JP2000512007A - ヘモグロビンを含有する医療サンプルの分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、遊離ヘモグロビンを含有するサンプル中の被検体の測定方法に関し、光学測定により測定を行い、被検体濃度の測定値を数学的に補正する。特に、医療サンプル(例えば、血清もしくは血漿サンプル)中の総タンパク質、鉄、およびアルブミンのパラメータの決定に適している。（ａ）分析するサンプルの空値を測定する段階と、(b)ヘモグロビン非含有基準サンプルの空値を測定する段階と、（ｃ）被検体濃度の未補正値を測定する段階と、（ｄ）段階(ｃ)において得られた値を、段階(ａ)および(ｂ)で得られた値と相関させることにより補正して、該被検体濃度の補正値を得る段階とによって、被検体濃度の測定値の補正が達成される。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘモグロビンを含有する医療サンプルの分析方法 本発明は、遊離ヘモグロビンを含有するサンプル中の被検体の測定方法に関す る。該方法においては、光学測定により測定を行い、被検体濃度の測定値を数学 的に補正する。本方法は特に、医療サンプル(例えば、血清もしくは血漿サンプ ル)中の総タンパク質、鉄、およびアルブミンのパラメータの測定に適している 。 多くの被検体の測定において、溶血が相当な程度妨害する場合のあることが一 般的に知られている。しかし誤りのない測定値を得るために、これまで溶血によ る妨害を低減する様々な方法が公表されてきた。 欧州特許第0 268 025号明細書に述べられているように、溶血の程度と生じる 測定誤差との間の図式関係が、いくつかの被検体について確立されている。この 図式関係から、溶血の程度についての別個の測定に基づいて補正係数を求めるこ とができ、これを用いて得られた分析結果を数学的に補正することができる。 JayおよびProvasekもまた、溶血の程度を測定し、補正係数を用いることによ って、溶血性サンプルにおいて誤りのない値を得ることが可能であると記載して いる(Clin chem 38/6，1026(1992)およびClin Chem 39/9，1804-1810(1993))。 この場合、溶血の程度は、サンプル中のＨｂ含量についての別個の測定により決 定された。 米国特許第4,263,512号明細書においては、被検体に加えて、混濁(Ｘ)、溶血( Ｙ)、および黄疸(Ｚ)の程度を測定し、式Ｓ'＝Ｓ−α・Ｘ−β・Ｙ−γ・Ｚを用い て、測定された被検体値(Ｓ)を補正することが推奨されている。この場合、Ｓ’ は補正された被検体値であり、α、β、およびγは、基準液体を用いて混濁、溶 血および黄疸の影響を測定することにより得られた補正係数である。Ｘ、Ｙ、お よびＺは、多チャンネル測定(multichannel measurement)、次いで、他の妨害物 質のそれぞれの割合を考慮し、吸光度の差から複雑な計算を行うことにより得ら れる。 溶血の程度を別個に測定すること無しに、溶血による妨害を補正する方法の１ つが、独国特許出願公開第44 27 492号明細書に示されている。この明細書にお いては、溶血により赤血球から放出された妨害物質の含量と、主反応の前に生じ る予備反応との間に数学的関係が見出されている。溶血の程度と妨害寄与との間 に見出された関係を利用し、このように予備反応中に決定された溶血の程度を用 いて、主反応において得られる被検体の結果(反応速度_合計)が、式[反応速度_{物 質} ／_{サンフ゜ル}＝反応速度_合計反応速度_予備反応−反応速度_物質／_赤血球](ここで、 物質とは、サンプル中の測定される成分を指す)により補正される。 ヘモグロビンによる妨害はまた、サンプル空値(blank value)を測定すること によってもしばしば排除され得る。しかし、これは、ビウレット法による総タン パク質の測定には適用できず(Morganら、Microchem．J．44，282-287(1991))、 またブロモクレゾールグリーンおよびブロモクレゾールパープル法によるアルブ ミンの測定にも適用できない。さらに、鉄の測定において、サンプルからＨｂが 透析により予め除去されていない場合に常にヘモグロビンによる妨害が生じるこ とが知られている(Sonntag，J.Clin．Chem．Clin．Biochem．24/2，127-139(198 6))。また、鉄の場合、サンプル空値の測定だけではＨｂ妨害を排除することは 不可能である。 しかし、上記した妨害を排除する方法の全てが、相当な労力(透析によるサン プル調製、または、例えばＨｂ含量の測定による溶血の程度についての別個の測 定)、ならびに/あるいは複雑な数学的補正アルゴリズムを要するという欠点を有 する。 また、記載した方法の全てが、溶血により引き起こされる誤った測定の排除に 関する。ヘモグロビンを主成分とする血液代用品の開発により、天然もしくは合 成ヘモグロビン、またはヘモグロビン様化合物による妨害を除去する課題は以前 にも増して重大なものとなった。従って、このような妨害はまた、一方で非溶血 性のサンプル物質中で生じ、他方で、血液代用品治療においては、血液血清もし くは血漿中のヘモグロビン含量が1000mg/dlを上回り得るために、天然溶血の場 合よりもさらに高い程度で生じる。 本発明の目的は、合成ＨｂもしくはＨｂ-様化合物を主成分とする天然ヘモグ ロビンまたは血液代用品により引き起こされ、簡単なサンプル空値の測定では排 除され得ない妨害を排除する方法を提供することである。また、本方法は、従来 の一般的方法と比較して労力が有意に軽減され、また少なくとも1000mg/dlまで のＨｂによる妨害の排除が確実である。 本発明の目的は、驚くことに、サンプル空値レベルと、遊離ヘモグロビンによ って引き起こされる測定結果の誤差(falsification)の程度との関係を見出した ことにより達成された。その結果、Ｈｂ含量が高い場合においても、簡単な数学 的補正式により、被検体濃度についての正確な値を正しく決定することが可能で ある。従来技術と比較して、本発明による方法は、Ｈｂを含有する医療サンプル の測定値を補正するために、Ｈｂ含量についての別個の測定または予備反応の程 度の測定のいずれも必要としないという有利な特徴をもつ。 従って、本発明の主題は、光学測定による、遊離ヘモグロビンを含有するサン プル中の被検体の測定方法であって、 （ａ） 分析するサンプルの空値を測定する段階と、 （ｂ） ヘモグロビン非含有基準サンプルの空値を測定する段階と、 （ｃ） 被検体濃度の未補正値を測定する段階と、 （ｄ） 段階(ｃ)において得られた値を、段階(ａ)および(ｂ)で得られた値 と相関させることにより補正して、該被検体濃度の補正値を得る段階とに より該被検体濃度の測定値を補正する、方法である。 本発明の方法の段階(ｄ)における被検体濃度の補正値は、以下の関係式： Ｃ’_サンプル＝Ｃ_サンプル−Ｆ・Ｅ１_サンプル＋Ｆ・Ｅ１_基準 （式中、Ｃ’_サンプルは該被検体濃度の補正値であり、 Ｃ_サンプルはサンプル中の該被検体濃度の未補正測定値であり、 Ｆはテストに特有の補正係数であり、 Ｅ１_サンプルはサンプル中で測定された空値であり、および、 Ｅ１_基準は基準サンプル中で測定された空値である。） により決定されることが好ましい。。 本発明の補正方法は、特にサンプル中に存在する遊離ヘモグロビンによる妨害 が引き起こされる波長での光学測定により被検体が測定される方法に適している 。光学測定は、特に500〜750nmの範囲において行われることが好ましい。 本発明の方法は、遊離ヘモグロビンが存在するあらゆるサンプルの測定に適し ている。このようなサンプルの例として、溶血性の血清もしくは血漿サンプル、 または血液代用品を含有するサンプルが挙げられる。本発明でいう用語「遊離ヘ モグロビン」に包含される血液代用品の例としては、誘導体化、重合、変性、ま たは架橋結合されたヘモグロビン(特にヒトヘモグロビンまたはウシヘモグロビ ン、ならびに組換え的に産生されたヘモグロビン)誘導体が挙げられる。 本発明の方法の好ましい実施態様においては、サンプルの総タンパク質含量が 測定される。この測定は、ビウレット法により行うことが好ましい。本発明のさ らに特に好ましい実施態様においては、サンプル中の鉄含量が測定される。この 鉄含量の測定は、フェロジン(ferrozine)法により行うことが好ましい。さらに 特に好ましい実施態様においては、サンプル中のアルブミン含量が測定される。 このアルブミン含量の測定は、ブロモクレゾールグリーンもしくはブロモクレゾ ールパープル法により行うことが好ましい。従来はヘモグロビン含有サンプルの 測定の妨害を排除する簡単な方法が知られていなかったこれらのパラメータを決 定するための測定手順は、本発明の方法により驚くほどに簡単にすることができ る。 本発明の方法のさらなる特徴は、少なくとも20mg/dlまでの高い含量のビリル ビンを有する黄疸サンプルを簡単に測定することさえ可能なことである。適切な 清浄剤を例えば試薬に加えて使用することにより、高脂血症性(lipaemic)サンプ ルによる妨害を排除することができる。 血清もしくは血漿サンプル、特にヒト血清もしくは血漿サンプルを、本発明の 方法におけるサンプルとして使用することが好ましい。臨床的に健康な被験者由 来の血清もしくは血漿サンプルが、基準(reference)サンプルとして有利に使用 される。特に、臨床的に健康な被験者由来のヘモグロビン非含有血清もしくは血 漿プールを使用することが好ましい。 本発明の方法の特定の利点は、自動分析装置(例えば、Boehringer Mannheim/H itachi 704もしくは717分析装置)で実施できることである。簡単な数学的補正式 により被検体濃度の補正値がすでに出力され、その後それ以上数学的な補正が必 要でないように自動分析装置をプログラムすることができる。 測定された被検体濃度の補正に重要となるパラメータは、テストに特有の補正 係数Ｆである。この捕正係数Ｆは、 （ａ）少なくとも１つのサンプルがヘモグロビンを含有せず、少なくとも ２つのサンプルが異なる濃度の遊離ヘモグロビンを含有する、同量の被検 体を含有する少なくとも３つのサンプルからなる組を調製する段階と、 （ｂ）各サンプルの空値を測定して、ヘモグロビン非含有サンプルと比較 した場合のヘモグロビンの存在により生じるサンプル空値の増加を決定す る段階と、 （ｃ）各サンプル中の前記未補正被検体濃度を測定して、ヘモグロビン非 含有基準サンプルと比較した場合のヘモグロビンの存在により生じる測定 値の誤差を決定する段階と、 （ｄ）段階(ｃ)において決定された該測定値の誤差を、段階(ｂ)において 決定された該サンプル空値の増加と相関させて、該テストに特有の補正係 数を得る段階と、 を含む手順により決定することが好ましい。 補正係数Ｆを決定する場合には、少なくとも５個のサンプル(例えば、10個の サンプル)が異なる濃度の遊離ヘモグロビンを含有する、サンプルからなる組を 調製することが好ましい。サンプルからなる組において遊離ヘモグロビンの濃度 は、例えば0mg/dlから少なくとも1000mg/dlまでの範囲で変化する。 遊離ヘモグロビンを含有する上記組の特定のサンプルについて、サンプルに特 有の補正係数Ｆ’が以下の関係式： Ｆ’＝ΔＣ：ΔＥ１ （式中、ΔＣは、各サンプルについて、基準サンプルと比較した場合の遊離ヘモ グロビンの存在によって生じる測定値の誤差量であり、および、 ΔＥ１は、各サンプルについて、基準サンプルと比較した場合の遊離ヘモグロビ ンの存在によって生じるサンプル空値の増加である。） により決定される。 個々のサンプルについて決定された該補正係数Ｆ’の平均を算出することにより 、テストに特有の補正係数Ｆを決定することができる。このようにして、ブロモ ク レゾールグリーン法によるアルブミンテストについては補正係数Ｆ0.332、フェ ロジン法による鉄テストについては補正係数Ｆ0.290、そしてビウレット法によ る総タンパク質テストについては補正係数Ｆ0.115を決定することが可能であっ た。これらの補正係数を使用した場合、ヘモグロビン含有サンプル中において、 測定される被検体の優れた回収率が認められる。 本発明を、以下の実施例により更に説明する。 一般的な方法： １．補正係数の決定(実施例１〜３も参照されたい) 臨床的に健康な被験者の血清もしくは血漿プールからの11のサンプルに種々の 量の溶血産物、ヘモグロビン、またはＨｂ様化合物を加え、一定の被検体含量で 、Ｈｂ濃度が最も低いサンプル(＝基準)はＨｂを含有せず、最も高いサンプルは 少なくとも1000mg/dlのＨｂを含有する、Ｈｂ濃度の組が形成されるようにする 。この組の全てのサンプルを、各テストで測定し、各サンプルについて、基準と 比較してＨｂ含量に応じた誤った被検体値を得る。 各サンプルについて、Ｈｂ非含有サンプル(＝基準)のサンプル空値と比べたＨ ｂにより生じるサンプル空値の増加ΔＥ１を決定した： ΔＥ１＝Ｅ１_{サンフ゜ル}−Ｅ１_基準 さらに、各サンプルについて、基準中で測定された被検体値と比べたＨｂにより 生じる被検体値の誤差量ΔＣを決定した： ΔＣ＝Ｃ_{サンフ゜ル}−Ｃ_基準 妨害成分ΔＣを、サンプル空値増加ΔＥ１で割ると、各サンプルについての補 正係数Ｆ'_{サンフ゜ル}＝ΔＣ：ΔＥ１が求められる。 次いで、このようにして得たＨｂ濃度の組の10個の係数から、平均補正係数Ｆ を計算する。この係数は、アルブミン、鉄、および総タンパク質について一度決 定されればよい固定パラメータであり、従って各テストにおいて一定である。 ２．補正された被検体値の計算(実施例４〜８も参照されたい) サンプルの測定被検体値Ｃ_{サンフ゜ル}を妨害成分ΔＣにより数学的に補正すること により、各サンプルの補正されて妨害のない被検体値Ｃ’_{サンフ゜ル}を決定する。 Ｃ’_{サンフ゜ル}＝Ｃ_{サンフ゜ル}−ΔＣ Ｃ’_{サンフ ル}＝Ｃ_{サンフ ル}−Ｆ・ΔＥ Ｃ’_{サンフ ル}＝Ｃ_{サンフ ル}−Ｆ・(Ｅ１_{サンフ ル}−Ｅ１_基準) Ｃ’_{サンフ ル}＝Ｃ_{サンフ ル}−Ｆ・Ｅ１_{サンフ ル}＋Ｆ・Ｅ１_基準 上記したように、基準は、臨床的に健康な被験者のＨｂ非含有の血清もしくは 血漿のプールである。上記方法においては、サンプル空値と測定信号との関係に より、種々の患者サンプルの測定サンプル空値の変動分布幅の影響は無視できる 。少なくとも20mg/dlのビリルビン含量を有する黄疸サンプルでさえも妨害する ことはない。高脂血症性サンプルによる妨害は、適切な清浄剤を例えば試薬に加 えて使用することにより排除することができる。黄疸および高脂血症性サンプル は、Glick(Clin．Chem．32/3，470-475(1986))と同様に、ヒト血清にビリルビン お 例えばBoehringer Mannheim/Hitachi 704または717機器などの自動的に測定す る分析装置において、補正値だけが印字され、その後それ以上数学的補正が必要 とならないように、妨害のない被検体値の計算をプログラムすることができる。 例えば、このプログラミングは、アルブミンについて、Boehringer Mannheim/Hi tachi 704機器で以下のように実施される： １．パラメータプログラム：化学パラメータ：２．モニタ：較正モニタ(１)：テスト１について、Ｓ１吸光度として０を入力、 Ｋとして100,000を入力。 ３．計算されたテストにより、補正された被検体値を計算する(Boehringer Mann heim/Hitachi 704マニュアルを参照されたい)： 計算されたテスト＝(テスト２)−(テスト１)・Ｆ＋濃度_基準 テスト２は、測定された未補正の被検体値濃度の決定である。 テスト１は、サンプル空値の吸光度の決定である。 Ｆは、アルブミン、鉄、または総タンパク質について、Ｈｂ妨害を補正するた めに決定された係数である。 濃度_基準＝Ｆ・Ｅ１_基準であり、濃度として入力。実施例１ ブロモクレゾールグリーン法によるアルブミンの測定のための補正係数の決定 アッセイコード2-15-23を用いて、Boehringer Mannheim/Hitachi 704分析装置 で、37℃にて測定を行った。以下の試薬を使用した： 試薬１：75mmol/lコハク酸緩衝液(pH4.2) 試薬２：75mmol/lコハク酸緩衝液(pH4.2)； 0.3mmol/lブロモクレゾールグリーン テスト手順は以下の通りであった：350μlの試薬１を４μlのサンプルに加え 、サンプル空値の決定後、350μｌの試薬２を加えた。次いで、２分後に被検体 を測定した。600nmの主波長、および700nmの二次波長を測定に用いた。 この測定の結果を表１に示す。テストに特有の補正係数の値は0.332と決定さ れた。実施例２ フェロジン法による鉄の測定のための補正係数の決定 アッセイコード2-24-30を用いて、Boehringer Mannheim/Hitachi 717分析装置 で、37℃にて測定を行った。以下の試薬を使用した： 試薬１：150mmol/l酢酸Ｎａ緩衝液(pH5.0)； ４mmol/l塩化グアニジウム；100mmol/lチオ尿素； 界面活性剤 試薬２：150mmol/lアスコルビン酸、50mmol/lフェロジン テスト手順は以下の通りであった：250μlの試薬１を20μlのサンプルに加え 、 サンプル空値の決定後、50μlの試薬２を加えた。次いで、１分後に被検体を測 定した。546nmの主波長、および700nmの二次波長を測定に用いた。 この実験の結果を表２に示す。テストに特有の補正係数の値は0.290と決定さ れた。実施例３ ビウレット法による総タンパク質の測定のための補正係数の決定 アッセイコード2-24-50を用いて、Boehringer Mannheim/Hitachi 717分析装置 で、37℃にて測定を行った。以下の試薬を使用した： 試薬１：200mmol/lＮａＯＨ；32mmol/l酒石酸Ｋ−Ｎａ 試薬２：200mmol/lＮａＯＨ；32mmol/l酒石酸Ｋ−Ｎａ； 30.5mmol/lＫＩ；12.15mmol/l硫酸Ｃｕ テスト手順は以下の通りであった：250μlの試薬１を７μlのサンプルに加え 、サンプル空値の決定後、250μlの試薬２を加えた。次いで、５分後に被検体を 測定した。546nmの主波長、および700nmの二次波長を測定に用いた。 この実験の結果を表３に示す。テストに特有の補正係数の値は0.115と決定さ れた。実施例４ アルブミンの測定のための補正式の使用 実施例１において決定された補正係数を用いて、血液代用品を加えて得たヘモ グロビンを含有するサンプルを決定した。 テスト手順は実施例１に記載した通りであった。 サンプル中の補正された被検体濃度を求めるための式は以下の通りであった： Ｃ’_{サンフ゜ル}＝Ｃ_{サンフ゜ル}−Ｆ・Ｅ１_{サンフ゜ル}＋Ｆ・Ｅ１_基準＝Ｃ_{サンフ゜ル}−Ｆ・Ｅ１_{サンフ゜ ル} ＋0.3g/l この実験の結果を表４に示す。補正により、100±１％の回収率が達成された ことが分かる。実施例５ 鉄の測定のための補正式の使用 実施例２において決定された補正係数を用いて、溶血産物を加えて得たヘモグ ロビンを含有するサンプル中の鉄をフェロジン法により測定した。 テスト手順は実施例２に記載した通りであった。 補正された分析値を求めるための式は以下の通りであった： Ｃ’_サンプル＝Ｃ_サンプル−Ｆ・Ｅ１_サンプル＋Ｆ・Ｅ１_基準＝Ｃ_サンプル−Ｆ・Ｅ１_{サンプ ル} ＋2.9μｇ/dl この実験の結果を表５に示す。１つの値を除いては、100％±2.5％の範囲内の 優れた鉄回収率が達成されたことが分かる。実施例６ 総タンパク質の測定のための補正式の使用 実施例３において決定された補正係数を用いて、血液代用品を加えて得たヘモ グロビンを含有するサンプル中の総タンパク質をビウレット法により測定した。 実験は実施例３に記載したように行った。 補正された分析値を求めるための式は以下の通りであった： Ｃ’_サンプル＝Ｃ_サンプル−Ｆ・Ｅ１_サンプル＋Ｆ・Ｅ１_基準＝Ｃ_サンプル−Ｆ・Ｅ１_サンプル＋0. 6g/dl この実験の結果を表６に示す。総タンパク質の回収率がほとんどの場合に100 ±１％の範囲内にあることが分かる。実施例７ 黄疸サンプル中のアルブミンの測定 実施例１において決定されたテストに特有の補正係数を用いて、ブロモクレゾ ールグリーン法により、ビリルビンを加えて得た黄疸サンプル中のアルブミンを 測定した。 テスト手順は、実施例１に記載した通りであった。補正された分析値を求める ための式は、実施例４に記載のものであった。 この実験の結果を表７に示す。補正式を使用することによって回収率の悪化が 生じなかったことが分かる。実施例８ 高脂血症性サンプル中の鉄の測定 実施例２において決定されたテストに特有の補正係数を用いて、フェロジン法 テスト手順は、実施例２に記載した通りであった。補正された分析値を求める ための式は、実施例５に記載のものであった。 この実験の結果を表８に示す。補正式を使用することによって高脂血症中の回 収率の悪化が生じなかったことが分かる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 光学測定による、遊離ヘモグロビンを含有するサンプル中の被検体の測 定方法であって、 (ａ) 分析するサンプルの空値を測定する段階と、 (ｂ) ヘモグロビン非含有基準サンプルの空値を測定する段階と、 (ｃ) 被検体濃度の未補正値を測定する段階と、 (ｄ) 段階(ｃ)において得られた値を、段階(ａ)および(ｂ)で得られた値 と相関させることにより補正して、該被検体濃度の補正値を得る段階と により該被検体濃度の測定値を補正する、前記方法。 ２． 前記被検体濃度の補正値が、以下の関係式： Ｃ’_{サンフ゜ル}＝Ｃ_{サンフ゜ル}−Ｆ・Ｅ１_{サンフ゜ル}＋Ｆ・Ｅ１_基準 (式中、Ｃ’_{サンフ゜ル}は該被検体濃度の補正値であり、 Ｃ_{サンフ゜ル}はサンプル中の該被検体濃度の未補正測定値であり、 Ｆはテストに特有の補正係数であり、 Ｅ１_{サンフ゜ル}は前記サンプル中で測定された空値であり、および、 Ｅ１_基準は前記基準サンプル中で測定された値である） により算出される、請求項１に記載の方法。 ３． 前記被検体の測定を、600〜700nmの範囲での光学測定により行う、請求 項１または２に記載の方法。 ４． 血液代用品を含有するサンプルが測定される、請求項１〜３のいずれか １項に記載の方法。 ５． 前記サンプルの総タンパク質含量が測定される、請求項１〜４のいずれ か１項に記載の方法。 ６． 前記総タンパク質含量の測定がビウレット法により行われる、請求項５ に記載の方法。 ７． 前記サンプル中の鉄含量が測定される、請求項１〜４のいずれか１項に 記載の方法。 ８． 前記鉄含量がフェロジン法により測定される、請求項７に記載の方法。 ９． 前記サンプル中のアルブミン含量が測定される、請求項１〜４のいずれ か１項に記載の方法。 10． 前記アルブミン含量が、ブロモクレゾールグリーン法もしくはブロモクレ ゾールパープル法により測定される、請求項９に記載の方法。 11． 高脂血症性サンプルの測定において、清浄剤を加える、請求項１〜10の いずれか１項に記載の方法。 12． 前記測定が、血清もしくは血漿サンプルにおいて行われる、請求項１〜 11のいずれか１項に記載の方法。 13． 臨床的に健康な被験者の血清もしくは血漿サンプルを基準サンプルとし て使用する、請求項１〜12のいずれか１項に記載の方法。 14． 自動分析装置にて実施される、請求項１〜13のいずれか１項に記載の方 法。 15． 前記自動分析装置が、前記被検体濃度の補正値がすでに印字されるよう にプログラムされている、請求項14に記載の方法。 16． 前記テストに特有の補正係数Ｆの決定が、 (ａ)少なくとも１つのサンプルがヘモグロビンを含有せず、少なくとも２ つのサンプルが異なる濃度の遊離ヘモグロビンを含有する、同量の被検体 を含有する少なくとも３つのサンプルからなる組を調製する段階と、 (ｂ) 各サンプルの空値を測定して、ヘモグロビン非含有サンプルと比較 した場合のヘモグロビンの存在により生じるサンプル空値の増加を決定す る段階と、 (ｃ) 各サンプル中の前記未補正被検体濃度を測定して、ヘモグロビン非 含有基準サンプルと比較した場合のヘモグロビンの存在により生じる測定 値の誤差を決定する段階と、 (ｄ) 段階(ｃ)において決定された該測定値の誤差を、段階(ｂ)において 決定された該サンプル空値の増加と相関させて、該テストに特有の補正係 数を得る段階と を含む、請求項２に記載の方法。 17． 少なくとも５個のサンプルが異なる濃度の遊離ヘモグロビンを含有する 、 サンプルからなる組を調製する、請求項16に記載の方法。 18． ０mg/dl〜少なくとも1000mg/dlにわたる遊離ヘモグロビン濃度を有する サンプルからなる組を調製する、請求項16または17に記載の方法。 19． 遊離ヘモグロビンを含有するサンプルについて、サンプルに特有の補正 係数Ｆ’を以下の関係式： Ｆ’＝ΔＣ：ΔＥ１ (式中、 ΔＣは、個々のサンプルについて、基準サンプルと比較した場合の遊離ヘ モグロビンの存在によって生じる測定値の誤差量であり、および、 ΔＥ１は、個々のサンプルについて、基準サンプルと比較した場合の遊離 ヘモグロビンの存在によって生じるサンプル空値の増加である。） により決定し、個々のサンプルそれぞれについて決定された該補正係数 Ｆ’の平均を算出することにより、テストに特有の補正係数Ｆを決定する 、請求項16〜18のいずれか１項に記載の方法。