggaaatcct aatgcatggc atggaagtgg aagatgttcc taacatccag 780

gaacgaccac ttctgatgtt agagaaggtg gagaaagtga gaactacact tgccgatcta 840

tttgctgcag aagcattctc atcaagtgat gcagaggata agtgttaccc gaaaatcgtc 900

attgttgctg gggcatccac ttcaaagcct acgtcgtgca tggagaagat gcatcacaag 960

aagccaacaa aaccaacgtc aaagccgctg aaggctacaa gaaaattaag tcgagtatgg 1020

ttttcttcgt ctctgcttta tttgttaagc cttgttacat tatattttac tagtctggaa 1080

tttattacac tttgttccat ggtcagtgcg ccacatctta cacatatgtt ttaccatata 1140

gctacaactg gagtaagcat tatgcatcta gccagtcttt agtggtaaat gatcactgac 1200

ctggaatgca cctttttggt ttttgtcatc tgtaaaataa gtaggtcatg aggaagatgt 1260

tggggaagaa gatccaccca gagcagctca atggacgtag caatgcagag ggccctgtca 1320

ctgcataatg ctaggtttgt ggacaaaagt ttcctttctc tatctggcaa tttattacct 1380

agagtttttt taaagctgtc tgttgaacta tacagggctc aaggcccttg tgttttgcat 1440

acgattttgt acctttccaa attttcttga tttttacttg gattccattg tttgtaataa 1500

aattaggtta atatctgagg tagtatttgc atagaatgga taccttctac caaagttata 1560

tttgtttgtg ggtcctagag ctagcatgac ccacgaatca cattcaagaa tatagtaatt 1620

cgtttaggct acatttcact aggaatagaa catatgaata ttctcaggtt taataaggca 1680

gatgcaaaaa agaactgaat agcacaggaa agtaattttt ccatttcaag cttctcacag 1740

tcaaaaacaa gtaatggttc aaaaattgaa tattctatca cctgttgcct ccatttatgt 1800

ggaactcaca agagggtcta agtgctgctt gacactctga cctgtattta aataaaatgt 1860

tatcacctat tgcctctgct tattattggg atctcaaaac acaatctatt actgtgtatg 1920

ccttggcatt ttttaaaatc tgagctgccc ccttattctt cacattttct cagaaaacca 1980

tataaacttt tagataaatg aagcttttat tgatctcaga caattacatc aagttgatag 2040

aaccaaacta agaacacttc tggcctctga taatggaact gctgtttgtt taagtagaaa 2100

gaatggtgtg tgtattttaa cggttggtga ttgggaattg ggatgcagtg accatggaga 2160

ctgtgttctt cagaatattt ttaagaaata gtgttttcgg tggatcctat catggaactg 2220

cctatggtgg aaagagcaat acgagttgaa acatataggg attaggaagc atgggttcgg 2280

actaaaatgc attcgttcct gccatgatgc aaagcttcat tcgaagcaaa atgagcacat 2340

gccatggtac agtggcgtgc aacgagcact gcaattgcac acgacgtgca tgttctgaaa 2400

aaggccagtg gacactagac atgcagctaa tcctcttttg atgaattcta tcatgaaacc 2460

aatggattcg ttgaaaatct gaacaaattg atggatttgg tcccagctgt agaaaggttg 2520

gcaaactctt ctcgctcctg tattattgta ggctggagct atgatggacc aaatcatcag 2580

aagcaaattt caccatatat aagcatctac ttttatcttt ttctctattt taaaatgtga 2640

tcatagtgaa gttatataca ttctatctgc ttaacgctcc acattatcca aaaaaatgca 2700

tcacactcca tattgggaac acgttggtgg ttctgaacca aagtcgatct cttgatgcca 2760

attttttttt tgagctggtt gagtagtcga actgggaaca attactgctt gaggctacaa 2820

aatttctggc cgacaatacg tcttgatcag gaactgacta aagaaattcc ctttcacctt 2880

ttgcgggatt tgttggatcc atcctcacgc ttcggattcc ttgctcaaga gaaacatcca 2940

tgcatatcgt cgacagcgtt cgttcagtcc tcttcctttt gttgttggtg ctgttgttat 3000

tattgttatt gttattgctg cctattcgct cgccagtgat gaagaatagt cctgcctata 3060

tttgcctgta gtacattgta aagctacagt tgacgtgtct tgtaagaccc ttattattat 3120

tgtccatacc acgacgtctc 3140

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> sgRNA

<400> 2

actgcataat gctaggtttg tgg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> sgRNA

<400> 3

tactgtctgg ctttctcttc tgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> sgRNA

<400> 4

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<210> 5

<211> 23

<212> DNA

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<400> 5

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<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> sgRNA

<400> 6

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Claims (10)

1.一种制备株型为收敛型的禾本科植物的方法，其特征在于，所述方法包括下调植物中Tac1的表达或活性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的下调Tac1包括：在植物中敲除或沉默Tac1基因；较佳地，包括：以基因编辑方法敲除Tac1基因，以特异性干扰Tac1基因表达的干扰分子来沉默Tac1，或以同源重组方法敲除Tac1基因；较佳地，以基因编辑方法敲除Tac1基因。

3.一种Tac1的用途，用于作为下调靶点，以制备株型为收敛型的禾本科植物。

4.一种Tac1下调剂的用途，用于制备株型为收敛型的禾本科植物；较佳地，所述的Tac1下调剂通过下调Tac1，促进植物的株型为收敛型；较佳地，所述的Tac1下调剂包括：敲除或沉默Tac1基因或抑制Tac1蛋白活性的下调剂；较佳地，包括：敲除Tac1基因的基因编辑试剂，特异性干扰Tac1基因表达的干扰分子，基于同源重组的敲除Tac1基因的试剂。

5.如权利要求1、3或4所述，其特征在于，所述基因编辑包括：靶向于选自下组的靶点进行基因编辑：3’-UTR区域；外显子区第1个外显子；5’-UTR区域。

6.如权利要求5所述，其特征在于，对3’-UTR区域进行基因编辑时，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

对外显子区第1个外显子进行基因编辑时，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示；或

对5’-UTR区域进行基因编辑时，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

7.如权利要求1、3或4所述，其特征在于，所述禾本科植物为表达Tac1蛋白或其同源物的植物；较佳地，所述禾本科植物包括选自：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草。

8.一种Tac1的用途，用于作为鉴定禾本科植物株型是否为收敛型的分子标记。

9.用于制备株型为收敛型的禾本科植物的基因编辑试剂，其为sgRNA试剂，其靶向于选自下组的靶点进行基因编辑：3’-UTR区域；外显子区第1个外显子；5’-UTR区域；较佳地，对3’-UTR区域进行基因编辑时，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；对外显子区第1个外显子进行基因编辑时，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；或，对5’-UTR区域进行基因编辑时，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

10.用于制备株型为收敛型的禾本科植物的表达构建体或表达盒，其包括能在体内靶向于选自下组的靶点进行基因编辑的序列：3’-UTR区域；外显子区第1个外显子；5’-UTR区域；较佳地，所述的序列根据SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQID NO:6而设计。

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