JP2000514035A - リポソーム調製物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 封入材料を含んだリポソームからなるリポソーム調製物の製造方法を開示する。この方法は、(A)脂質またはリポソーム処方の複数の画分を準備する、(B)封入すべき材料の溶液でこの複数の画分を水和させる、そして(C)各分画を合わせて単一のリポソーム調製物を形成させる、という工程を含む。得られたリポソーム調製物は、薬物やワクチンの輸送に利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソーム調製物の製造方法 発明の技術分野 本発明は抗原や薬物のような材料を封入したリポソーム調製物の製造方法に関 するものである。この調整方法はワクチンや薬物輸送のために利用することがで きる。 発明の背景 リポソームは薬物輸送用の薬物担体としてインビボで利用されてきた。リポソ ーム封入薬物には次のような利点がある： 薬物が相対的に不透過性の２層膜に封入されていて、薬物が環境から保護されて いる； リポソームは明らかな細胞毒性を示すことなく細胞に取り込まれることから、 封入材料の細胞吸収が促進される； 封入が薬物動態を改善する； リポソームは、天然、生分解性、非毒性である（Mayhew et.al.，”Therapeut ic Application of Liposomes”Liposomes，M.J.Ostro，ed．（Marcel Dekker， Inc.，1983）pp 289-341）。リポソームに抗原を封入したときにも、同じ利点が 観察されると信じられている。 多層膜リポソーム封入材料の工業的規模での製造方法がいくつか知られている （Rao，”Preparation of Liposomes on the Industrial Scale：Problems and Perspectives,”LIPOSOME TECHNOLOGY，Vol.1，G.Gregordias，ed.，（CRC Pres s.1984）pp.247-257）。一般にもっともよく利用されている方法では、脂質薄膜 （有機溶媒から得たもの）を容器壁に置き、封入するべき材料の水性溶液を加え 、容器を振とうする（Bangham et.al．J．Mol．Biol．13：238，1965）。適当な 条件のもとでは、この単純な方法は目的の材料を捕捉したリポソームの多層膜ビ シクルの形成をもたらす。この方法の成功は、脂質薄膜の形成に強く依存し、振 とうの方法の違いによって封入の変動が見られる。 ベルギー特許８６６６９７は、薄膜形成に依存しない代替え方法を開示してい る。この方法では、脂質の有機溶媒溶液が凍結乾燥され、封入すべき材料の水性 溶液で容易に水和される伝導性の物理学的性質を持った凍結乾燥産物を与える。 公知の方法にともなう問題点には、バッチ間のリポソーム内に捕捉される材料 の総量（封入効率;encapsulation efficiency）、総脂質（mgあるいはμmole） 当たりの内部捕捉空間の大きさ、個々のリポソームの平均直径、サイズの分布の 変動がある（前述のMeyhew et.al.）。たとえば、Conrad et al．（Biochim．Bi ophes．Acta 352：36-46，1974のTable１）は、18あるいは８つの個別に調製し たリポソーム調製物の間で、封入効率に１２−１３％の標準偏差が見られたこと を示した。個別に調製したものの間で値の幅がおよそ５０％変動していると推測 される。同じ条件のもとでの、低水準の封入、および封入効率のバッチ間の大き な変動については他にも報告されている。（前述のRao）。 封入効率の変動を小さくするために有効な工業的な方法は未だに開発されてい ない。封入効率の大きな変動は、ワクチンや薬物輸送のためのリポソーム調製物 の大規模な生産に関して不利である。変動は、バッチとバッチの間の均一性の保 証を事実上不可能なものとし、また品質管理を困難にする。 発明の概要 本発明の目的は、バッチ間の封入効率の変動を小さくした、リポソーム調製物 の製造方法を提供することである。 この目的にしたがって、本発明の一態様は封入材料を含むリポソーム調製物の 製造方法を提供し、この製造方法は封入すべき材料の水溶液に脂質またはリポソ ーム処方を水和させる工程を含み、つぎの点で改良されている：(A)脂質または リポソーム処方の複数の画分を用意する；(B)封入すべき材料の溶液で各複数の 画分を水和させる；そして(C)各複数の画分を合わせて単一のリポソーム調製物 を形成させる。画分は、それを混合する前に封入されなかった材料を除去するた めに洗浄することもできる。封入すべき材料は抗原や薬物とすることができ、調 製物はワクチンに利用することができる。 本発明の他の態様は、(A)水和されたリポソーム処方の複数の画分を準備する ；(B)前記各複数の画分を凍結乾燥し；(C)前記複数の画分を封入すべき材料から なる溶液で水和し；そして(D)前記複数の画分を合わせて単一のリポソーム調製 物とする工程からなる、封入材料を含むリポソーム調製物の製造方法を提供す る。 本発明の更に他の態様は、(A)脂質またはリポソームの処方からなる複数の容 器を用意する；(B)前記複数の容器の一つに封入すべき材料からなる溶液を導入 し、それによってリポソーム懸濁液を形成し；(C)先に調製したリポソーム懸濁 液を他の複数の容器に導入し、そして；(D)工程(C)を繰り返してリポソーム調製 物を形成させる工程からなる、封入材料を含むリポソーム調製物の製造方法を提 供する。 加えて、本発明の目的と利点の一部は、本開示で後に説明され、また一部は開 示から自明であり、あるいは本発明から導き出されるであろう。この目的と利点 は、添付した請求項で特に指摘した方法と構成によって実現され、また得ること ができるだろう。 図面の簡単な説明 図１は、リポソーム調製物を公知の方法（●）と本発明の方法（■）で製造し たときの添加グルコースに対する封入された％と、リポソームのリン脂質濃度を 示す。 好ましい実施態様の詳細な説明 リポソーム封入材料の調製において、バッチ間での封入効率の変動が観察され るのにはたくさんの原因がある。たとえば、水和に用いる容器のサイズと形、温 度、そして水和させる乾燥脂質薄膜の厚さのばらつきは、そのバッチの封入効率 の決定に寄与する。その変動は、これらの条件のうちのいくつか、あるいは全て の影響が蓄積したものである。 本発明は、リポソーム調製物の工業的な製造におけるバッチ間の変動の主要な 原因が、各バッチの水和工程における変動に由来していて、そのためにリポソー ム内に捕捉される材料の量がバッチの間で変動しているという前提にたっている 。 この工程における変動が封入効率の重要な決定要因であることを調べるために 、次の実験を行った。乾燥脂質薄膜を少量の０．３０８Mグルコースで公知の方 法で水和し、リポソームのリン脂質濃度を１０mM、２０mM、４０mM、６０mM、８ ０mMそして１００mMとしてリポソーム調製物を形成した。図１の●は、この方法 で の添加したグルコースのうちリポソームに捕捉された％に対するリポソームのリ ン脂質濃度を示す。リポソームのリン脂質濃度が０−４０mMでは直接的な関係が 観察された。しかしリポソームのリン脂質濃度が高くなると、封入効率はその曲 線とは有意に違っていた。１００mM試料のデータポイントは強調するために囲っ た。 本発明の実施態様にしたがって１００mM調製物を調製した場合、封入効率はよ り予測したものに近くなる。特に、グルコースの０．３０８M溶液を乾燥薄膜か らなる容器に加え、脂質を水和させるためにこの容器を振とうして、リン脂質濃 度１０mMの懸濁液を与える。この懸濁液を脂質薄膜からなる他の容器に加えると 、リン脂質濃度２０mMの懸濁液を与える。この方法は合計１０回繰り返され、濃 度１００mMの最終的なリポソーム調製物を得た。この方法によって捕捉されたグ ルコースの％（図１の■参照）は、先に述べた０−４０mM試料のデータに基づい て予測できる範囲にあった。 この実験は、大幅な変動が水和時にもたらされことを立証している。本発明の 方法はこの問題を回避し、そしてバッチ間の封入効率の変動を小さな幅に抑えつ つリポソーム調製物を得ることができる。 本発明の方法において、リポソーム調製物は、脂質またはリポソーム処方の複 数の画分を封入すべき材料の溶液で水和し、そして最終的なリポソーム調製物を 形成するためにその一部をプールすることによって製造される。 本発明の方法は、リポソームを作るための先に述べた公知の方法を含むいろい ろな方法に合わせて実施することができる。たとえば、(A)脂質またはリポソー ム処方の複数の画分を準備する；(B)封入すべき材料の溶液でその画分を水和さ せる；そして(C)この水和した画分を最終的なリポソーム調製物の形成のために 混合する。 この画分は個別に水和され、リポソーム調製物の最終的なバッチを形成するた めに各画分は水和された後にプールされる。あるいは、代替え方法として、最初 の画分を水和し、得られる懸濁液を次の画分の水和に利用し、水和の結果得られ る懸濁液をその次の水和に利用する、そしてこの方法を全画分が水和されるまで 繰り返せば、リポソーム調製物の最終バッチが形成される。 好ましい実施態様においては、本製造方法は次の工程を含む；空の水リポソー ム処方（懸濁液）の複数の画分を準備する。各画分を凍結乾燥し封入すべき材料 の溶液で水和すれば、材料を捕捉したリポソームの複数の画分が形成される。こ れらの画分は単一バッチを形成するためにプールされ、最終的なリポソーム調製 物を構成する。各画分はプールされる前に封入されなかった材料を除くために洗 浄することができる。 その代わりに、脂質の有機溶媒溶液の複数の画分を準備し、それぞれを乾燥し て複数の空のリポソーム処方を形成するために水で水和する。各画分を凍結乾燥 し、封入すべき材料の溶液で水和する。これら画分は、封入されなかった材料を 除くために洗浄することもできる。次いで全画分を単一のプールに混合し、最終 的なリポソーム調製物を構成する。 更に他の方法として、たとえば空のリポソーム処方の凍結乾燥してから凍結乾 燥材料を複数の画分に分割することにより、あるいはリポソーム処方を複数の画 分に分割してから凍結乾燥することによって、凍結乾燥した空のリポソーム処方 の複数の画分を準備する。各凍結乾燥画分は封入すべき材料の溶液で水和し、こ こで封入されなかった材料を除くために洗浄してもよい。次いで全画分を単一の プールに混合し、最終的なリポソーム調製物を構成する。 更に他の実施態様として、前述のBangham et al.の方法が本発明の方法に適用 される。たとえば、複数の容器に脂質の有機溶媒溶液の複数の画分を準備し、た とえばロータリーエバポレーターを使って各画分から有機溶媒を蒸発させると、 各容器の壁には乾燥脂質薄膜が形成される。封入すべき材料の水性溶液を各画分 に加えて各容器を振とうすると、材料を捕捉したリポソームの複数の画分が形成 される。次いでこの画分は、最終的なリポソーム調製物を形成するためにプール される。 この方法の他の応用では、容器壁に乾燥脂質薄膜を持つ複数の容器を準備する 。封入すべき材料の水性溶液をこの容器に加え、脂質薄膜を水和させリポソーム の懸濁液とするためにこの容器を振とうする。この懸濁液を他の容器に加えて振 とうし、得られる懸濁液を更に他の容器に加える。全ての脂質薄膜を水和するま でこの方法を繰り返し、最終的なリポソーム調製物を形成させる。 本発明によるその他のリポソーム調製物の製造方法は当業者にとって自明であ る。 「脂質またはリポソーム処方」とは、本明細書では脂質またはリポソーム処方 の全体を意味する。画分は溶液、懸濁液、薄膜、あるいは凍結乾燥粉末のような 任意の形とすることができる。複数の画分とは、ここでは１つ以上の画分を意味 する。脂質またはリポソーム処方の少なくとも２つの画分を用意することが、本 発明の利点が確実に実現する。 本発明によって提供される複数の画分は、試験管、反応容器、フラスコあるい はその他の適当な容器といった当業者には自明の別々の容器の中に用意される。 複数の画分は、１つの脂質やリポソーム処方を複数の容器に分割することによっ て準備してもよい。 用意する脂質やリポソーム処方の画分の数は、出発材料、最終的な調製物、あ るいは実験条件に強く依存する。上記のとおり、最小では２画分を用意する。利 用可能な容器の数と大きさ、封入すべき材料の量、製造したい最終的なリポソー ム調製物の量、そして最終的な調製物に必要とされるリン脂質濃度が、準備すべ き画分の数を決める要因である。 もしもリポソーム処方の複数の画分を凍結乾燥する必要があれば、各容器に加 える画分の体積を容器の最大容量のおよそ８−１２％とするのが望ましい（たと えば５０mLの容器なら、リポソームの量は４−６mL）。容器の容量よりも大きな 体積を利用すると、凍結乾燥が思いがけず不完全に終わってしまいかもしれない 。容器の最大容量は、使用する凍結乾燥機器に収容できる容器の最大高で決まる 。 本発明の望ましい実施態様では、他の条件に関わらず脂質またはリポソーム処 方の少なくとも１０画分が利用される。最終的な量が１００−２００mL、リン脂 質濃度が５０mMの調製物を得るために、本発明にしたがって、４０−６０画分を 使ってリポソーム調製物が製造される。 多くの場合、準備すべき画分の数の上限は経験的に決められるだろう。たとえ ば、もしもその画分を遠心分離によって洗浄するのなら、利用できる遠心分離機 の数、遠心分離に使う試験管やビンの数の制限が必要な画分の数を決めるだろう 。最近の実験で、１つの空の水性リポソーム処方を２００に分割し、各画分を凍 結乾燥し、更に抗原溶液で水和させ、各画分をひとつのバッチにまとめることに よって、リポソーム調製物１バッチを一日で調製した。本発明にしたがってより 多くの画分を利用してもよい。 上記のとおり、封入材料を含むリポソームの個々の画分は、最終バッチにまと める前に洗浄してもよい。封入されなかった材料を除くための洗浄方法は、当業 者によく知られており、封入される材料によって変わる。たとえば、いくつかの 抗原や薬剤では、遠心分離と再懸濁を行うことによって、封入されなかった材料 のほぼすべて（９５％以上）が最初の洗浄工程で除去される。他のケースでは、 封入されなかった材料の９５％の除去を達成するために２回目の洗浄が求められ る。 生理的ｐＨで溶解性を示さない材料については、溶解に必要なｐＨを持つ緩衝 液に溶解した封入材料で脂質またはリポソーム処方を水和する。このような製造 方法においては、最初の洗浄には水和に用いたのと同じｐＨを持つ同じ緩衝液を 使って実施し、２度目の洗浄を生理的ｐＨの緩衝液で実施するとよい。得られる リポソームの沈殿は、最終的な調製物として使用するために生理的ｐＨの緩衝溶 液に再懸濁させる。 封入すべき材料は、たとえば抗原や薬剤とすることができる。他の方法でリポ ソームに封入されていたものを含む任意の抗原や薬剤を利用することができる（ Wassef et al.，Immunollogicalmethods 4:217-222，1994、Aliving et al.，AI DS Res．and Human Retroviruses 10(2):S91-S94，1994）。たとえば、マラリア 原虫Plasmodium falciparumのスポロゾイト生活環のスポロゾイト(circumsporoz oite)から誘導した組換えタンパクである２つのマラリア抗原Ｒ３２ＮＳ１₈₁（S mithcline Bechman，SKF 105154）およびＮＳ１₈₁ＲＬＦ（Smithcline Bechman, SKF 107727）が、本発明の方法によってリポソームに封入され臨床治験に用いら れている（Fries et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89：358-362，1992）。 このワクチン構造物はワクチン構造物として高度な成功を収め、ヒトでマラリア 抗原に対する高い抗体レベルを生じた。 また、抗リーシユマニア剤であるスティボグルコネート・ナトリウム（Pentos tam(R)、ウエルカム・ファウンデーション Ltd.;sodium stigluconate）も本発 明の方法にしたがってリポソームに封入される。ＨＩＶのエンベロープタンパク ｇｐ１２０を封入したリポソーム調製物の製造を開示するこれらの内容（Alving et al.，”Preparation or Liposomes For Use As Drug Carriers in The Trea tment of Leishmaniasis”LIPOSOME TECHNOLOGY，Vol.II，G．Gregordias，ed., （CRC Press，1984）pp.55-68、継続中のアメリカ特許出願番号−代理人事件番 号71007/119−）は引用によって組み入れられる。この調製物は本発明にしたが っで製造することができる。 最終的な構造物はワクチンや薬剤構造物として使用するために包装してもよい 。封入効率が封入すべき材料の疎水性や抗原の荷電といったような特性に依存し ているので、ある任意の抗原についてそれを予測することはできない。もしも注 射量当たりの抗原の個々の投与量が必要ならば、ワクチン構造物における最終的 な脂質濃度から経験的に導かなければならない。 本発明の実施態様は、実施例を通じて更に本発明の詳細な部分について明らか にされるであろう。これらの実施例は本発明の特定の要素を説明するが、その範 囲を制限的に解釈すべきではない。実施例１．剤型当たり１０００μｇのＭＰＬを含むリポソームＲ３２ＮＳ１ワク チンの製造手順 最終的な剤型は無菌的に調製した。有機溶媒を使う全ての操作はドラフトの中 で行った。 １．脂質溶液の蒸発容器への添加 １００mLの滅菌したパイロジェンフリーの１００mLメスシリンダー（１mL目盛 り）を、滅菌したパイロジェンフリーの酸で２回洗浄した、２４／４０のすり合 わせ口を持つ容量2Lのナス型フラスコに脂質溶液を加えるために使用した。ナス 型フラスコの口は、脂質溶液を加えるとき以外は、アルミホイルで覆っておいた （フラスコの無菌性を維持するため）。ホイルはロータリーエバポレーターにフ ラスコを装着するときに取り除いた。 フラスコに加えたもの ２．脂質溶液の蒸発乾固 脂質溶液をナス型フラスコに分注した後すぐに、それを次の条件でロータリー エバポレーターに装着した。 水浴温度 ４０−４５℃ 凝縮コイル 水道水で冷却 トラップ 氷中冷却 フラスコの角度 約４５℃ 回転スピード 最初は２にセットし、脂質溶液が粘調になってきたら１に調節 した 真空ポンプ 最初はゲージで２００mbarにセットし、泡が生じないときには １００mbarに減らした。 凝縮された溶媒が逆流しないように滅菌したグラストラップによってフラスコ をエバポレーターに装着した。全ての溶媒が蒸発し、脂質薄膜がガラス上に残る まで回転を続けた。いったん乾燥（約１時間）させたフラスコはエバポレーター から取り外した。取り外した後、速やかにフラスコの口を滅菌したワットマン＃ ５４１ろ紙で覆って輪ゴムで固定し、残存する溶媒を完全に除くためにデシケー ターに入れて更に高真空（１０mbar）で一晩乾燥させた。一晩乾燥させた後に、 デシケーターを真空状態のまま閉鎖し脂質薄膜の水和を行うまで４−６℃に保存 した。 ３．脂質薄膜の水和 デシケーターをラミナー・フロー・フード（laminar flow hood）に動かして 開け、脂質薄膜を含むフラスコをデシケーターから取り出した。ナス型フラスコ の口を覆ったろ紙を、滅菌したすり合わせガラス栓で置き換えた。３８５mLの滅 菌したパイロジェンフリーの注射用水（アメリカ薬局方）を滅菌ピペットでナス 型フラスコに分注した。すり合わせガラス栓を置き換えて、全ての脂質薄膜がフ ラスコの壁から離れるまで手で激しく振とうした。このときのリン脂質濃度は、 最初に加えたリン脂質と水和容積に基づき約４５mMであった。水和したリポソー ムのフラスコは、リポソームを凍結乾燥のために分注するまで４−６℃に保存し た。 ４．水和したリポソームの凍結乾燥容器への分注 水和したリポソームのフラスコは汚染されないようにクリーンルームに運んだ 。フラスコの内容物を室温とした後、均一な懸濁液とするためにリポソームを激 しく振とうし、無菌試験のための試料を採取した。７．０mLの水和リポソームを ６０本の滅菌ワクチン用のビン（容量６０mL）に分注した。ゴム栓をビンに部分 的に装着した。このビンを凍結乾燥装置のチャンバー（クリーンルームに直接開 放されている）に置き、このチャンバーを閉め、そして内容物を凍結するために ビンを−４０℃で８時間以上保持した。 ５．凍結乾燥 凍結乾燥サイクルは−４０℃で開始した。温度は２．５℃/hourの割合で１０ ℃まで上げた。生成物は１０℃で１２−３６時間保持し、ついで温度を２０℃に 合わせた。凍結乾燥サイクル完了後、ビンを凍結乾燥装置から取り出し（クリー ンルーム中で）、ゴム栓を完全に装着し、アルミシールを各ビンに施した。ビン を滅菌したカバー付きトレー中に置いてクリーンルームから出し、４−６℃の暗 所に保存した。 ６．抗原による凍結乾燥リポソームの再構成 Ｒ３２ＮＳ１抗原（ＳＫＰ１０５１５４、ロット＃Ｕ−９００５５−ＺＩＡ、 ＪＦＭ１６８４３−５９）は、４．２mg/mLの酢酸緩衝液ｐＨ５．５溶液１９０m Lとして受け入れた。この溶液を、０．２％のＥＤＴＡナトリウムで予め６０分 間煮沸したスペクトレイパー・チュービング（Spectrapor tubing）（カットオ フ分子量３５００）を使い、ｐＨ６．５のＰＢＳ１２Lに対して３−６時間、４ −６℃で透析した。透析後Ｒ３２ＮＳ１溶液は、ラミナー・フロー・フード（la minar flow hood）中で０．２２ミクロンのフィルターを通して滅菌した。ろ過 したＲ３２ＮＳ１溶液は、凍結乾燥リポソームの再構築に使うまで４−６℃で保 存した。凍結乾燥リポソームのトレーをラミナー・フロー・フード（laminar fl ow hood）に移した。アルミシールの真ん中を取り、リン脂質濃度が約２００mM となるように、透析した１．５mLの滅菌ろ過したＲ３２ＮＳ１溶液（約４．２mg /mL）を注射器で各ビンに分注した。凍結乾燥リポソームを完全に濡らすために ビンを緩やかに振とうし、カバーしたトレーに戻してラミナー・フロー・フード （laminar flow hood）から出し、より完全な再構成を与えるために４−６℃で １６−７２時間保存した。 ７．封入されなかったＲ３２ＮＳ１の除去 再構成したリポソームのトレーを汚染されないようにクリーンルームに移した 。リポソームを室温に戻し、全ての脂質を懸濁させて（乾燥した脂質の固まりが 無いように）から、アルミシールをビンから取り、２５mLの滅菌ろ過したリン酸 緩衝生理食塩水を滅菌ピペットで各ビンに分注した。希釈したリポソームを４６ 本の滅菌したポリカーボネート製スクリューキャップ付き遠心管（容量３５mL） に移した。遠心管は減菌したＳＡ−６００ローターに入れ（１回に１２本）、ロ ーターを閉じた。ローターをクリーンルームから出して、Sorvall RC2b冷却高速 遠心機にセットした。リポソームは１４０００rpm（約３００００×ｇ）、２０ −２５℃で２０分間遠心した。沈殿を乱さないようにローターを遠心機から取り 出し、汚染されないようにクリーンルームに移した。遠心管をローターから外し 、吸引管につながった2Lの滅菌吸引フラスコに滅菌チューブで装着した滅菌パス ツールピペットで上清画分を除去した。この操作は全てのチューブを遠心するま で繰り返した。 ８．洗浄したリポソームの再懸濁 上清画分を除去した後、１．５mLの滅菌ろ過したリン酸緩衝生理食塩水を各遠 心管に加えリポソーム沈殿を手で振とうして再懸濁させた。再懸濁リポソームを 滅菌した２５０mLメスシリンダーにピペットで移した。各遠心管を追加の１．０ mLのリン酸緩衝生理食塩水で洗い、これもまたメスシリンダーに移した。最終的 な総体積が１８５mLとなるように、リン酸緩衝生理食塩水をプールしたリポソー ム沈殿に加えた。バルクの無菌性と抗原封入を測定するためのサンプルを取った 。 ９．最終的な内容物の特性 リポソームワクチンは、１５３本の容量５mLのワクチンビンに１．０mL／本づ つ無菌的に分配した（ビン詰めはクラス１００クリーンルームで行った）。この ビンに栓をし、アルミキャップでシールし、ラベルして４−６℃で保存した。最 終的な無菌性、安全性、パイロジェン試験、そして力価の試験、更に抗原の封入 を測定するためのサンプルを取った。実施例２．剤型当たりワクチン１００μｇのＭＰＬを含むリポソームＲ３２ＮＳ １ワクチンの製造手順 最終的な剤型は無菌的に調製した。有機溶媒を使う全ての操作はドラフトの中 で行った。 １．脂質溶液の蒸発容器への添加 滅菌したガラスピペット（容量１０mL、１／１０mL目盛り）と、１００mLの滅 菌したパイロジェンフリーの１００mLメスシリンダー（１mL目盛り）を、滅菌し たパイロジェンフリーの酸で２回洗浄した、２４／４０のすり合わせ口を持つ容 量２Lのナス型フラスコに脂質溶液を加えるために使用した。ナス型フラスコの 口は、脂質溶液を加えるとき以外は、アルミホイルで覆っておいた（フラスコの 無菌性を維持するため）。ホイルはロータリーエバポレーターにフラスコを装着 するときに取り除いた。 フラスコに分注したもの ２．脂質溶液の蒸発乾固 脂質溶液をナス型フラスコに分注した後すぐに、それを次の条件でロータリー エバポレーターに装着した。 水浴温度 ４０−４５℃ 凝縮コイル 水道水で冷却 トラップ 氷中冷却 フラスコの角度 約４５℃ 回転スピード 最初は２にセットし、脂質溶液が粘調になってきたら１に調節 した 真空ポンプ 最初はゲージで２００mbarにセットし、泡が生じないときには １００mbarに減らした。 凝縮された溶媒が逆流しないように滅菌したグラストラップによってフラスコ をエバポレーターに装着した。全ての溶媒が蒸発し、脂質薄膜がガラス上に残る まで回転を続けた。いったん乾燥（約１時間）させたフラスコはエバポレーター から取り外した。取り外した後、速やかにフラスコの口を滅菌したワットマン＃ ５４１ろ紙で覆って輪ゴムで固定し、残存する溶媒を完全に除くためにデシケー ターに入れて更に高真空（１０mbar）で一晩乾燥させた。一晩乾燥させた後に、 デシケーターを真空状態のまま閉鎖し脂質薄膜の水和を行うまで４−６℃に保存 した。 ３．脂質薄膜の水和 デシケーターをラミナー・フロー・フード（laminar flow hood）を動かして 開け、脂質薄膜を含むフラスコをデシケーターから取り出した。ナス型フラスコ の口を覆ったろ紙を、滅菌したすり合わせガラス栓で置き換えた。３８５mLの滅 菌したパイロジェンフリーの注射用水（アメリカ薬局方）を滅菌ピペットでナス 型フラスコに分注した。すり合わせガラス栓を置き換えて、全ての脂質薄膜がフ ラスコの璧から離れるまで手で激しく振とうした。このときのリン脂質濃度は、 最初に加えたリン脂質と水和容積に基づき約４４mMであった。水和したリポソー ムのフラスコは、リポソームを凍結乾燥のために分注するまで４−６℃に保存し た。 ４．水和したリポソームの凍結乾燥容器への分注 水和したリポソームのフラスコは汚染されないようにクリーンルームに運んだ 。フラスコの内容物を室温とした後、均一な懸濁液とするためにリポソームを激 しく振とうし、無菌試験のための試料を採取した。７．０mLの水和リポソームを ５８本の滅菌ワクチン用のビン（容量６０mL）に分注した。ゴム栓をビンに部分 的に装着した。このビンを凍結乾燥装置のチャンバー（クリーンルームにのみ開 放されている）に置き、このチャンバーを閉め、そして内容物を凍結するために ビンを−４０℃で８時間以上保持した。 ５．凍結乾燥 凍結乾燥サイクルは−４０℃で開始した。温度は２．５℃/hourの割合で１０ ℃まで上げた。生成物は１０℃で１２−３６時間保持し、ついで温度を２０℃に 合わせた。凍結乾燥サイクル完了後、ビンを凍結乾燥装置から取り出し（クリー ンルーム中で）、ゴム栓を完全に装着し、アルミシールを各ビンに施した。ビン を滅菌したカバー付きトレー中に置いてクリーンルームから出し、４−６℃の暗 所に保存した。 ６．抗原による凍結乾燥リポソームの再構成 凍結乾燥リポソームのトレーをラミナー・フロー・フード（laminar flow hoo d）に移した。アルミシールの真ん中を取り、リン脂質濃度が約２００mMとなる ように、透析した１．５mLの滅菌ろ過したＲ３２ＮＳ１溶液（約４．２mg/mL、 前記実施例１で調製したとおり）を注射器で各ビンに分注した。凍結乾燥リポソ ームを完全に濡らすためにビンを緩やかに振とうし、カバーしたトレーに戻して ラミナー・フロー・フード（laminar flow hood）から出し、より完全な再構成 を与えるために４−６℃で１６−７２時間保存した。 ７．封入されなかったＲ３２ＮＳ１の除去 再構成したリポソームのトレーを汚染されないようにクリーンルームに移した 。リポソームを室温に戻し、全ての脂質を懸濁させて（乾燥した脂質の固まりが 無いように）から、アルミシールをビンから取り、２５mLの滅菌ろ過したリン酸 緩衝生理食塩水を滅菌ピペットで各ビンに分注した。希釈したリポソームを４６ 本の滅菌したポリカーボネート製スクリューキャップ付き遠心管（容量３５mL） に移した。遠心管は滅菌したＳＡ−６００ローターに入れ（１回に１２本）、ロ ーターを閉じた。ローターをクリーンルームから出して、SorvallRC2b冷却高速 遠心機にセットした。リポソームは１４０００rpm（約３００００×ｇ）、２０ −２５℃で２０分間遠心した。沈殿を乱さないようにローターを遠心機から取り 出し、汚染されないようにクリーンルームに移した。遠心管をローターから外し 、吸引管につながった４Lの滅菌吸引フラスコに滅菌チューブで装着した滅菌パ スツールピペットで上清画分を除去した。この操作は全てのチューブを遠心する まで繰り返した。 ８．洗浄したリポソームの再懸濁 上清画分を除去した後、１．５mLの滅菌ろ過したリン酸緩衝生理食塩水を各遠 心管に加えリポソーム沈殿を手で振とうして再懸濁させた。再懸濁リポソームを 滅菌した２５０mLメスシリンダーにピペットで移した。各遠心管を追加の１．０ mLのリン酸緩衝生理食塩水で洗い、これもまたメスシリンダーに移した。最終的 な総体積が１８０mLとなるように、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水をプールした リポソーム沈殿に加えた。バルクの無菌性と抗原封入を測定するためのサンプル を取った。 ９．最終的な内容物の特性 リポソームワクチンは、１４７本の容量５mLのワクチンビンに１．０mL／本づ つ無菌的に分配した（ビン詰めはクリーンルームで行った）。このビンに栓をし 、アルミキャップでシールし、ラベルして４−６℃で保存した。最終的な無菌性 、安全性、パイロジェン試験、そして力価の試験、更に抗原の封入を測定するた めのサンプルを取った。実施例３．実施例１と２で得たリポソーム調製物の封入効率 上記実施例１と２で得たＲ３２ＮＳ１を含む２バッチのリポソームを、バッチ 間の封入効率の変動を測定するために分析した。次の結果が得られた。 リポソーム性マラリアワクチンの臨床用ロットにおけるＲ３２ＮＳ１の封入 実施例１ 20.3％ 実施例２ 18.7％ 平均（±S.D.） 19.5±1.1 平均との偏差 ±0.8％ このデータは、2バッチの間でＲ３２ＮＳ１の封入効率の変動がたいへん小さ く、平均からの偏差はわずかに±０．８％であることを示している。これは前述 のConrad et al.によって報告された１２−１３％の偏差に対して有意に有利で あることを表している。 本発明の方法と組成物にいろいろな改変や変更を行うことは当業者にとって自 明である。したがって本発明は、添付した請求項とその均等の範囲内で行われる 本発明の改変と変更を含むものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ワッセフ ナビラ エム. アメリカ合衆国 メリーランド州 ポトマ ック ベルズ ミルズ ロード 9117

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．封入材料を含むリポソーム調製物の製造方法において、脂質またはリポソー ム処方を封入すべき材料の溶液に水和させる工程を含み、 （A）脂質またはリポソーム処方の複数の画分を用意する； （B）封入すべき材料の溶液で各複数の画分を水和させる；そして （C）各複数の画分を合わせて単一のリポソーム調製物を形成させる 点において改良されている前記方法。 ２．材料が抗原である請求項１の方法。 ３．抗原がＨＩＶ抗原ｇｐ１２０である請求項２の方法。 ４．抗原がＲ３２ＮＳ１₈₁、およびＮＳ１₈₁ＲＬＦからなる群から選択されるマ ラリア抗原である請求項２の方法。 ５．材料が薬物である請求項１の方法。 ６．薬物がスティボグルコネート・ナトリウムである請求項５の方法。 ７．調製物がワクチンに使用するためのものである請求項１の方法。 ８．工程(B)と(C)の間に、封入されなかった材料を除くために複数の画分を洗浄 する工程を付加的に含む請求項１の方法。 ９．洗浄が複数の画分を沈殿物としこの沈殿物を再懸濁する遠心分離である請求 項８の方法。 １０．脂質あるいはリポソーム処方の少なくとも２の画分を用意する請求項１の 方法。 １１．脂質あるいはリポソーム処方の少なくとも約１０の画分を用意する請求項 １の方法。 １２．脂質あるいはリポソーム処方の約４０−約６０の画分を用意する請求項１ の方法。 １３．脂質あるいはリポソーム処方の約２００の画分を用意する請求項１の方法 。 １４．工程(A)の処方が脂質処方である請求項１の方法。 １５．工程(A)の処方がリポソーム処方である請求項１の方法。 １６．(A)水和されたリポソーム処方の複数の画分を与え； （B）前記各複数の画分を凍結乾燥し； （C）前記複数の画分を封入すべき材料からなる溶液で水和し；そして （D）前記複数の画分を合わせて単一のリポソーム調製物とする 工程からなる、封入材料を含むリポソーム調製物の製造方法。 １７．材料が抗原である請求項１６の方法。 １８．材料が薬物である請求項１６の方法。 １９．調製物がワクチンに使用するためのものである請求項１６の方法。 ２０．水和されたリポソーム処方の少なくとも２つの画分を用意する請求項１６ の方法。 ２１．水和されたリポソーム処方の少なくとも約１０の画分を用意する請求項１ ６の方法。 ２２．水和されたリポソーム処方の約４０−約６０の画分を用意する請求項１６ の方法。 ２３．水和されたリポソーム処方の少なくとも約２００の画分を用意する請求項 １６の方法。 ２４．工程(C)と(D)の間に、封入されなかった材料を除くために複数の画分を洗 浄する工程を付加的に含む請求項１６の方法。 ２５．洗浄が前記複数の画分を沈殿物としこの沈殿物を再懸濁する遠心分離であ る請求項２４の方法。 ２６．(A)脂質またはリポソームの処方を含む複数の容器を用意し； （B）前記複数の容器の一つに封入すべき材料からなる溶液を導入し、それによ ってリポソーム懸濁液を形成し； （C）先に調製したリポソーム懸濁液を他の複数の容器に導入し、そして； （D）工程(C)を繰り返してリポソーム調製物を形成させる 工程からなる、封入材料を含むリポソーム調製物の製造方法。 ２７．材料が抗原である請求項２６の方法。 ２８．材料が薬物である請求項２６の方法。 ２９．調製物がワクチンに使用するためのものである請求項２６の方法。 ３０．脂質またはリポソーム処方を含む少なくとも２つの容器を用意する請求項 ２６の方法。 ３１．脂質またはリポソーム処方を含む少なくとも約１０の容器を用意する請求 項２６の方法。 ３２．脂質またはリポソーム処方を含む約４０−６０の容器を用意する請求項２ ６の方法。 ３３．脂質またはリポソーム処方を含む少なくとも約２００の容器を用意する請 求項２６の方法。 ３４．容器のそれぞれが乾燥脂質薄膜である請求項２６の方法。