JPS6118693B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、検体の分析方法に関し、特に吸光度
の測定によつてクロモゲンを測定し得る分析方法
に関する。 生化学検査の分野における最近の自動化の傾向
は極めて著しいものがある。自動分析装置も又、
初期のフロータイプから最近の種々のデイスクリ
ートタイプ迄多種多様にわたる機種が開発されて
いる。これら各種の自動分析装置は、検査件数全
体の拡大と、測定結果の精密度の向上の両面にお
いて著しい効果を発揮している。即ち、現在使用
されている自動分析装置においては、検体処理の
速度と、精密度の２点に関する限りにおいては、
殆どの自動分析装置が使用者の要求をほぼ満足す
るような段階に到達しつつある。しかし、測定結
果の正確度の点を考慮すると、現在使用されてい
る各種の自動分析装置は未だ幾多の問題点を有
し、使用者の要求を満たすには程遠いものがあ
る。就中、溶血（ヘモグロビン）、黄疸（ビリル
ビン）、乳び（濁り）を始めとする各種のクロモ
ゲンが自動分析装置の測定の正確度を失わしめて
いる。 このような妨害クロモゲンによる影響は、特に
エンドポイントの比色分析及び比濁分析において
著しく、レート法（反応速度測定法）においては
殆どない。しかしながら、生化学検査の全ての物
質に対してレート法を用いることは原理的には可
能であつても、試薬の価格、操作の簡便さ、処理
速度等の点に問題がある。従つて、現状では、検
査件数全体に対して比色分析法の占める割合は依
然として極めて高い。 従つて、比色分析法（比濁分析法も含む）にお
ける、前述のようなクロモゲンによる正確度の劣
化のない自動装置用比色分析法が開発されるなら
ば、その果たす役割は極めて大きい。 従来から行なわれている、このようなクロモゲ
ンの妨害を防ぐ最も基本的な方法は、全ての検
体、全ての検査項目毎に検体ブランクを測定する
ものである。勿論、検体ブランクを測定するため
の試薬の組成など、検討すべき問題も多くある
が、基本的には測定反応に関与する物質の中の適
当なものを除いた試薬を用いて検体ブランクを測
定し、これとその検体の反応液との差より目的物
質を算出すれば、前述のような妨害物質の影響の
ない真値に近い正確な分析値が得られる。しかし
ながら、このような検体ブランク補正法を自動分
析装置に用いると、１試料に対し２回ずつ測定が
必要となるため、必然的に装置の検体処理速度が
半分に低下し、しかも必要な試薬の種類が増大す
る等の欠点もあり、１部の特殊な検査項目の検査
以外には適用されていないのが現状である。 生化学検査において比色分析によつて測定され
る被目的物質の種類は40種類以上あるが、従来そ
れらの比色分析方法としては１波長法或るいは２
波長法が用いられている。即ち、前者は、目的物
質に対応する反応物質或るいは反応生成物の吸光
中心近傍の特定波長における吸光度を即定するも
のであり、該中心近傍の波長と他の適当なもう１
つの波長における吸光度の差を測定するのが後者
である。しかし、いずれの方法も前記のような
種々の妨害物質の影響を受けるという問題があ
る。 第１図に、各妨害物質と吸収スペクトルの関係
を模型的に示す。図において、スペクトル１０
は、前述のような妨害物質を全く含まない理想的
な血清の反応液の吸収スペクトル、スペクトル１
２は、乳び、黄疸、溶血等の妨害物質を含む実際
の血清の反応液の吸収スペクトルである。第１図
に示すような例において、波長λ_２により１波長
比色を行なつた場合を考えると、これら２つの検
体中の目的物質の濃度は本来同程度であるにもか
かわらず、スペクトル１２は、スペクトル１０の
約２倍の分析値を与える。２波長比色法の場合、
前記妨害物質の他に含まれる微小な気泡や固形物
は、一般にそのスペクトルを図の縦軸方向に平行
移動させるのみで、１波長比色法の場合程大きい
誤差を与えないという特徴を有する。しかし、２
波長比色法の場合、前述のクロモゲンの妨害はス
ペクトル１２に示されるように複雑であり、波長
λ_２とλ_３の場合は50％の正の誤差を、波長λ_２
とλ_１を用いた場合は30％の負の誤差を与える。 本発明の目的は、複数の妨害クロモゲンのそれ
ぞれに分析用チヤンネルを設けなくても妨害クロ
モゲンを測定でき、かつ分析項目の測定値に対し
妨害クロモゲンの影響を補正できる分析方法を提
供することにある。 本発明では、検体とNADH等の補酵素を混合し
た試料液を調製し、この試料液について可視波長
域の複数波長の吸光度値に基づいて乳び、溶血お
よび黄疸の程度を測定し、一方、上記検体を反応
させた反応液に関し特定の分析項目を測定し、こ
の特定の分析項目の測定値を乳び、溶血および黄
疸の程度に応じて補正することを特徴とする。 以下、本発明の原理を説明する。浮び、溶血、
黄疸等の妨害クロモゲンの吸収スペクトルは、液
性によつて異なり、多くの場合重なり合つている
ため、そのスペクトルの解析は困灘である。就
中、これらの吸収に更に目的物質の吸収が重なつ
た場合、その解析は一段と困難であり、仮に解析
できたとしてもその精密度は著しく低下してい
る。従つて、多項目自動分析装置のように、同一
検体に対して多くの項目を同時に測定する場合
は、各測定項目毎にそのスペクトルを解析するよ
りは、最も解析しやすい項目についてのみそのス
ペクトルを解析し、該スペクトルより例えば上述
の３種の妨害物質の量を測定し、その値を用いて
他の項目の測定値を補正する方が容易である。前
記妨害クロモゲンを最も解析しやすい分析項目と
しては、例えば、グルタミン酸オキザロ酢酸トラ
ンスアミナーゼ（以下GOTと称する）、グルタミ
ン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（以下GPT
と称する）、乳酸脱水素酵素（以下LDHと称す
る）、ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（以下HBDHと
称する）のように、紫外部吸収によつて目的物質
を測定する分析項目があげられる。これらの分析
項目の測定においては、その目的物質であるニコ
チンアミドアデニンデヌクレオチツド（以下
NADHと称する）の吸収が紫外部のみにあり、可
視波長域においては前述の妨害物質による吸収ス
ペクトと重ならない。しかも、その試薬中にはヘ
モグロビンや黄疸或るいはリポ蛋白（濁りの原因
の１つ）等と反応する物質が含まれておらず、液
性も中性の緩衝液（PH7.4）であるため、前述の
妨害物質のスペクトルが比較的単純な形状をして
おり、その解析が容易である。NADHの他の紫外
部のみに吸収を有する補酵素としては、NADPH
を用いることができ、340nm付近の吸収を測定し
てGOTやGPTを測定する。 第２図に、GOTの紫外部測定の吸収スペクト
ルを示す。図において、１４は前述の妨害クロモ
ゲンを全く含まない理想的な正常血清の反応液の
スペクトルを水対象で示したもの、１６は、高乳
び血清の反応液のスペクトルを試薬ブランク対象
で示したもの、１８は、高黄疸血清の反応液のス
ペクトルを同じく試薬ブランク対象で示したもの
である。ここで、水対象スペクトル１４は、試料
セルに収容した妨害クロモゲンを含まない血清の
反応液の吸収スペクトルと、対照セルに収容した
水の吸収スペクトルとを測定し、各波長点におけ
る両者の吸光度差を表示したものである。また、
試薬ブランク対象スペクトル１６は、試料セルに
収容した高乳び血清の反応液の吸収スペクトル
と、対照セルに収容した測定用試薬（血清試料を
含まない）の吸収スペクトルとを測定し、各波長
における両者の吸光度差を表示したものである。
試薬ブランク対象スペクト１８は、高黄疸血清に
ついて同様に表示したものである。 第２図において、波長λ₁₁は340nm、λ₁₂は
376nm、λ₁₃は415nm、λ₁₄は450nm、λ₁₅は
480nm、λ₁₆は505nm、λ₁₇は546nm、λ₁₈は
570nm、λ₁₉は600nm、λ₂₀は660nm、λ₂₁は
700nm、λ₂₂は850nmである。図から明らかなご
とく、GOT測定の反応液の可視波長域のスペク
トルを解析すれば、前記妨害クロモゲンの量を求
めることができる。 以下、測定波長として12波長を同時検出し得る
多波長光度計（例えば特開昭50−18090参照）を
備えた自動分析装置を用いた場合の、本発明の実
施例を詳細に説明する。第３図に、該多波長自動
分析装置を使用して分析した場合に得られる吸収
スペクトラムを示す。図において、２０は、
GOT測定液で希釈した乳び基準液のスペクト
ル、２２は、同じくGOT測定液で希釈した溶血
基準液のスペクトル、２４は、同じくGOT測定
液で希釈した黄疸基準液のスペクトルである。乳
び基準液は、20クンケル単位相当の微細ポリスチ
レン粉末を、GOT試薬で希釈乳濁させたもの、
溶血基準液は、1000mg／dlのヘモグロビン基準
液を、検体血清と同一条件でGOT測定液で希釈
溶解したもの、黄疸基準液は、10mg／dlのビリ
ルビンコントロール血清を検体血清と同一条件で
GOT測定液で希釈溶解したものである。前記ス
ペクトル２０，２２，２４は、いずれも試薬ブラ
ンク対象のスペクトルである。この場合、各試薬
対象スペクトルは、各試料セルに収容した各クロ
モゲンの基準液の吸収スペクトルと、対照セルに
収容した測定用試薬（血清試料を含まない）の吸
収スペクトルとを測定し、各波長における各基準
液と試薬ブランク液との吸光度差を表示したもの
である。又各波長は、第２図と同一である。 第３図から明らかなごとく、GOT測定液で可
視波長域に表われる検体ブランク吸収のうち、λ
₂₀以降の長波長域は乳びによるものであり、λ₁₇
〜₁₉の中間波長域は乳びと溶血によるものであ
り、λ₁₆以前の短波長域は、乳び、溶血、黄疸の
３成分によるものであることが分かる。従つて、
以下に述べる方法によつて、これら３成分を弁別
測定することが可能である。 即ち、GOT測定の検体反応液の吸収スペクト
ルを多波長光度計によつて全波長域にわたつて測
定し、その紫外部吸収により目的物質のGOTを
測定すると同時に、可視波長域のスペクトルより
次の方法によつて、その検体血清中の乳び度、溶
血度、黄疸度を求める。 まずλ₂₀以降の適当な２波長（例えばλ₂₀とλ
₂₁）の吸光度差より、次式をを用いて乳び度Ｘを
求める。 Ｘ＝Ａ_{２０−２１}／Ｔ_{２０−２１} ……(1) ここで、A_20-21は、検体における波長λ₂₀とλ
₂₁の吸光度差、T_20-21は、スペクトル２０より予
め求めた、単位濁度当りの単位吸光度差を表わす
定数である。 次に、中波長域の適当な２波長（例えばλ₁₈と
λ₁₉）における吸光度差A_18-19より次式を用いて
溶血度Ｙを求める。 Ｙ＝Ａ_{１８−１９}−Ｘ・Ｔ_{１８−１９}／Ｈ_{１８−１
９}……(2) ここで、T_18-19は、スペクトル２０より予め求
めた、単位濁度当たりの吸光度差を示す定数、
H_18-19は、同じくスペクトル２２より予め求め
た、単位溶血度当たりの吸光度差を示す定数であ
る。 次に、更に、短波長域の適当な２波長（例え
ば、λ₁₅とλ₁₆）における吸光度差A_15-16より、次
式を用いて、黄疸度Ｚを求める。 Ｚ＝Ａ_{１５−１６}−Ｘ・Ｔ_{１５−１６}−Ｙ・Ｈ_{１５
−１６}／Ｂ_{１５−１６}……(3) ここで、T_15-16は、スペクトル２０より予め求
めた単位濁度当たりの吸光度差を示す定数、
H_15-16は、同じくスペクトル２２より予め求めた
単位溶血度当たりの吸光度差を示す定数、B_15-16
は、同じくスペクトル２４より予め求めた単位黄
疸度当たりの吸光度差を示す定数である。 前記のようにして求めた、検体中の乳び度Ｘ、
溶血度Ｙ、黄疸度Ｚから、次式を用いて、比色分
析法による分析値Ｓを補正し、正確度の高い補正
分析値S¹を得ることができる。 S¹＝Ｓ−α・Ｘ−β・Ｙ−τ・Ｚ ……(4) ここで、α，β，τは、前述した乳び、溶血、
黄疸の各基準液を検体と同一条件で測定して予め
求めた換算定数である。 前記各式で用いられる定数、T_20-21，T_18-19，
T_15-16，H_18-19，H_15-16，B_15-16，α，β，τは、
自動分析装置と試薬が同一であれば一定であるた
め、一度測定すれば、必ずしも毎回求める必要は
ない。 第１表に、前記補正の効果を示す。使用した装
置は、16分析項目を、120検体／時間で処理でき
る自動分析装置で、第３図に示した340〜850nm
の12波長における吸光度を測定できる多波長光度
計を備えているものである。

【表】 第１表において、コリンエステラーゼ
（CHE）は、570−600nm、アルカリフオスフア
ターゼ（ALP）、546−600nm、ロイシンアミノペ
プチターゼ（LAP）は、480−505nm、トリグリ
セライド（TG）は、340−376nmの２波長比色法
による測定であり、検体血清は、乳び度Ｘ、溶血
度Ｙ、黄疸度Ｚの測定値の示すように、強度の溶
血血清である。表から明らかなごとく、強度溶血
による妨害のため、CHE、TGの２波長測定値が
負となる非理論的な２波長比色法の測定値が、同
一検体のGOT測定値のスペクトルより求めた、
乳び度Ｘ、溶血度Ｙ、黄疸度Ｚを用いて補正する
ことによつて改善されていることが分かる。 本実施例においては、検体中の妨害クロモゲン
である乳び度を、可視波長域の吸収スペクトルの
長波長域における適当な２波長の吸光度差から求
め、同じく溶血度を前記乳び度及び中波長域にお
ける適当な２波長の吸光度差から求め、更に、同
じく黄疸度を、前記乳び度、溶血度及び短波長域
における適当な２波長の吸光度差から求めるよう
にしているので、各妨害クロモゲン濃度を、分離
して、かつ精度良く求めるることが可能である。 なお、前記実施例においては、妨害クロモゲン
の量を求めるのに、GOTの測定液のスペクトル
を用いていたが、妨害クロモゲンを求めるための
スペクトルは前記実施例に限低されず、GPT、
LDH、HBDH等の紫外部測定の測定液のスペク
トルを用いることができる。 又、前記実施例は、２波長測定法を用いた比色
分析方法に本発明を適用したものであるが、本発
明の適用範囲はこれに限定されず、適当な１波長
における吸光度で代用することにより、１波長吸
光分析にも適用することは明らかである。 なお、前記実施例は、本発明、血清に対する比
色分析方法に適用したものであるが、本発明の適
用範囲がこれに限定されず、一般の比色分析方法
に適用できることは明らかである。 以上のように本発明によれば、NADHなどの補
酵素を含む試料液から得た妨害クロモゲンの量に
応じて、分析項目の測定値を補正するようにした
ので、わざわざ妨害クロモゲン測定用チヤンネル
を分析装置に設けなくても、正確度の高い分析値
を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、比色分析法における誤差要因を模型
的に示した線図、第２図は、GOT反応液中に代
表的な検体血清の吸収スペクトルの例を示す線
図、第３図は、同GOT反応液中における、乳
び、溶血、黄疸の各基準スペクトルを示す線図で
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 乳び、溶血および黄疸のうちの少なくとも１
   つによるクロモゲンの影響がある試料に光を照射
   し、その試料のクロモゲンを測定するクロモゲン
   の影響がある検体の分析方法において、上記光が
   照射される試料は、NADH等の補酵素と検体とを
   含む試料液であること、この試料液について可視
   波長域の複数波長の吸光度値に基づいて乳び、溶
   血および黄疸の程度を測定すること、上記検体を
   反応させた反応液に関し特定の分析項目を測定す
   ること、上記特定の分析項目の測定値を上記乳
   び、溶血および黄疸の程度に応じて補正すること
   を含むクロモゲンの影響がある検体の分析方法。