JP2000511783A

JP2000511783A - ランダムプライマーまたは定義プライマーを用いるポリヌクレオチド配列の組換え

Info

Publication number: JP2000511783A
Application number: JP10545987A
Authority: JP
Inventors: エイチ．アーノルド，フランセス; シャオ，ジーシン; エイ．アフホルター，ジョセフ; ジャオ，フイミン; ジェイ．ギバー，ロレイン
Original assignee: カリフォルニアインスティテュートオブテクノロジー
Priority date: 1997-03-25
Filing date: 1998-03-25
Publication date: 2000-09-12
Also published as: IL127031A0; BR9804791A; PL330287A1; CA2255670A1; EP0975653A4; US6177263B1; US6153410A; CN1230990A; WO1998042728A1; NZ332906A; EP0975653A1; AU724698B2; EP0920496A4; CA2285657A1; EP0920496A1; WO1998042832A1; AU6772598A; AU6942098A

Abstract

(57)【要約】プライマーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ触媒伸長に基づくポリヌクレオチド配列のインビトロ変異誘発および組換えのための方法が開示される。この方法は、テンプレートポリヌクレオチド（単数または複数）をランダム配列プライマーまたは定義配列プライマーでプライミングして、低レベルの点変異を有する短いDNAフラグメントのプールを作製することを含む。DNAフラグメントは、変性、続いてアニーリングおよびさらなる酵素触媒DNA重合に供される。この手順は、最初のテンプレートポリヌクレオチドの変異体を含む完全長遺伝子を生成するために十分な数の回数で反復される。これらの遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応によりさらに増幅され、そしてコードされるタンパク質の発現のためのベクターにクローニングされ得る。

Description

【発明の詳細な説明】ランダムプライマーまたは定義プライマーを用いるポリヌクレオチド配列の組換え米国政府は、エネルギー省により授与された補助金番号DE-FG02-93-CH10578および海軍研究事務所により授与された補助金番号N00014-96-1-0340により本発明において一定の権利を有する。発明の背景１．発明の分野本発明は、一般的に、ポリヌクレオチド配列の変異誘発および組換えのためのインビトロ方法に関する。より詳細には、本発明は、プライマーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ触媒伸長、それに続く遺伝子組立て、および任意の遺伝子増幅に基づく、ポリヌクレオチド配列のインビトロ変異誘発および組換えのための単純なおよび効率的な方法を含む。２．関連技術の説明本発明の背景を記載するために、そしてその実施に関するさらなる詳細を提供するため本明細書中に参照される刊行物および他の参考資料は、参考として本明細書中に援用される。簡便のために、参考資料は数的に参照され、そして添付の著書目録おいて分類される。タンパク質は、実用的な適用のためにそれらの性能を改善する目的で操作される。望ましい特性は目的の適用に依存し、そしてレセプターへのより堅い結合、高い触媒活性、高い安定性、より広い（もしくはより狭い）範囲の基質を受容する能力、または有機溶媒のような非天然環境において機能する能力を含み得る。種々のアプローチ（「合理的な」設計およびランダム変異誘発法を含む）は、タンパク質機能を最適化するために首尾良く使用されてきた（１）。所定の最適化問題のためのアプローチの選択は、配列と構造と機能との間の関連の理解度に依存する。例えば、酵素触媒部位の合理的な再設計は、しばしば、酵素構造、種々のリガンドおよび反応中間体アナログを有する酵素複合体の構造、ならびに触媒機構の詳細の広範な知識を必要とする。このような情報は、非常にわずかな十分に研究された系にのみ利用可能であり；潜在的に興味深い酵素の非常に大多数についてはほとんど知られていない。存在するタンパク質機能を担うアミノ酸および新たな機能を生じさせ得るアミノ酸の同定は、しばしば圧倒的な難題のままである。これは、多くのタンパク質機能が少数のアミノ酸に拘束されず、活性部位から離れた残基により影響されるという増大する認識と共に、新規のタンパク質を操作するために、増大する数のグループをランダム変異誘発または「定方向」進化に向わせた（１）。種々の最適化手順（例えば、遺伝子アルゴリズム（２、３）および進化的ストラテジー（４、５））は自然進化より影響を与えられた。これらの手順は、特定の最適化目的を達成するために、変異（集団のメンバーに小さなランダム変化を作る）ならびに交叉（異なる個体の特性を組み合わせる）を使用する。異なる最適化問題のコンピューターシミュレーションにより示されるように、変異と交叉との間の強力な相互作用もまた存在する（６〜９）。これらの重要なプロセスを模倣する効率的かつ実用的な実験技術を開発することは、科学的な難題である。このような技術の適用は、例えば、インビボでまたは生体系の制約から完全に離れてさえも、生物学的分子（例えば、タンパク質および核酸）の機能を調査し、そして最適化することを可能にするはずである（10，11）。自然進化から着想を得た、定方向進化は、変異分子のプール（これは、そこに存在する変化または増強した機能を有するタンパク質をコードする分子について十分な多様性を有する）の作製および選択またはスクリーニングを含む。これは、一般的に、変異遺伝子ライブラリーの作成から始める。所望の特性または特性のセットに関して改善を示す遺伝子産物は、選択またはスクリーニングにより同定される。これらの産物をコードする遺伝子（単数または複数）は、有益な変異を蓄積するために、さらなるサイクルのプロセスに供され得る。この進化は、どの程度まで進行したいか、および各世代において代表的に観察される変異の効果に依存して、少ないかまたは多くの世代を含み得る。このようなアプローチは、新規の機能的な核酸(12)、ペプチドおよび他の低分子(12)、抗体(12)、ならびに酵素および他のタンパク質（13、14、16）を作成するために使用された。定方向進化は、産物自体についての特定の知識をほとんど必要とせず、最適化されるべき機能を評価するための手段のみを必要とする。これらの手順は、機能評価における不正確さおよびノイズにかなり寛容でありさえする（15）。定方向進化のための遺伝子多様性は、種々の方法（変異誘発PCR（15）または組み合せカセット変異誘発（16）を含む）を用いて新たな点変異を導入することにより作成され得る。しかし、遺伝子を組換える能力は、自然進化におけるその重要な役割により証明されるように、進化プロセスに対して重要な特徴を付加し得る。相同組換えは重要な自然のプロセスであり、ここで生物は遺伝情報を関連遺伝子間で交換し、種内での利用可能な遺伝的多様性を増大させる。潜在的に強力な適応性および多様化能力をそれらの宿主に導入する一方、このような経路はまた、非常に低い効率で操作し、しばしば、10世代後でさえも経路の構造または機能において有意でない変化を誘発する。従って、このような機構は、地質学的時間範囲にわたって宿主生物／種に有益であるとわかるが、インビボ組換え法は、生物の中間代謝および生存に強く連結しない酵素または他のタンパク質の性能を作るために、扱いにくく、使用不可能でない場合、組合せ的なプロセスを示す。いくつかのグループは、定方向進化における遺伝子組換えの有用性を認識した。遺伝子のインビボ組換えのための方法は、例えば、公開されたPCT出願WO97/07 205および米国特許第5,093,257号において開示されている。上記のように、これらのインビボ法は扱いにくく、そして機能の迅速な進化について十分に最適化されない。Stemmerは、関連DNA配列のインビトロ組換えのための方法を開示し、ここで一般的に酵素（例えば、DNase I）を用いて親配列はフラグメントに切断され、そして再組立てされる（17、18、19）。しかし、DNase Iおよび他のエンドヌクレアーゼに関連した非ランダムDNAフラグメント化は、組換えに偏りを導入し、そして組換え多様性を制限する。さらに、この方法は、二本鎖ポリヌクレオチドの組換えに制限され、そして一本鎖テンプレートにおいて使用され得ない。さらに、この方法は、遺伝子およびプライマーの特定の組み合せで十分に働かない。例えば、短い配列（200ヌクレオチド(nt)未満）の組換えには効率的でない。最後に、この方法は、全く骨が折れ、いくつかの工程を必要とする。インビトロでの点変異誘発および組換えにより新規の遺伝子を作成するための代替の簡便な方法が必要とされる。発明の要旨本発明は、１セットの親配列（テンプレート）のインビトロでの点変異および組換えによる新規のポリヌクレオチド配列の作成に対して、新たなおよび有意に改善したアプローチを提供する。新規のポリヌクレオチド配列は、それら自体で（例えば、DNAに基づく計算のために）有用であり得るか、またはそれらは、遺伝子産物の定方向進化のために組換え生物内で発現され得る。本発明の１つの実施態様は、テンプレート遺伝子（単数または複数）をランダム配列オリゴヌクレオチドでプライムして、短いDNAフラグメントのプールを作製することを含む。適切な反応条件下で、これらの短いDNAフラグメントは、相補性に基づいて互いにプライムし得、従って熱安定性DNAポリメラーゼの存在下で反復熱サイクリングにより完全長遺伝子を形成するために再組立てされ得る。これらの再組立てされた遺伝子（点変異ならびに異なる親遺伝子由来の配列の新規の組み合せを含む）は、従来のPCRによりさらに増幅され、そしてコードされるタンパク質の発現のために適切なベクターにクローニングされ得る。遺伝子産物のスクリーニングまたは選択は、改善したまたはさらに新規の機能を有する新たな改変体を導く。これらの改変体は、それらがさらなるサイクルの変異誘発および組換えのための新たな開始点であるか、またはそれらが新たな開始点として作用し得るように使用され得る。本発明の第２の実施態様は、テンプレート遺伝子（単数または複数）を、定義された配列または制限されたランダム性を示す定義配列のプライマーオリゴヌクレオチドの１セットでプライムして、短いDNAフラグメントプールを作製し、次いでこれを完全長遺伝子に上記のように再組立てすることを含む。本発明の第３の実施態様は、本発明者らが「交互交換的(staggered)伸長」プロセスすなわちStEPと呼ぶ新規のプロセスを含む。伸長プライマーにより作成されたフラグメントプールを再組立てる代わりに、完全長遺伝子は、テンプレート（単数または複数）の存在下で直接組立てられる。StEPは、変性、それに続く極端に省略されたアニーリング／伸長工程の反復サイクルからなる。各サイクルにおいて、伸長フラグメントは、相補性に基づいて異なるテンプレートにアニーリングし、そしてさらに少し伸長して「組換えカセット」を作成し得る。このテンプレート切り替えにより、ポリヌクレオチドの大部分は、異なる親遺伝子由来の配列を含む（すなわち、新規の組換え体である）。このプロセスは、完全長遺伝子が形成するまで反復される。その後、任意の遺伝子増幅工程が行われ得る。本発明の異なる実施態様は、異なる適用のための特性および利点を提供する。最も好ましい実施態様において、テンプレートポリヌクレオチドの5'および3'末端に対応するか、またはそれに隣接する、１つ以上の定義プライマーまたは制限されたランダム性を示す定義プライマーはStEPと使用して、新規の完全長配列に増殖する遺伝子フラグメントを作製する。この単純な方法は、テンプレート配列（単数または複数）の知識を必要としない。別の好ましい実施態様において、複数の定義プライマーまたは制限されたランダム性を示す定義プライマーを使用して、完全長遺伝子に再組立てされる短い遺伝子フラグメントを作製する。複数の定義プライマーを使用することは、使用者がインビトロ組換え頻度を偏らせることを可能にする。配列情報が利用可能な場合、プライマーは、特定の位置での組換え頻度を増大させる重複組換えカセットを作製するように設計され得る。他の特性の中で、この方法は、利用可能な構造的および機能的情報、ならびに前の世代の変異誘発および選択（またはスクリーニング）により蓄積された情報を利用する順応性を導入する。組換えに加えて、プライマーに基づく組換えプロセスの異なる実施態様は、点変異を作製する。この点変異率を知り、そして制御し得ることが所望され、これはDNA合成および遺伝子再組立ての条件を操作することによりなされ得る。定義プライマーアプローチを用いて、特定の点変異もまた、変異誘発プライマーの使用により配列中の特定の位置に指向され得る。本発明に従った種々のプライマーに基づく組換え法は、広い範囲のpH値にわたってそして有機溶媒の存在下でActinoplanes utahensis ECBデアシラーゼの活性を増強し、そしてBacillus subtilisサブチリシンＥの熱安定性を改善することが示された。DNA配列決定は、新規の配列の作製において点変異および組換えの役割を確認する。これらのプロトコルは、単純かつ信頼性のある両方であることが見出された。上記で議論されたおよび多くの他の特性および付随利点は、添付の図面と共に採用される場合、以下のより詳細な説明を参照してより良く理解される。図面の簡単な説明図１は、ランダム配列プライマーおよび遺伝子再組立てを用いた本発明に従う組換えを示す。示された工程は：ａ）中温性または高熱性ポリメラーゼと、プライマーとしてランダム配列オリゴヌクレオチド（プライマーは示さず）を用いた１本鎖ＤＮＡフラグメントの合成；ｂ）テンプレートの除去；ｃ）高熱性DNAポリメラーゼを用いた再組立て；ｄ）熱安定性ポリメラーゼ（単数または複数）を用いた増幅；ｅ）クローニングおよびスクリーニング（必要に応じて）；ならびにf）選択された遺伝子（単数または複数）を用いたプロセスの反復（必要に応じて）である。図２は、定義プライマーを用いた本発明に従う組換えを示す。この方法は、２つの遺伝子の組換えについて例示され、ここでＸ＝変異である。図で示された工程は以下の通りである：ａ）遺伝子は、別々になされ得るか（１反応あたり２つのプライマー）、または組み合わされ得る（１反応あたり複数のプライマー）、ＰＣＲ反応物中の定義プライマーでプライムされる；ｃ）最初の産物は、定義プライマーが使い尽くされるまで形成される。テンプレートは除去される（必要に応じて）；ｄ）最初のフラグメントは、外部プライマーの添加なく、さらなるサイクルのPCRにおいてそれ自体をプライムおよび伸長する。組立ては、完全長遺伝子が形成されるまで続く；ｅ）（必要に応じて）完全長遺伝子は、外部プライマーを用いてPCR反応物中で増幅される；ｆ）（必要に応じて）選択された遺伝子（単数または複数）を用いてプロセスを反復する。図３は、２つの定義隣接プライマーおよびStEPを用いた本発明に従う組換えを示す。１つのプライマーおよび２つのテンプレート由来の２つの一本鎖のみが、組換えプロセスを例示するためにここで示される。図で示された工程は以下を含む：ａ）変性後、テンプレート遺伝子は１つの定義プライマーでプライムされる；ｂ）短いフラグメントは、短時間でプライマー伸長により生成される；ｃ）次のサイクルのStEPにおいて、フラグメントはランダムにテンプレートに対してプライムされ、そしてさらに伸長される；ｄ）変性およびアニーリング／伸長は、完全長遺伝子が作られる（アガロースゲル上で目に見える）まで反復される；ｅ）完全長遺伝子は精製されるか、または外部プライマーを用いてPCR反応物中で増幅される（必要に応じて）；ｆ）（必要に応じて）選択された遺伝子（単数または複数）を用いてプロセスを反復する。図４は、本発明に従った、２つの隣接プライマーおよび交互交換的伸長を用いた２つの遺伝子の組換え結果の模式図である。組換えライブラリーから選択された５つの遺伝子のDNA配列が示され、ここでＸは親遺伝子に存在する変異であり、そして三角は新たな点変異を示す。図５は、実施例３に記載される、pNBエステラーゼ遺伝子配列の模式図である。テンプレート遺伝子2-13および5-B12は、定義プライマープローチを用いて組換えられた。プライマー位置は矢印で示され、親配列が互いに異なる位置はｘで示される。新たな点変異は三角で示される。これらの組換え遺伝子において同定された変異が列挙される（親配列において異なる位置のみが列挙される）。6E6 および6H1の両方は、テンプレート遺伝子の組換え産物である。図６は、散在されたプライマーに基づく組換えによりテンプレート遺伝子R1およびR2から組換え遺伝子を作製するために使用された、４つの定義内部プライマーの位置および配列を示す。プライマーP50Fは、同時に、HindIII制限部位を削除し、そして新たな独特のNheI部位を付加する、変異（塩基位置598でのＡ→Ｔ）を含む。遺伝子R2もまた、HindIII部位を削除する、同じ塩基位置での変異Ａ →Ｔを含む。図７は、40クローンからのプラスミドの制限消化分析の結果を示す電気泳動ゲルである。図８は、定義プライマーに基づく組換えライブラリー由来の10の遺伝子を配列決定した結果を示す。線は、45ntのそのプロ配列、全成熟配列、および停止コドン後の113ntを含む、986bpのサブチリシンＥ遺伝子を示す。クロスは、親遺伝子 R1およびR2由来の変異位置を示すが、三角は、組換え手順の間に導入された新たな点変異の位置を示す。丸は、変異誘発プライマーP50Fにより導入された変異を示す。図９は、ランダム配列プライマー組換え法を、Actinoplanes utahensis ECBデアシラーゼ遺伝子に適用した結果を示す。（ａ）2.4kbのECBデアシラーゼ遺伝子はアガロースゲルから精製された。（ｂ）ランダムプライミング産物のサイズは、100〜500塩基の範囲であった。（ｃ）300塩基より短いフラグメントが単離された。（ｄ）精製フラグメントを使用して、スメアバックグラウンドを有する完全長遺伝子を再び組立てた。（ｅ）ECBデアシラーゼ遺伝子と同じサイズの単一のＰCR産物が、この遺伝子の開始および停止領域に位置する２つのプライマーを用いた従来のPCR後に得られた。（ｆ）XhoIおよびPsh AIでの消化後に、PCR産物は、変異ライブラリーを形成するために改変pIJ702ベクターにクローニングされた。（ｇ）このライブラリーのStreptomyces lividans TK23への導入は、活性EC Bデアシラーゼを産生する約71％のクローンをもたらした。図10は、野生型ECBデアシラーゼおよび本発明に従って得られた変異体M16の比活性を示す。図11は、野生型ECBデアシラーゼおよび本発明に従って得られた変異体M16の活性のpHプロフィールを示す。図12は、ライブラリー／クレノウからランダムに選択された10のクローンのDN A配列分析を示す。線は、45ntのそのプロ配列、全成熟配列、および停止コドン後の113ntを含む、986bpのサブチリシンＥ遺伝子を示す。クロスは、R1およびR2 由来の変異位置を示すが、三角は、ランダムプライミング組換えプロセス間に導入された新たな点変異の位置を示す。図13は、以下の異なるポリメラーゼを用いて生成された５つのライブラリー由来のスクリーニングされたクローンの熱安定性指数プロフィールを示す：ａ）ライブラリー／クレノウ、ｂ）ライブラリー／T4、ｃ）ライブラリー／Sequenase 、ｄ）ライブラリー／Stoffel，およびｅ）ライブラリー／Pfu。65℃でのインキュベーション後の標準化残存活性（Ar/Ai）は、酵素熱安定性の指標として使用された。データはソートされ、そして下がっていく順番でプロットされた。発明の詳細な説明本発明の１つの好ましい実施態様では、全ての可能なヌクレオチド配列の組み合せを有するプライマーの１セット（dp(N)L、ここでL＝プライマーの長さである）が、プライマーに基づく組換えに使用される。異なる長さのオリゴデオキシヌクレオチドが、E.coliポリメラーゼＩのクレノウフラグメントによる１本鎖テンプレート上でのDNA合成開始のためのプライマーとして作用し得ることは、数年間知られてきた（21）。それらは通常のPCRプライマーのサイズより小さいが（すなわち、13塩基未満）、ヘキサヌクレオチドほどの短さのオリゴマーは、正確に反応をプライムし得、そして標識反応においてしばしば使用される（22）。本発明に従って遺伝子フラグメントのプールを作成し、続いて遺伝子を再組立てするためのランダムプライマーの使用は、図１に示される。この工程は、ランダムプライミングによる１本鎖ポリヌクレオチドテンプレートからの多様な「ブリーディングブロック(breeding block)」の作製、DNAポリメラーゼおよびヌクレオチドの存在下の熱サイクリングにより作製された短い新生DNAフラグメントからの完全長DNAの再組立て、およびさらなるクローニングおよびスクリーニングのための従来のPCRによる再組立てされた産物からの所望の遺伝子の増幅を含む。この手順は、主にプライミング工程で、しかし他の工程間でも新たな変異を導入する。これらの新たな変異およびテンプレート配列に既に存在する変異は再組立て間に組換えられて、新規のDNA配列のライブラリーを作成する。この手順は、所望であれば、選択された配列において反復され得る。ランダムプライミング手順を行うために、テンプレート（単数または複数）は、線状形態または閉環形態の１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチド（単数または複数）であり得る。テンプレートは、等モル量で、または例えばそれらの機能的な特性により秤量される量で混合され得る。少なくともいくつかの場合において、テンプレート遺伝子は、付加的な変異が導入されるべきではないベクターにクローニングされているので、それらは通常最初に制限エンドヌクレアーゼ（単数または複数）で切断され、そしてベクターから精製される。得られた線状DNA分子は煮沸により変性され、ランダム配列オリゴデオキシヌクレオチドにアニーリングされ、そして適切な量のdNTPの存在下でDNAポリメラーゼとインキュベートされる。ヘキサヌクレオチドプライマーが好ましいが、より長いランダムプライマー（24塩基まで）もまた、ランダムプライミング合成間に使用されるDNAポリメラーゼおよび条件付けに依存して使用され得る。従って、オリゴヌクレオチドは、全標的領域に沿って種々の位置で目的のDNAをプライムし、そして伸長されて、テンプレートDNAの各鎖に相補的な短いDNAフラグメントを作製する。塩基の誤った取り込みおよび誤ったプライミングのような事象により、これらの短いDNA フラグメントもまた点変異を含む。日常的に確立された反応条件下で、短いDNA フラグメントは、相同性に基づいて互いにプライムし、そして熱安定性DNAポリメラーゼの存在下での反復熱サイクリングにより完全長遺伝子に再組立てされ得る。得られた完全長遺伝子は多様な配列を有するが、これらのうちのほとんどは、最初のテンプレートDNAの配列になお似ている。これらの配列は従来のPCRによりさらに増幅され、そして発現のためにベクターにクローニングされ得る。発現された変異体のスクリーニングまたは選択は、改善したまたはさらに新たな特定の機能を有する改変体を導くはずである。これらの改変体は、実際の問題に対する部分的な解決として直ぐ使用され得るか、またはそれらは、定方向進化のさらなるサイクルのための新たな開始点として作用し得る。タンパク質最適化のために使用される他の技術（例えば、組み合せカセット変異誘発およびオリゴヌクレオチド指向変異誘発（24、25、26）、誤りがちな(err or-prone)PCR(27、28)またはDNAシャッフリング（17、18、19））と比較して、インビトロタンパク質進化のためのランダムプライマーに基づく手順の利点のいくつかは以下のように要約される：１．ランダムプライミング合成に使用されるテンプレート（単数または複数）は、１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチドのいずれかであり得る。対照的に、組換えのための誤りがちなPCRおよびDNAシャッフリング方法（17、18、19）は、２本鎖ポリヌクレオチドのみを必ず使用する。本明細書中に記載した技術を用いて、変異および／または交叉は、異なるDNA依存性DNAポリメラーゼを用いることによりDNAレベルで、または異なるRNA依存性DNAポリメラーゼを用いることにより直接mRNAからでさえ導入され得る。組換えは、１本鎖DNAテンプレートを用いて行われ得る。２．ランダムフラグメントを作製するために２本鎖DNAテンプレートのフラグメント化（一般的に、DNAseIで行われる）を必要とする、DNAシャッフリング手順とは対照的に、本明細書に記載される技術は、さらなる再組立てのための「ブリーディングブロック」として制御可能なサイズのDNAフラグメントを得るためにランダムプライミング合成を使用する（図１）。１つの直接的な利点は、ヌクレアーゼ活性の２つの供給源（DNAseIおよび5'-3'エキソヌクレアーゼ）が削除され、そしてこれが、最終的な再組立ておよび増幅遺伝子フラグメントのサイズにわたるより簡単な制御を可能にすることである。３．ランダムプライマーは、全ての位置で４つ全ての塩基を含む合成オリゴヌクレオチド集団であるので、それらはそれらの長さが均一であり、そして配列の偏りを欠いている。配列不均一性は、それらが多くの位置でテンプレートDNA鎖とハイブリッドを形成するのを可能にする。その結果、テンプレートの全ヌクレオチド（恐らく、極度の５'端のヌクレオチドを除いて）は、同様の頻度で産物にコピーされるはずである。この方法で、変異および交叉の両方が、例えば、誤りがちなPCRまたはDNAシャッフリングよりランダムに起こり得る。４．ランダムプライムされたDNA合成は、ヘキサヌクレオチド混合物のDNAテンプレートへのハイブリダイゼーションに基づき、そして相補鎖は、ポリメラーゼおよび４つのデオキシヌクレオチド三リン酸を用いて、ランダムヘキサヌクレオチドプライマーの3'-OH末端から合成される。従って、反応は、DNAテンプレートの長さから独立している。200塩基の長さのDNAフラグメントは、線状化プラスミドまたはλDNAと同様に等しくプライムされ得る(29)。これは、例えば、ペプチドの操作に特に有用である。５．DNaseIは、ピリミジンヌクレオチドに隣接する部位で優先的に２本鎖DNAを加水分解するエンドヌクレアーゼであるので、DNAシャッフリングにおけるその使用は、テンプレート遺伝子消化の工程での（特に、高G＋Cまたは高A＋T含有量を有する遺伝子に対して）偏りをもたらし得る。全変異率および組換え頻度に対するこの潜在的な偏りの影響は、ランダムプライミングアプローチを使用することにより避けられ得る。テンプレートDNAのG+Cリッチ領域への優先的なハイブリダイゼーションによるランダムプライミングにおける偏りは、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーのＡおよびＴ含有量を増大させることにより克服し得る。本発明を実施する重要な部分は、ランダムプライミングプロセス間に合成される新生１本鎖DNAの平均サイズを制御することである。この工程は、他者により詳細に研究されている。HodgsonおよびFisk(30)は、合成された１本鎖DNAの平均度である)であることを見出した。プライマー濃度と産出DNAフラグメントサイズとの間の逆関係は、立体障害によるものであり得る。このガイドラインに基づいて、ランダムプライミング合成のための適切な条件は、異なる長さの個々の遺伝子について容易に設定され得る。多数のポリメラーゼは現在入手可能であるので、短い新生DNAフラグメントの合成は、種々の様式で達成され得る。例えば、バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ（23）またはT7 Sequenaseバージョン2.0 DNAポリメラーゼ（31，32）は、ランダムプライミング合成に使用され得る。１本鎖ポリヌクレオチドテンプレートについて（特に、RNAテンプレートについて）、逆転写酵素はランダムプライミング合成に好ましい。この酵素は3'→5' エキソヌクレアーゼ活性を欠くので、むしろ誤りがちである。高濃度のdNTPおよびMn²⁺の存在下で、500塩基毎に約１塩基が誤って取り込まれる（29）。反応条件を改変することにより、PCRは、短い新生DNAフラグメント用の熱安定性ポリメラーゼを使用するランダムプライミング合成について調節され得る。重要な考慮は、短いランダムプライマーがテンプレートにアニーリングし、そしてより高い温度で十分なDNA増幅を与え得ることを確実にする反応条件を日常的な実験により同定することである。本発明者らは、dp(N)12ほどの短さのランダムプライマーが、伸長プライマーを作製するためのPCRで使用され得ることを見出した。PCRをランダムプライミング合成に適合させることは、短い新生DNAフラグメントを作るための簡便な方法を提供し、そしてこのランダムプライミング組換え技術を非常に確固とする。多くの進化シナリオにおいて、組換えは、配列情報がテンプレート配列の少なくともいくつかで利用可能であるオリゴヌクレオチド配列間で行われるはずである。このようなシナリオにおいて、種々の変異間で分散される一連のプライマーを定義し、そして合成することがしばしば可能である。定義プライマーが使用される場合、それらは６〜100塩基長であり得る。本発明に従って、これらの定義プライマーが一連の重複プライマー伸長反応（熱サイクリングにより促進され得る）を開始させることにより、蓄積された変異の１つ以上、テンプレート間の対立遺伝子の差違またはイソタイプ差異をそれぞれ含む、組換えカセットを作製することは可能である。定義プライマーを用いた、重複伸長産物がDNA重合反応において作製されるこのような方法において、利用可能なプライマーの枯渇は、完全な遺伝子産物が作製されるまでプライマー伸長産物の進行的な交叉ハイブリダイゼーションを導く。反復回のアニーリング、伸長、および変性は、各重複カセットとその他全てとの組換えを保証する。本発明の好ましい実施態様は、１セットの定義オリゴヌクレオチドプライマーを使用してDNA合成をプライムする方法を含む。図２は、定義プライマーが使用される本発明の例示的なバージョンを示す。オリゴヌクレオチドプライマーの注意深い設計および配置は、非ランダム伸長組換えプライマーの作製を容易にし、そして相同なテンプレートの長さに沿った主な組換え（同時分離）事象を決定するために使用される。本発明の別の実施態様は、テンプレートの存在下でのプライマーに基づく遺伝子組立ておよび組換えに対する代替のアプローチである。従って、図３に示されるように、本発明は、酵素触媒DNA重合が、変性前に（伸長工程の時間を制限し、そしてその温度を低下させることにより）ただ手短に進行させられる組換えを含む。変性に続いて、伸長フラグメントのテンプレート配列へのランダムアニーリングが行われ、そして部分的伸長が続けられる。このプロセスは、完全長配列が作られるまで、プライマーおよびテンプレートの濃度に依存して複数回反復される。このプロセスは、交互交換的伸長すなわちStEPと呼ばれる。ランダムプライマーはまたStEPに使用され得るが、遺伝子合成は、定義プライマーほど非常に効率的でない。従って、定義プライマーが好ましい。この方法において、手短なアニーリング／伸長工程（単数または複数）は、部分的に伸長されたプライマーを作製するために使用される。代表的なアニーリング／伸長工程は、高い忠実度のプライマーアニーリングを可能にするが（Tm^-25 より大きなT_{アニーリンク゛}）、重合／伸長をたった２、３秒に（または平均伸長を300nt 未満に）制限する条件下で行われる。最小限の伸長は、好ましくは20〜50ntのオーダーである。熱安定性DNAポリメラーゼは、代表的に最適温度で100〜150ヌクレオチド/秒/酵素分子の最大重合速度を示すが、最適温度（T_opt）に近い温度で適切なアレニウスのキネティクスに従うことが証明された。従って、55℃の温度で、熱安定性ポリメラーゼは、72℃（T_opt）で示す定常状態重合速度すなわち24 nt/秒の20〜25％しか示さない（40）。37℃および22℃で、Taqポリメラーゼは、それぞれ1.5nt/秒および0.25nt/秒の伸長活性を有することが報告される（24）。時間および温度の両方は、所望の組換え事象ならびに基本的なポリメラーゼキネティクスおよび生化学の知識に基づいて日常的に変えられ得る。交互交換的伸長プロセスの進行は、プライマー伸長における種々の時点で反応チューブからアリコートを取り出し、そしてアガロースゲル電気泳動によりDNA フラグメントを分離することによりモニターされる。有効なプライマー伸長の証拠は、サイクル数の増大と共に分子量が増大する進行初期での低分子量「スメア」の出現から示される。（指数的に新たなDNAを作製する）遺伝子増幅プロセスとは異なり、StEPは、異なるテンプレート遺伝子に対応するDNAセグメントを含むその初期サイクルにおいて、付加的な様式で新たなDNAフラグメントを作製する。非増幅条件下で、2 0サイクルのStEPは、最初のテンプレート濃度の約40倍の最大モル収率DNAを作製する。比較すると、遺伝子増幅のための理想化されたポリメラーゼ連鎖反応プロセスは終始倍数的に増加し、同数の工程により約１×10⁶倍の最大モル収率を与える。実際に、２つのプロセス間の差異はPCRにより観察され得、１ng/μｌ未満の濃度のテンプレートおよび10〜500倍過剰（対遺伝子増幅に代表的な10⁶倍過剰）のプライマーで開始した場合に、少し（10未満）だけのサイクルの後に明らかな「バンド」を生じる。同様の反応条件下で、StEPは、サイクル数の増大と共に分子量が増大するほとんど目に見えない「スメア」を生じることが期待される。有意な数のプライマー伸長DNA分子が、完全長遺伝子の1/2の長さを超えるサイズに達し始める場合、半分伸長した順鎖および逆鎖が交差ハイブリダイズして、プロセスのその時点で遭遇するサイズのほぼ２倍サイズのフラグメントを作製し始めると、分子量の急速なジャンプが生じる。この時点で、スメアの適切な分子量の別々のバンドへの同時凝固は、DNAをStEPに供し続けるか、または熱サイクルを変えて、プライムされたDNAの完全な伸長を指数的な遺伝子増幅に駆動させることにより急速に生じ得る。遺伝子組立て（および必要であれば、二本鎖形態への変換）後に、組換え遺伝子は増幅され（必要に応じて）、適切な制限酵素で消化され、そして発現遺伝子産物のスクリーニングのために発現ベクターに連結される。このプロセスは、所望であれば、所望の機能の進化を導く配列変化を蓄積するために反復され得る。交互交換的伸長および相同的遺伝子組立てプロセス（StEP）は、ランダム様式または偏った様式で同様の遺伝子を組換えるための強力で柔軟な方法を示す。このプロセスは、プライマーの配置およびアニーリング／伸長工程を可能にする時間を制御することにより、既知の一連の配列の特定領域内でまたはそこから離れて組換えを集中させるために使用され得る。これはまた、別々にまたは単一の反応内で作製された相同的遺伝情報の特定のカセットを組換えるために使用され得る。この方法はまた、配列情報が入手可能でないが、機能的5'および3'増幅プライマーが調製され得る、遺伝子の組換えに適用可能である。他の組換え方法と異なって、交互交換的伸長プロセスは、複合体の分離または精製工程なく従来の手順を用いて単一のチューブ内で作動され得る。本発明の定義プライマー実施態様の利点のいくつかは、以下のように要約される：１．StEP法は、組立てられた産物からの親分子の分離を必要としない。２．定義プライマーは、組換え事象の位置を偏らせるために使用され得る。３．StEPは、組換え頻度が伸長時間を変えることにより調節されるのを可能にする。４．組換え手順は、単一のチューブ内で行われ得る。５．このプロセスは、１本鎖ポリヌクレオチドまたは２本鎖ポリヌクレオチドで行われ得る。６．このプロセスは、DNase Iまたは他のエンドヌクレアーゼにより導入される偏りを避ける。７．ユニバーサルプライマーが使用され得る。８．制限されたランダム性を示す定義プライマーは、遺伝子の選択された領域で変異頻度を増大させるために使用され得る。当業者により理解されるように、本発明のいくつかの実施態様が可能である。例示的な実施態様は以下を含む：１．定義隣接プライマーおよび交互交換的伸長のみを使用する関連遺伝子の組換えおよび点変異。２．プライマー枯渇が熱サイクリングの経過にわたって生じ、組換え合成遺伝子が形成されるまで重複遺伝子フラグメントを交差ハイブリダイズさせそして伸長させる、十分に低い濃度での隣接プライマーおよび一連の内部プライマーを使用する関連遺伝子の組換えおよび変異。３．再組立てされて新たな遺伝子を形成する短いDNAフラグメントのプールを作製するために、高濃度のランダム配列プライマーを使用する遺伝子の組換えおよび変異。４．再組立てされて新たな遺伝子を形成するDNAフラグメントのプールを作製するために、１セットの定義プライマーを使用する遺伝子の組換えおよび変異。５．新たな遺伝子を形成するために、１つ以上の定義プライマーおよび交互交換的伸長を使用する１本鎖ポリヌクレオチドの組換えおよび変異。６．プライマー内の30％を超えるまたは60％を超えるヌクレオチド位置で制限されたランダム性を有する定義プライマーを使用する組換え。プライマーに基づく組換え法の使用を示す実施の実施例は以下の通りである。実施例１サブチリシンＥを組換え、そしてその熱安定性を増強するための、定義された隣接プライマーおよび交互交換的伸長の使用本実施例は、定義プライマー組換え法が、野生型サブチリシンＥの熱安定性を超える熱安定性を有するサブチリシン改変体をコードすることが知られ−−ている２つの遺伝子の組換えによりサブチリシンＥの熱安定性を増強するためにどのように使用され得るのかを示す。本実施例は、テンプレートの5'および3'末端に対応する２つのプライマーのみを利用する図３に概説される一般的な方法を証明する。図３に概説されるように、伸長される組換えプライマーを、反復サイクルの変性、それに続く極端に省略されたアニーリング／伸長工程（単数または複数）からなる、交互交換的伸長プロセス（StEP）により作製する。伸長されたフラグメントを、DNAポリメラーゼの存在下での熱サイクリングにより補助される相同的遺伝子組立てにより完全長遺伝子に再組立てし、続いて必要に応じて遺伝子増幅工程を行う。２つの熱安定性サブチリシンＥ変異体R1およびR2を使用して、交互交換的伸長を用いた定義プライマーに基づく組換え技術を試験する。これらの２つの遺伝子が互いに異なる位置を表１に示す。R1およびR2で異なる10ヌクレオチド位置のうち、アミノ酸置換Asn181-Asp(N181D)およびAsn218-Ser(N218S)を導くそれらの変異のみが熱安定性を付与する。残りの変異は、熱安定性に対するそれらの効果に関してはっきりしない（33）。単一の改変体N181DおよびN218Sの65℃での半減期は、それぞれ野生型サブチリシンＥの半減期より約３倍および２倍大きく、そしてそれらの融点Tmは、それぞれ野生型酵素の融点より3.7℃および3.2℃高い。両方のこれらの機能的変異を含む配列を生じるランダム組換え事象は、新たな有害な変異が組換えプロセス間にこれらの遺伝子に導入されなければ、65℃でのその半減期が野生型サブチリシンＥの半減期より約８倍大きい酵素を生じさせる。さらに、組換えプロセスに関連した全ての点変異誘発率は、組換えされた改変体ライブラリーの小さなサンプリングの触媒活性プロフィールから評価され得る。点変異誘発率が０の場合、集団の25％は野生型様活性を示すはずであり、集団の25 ％は２重変異体（N181D＋N218S）様活性を有するはずであり、そして残りの50％は１重変異体（N181DまたはN218S）様活性を有するはずである。有限の点変異誘発は、野生型様（またはより低い）活性を有する酵素をコードするライブラリーの画分を増大する。この画分を使用して、点変異誘発速度を評価し得る。表１熱安定性サブチリシンE変異体R1およびR2におけるDNAおよびアミノ酸置換遺伝子塩基塩基置換コドンの位置アミノ酸アミノ酸置換 R1 780 Ａ→Ｇ２ 109 Asn→Ser 1107 Ａ→Ｇ２ 218 Asn→Ser 1141 Ａ→Ｔ３ 229 同義 1153 Ａ→Ｇ３ 233 同義 484 Ａ→Ｇ３ 10 同義 520 Ａ→Ｔ３ 22 同義 598 Ａ→Ｇ３ 48 同義 731 Ｇ→Ａ１ 93 Val→Ile R2 745 Ｔ→Ｃ３ 97 同義 780 Ａ→Ｇ２ 109 Asn→Ser 995 Ａ→Ｇ１ 181 Asn→Asp 1189 Ａ→Ｇ３ 245 同義列挙された変異は、共通に780での塩基置換を有する野生型サブチリシンＥに対して比較する。材料と方法２つの隣接プライマーを用いる定義プライマーに基づく組換えのための手順２つの定義プライマー、P5N(5'-CCGAG CGTTG CATAT GTGGA AG-3'(配列番号１) 、下線配列はNdeI制限部位である)およびP3B(5'-CGACT CTAGA GGATC CGATT C-3' (配列番号２)、下線配列はBamHI制限部位である)（それぞれ、5'および3'隣接プライマーに対応する）を、組換えのために使用した。条件（100μｌ最終容量）：遺伝子R1およびR2（1:1で混合）を含む0.15pmolプラスミドDNAをテンプレートとして使用し、15pmolの各隣接プライマー、１倍Taq緩衝液、0.2mMの各dNTP、1. 5mM MgCl₂、および0.25UのTaqポリメラーゼを使用した。プログラム：95℃５分、80サイクルの30秒94℃、５秒55℃。正しいサイズ（約1kb）の産物を電気泳動後0.8％アガロースゲルから切り、そしてQIAEX IIゲル抽出キットを用いて精製した。この精製産物をNdeIおよびBamHIで消化し、そしてpBE3シャトルベクターにサブクローニングした。この遺伝子ライブラリーをE.coli HB101において増幅し、そして他の場所に記載されるように（35）、発現およびスクリーニング用のB.subt ilis DB428コンピテント細胞に移した。 DNA配列決定遺伝子をQIAprepスピンプラスミドミニプレップキットを用いて精製して、配列決定品質のDNAを得た。配列決定を、ダイターミネーターサイクル配列決定キット（Perkin-Elmer，Branchburg，NJ）を用いてABI 373DNA配列決定システムにおいて行った。結果交互交換的伸長の進行を、プライマー伸長プロセスにおける種々の時点での反応チューブからアリコート（10μｌ）を取り出し、そしてアガロースゲル電気泳動によりDNAフラグメントを分離することによりモニターした。プライマー伸長反応のゲル電気泳動は、55℃で５秒のアニーリング／伸長反応が、このスメア内に100bp（20サイクル後）、400bp（40サイクル後）、800bp（60サイクル後）、および最終的に多数の約1kbのバンドに近いスメアの出現をもたらすことを明らかにした。このバンド（再組立てされた産物の混合物）をゲル精製し、制限酵素 BamHIおよびNdeIで消化し、そしてE.coli/B.subtilis pBE3シャトルベクターのB amHI-NdeI消化により作製されたベクターに連結した。この遺伝子ライブラリーを、E.coli HB101において増幅し、そして発現およびスクリーニング用のB.subt ilis DB428コンピテント細胞に移した（35）。酵素改変体の熱安定性を、以前に記載された96ウェルプレートフォーマットにおいて決定した（33）。約200のクローンをスクリーニングし、そして約25％がサブチリシン活性を保持した。これらの活性クローンのうち、２重変異体様表現型（高い熱安定性）の頻度は約23％であり、１重変異体様表現型は約42％であり、そして野生型表現型は約34％であった。この分布は、２つの熱安定性変異N218 SおよびN181Dが互いに完全に自由に組換え得る場合に期待される値に非常に近い。 20のクローンを、ランダムにE.coli HB101遺伝子ライブラリーから拾った。それらのプラスミドDNAを単離し、そしてNdeIおよびBamHIで消化した。20のうち９（45％）が正しいサイズ（約１kb）の挿入物を有した。従って、上記のライブラリーの約55％は、正しいサブチリシンＥ遺伝子の欠如により活性を有さなかった。これらのクローンはサブチリシンライブラリーのメンバーでなく、そして本発明者らの計算から除去されるべきである。この要因を考慮に入れると、本発明者らは、ライブラリーの55％（25％活性クローン／正しいサイズ挿入物を有する45 ％クローン）がサブチリシン活性を保持したことを見出す。この活性プロフィールは、遺伝子あたり２変異未満の点変異誘発率を示す（36）。正しいサイズの挿入物を有する５つのクローンを配列決定した。結果を図４に要約する。５つ全ての遺伝子は、１〜４で変化する最小交叉を有する組換え産物である。１つの新たな点変異しか、これらの５つの遺伝子において見出されなかった。実施例２ pNBエステラーゼ変異体を組換えるための定義された隣接プライマーおよび交互交換的伸長の使用 pNBエステラーゼについて本明細書で使用される２プライマー組換え法は、サブチリシンＥについて実施例１に記載された方法に類似する。14塩基で異なる２つのテンプレートpNBエステラーゼ変異体遺伝子を使用する。両方のテンプレート（61C7および4G4）を、プラスミド形態で使用する。両方の標的遺伝子は、１ｎg/μｌの濃度で伸長反応物中に存在する。隣接プライマー（RM1AおよびRM2A、表2）を最終濃度２ng/μｌで添加する（テンプレートの約200倍モル過剰）。表２ pNBエステラーゼ遣伝子の組換えにおいて使用されるプライマークローン61C7は有機溶媒中でその活性に基づいて単離され、そして13のDNA変異対野生型配列を含む。クローン4G4は熱安定性について単離され、野生型と比較した場合に17のDNA変異を含む。８つの変異は、共通の先祖によりそれらの間で共有される。4G4由来の遺伝子産物は、61C7由来の遺伝子産物より著しく熱安定性である。従って、遺伝子間の組換えの１つの基準は、組換え遺伝子における高い溶媒活性および高い熱安定性の同時分離または両方の特性の喪失である。さらに、組換え頻度および変異誘発率は、ランダムクローンを配列決定することにより確かめられ得る。 pNBエステラーゼ遣伝子に対して、プライマー伸長は、94℃30秒に続いて55℃1 5秒からなる熱サイクルを有する90回の伸長を通して進行する。アリコート（10 μｌ）を、サイクル20、40、60、70、80、および90の後に取り出す。アガロースゲル電気泳動は、それぞれの連続サンプル点で平均サイズおよび全強度を増大させる、サイクル20による低分子量「スメア」の形成を明らかにする。サイクル90 により、0.5kbから４kbまで伸び、そして約２kb（完全長遺伝子の長さ）のサイズで最大シグナル強度を示す明白なスメアが、明らかである。半分の長さから完全長の遺伝子へのジャンプは、60〜70サイクルで起こるらしい。強度のスメアを６サイクルのポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、完全長の組換え遺伝子集団をより明らかに定義する。マイナスプライマーコントロールもまた隣接プライマーで増幅して、反応混合物中の残存テンプレートによるバックグラウンドを決定する。プライマー伸長遺伝子集団からのバンド強度は、10倍を超えてコントロールのバンド強度を超え、これは増幅された非組換えテンプレートが増幅遺伝子集団の小さな画分のみを含むことを示す。増幅組換え遺伝子のプールを、制限酵素XbaIおよびBamHIで消化し、そしてZoc kら（35）により記載されるpNB106R発現ベクターに連結する。連結DNAのE.coli 株TGIへの形質転換を、十分に特徴づけられた塩化カルシウム形質転換手順を用いて行う。形質転換コロニーを、20μｇ/mlのテトラサイクリンを含むLB/アガープレート上で選択する。このプロセスの変異誘発率を、活性エステラーゼを発現するクローンの存在を測定することにより決定した（20）。さらに、ランダムに突つかれたコロニーを配列決定し、そしてこれを使用して、この方法の変異誘発頻度および組換え効率を定義する。実施例３散在された内部定義プライマーおよび交互交換的伸長を用いたpNBエステラーゼ遺伝子の組換え本実施例は、散在された定義プライマー組換え技術が、点変異誘発および親配列に存在する変異の組換えにより新規配列を生成し得ることを証明する。実験設計および背景情報２つのpNBエステラーゼ遺伝子(2-13および5-B12)を、定義プライマー組換え技術を用いて組換えた。2-13および5-B12の両方由来の遺伝子産物は、野生型よりある程度まで熱安定性である。遺伝子2-13は、野生型配列に初めから存在しない９つの変異を含むが、一方遺伝子5-B12は14の変異を含む。これらの２つの遺伝子が互いに異なる位置を図５に示す。表３は、本実施例に使用される８つのプライマーの配列を示す。テンプレート遺伝子にアニーリングするオリゴの位置（テンプレート遺伝子の5'末端）を、プライマー方向と同様に（Ｆは正方向プライマーを示し、Ｒは逆方向プライマーを示す）表に示す。これらのプライマーを、図５の遺伝子2-13に沿って矢印として示す。表３本実施例において使用されたプライマーの配列材料と方法定義プライマーに基づく組換え１．組換えられる遺伝子の調製。組換えられる遺伝子を含むプラスミドを、Qiap repキット（Qiagen，Chatsworth，CA）を用いて形質転換TG1細胞から精製した。プラスミドをUV吸収により定量し、そして50ng/μｌの最終濃度で1:1で混合した。２．交互交換的伸長PCRおよび再組立て。４μｌのプラスミド混合物を、８つのプライマーの各1.25ngもまた含む、100μｌの標準反応物（1.5mM MgCl₂、50mM K Cl、10mM Tris-HCl(pH9.0)、0.1％Truton X-100、0.2mM dNTP、0.25U Taqポリメラーゼ（Promega，Madison，WI）中でテンプレートとして使用した。プライマーを含まないコントロール反応物もまた組立てた。反応物を、94℃、30秒；55℃、 15秒の100サイクルにより熱サイクルした。この時点でのアガロースゲル上での反応物アリコートのチェックは、産物がより大きなスメアであることを示した（プライマーなしのコントロールでは目に見える産物はなかった）。３．テンプレートのDpnI消化。次いで、組立て反応物からの１μｌをDpnIで消化して、テンプレートプラスミドを除去した。10μｌのDpnI消化物は、１×NEBuff er４および5UのDpnl（両方をNew England Biolabs，Beverly，MAから得た）を含み、そして37℃で45分間インキュベートし、続いて70℃で10分間インキュベートして、酵素を熱殺傷した。４．組立てられた産物のPCR増幅。次いで、10μｌの消化物を、遺伝子末端に特異的な0.4μＭのプライマ-5b(ACTTAATCTAGAGGGTATTA)(配列番号11)および3b(AGC CTCGCGGGATCCCCGGG)(配列番号12)を含む、90μｌの標準PCR反応物（工程２に記載）に添加した。20サイクルの標準PCR（94℃、30秒；48℃、30秒、72℃、１分）後、正しいサイズ（２kb）の強いバンドが、反応をアガロースゲル上でチェックした時に目に見えたが、一方プライマーなしのコントロールからのレーンでは、非常にかすかなバンドしか目に見えなかった。産物のバンドを精製し、そして発現プラスミドpNB106Rにクローニングし戻し、そしてTGI細胞にエレクトロポレーションにより形質転換した。結果この形質転換から生じたコロニーの４つの96ウェルプレートを、pNBエステラーゼの初期活性および熱安定性についてアッセイした。コロニーの約60％は、親遺伝子値の20％以内の初期活性および熱安定性を示した。非常にわずかな（10％）クローンは不活性であった（親初期活性値の10％未満）。これらの結果は、低率の変異誘発を示唆する。最も高い熱安定性値を有する４つの変異体を配列決定した。２つのクローン（6E6および6H1）は、親遺伝子間の組換え結果であった（図５）。残りの２つのクローンのうち１つは新規の点変異を含み、そして１つは親5B12との差異を示さなかった。変異体6E6における変異T99CおよびC204Tの組み合せは、これらの２つの部位間の組換え事象の証拠である。さらに、変異体6Hl は、変異Al072Gの喪失（しかし、変異C1038TおよびT1310Cの保持）を示し、これは２つの組換え事象の証拠である（１つは部位1028と1072間で、もう１つは1072 と1310間であった）。計５つの新たな点変異を、配列決定した４つの遺伝子において見出した。実施例４内部定義プライマーおよび交互交換的伸長を用いた２つの熱安定性サブチリシンＥ改変体の組換え本実施例は、定義プライマー組換え技術が、親配列の存在下で新たな変異の組み合せを含む新規の配列を生成し得ることを証明する。酵素性能（ここでは熱安定性）のさらなる改善を得るための定義プライマー組換え技術の有用性をさらに証明する。本実施例は、定義プライマーが組換えを偏らせ得、その結果、組換えがプライマーにより定義される配列部分（プライマー内部）に非常にしばしば現われることをさらに示す。さらに、本実施例は、特定の変異が、所望の変異（単数または複数）を含む適切な定義プライマー配列（単数または複数）を用いることにより組換え配列に導入され得ることを示す。実施例１の２つの熱安定性サブチリシンＥ改変体（R1およびR2）をコードする遺伝子を、内部プライマーを用いた定義プライマー組換え手順を用いて組換えた。図６は、本実施例のテンプレート遺伝子R1およびR2から組換え子孫遺伝子を作製するために使用された４つの定義内部プライマーを示す。プライマーP50Fは、 Hi ndIII制限部位を削除し、そして新たな独特のNheI部位を同時に付加する変異（塩基598位のＡ→Ｔ）を含む。このプライマーを使用して、特定の変異がまた、定義プライマーの特定の設計により組換え配列集団に導入され得ることを証明する。遺伝子R2はまた、同じ塩基位置で変異Ａ→Ｇを含み、これはHindIII部位を削除する。従って、組換えライブラリーからサンプリングされたランダムクローンの制限分析（NheIおよびHindIIIにより切断する）は、組換え効率および変異誘発プライマーを介した特定の変異の導入効率を示す。ランダムに突ついた（スクリーニングされない）クローンの配列分析は、定義プライマーに基づく組換え間に生じる組換えおよび変異誘発事象におけるさらなる情報を提供する。材料と方法定義プライマーに基づく組換え図２に示される定義プライマーに基づく組換えバージョンを、StEPを加えて行った。１．組換えられる遺伝子の調製。R1およびR2遺伝子を含む約10μｇのプラスミドを、37℃で１時間、50μｌの１×緩衝液Ｂ（Boehringer Mannheim，Indianapoli s，IN）中のNdeIおよびBamHI(各30Ｕ)を用いて消化した。約１kbの挿入物を、QI AEX IIゲル抽出キットを用いて0.8％調製用アガロースゲルから精製した。DNA挿入物を10mM Tris-HCl(pH7.4)に溶解した。DNA濃度を評価し、そして挿入物を50n g/μｌの濃度で1:1で混合した。２．交互交換的伸長PCRおよび再組立て。条件（100μｌ最終容量）：約100ngの挿入物をテンプレートとして使用し、４つの内部プライマーの各50ng、１×Taq 緩衝液、0.2mMの各dNTP、1.5mM MgCl₂、および0.25U Taqポリメラーゼを使用した。プログラム：94℃30秒、55℃15秒の７サイクル、続いて94℃30秒、55℃15秒、72℃５秒のさらに10サイクル（交互交換的伸長）、続いて94℃30秒、55℃15秒、72℃１分の53サイクル（遺伝子組立て）。３．テンプレートのDpnI消化。この反応物の１μｌをdH₂Oで9.5μｌまで希釈し、そして0.5μｌのDpnI制限酵素を添加して、45分間DNAテンプレートを消化し、続いて70℃で10分間インキュベートし、次いでこの10μｌを10サイクルPCR反応におけるテンプレートとして使用した。４．再組立てされた産物のPCR増幅。PCR条件（100μｌ最終容量）：30pmolの各外部プライマーP5NおよびP3B、１×Taq緩衝液、0.2mMの各dNTP、および2.5U Taq ポリメラーゼ。PCRプログラム：94℃30秒、55℃30秒、72℃１分の10サイクル。このプログラムは、正しいサイズの単一バンドを与えた。産物を精製し、そして pBE3シャトルベクターにサブクローニングした。この遺伝子ライブラリーをE.co liHB101において増幅し、そして他の場所で記載されるように(35)、発現およびスクリーニングのためにB.subtilis DB428コンピテント細胞に移した。酵素改変体の熱安定性を、以前に記載された（33）96ウェルプレートフォーマットにおいて決定した。 DNA配列決定 10のE.coli HB101形質転換体を配列決定のために選択した。遺伝子を、QIApre pスピンプラスミドミニプレップキットを用いて精製して、配列決定品質のDNAを得た。配列決定を、ダイターミネーターサイクル配列決定キット（Perkin-Elmer ，Branchburg，NJ）を用いてABI 373 DNA配列決定システムにおいて行った。結果制限分析組換えライブラリーからランダムに突つかれた40のクローンを、制限酵素NheI およびBamHIで消化した。別の実験において、同じ40のプラスミドをHindIIIおよびBamHIで消化した。これらの反応産物をゲル電気泳動により分析した。図７に示すように、40クローンのうち８つ（約20％）が新たに導入されたNheI制限部位を含み、これは変異誘発プライマーが本当に特定の変異を集団に導入し得たことを証明する。 DNA配列分析最初の10のランダムに突つかれたクローンを配列分析に供し、そしてその結果を図８に要約する。10の遺伝子のうち最低６つが組換えを受けた。これらの６つの遺伝子のうち、遺伝子R1とR2間の最小交叉事象（組換え）は、１〜４で変化する。全ての目に見える交叉は、４つのプライマーにより定義される領域内で起こった。この領域外の変異は、塩基484位および520位での２つの変異間の組換えはないという事実により示されるように、あるとしても、まれに組換えられる。これらの結果は、定義プライマーが組換えを偏らせ得、その結果、プライマーにより定義される配列部分に非常にしばしば現れることを示す。共に非常に近い変異はまた、共に残る傾向がある（例えば、塩基置換731および745ならびに塩基置換 1141および1153はいつも一対として残る）。しかし、クローン７の配列は、33塩基ほど離れて密接する２つの変異が組換えられ得ることを示す（1107および1141 の塩基位置）。 23の新たな点変異は、このプロセス間で10の遺伝子に導入された。0.23％のこの誤りの率は遺伝子あたり２〜３の点変異に相当し、そしてこれは、指向された酵素進化のための変異体ライブラリーを作製するのに最適であると決定された率である（15）。変異型を表４に列挙する。変異は主にトランジションであり、遺伝子に沿って均一に分配される。表４ 10の組換え遣伝子において同定された新たな点変異トランジション頻度トランスバーション頻度Ｇ→Ａ４Ａ→Ｔ１Ａ→Ｇ４Ａ→Ｃ１Ｃ→Ｔ３Ｃ→Ａ１Ｔ→Ｃ５Ｃ→Ｇ０Ｇ→Ｃ１Ｇ→Ｔ０Ｔ→Ａ３Ｔ→Ｇ０計9860の塩基を配列決定した。変異率は0.23％であった。４）表現型分析約450のB.subtilis DB428クローンを突つき、そして96ウェルプレートにおいて20μｇ/mlのカナマイシンを補充したSG培地中で増殖させた。約56％のクローンが活性酵素を発現した。以前の経験から、本発明者らは、このレベルの不活性化が遺伝子あたり２〜３の変異オーダーでの変異率を示すことを知っている（35 ）。約５％のクローンは、二重変異体（N181D＋N218S）様表現型を示した（これは、主として点変異誘発によるランダム組換え単独について期待される25％値より下である）。（DNA配列決定は、10のランダムに突つかれたクローンからの２つのクローン７および８がN218SおよびN181D変異の両方を含むことを示した。）実施例６ランダムプライミング組換え法によるActinoplanes utahensis ECBデアシラーゼの最適化本実施例において、この方法を使用して、変性した線状２本鎖DNA（例えば、ゲル電気泳動により精製された制限フラグメント；22）からの短いDNAフラグメントを作製する。モル過剰のプライマーと混合した精製DNAを煮沸により変性し、次いで、合成を、E.coli DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントを用いて行う。この酵素は5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠き、その結果、ランダムプライミング産物がプライマー伸長により排他的に合成され、そしてエキソヌクレアーゼにより分解されない。この反応をpH6.6で行い、ここで酵素の3'→5'エキソヌクレアーゼ活性は非常に低減される（36）。これらの条件は、合成のランダムな開始に好ましい。この手順は以下の工程を含む：１．目的のDNAを適切な制限エンドヌクレアーゼ（単数または複数）で切断し、そしてWizard PCR Prepキット（Promega，Madison，WI）を用いたゲル電気泳動により目的のDNAフラグメントを精製する。例として、Actinoplanes utahensi s ECBデアシラーゼ遺伝子を、組換えプラスミドpSHP100から2.4kb長のXhoI-Psh AIフラグメントとして切断した。後の変性工程のためにDNAを線状化することは必須であった。フラグメントを、Wizard PCR Prepキット（Promega，Madison，WI ）を用いたアガロースゲル電気泳動により精製した（図９、工程（ａ））。ゲル精製もまた、Mg²⁺イオンが次の工程においてDNAを変性し難くするので、DNAから制限エンドヌクレアーゼ緩衝液を除去するために必須であった。２．H₂Oに溶解した400ng（約0.51pmol）の２本鎖DNAを、2.75μｇ（約1.39nmo l）のdp(N)₆ランダムプライマーと混合した。煮沸水中での３分間の浸漬後、混合物を直ぐに氷／エタノール浴に入れた。ランダムプライミング産物のサイズは、プライマー濃度の逆関数である（33）。高濃度のプライマーの存在は、立体障害を導くと考えられる。ここに記載の反応条件下で、ランダムプライミング産物は、アルカリアガロースゲルによる電気泳動により決定されるように約200〜400bpである（図９、工程ｂ）。３．10μｌの10×反応緩衝液（10×緩衝液：900mM HEPES（pH6.6）；0.1M塩化マグネシウム、10mMジチオスレイトール、および５mM各dATP、dCTP、dGTP、dTTP ）を変性サンプルに添加し、そして反応混合物の総容量をH₂Oで95μｌに上げた。４．10単位（約５μｌ）のE.coli DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントを添加した。全ての成分を、チューブの外側を穏やかにたたくことにより混合し、そしてマイクロフュージ(microfuge)中で12,000gで１〜２秒遠心分離して、全ての液体を底に移動させた。反応を22℃で35分間行った。伸長速度は、テンプレートおよび４つのヌクレオチド前駆体の濃度に依存する。反応をエキソヌクレアーゼ(exonucleolytic)消化を最小化する条件下で行ったので、新たに合成された産物は、検出可能な程度まで分解されなかった。５．22℃で35分後、反応を、サンプルを氷上で０℃に冷却することにより終結させた。100μｌの氷冷H₂Oを反応混合物に添加した。６．ランダムプライムされた産物を、連続的に、Centricon-100フィルター（テンプレートおよびタンパク質を除去するために）ならびにCentricon-10フィルター（プライマーおよび50塩基未満のフラグメントを除去するために）に全反応混合物を通過させることにより精製した。Centriconフィルターは、Amicon Inc( Berverly，MA)から入手可能である。Retentate画分（約85μｌの容量）をCentri con-10から取り出した。この画分は、所望のランダムプライミング産物を含み（図９、工程ｃ）そして遺伝子全体の再組立てに使用された。遺伝子全体の再組立てを以下の工程により達成した：１．PCRによる再組立てのために、５μｌのCentricon-10からのランダムプライムされたDNAフラグメント20μｌの２×PCRプレミックス（５倍希釈クローニングPfu緩衝液、0.5mM各dNTP、0.1U/μｌのクローニングPfuポリメラーゼ（Strata gene，La Jolla，CA））、８μｌの30％（v/v）グリセロール、および７μｌのH₂ Oを氷上で混合した。再組立てに使用したランダムプライムされたDNAフラグメントの濃度は最も重要な変数であるので、好ましい条件を確立するために、異なる濃度を有するいくつかの別々の反応物を設定することは有用である。２．96℃で６分間のインキュベーション後、いずれの鉱物油を添加することなくDNA Engine PTC-200(MJ Research Inc.,Watertown，MA)装置において、40回の熱サイクルをそれぞれ、95℃1.5分、55℃1.0分、および72℃1.5分＋５秒／サイクルで行い、最後のサイクルの伸長工程は72℃10分で進行した。３．20、30、および40サイクルで３μｌのアリコートを反応混合物から取り出し、そしてアガロースゲル電気泳動により分析した。40サイクルで再組立てされたPCR産物は、より大きなおよびより小さなサイズのスメア中に正しいサイズの産物を含んだ（図９、工程ｄを参照のこと）。この第１のPCRの正しく再組立てされた産物を、テンプレートDNAの末端に相補的なPCRプライマーを含む第２のPCR反応においてさらに増幅した。増幅手順は以下の通りである：１．2.0μｌのPCR再組立てアリコートを、100μｌ標準PCR反応物においてテンプレートとして使用し、このPCR反応物は、0.2mMのxhoF28(5'GGTAGAGCGAGTCTCGA GGGGGAGATGC3')(配列番号13)およびpshR22(5'AGCCGGCGTGACGTGGGTCAGC3')(配列番号14)の各プライマー、1.5mM MgCl₂、10mM Tris-HCl(pH9.0)、50mM KCl、200 μＭの４つの各dNTP、６％(v/v)グリセロール、2.5UのTaqポリメラーゼ(Promega ，Madison，WI)、ならびに2.5UのPfuポリメラーゼ（Stratagene，La Jolla，CA ）を含んだ。２．96℃で５分間のインキュベーション後、いずれの鉱物油を添加することなくDNA Engine PTC-200(MJ Research Inc.,Watertown，MA)装置において、15回の熱サイクルをそれぞれ95℃1.5分、55℃1.0分、および72℃1.5分で行い、続いて9 5℃1.5分、55℃1.0分、および72℃1.5分＋５秒／サイクルのさらに15回の熱サイクルを行い、最後のサイクルの伸長工程は72℃10分で進行した。３．増幅は、ECBデアシラーゼ遺伝子全体の正しいサイズを有する多量のPCR産物をもたらした（図９、工程ｅ）。クローニングを以下のように達成した：１．ECBデアシラーゼ遺伝子のPCR産物をXhoIおよびPsh AI制限酵素で消化し、そして改変pIJ702ベクターにクローニングした。２．S.lividans TK23プロトプラストを上記の連結混合物で形質転換して、変異体ライブラリーを形成した。ECB デアシラーゼ変異体のインサイチュスクリーニング上記のように得られたS.lividans TK23ライブラリー内の各形質転換体を、基質としてECBを用いるインサイチュプレートアッセイ法を用いてデアシラーゼ活性についてスクリーニングした。形質転換プロトプラストを、30℃で24時間のインキュベーションによりR2YEアガープレート上で再生させ、そしてさらに48〜72 時間チオストレプトンの存在下で発生させた。コロニーが適切なサイズに成長すると、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）中の0.5mg/ml ECBを含む６mlの45℃ 精製アガロース（Sigma）溶液を、各R2YEアガープレートの上部に注ぎ、そして3 7℃で18〜24時間さらに発生させた。野生型組換えプラスミドpSHP150-2を含むコントロールコロニーのものより大きな透明帯により囲まれるコロニーは、改善した酵素特性または改善した酵素発現および分泌レベルから生じるより効率的なEC B加水分解を示し、そして潜在的に陽性な変異体として選択した。これらのコロニーを、後の保存および操作のために突ついた。ECB デアシラーゼ変異体のHPLCアッセイ単一の陽性形質転換体を、５μｇ/mlチオストレプトンを含む20mlの発酵培地に接種し、そして30℃で48時間増殖させた。この工程で、全ての培養物を、基質としてECBを用いるHPLCアッセイに供した。100μｌの全ブロスを、0.1M NaAc(pH5. 5)、10％(v/v)Me0H、および200μｇ/mlのECB基質の存在下で30℃で30分HPLC反応に使用した。20μｌの各反応混合物をPolyLCポリヒドロキシエチルアスパルタミドカラム（4.6×100mm）にロードし、そして2.2ml/分の流速のアセトニトリル勾配により溶出した。ECB-核を225nmで検出した。ECB デアシラーゼ変異体の精製 HPLCアッセイ後、次いで、潜在的に陽性の変異体全ての2.0ml前培養物を使用して、50ml発酵培地に接種し、そして30℃、280rpmで、96時間増殖させた。次いで、これらの50ml培養物を7,000gで10分間遠心分離した。上清を16,000gで20分間、再遠心分離した。ECBデアシラーゼ変異体酵素を含む上清を-20℃で保存した。陽性変異体由来の上清を、10kDの分子量カットオフを有するAmicon濾過ユニットを用いてそれらの最初の容量の1/30までさらに濃縮させた。得られた酵素サンプルを、等容量の50mM KH₂PO₄(pH6.0)緩衝液で希釈し、そして1.0mlをHi-Trapイオン交換カラムに適用した。結合緩衝液は、50mM KH₂PO₄(pH6.0)および1.0M NaC lであった。０から1.0M NaClの直線勾配を、2.7ml/分の流速を用いて８カラム容量で適用した。ECBデアシラーゼ変異体画分は0.3M NaClで溶出し、そして濃縮され、そしてAmicon Centricon-10ユニットにおいて50mM KH₂PO₄(pH6.0)に緩衝液交換された。酵素純度をSDS-PAGEにより確かめ、そして濃度をBio-Radタンパク質アッセイを用いて決定した。ECB デアシラーゼ変異体の比活性アッセイ 4.0μｇの各精製ECBデアシラーゼ変異体を、0.1M NaAc（pH5.5）、10％(v/v)M eOH、および200μｇ/mlのECB基質の存在下での30℃で０〜60分間の活性アッセイのために使用した。20μｌの各反応混合物を、PolyLCポリヒドロキシエチルアスパルタミドカラム（4.6×100mm）にロードし、そして2.2ml/分の流速のアセトニトリル勾配により溶出した。反応産物を225nmでモニターし、そしてIBM PCデータ補足システムに記録した。ECB核ピークを数的に統合し、そしてこれを使用して各変異体の比活性を計算した。図10に示されるように、このランダムプライミングに基づく技術の野生型ECB デアシラーゼ遺伝子に対する１回のみの適用後に、2,012の最初の形質転換体から１つの変異体（M16）が、野生型酵素の2.4倍の比活性を有することが見出された。図11は、M16の活性が広いpH範囲にわたって野生型酵素のものと比較して増大されたことを示す。実施例７ランダム配列プライマー組換え法を使用する熱安定性Bacillus subtilisサブチリシンEの改良本実施例は、プライマーに基づく組換えのための種々のDNAポリメラーゼの使用を実証する。さらに、組換えによるサブチリシンEの安定化を実証する。実施例１に記載されている２つの熱安定サブチリシンE改変体をコードする、遺伝子R1およびR2を、組換えのための鋳型として選択した。 (1)標的遺伝子の調製サブチリシンE熱安定性変異体遺伝子R1およびR2（図１１）を、ランダムプライムDNA合成に供した。サブチリシンEプロ配列の45nt、全成熟配列、および停止コドン後の113ntを含有する986-bpフラグメントを、Bam H1およびNde 1でのプラスミドpBE3の二重消化により得、そしてWizard PCR Prepキット（Promega，Madi son，WI）を使用して、0.8%アガロースゲルから精製した。次の変性工程のためにDNAを直鎖状にすることが必要であった。ゲル精製もまた、DNAから制限エンドヌクレアーゼ緩衝液を除去するために必須であった。なぜなら、Ma²⁺イオンが次の工程でDNAを変性するのを困難にするからである。 (2)ランダムプライムDNA合成ランダムプライムDNA合成を使用して、変性直鎖状化二本鎖DNAから短いDNAフラグメントを生成させた。モル過剰のプライマーと混合した、精製B．subtilis サブチリシンE変異体遺伝子を、煮沸して変性し、次いで、合成を、以下のDNAポリメラーゼの１つを使用して実施した：E．coli DNAプリメラーゼIのクレノウフラグメント、バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ、およびT7シークエナーゼ (sequenase)バージョン2.0 DNAポリメラーゼ。その適切な実施条件（29）で、バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼは、クレノウフラグメントで行ったのと類似の合成結果を与える。T7シークエナーゼ型 2.0 DNAポリメラーゼ（31、32）を使用する場合には、合成DNAフラグメントの長さは通常はより長い。いくらかのMnCl₂が、合成フラグメントの長さを50〜400塩基以内に制御するために、合成時に含有されなければならない。短い新生DNAフラグメントもまた、Taq DNAポリメラーまたはPfu DNAポリメラーゼのStoffelフラグメントを使用するPCRによって生成され得る。重要な考慮は、短いランダムプライマーが鋳型にアニールし得、そしてより高温で十分なDNA 増幅を与え得ることを確実にする、日常的な実験によって反応条件を同定することである。本発明者らは、dp(N)₁₂と同じ短さのランダムプライマーが、フラグメントを生成するためにPCRに使用され得ることを見出した。２．１クレノウフラグメントによるランダムプライムDNA合成 E．coli DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントは、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠失し、その結果ランダムプライム産物が、プライマー伸長のみによって合成され、そしてエキソヌクレアーゼによって分解されない。反応は、pH6. 6で実施され、そこでは、酵素の3'→5'エキソヌクレアーゼ活性が非常に減退される（36）。これらの条件は、合成のランダムな開始に有利である。１．H₂Oに溶解されたR1 DNAの200ng（約0.7pmol）および等量のR2 DNAを、dp(N)₆ ランダムプライマー13.25μg（約6.7nmol）と混合した。沸騰水中に５分間た後に、混合物をすぐに氷／エタノール浴中に置いた。ランダムプライム産物の大きさは、プライマー濃度の逆関数である（30）。高濃度プライマーの存在は、立体障害を導くと考えられる。本明細書中に記載される反応条件下で、ランダムプライム産物は、アガロースゲル電気泳動によって測定されるように、約50〜500bpである。２．10μｌの10×反応緩衝液（10×緩衝液：900mM HEPES、pH6.6；0.1M塩化マグネシウム、20mMジチオトレイトール、ならびにdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP各 5mM）を変性試料に加え、反応混合物の総容量をH₂Oで95μｌにした。３．E．coli DNAポリメラーゼI（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）のクレノウフラグメントの10ユニット（約5μｌ）を加えた。チューブの外側を静かに叩いて全成分を混合し、そして微小遠心器中で1〜2秒間、12,000gで遠心分離して、全液体を底の方へ移動させた。反応は、22℃で３時間実施した。伸長速度は、鋳型および４ヌクレオチド前駆体の濃度に依存する。反応は、エキソヌクレアーゼ消化を最小にする条件下で実施されたので、新たに合成された産物は、検出可能な程度に分解されなかった。４．22℃での３時間後に、反応を、試料を氷上で０℃に冷却して停止した。氷冷 H₂O 100μｌを反応混合物に加えた。５．ランダムプライム産物を、全反応混合物を、Microcon-100フィルター（Amic on，Beverly MA）（鋳型およびタンパク質を除去するため）およびMicrocon-10 フィルター（40塩基未満のプライマーおよびフラグメントを排除するため）に連続して通過させて精製した。保持画分（容量約65μｌ）を、Microcon-10から回収した。所望のランダムプライム産物を含有するこの画分を、全遺伝子の再組み立てにおいて新たにMicrocon-10をさらに使用して、PCR反応緩衝液に対して緩衝液交換した。２．２バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼによるランダムプライムDNA合成バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼとE．coli DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントとは、各々5'-3'ポリメラーゼ活性および3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有することにおいて類似している。バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、クレノウフラグメントの活性より200倍を超えて大きい。一本鎖DNA鋳型から短いオリゴヌクレオチドプライマーを置換しないので（23）、変異誘発効率は、クレノウフラグメントとは異なる。１．H₂Oに溶解されたR1 DNAの200ng（約0.7pmol）および等量のR2 DNAを、dp(N)₆ ランダムプライマー13.25μｇ（約6.7nmol）と混合した。沸騰水中に５分間浸した後に、混合物をすぐに氷／エタノール浴中に置いた。高濃度プライマーの存在は、立体障害を導くと考えられる。２．10μｌの10×反応緩衝液（10×緩衝液：500mM Tris-HCl、pH8.8；150mM(NH₄ )₂SO₄、70mM塩化マグネシウム、100mM 2-メルカプトエタノール、0.2mg/ml ウシ血清アルブミン、ならびにdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP各2mM）を変性試料に加え、反応混合物の総容量をH₂Oで90μｌにした。３．T4 DNAポリメラーゼI（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）の10ユニット（約10μｌ）を加えた。チューブの外側を静かに叩いて、全成分を混合し、そして微小遠心器中で１〜２分間、12,000gで遠心分離して、全液体を底の方ヘ移動させた。反応は、37℃で30分間実施した。本明細書中に記載される反応条件下で、ランダムプライム産物は、約50〜500bpである。４．37℃での30分後に、反応を、試料を氷上で０℃に冷却して停止した。100μ ｌの氷冷H₂Oを反応混合物に加えた。５．ランダムプラム産物を、全反応混合物を、Microcon-100フィルター（鋳型およびタンパク質を除去するため）およびMicrocon-10フィルター（40塩基未満のプライマーおよびフラグメントを排除するため）に連続して通過させて精製した。保持画分（容量約65μｌ）を、Microcon-10から回収した。所望のランダムプライム産物を含有するこの画分を、全遺伝子の再組み立てにおいて、新たなMicr ocon-10をさらに使用して、PCR反応緩衝液に対して緩衝液交換した。２．３T7シークエナーゼv2.0 DNAポリメラーゼによるランダムプライムDNA合成 T7シークエナーゼv2.0 DNAポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性を欠如し、そして高度にプロセス性(processive)であるので、合成されたDNAの平均の長さは、クレノウフラグメントまたはT4DNAポリメラーゼにより合成されるDNAの長さより長い。しかし、反応物中の適量のMnCl₂の存在下で、合成されるフラグメントの大きさは400bp未満に制御され得る。１．H₂Oに溶解されたR1 DNAの200ng（約0.7pmol）および等量のR2 DNAを、dp(N)₆ ランダムプライマー13.25μｇ（約6.7nmol）と混合した。煮沸水中に５分間浸した後に、混合物をただちに氷／エタノール浴中に移した。高濃度プライマーの存在は、立体障害を導くと考えられる。２．10μｌの10×反応緩衝液（10×緩衝液：400mM Tris-HCl、pH7.5；200mM塩化マグネシウム、500mM NaCl、３mM MnCl₂、ならびにdATP、dCTP、dGTP、およびdT TP各3mM）を変性試料に加え、反応混合物の総容量をH₂Oで99.2μｌにした。３．T7シークエナーゼv2.0（Amersham Life Science，Cleveland，Ohio）の10ユニット（約0.8μl）を加えた。チューブの外側を静かに叩いて、全成分を混合し、微小遠心器中で１〜２秒間、12,000gで遠心分離して、全液体を底の方へ移動させた。反応は、22℃で15分間実施した。本明細書中に記載された反応条件下で、ランダムプライム産物は、約50〜400bpである。４．22℃での15分後に、反応を、試料を氷上で０℃に冷却して停止した。100μ ｌの氷冷H₂Oを反応混合物に加えた。５．ランダムプライム産物は、全反応混合物を、Microcon-100フィルター（鋳型およびタンパク質を除去するため）およびMicrocon-10フィルター（プライマーおよび40塩基未満のフラグメントを除去するため）に連続して通過させて、精製した。保持画分（容量約65μｌ）を、Microcon-10から回収した。所望のランダムプライム産物を含有するこの画分を、全遺伝子の再組み立てにおいて、新たな Microcon-10をさらに使用して、PCR反応緩衝液に対して緩衝液交換した。２．４Taq DNAポリメラーゼのStoffelフラグメントを使用するPCRによるランダムプライムDNA合成 E．coli DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントと同様に、Taq DNAポリメラーゼのStoffelフラグメントは、5'から3'のエキソヌクレアーゼ活性を欠如する。それはまたTaq DNAポリメラーゼより熱安定性である。Stoffelフラグメントは、低プロセス性を有し、解離するまでに、プライマーを平均わずか5〜10ヌクレオチド伸長する。その低プロセス性の結果として、それはまた改善した忠実度を有し得る。１．H₂Oに溶解されたR1 DNAの50ng（約0.175pmol）および等量のR2 DNAを、dp(N )₁₂ランダムプライマー6.13μｇ（約1.7nmol）と混合した。２．10μｌの10×反応前混合物（10×反応前混合物：100mM Tris-HCl、pH8.3；3 0mM塩化マグネシウム、100mM KCl、およびdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP各2mM ）を加え、そして反応混合物の総容量をH₂Oで99.0μｌにあげた。３．96℃にて５分間のインキュベーション後に、Taq DNAポリメラーゼ（Perkin- Elmer Corp.，Norwalk，CT）のStoffelフラグメント2.5ユニット（約1.0μｌ）を加えた。DNA Engine PTC-200（MJ Research Inc.，Watertown，MA）装置において、最後のサイクルの伸長工程なしに各々95℃で60秒、55℃で60秒、および72 ℃ で50秒のサーモサイクルを35回実施した。本明細書中に記載されている反応条件下で、ランダムプライム産物は約50〜500bpである。４．反応を、試料を氷上で０℃に冷却して停止した。100μlの氷冷H₂Oを反応混合物に加えた。５．ランダムプライム産物は、全反応混合物を、Microcon-100フィルター（鋳型およびタンパク質を除去するため）およびMicrocon-10フィルター（40塩基未満のプライマーおよびフラグメントを排除するため）に連続して通過させて、精製した。保持画分（容量約65μｌ）を、Microcon-10から取り出した。所望のランダムプライム産物を含有するこの画分を、全遺伝子の再組み立てにおいて、新たなMicrocon-10をさらに使用して、PCR反応緩衝液に対して緩衝液交換した。２.５Pfu DNAポリメラーゼを使用するPCRによるランダムプライムDNA合成 Pfu DNAポリメラーゼは極めて熱安定性であり、そして酵素は、固有の3'から5 'エキソヌクレアーゼ活性を有するが、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有さない。その塩基置換忠実度は、2×10^-6であると評価された。１．H₂Oに溶解されたR1 DNAの50ng（約0.175pmol）および等量のR2 DNAを、dp(N )₁₂ランダムプライマー6.13mg（約1.7nmol）と混合した。２．2×反応前混合物（2×反応前混合物：5倍希釈クローン化Pfu緩衝液（Strata gene，La Jolla，CA）、各dNTPの0.4mM）50μｌを加え、そして反応混合物の総容量をH₂Oで99.0μｌにあげた。３．96℃にて５分間のインキュベーション後に、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratag ene，La Jolla，CA）の2.5ユニット（約1.0μｌ）を加えた。DNA Engine PTC-20 0（MJ Research Inc.，Watertown，MA）装置で、各々95℃で60秒、55℃で60秒、および72℃で50秒、最終サイクルの伸長工程なしに、サーモサイクルを35回実施した。本明細書中に記載されている反応条件下で、主要なランダムプライム産物は約50〜500bpである。４．反応を、試料を氷上で０℃に冷却して停止した。氷冷H₂O 100μｌを反応混合物に加えた。５．ランダムプラム産物は、全反応混合物を、Microcon-100フィルター（鋳型およびタンパク質を除去するため）およびMicrocon-10フィルター（40塩基未満のプライマーおよびフラグメントを排除するため）に連続して通過させて、精製した。保持画分（容量約65μｌ）を、Microcon-10から回収した。所望のランダムプライム産物を含有するこの画分を、全遺伝子の再組み立てにおいて、新たなMi crocon-10をさらに使用して、PCR反応緩衝液に対して緩衝液交換した。 (3)全遺伝子の再組み立て１．PCRによる再組み立てには、Microcon-10からの10μｌのランダムプライムDN Aフラグメント、20μｌの2×PCR前混合物（5倍希釈クローン化Pfu緩衝液、各dNT P 0.5mM、0.1U/μｌクローン化Pfuポリメラーゼ（Stratagene，La Jolla，CA））、15μｌH₂Oを、氷上で混合した。２．96℃にて３分間のインキュベーション後に、DNA Engine PTC-200（MJ Resea rch Inc.，Watertown，MA）装置で、他にミネラルオイルを加えずに、各々95℃ で1.0分、55℃で1.0分、および72℃で1.0分＋5秒／サイクル、最終サイクルの伸長工程を72℃で10分間行って、サーモサイクルを40回実施した。３．20サイクル目、30サイクル目、および40サイクル目に、3μｌのアリコートを反応混合物から取り出し、そしてアガロースゲル電気泳動によって分析した。 40サイクル目での再組み立てPCR産物は、大小のサイズのスメアの中に正確な大きさの産物を含有した。 (4)増幅この第一PCRの正確な再組み立て産物をさらに、鋳型DNAの末端に相補的なPCR プライマーを含有する、第二PCR反応で増幅した。１．2.0μｌのPCR再組み立てアリコートを、100μｌ標準PCR反応での鋳型として使用し、これは、0.3mMのP1（5’CCGAGCGTTGC ATATGTGGAAG 3'）（配列番号15）およびP2（5’CGACTCTAGAGGATCCGATTC 3'）（配列番号16）の各プライマー、1. 5mM MgCl₂、10mM Tris-HCl(pH9.0)、50mM KCl各200mMの4つのdNTP、2.5UのTaqポリメラーゼ（Promega，Madison，WI，USA）、および2.5UのPfuポリメラーゼ（St ratagene，La Jolla，CA）を含有した。２．96℃にて３分間のインキュベーション後に、DNA Engine PTC-200（MJ Resea rch Inc.，Watertown，MA）装置で、他にミネラルオイルを加えずに、各々95℃ で60秒、55℃で60秒、および72℃で50秒での、15回サーモサイクルを実施し、後に95℃で60秒、55℃で60秒、および72℃で50秒（+5秒／サイクル）でのさらなる 15回サーモサイクル、最終サイクルの伸長工程を72℃で10分間行った。３．増幅は、正確な大きさのサブチリシンE全遺伝子を含み、多量のPCR産物をもたらした。 (5)クローニング短いDNAフラグメントが５つの異なるDNAポリメラーゼによって生成されたので、最終PCR増幅再組み立て産物の５プールが存在した。各DNAプールを、対応のサブチリシンE変異体ライブラリーを構築するために使用した。１．PCR増幅再組み立て産物を、Wizard DNA-CleanUpキット（Promega，Madison ，WI）によって精製し、Bam HIおよびNde Iで消化し、0.8%アガロースゲルで電気泳動を行った。986-bp産物をゲルから切り出し、そしてWizard PCR Prepキット（Promega，Madison，WI）によって精製した。産物を、pBE3シャトルベクターのBam HI-Nde I消化によって生成したベクターと連結した。２．E．coli HB101コンピテント細胞を、上記の連結混合物で形質転換し、変異体ライブラリーを形成した。このライブラリーからの約4,000形質転換体をプールし、そして組換えプラスミド混合物を、このプールから単離した。３．B subtilis DB428コンピテント細胞を、上記の単離プラスミド混合物で形質転換し、サブチリシンE改変体のもう１つのライブラリーを形成した。４．短い新生DNAフラグメントをランダムプライムするために使用されたDNAポリメラーゼに基づいて、ここで構築された５ライブラリーを命名した：ライブラリー／クレノウ、ライブラリー／T4、ライブラリー／シークエナーゼ、ライブラリー／Stoffel、およびライブラリー／Pfu。各ライブラリーからの約400形質転換体を、ランダムに取り出し、そして熱安定性についてのスクリーニングに供した（工程(7)を参照のこと）。 (6)ランダムクローン配列分析 B．subtilis DB428ライブラリー／クレノウから10のランダムなクローンを、D NA配列分析用に選択した。2mg/mlリゾチームをP1緩衝液に加え、細胞を37℃で５分間インキュベートし、コンピテントE．coli HB 10へ再転換し、そしてQlApr epスピンプラスミドミニプレップキットを使用して再度精製し、分析用品質のDN Aを得る改変を加えてQlAprepスピンプラスミドミニプレップキット（QIAGEN）を使用し、組換えプラスミドをB.subtilis DB428から個々に精製した。配列分析を、Dye Terminator Cycle Sequencingキット（Perkin-Elmer Corp.，Norwalk，CT ）を使用して、ABI 373 DNA Sequencing Systemで実施した。 (7)熱安定性についてのスクリーニング工程(4)に記載されている５ライブラリーの各々からの約400の形質転換体を、スクリーングに供した。スクリーニングは、基質としてスクシニル-Ala-Ala-Pro -Phe-p-ニトロアニリド（配列番号25）を使用して、以前に記載されたアッセイ（33、35）に基づいた。プラスミドライブラリーを含有するB．subtilis DB428 を、LB/カナマイシン（20μｇ/ml）プレート上で増殖させた。37℃で18時間後に、１つのコロニーを、ウェルあたり100μｌ SG/カナマイシン培地を有する96ウェルプレート中に取り出した。これらのプレートを振盪し、37℃で24時間インキュベートし、細胞を飽和状態まで増殖させた。細胞を遠心沈降させ、上清を熱安定性アッセイのために採取した。３つのレプリカ96ウェルアッセイプレートを、各増殖プレートについて複製した。各々のウェルは10mlの上清を含有していた。次に、サブチリシン活性を、100mlの活性アッセイ緩衝液（0.2mMスクシニル-Ala -Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド(配列番号25)、100mM Tris-HCl、10mM CaCl₂、p H8.0、37℃）を加えることにより、測定した。反応速度を、ThermoMaxマイクロプレートリーダー（Molecular Devices，Sunnyvale CA）で、1.0分間にわたって 405nmで測定した。室温で測定された活性を、活性クローンの画分を計算するために使用した（野生型の10%未満の活性を有するクローンを、不活性として得点づけた）。初期活性（Ai）を、各ウェルへ、予め暖めた（37℃）アッセイ溶液（ 0.2mMスクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド(配列番号25)、100mM Tris -HCl、pH8.0、10mM CaCl₂）100μｌを直ちに加えることにより、65℃にて10分間１アッセイプレートをインキュベートした後に測定した。残存活性（Ar）を、40 分間インキュベーション後に測定した。 (8)配列分析スクリーニング後に、ライブラリー／クレノウ由来の400形質転換体中の最も高い熱安定性を示す１つのクローンを、LB/カナマイシン寒天プレートに再度ストリークし、このプレートからの単一クローンをグリセロールストックおよびプラスミド調製用にチューブ培養物に播種した。組換えプラスミドを、QlAprepスピンプラスミドミニプレップキット（QIAGEN）を使用し、2mg/mlリゾチームをP1 緩衝液に加え、細胞を37℃で５分間インキュベートし、コンピテントE．coli HB 101へ再度形質転換し、次いでQlAprepスピンプラスミドミニプレップキットを使用して再度精製し、配列決定品質のDNAを得る、改変方法によって、精製した。配列分析を、Dye Terminator Cycle Sequencingキット（Perkin-Elmer Corp. ，Norwalk，CT）を使用する、ABI 373 DNA配列分析システムで実施した。結果１．ランダム配列組換えに関連する組換え頻度および効率ランダムプライムプロセスを上記のように実施した。そのプロセスを図１に示す。変異体ライブラリー／クレノウ由来の10のクローンをランダムに選択し、配列分析した。図12および表５に要約されているように、全クローンが親遺伝子とは異なっていた。組換えられた遺伝子の親R1およびR2からの特定点変異の発生頻度は、40%から70%の範囲であり、期待値50%付近を変動する。これは、２つの親遺伝子が、ランダムプライマー技術によって、ほぼランダムに組み変えられたことを示す。図12はまた、10変異体全てが、12bpのみ離れてでさえ、組換えまたは切断され得ることを示す。次に、工程(5)で構築された５ライブラリーの各々由来の400のランダムクローンを分析することによって、65℃でのサブチリシン熱不活化率を評価した。１つの96ウェルプレートから得られた熱安定性を、降下順にプロットして図13に示す。約21％のクローンが、N181DおよびN218Sの二重変異を有する変異体に比較して、熱安定性を示した。これは、RC2からのN181D変異およびRClからのN218S変異がランダムに組換えられたことを示す。ライブラリー／クレノウ由来のスクリーニングされた400の形質転換体の中で、最も高い熱安定性を示すクローンの配列分析は、変異がN181DおよびN218Sが存在することを示した。２．ランダムプライムプロセス中に新たに導入される変異の頻度５つのB．subtilis DB428ライブラリーの各々からの約400形質転換体（工程(5 )を参照のこと）を取り出し、96ウェルプレートで、20ug/mlカナマイシンを補充したSG培地中で増殖させ、サブチリシンE活性スクリーニングに曝した。約77〜8 4%のクローンが活性酵素を発現し、一方、おそらく新たに導入された変異の結果として、16〜23%の形質転換体が不活性であった。以前の実験から、本発明者らは、不活化の割合が、遺伝子あたり1または2変異のオーダーで変異割合を示すことを知っている（35）。図12に示されているように、新たな18の点変異が、このプロセスで導入された。この0.18%誤差率は、遺伝子あたり1〜2の新たな点変異に対応し、これは、不活性化曲線から決定された割合である。変異は、遺伝子にそってほぼランダムに分散している。表５ライブラリー／クレノウ由来の10のランダムなクローンにおける DNAおよびアミノ酸残基の置換変異型は表５に示されている。変異方向は明かに非ランダムである。例えば、 Aは、TまたはCのいずれかへの変化よりもGへしばしば変化する。全てのトランスジションおよび特にT-CおよびA-Gは、トランスバージョンよりも生じる。いくつかのヌクレオチドは、その他のものより変異しやすい。１つのG→C、１つのC→G 、および１つのC→Aトランスバージョンが、配列決定された10のクローンに認められた。これらの変異は、サブチリシンの誤り傾向の配列決定PCR変異誘発中にごくまれに発生した（37）。ランダムプライムプロセスは、PCRに基づく点変異誘発より広範囲のアミノ酸置換にアクセス可能であり得る。親R1およびR2中の646〜667位の短い配列5’C GGT ACG CAT GTA GCC GGT ACG 3 ’（配列番号16）が、ランダムクローンC#6中の5’C GGT ACG ATT GCC GCC GGT ACG 3'（配列番号17）に変異したことに注目することは興味深い。このストレッチは、両末端に２つの短い繰り返しを有するので、新たに導入された変異は、点変異のみのプロセスではなくて、スプリップ鎖ミスペアリング（splipped-stran d mispairing）プロセスの結果であり得る。フレームシフトは存在しないので、この種のずれ(slippage)は、ドメイン転換に有用であり得る。３．ランダムプライムプロセスでの異なるDNAポリメラーゼ精度の比較ランダムプライム組換え中に、相同DNA配列はほぼランダムに組換えられ、そして新しい点変異もまた導入される。これらの点変異は、いくつかのインビトロ進化適用に有用な多様性を提供し得るが、特に変異割合がこのように高いときに、それらは、すでに以前に同定された有益な変異の問題がある組換えである。ランダムプライムプロセス中の誤差率を調節することは、この方法をインビトロ進化問題を解決するために首尾よく適用するのに重要である。異なるDNAポリメラーゼを選択し、反応条件を改変することによって、ランダムプライム分子を産生する方法が、異なる誤差率を有する変異体ライブラリーを産生するように調整され得る。 E．coli DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、バクテリオファージT4 D NAポリメラーゼ、T7シークエナーゼバージョン2.0DNAポリメラーゼ、TaqポリメラーゼのStoffelフラグメントおよびPfuポリメラーゼを、新生DNAフラグメント合成についてテストした。得られた５集団の活性プロフィール（工程(5)を参照のこと）は、図13に示されている。これらのプロフィールを得るために、96ウェルプレートスクリーニングアッセイで測定された個々のクローンの活性を、降下順にプロットする。ライブラリー／Stoffelおよびライブラリー／クレノウは、ライブラリー／Pfuよりも、高割合で野生型または不活性サブチリシンEクローンを含有する。５集団全てで、野生型および不活性クローンの割合は、17-30%の範囲である。実施例８一本鎖DNAを組換えるための定義隣接プライマーおよび交互交換的伸長の使用本実施例は、一本鎖DNAの組換えにおける、付着伸長による定義プライマー組換えの使用を実証する。方法の説明一本鎖DNAは、種々の方法によって調製され得、最も容易には、ヘルパーファージを使用するプラスミドからである。現在使用されている多くのベクターは、 M13mp誘導体のような、繊維状ファージから由来する。細胞への形質転換後に、これらのベクターは、新しい二本鎖環およびベクターの二本鎖の１つに由来する一本鎖環の両方を生じ得る。一本鎖環は、ファージ粒子にパッケージングされ、細胞から分泌され、そして培養上清から容易に精製され得る。２つの定義プライマー（例えば、鋳型の5'および3'末端へハイブリダイズする）が、一本鎖遺伝子を組換えるために本発明に使用される。プライマーの１つのみが、最終PCR増幅の前に必要とされる。伸長される組換えプライマーが、付着伸長プロセス（StEp）によって最初に産生される。このプロセスは、変性工程、その後の非常に省略されたアニーリング／伸長工程の繰り返しサイクルからなる。次に、伸長されたフラグメントは、DNAポリメラーゼの存在下で、サーモサイクルによる相同遺伝子組み立て、およびそれに続く遺伝子増幅工程によって、全長遺伝子へ再構築される。交互交換的伸プロセスの進行は、プライマー伸長における、種々の時間点に反応チューブ（100ul開始容量）からアリコート（10ul）を取り出し、アガロースゲル電気泳動によってDNAフラグメントを分離することによってモニターする。有効なプライマー伸長の証拠は、サイクル数の増加に伴う分子量増加のプロセスの初期に、低分子量の「スメア」の出現として観察される。最初の反応条件は、鋳型変性（例えば、94℃で30秒変性）、およびそれに続く、反応サンプリング前に5-20サイクル増大を介して繰り返される、非常に短いアニーリング／伸長工程（例えば、55℃で１秒から15秒）を可能にするように設定される。代表的には、交互交換的伸長の20〜200サイクルが、完全遺伝子長を超える大きさに対応する一本鎖DNA「スメア」の発生に必要とされる。実験設計は実施例１のとおりである。２つの熱安定サブチリシンE変異体R1およびR2遺伝子を、EcoRIおよびBamHIによる制限消化によって、ベクタ−M13mp18 へサブクローニングする。一本鎖DNAは（39）に記載されるように調製する。２つの隣接プライマーに基づく組換え２つの定義プライマー、それぞれに、5'および3'隣接プライマーに対応する、 P5N（5'-CCGAG CGTTG CATAT GTGGA AG-3'(配列番号18)、下線をつけた配列は、N deI制限部位である）およびP3B（5'-CGACT CTAGA GGATC CGATT C-3'(配列番号19 )、下線をつけた配列は、BamHI制限部位である）を、組換えに使用した。条件（ 100ul最終容量）:R1およびR2遺伝子（1:1混合）を含有する0.15pmol一本鎖DNAを鋳型として使用、15pmolの１つの隣接プライマー（P5NまたはP3Bのいずれか）、 1 x Taq緩衝液、0.2mMの各dNTP、1.5mMのMgCl₂、および0.25UのTaqポリメラーゼ。プログラム：95℃で５分、94℃で30秒の80〜200サイクル、55℃で5秒。正しいサイズの一本鎖DNA産物（約1kb）を、電気泳動後に0.8％アガロースゲルから切り出し、QIAEX IIゲル抽出キットを使用して精製する。この精製産物を、従来の PCRによって増幅する。条件（100ul最終容量）：1〜10ngの鋳型、30pmolの各隣接プライマー、1×Taq緩衝液、0.2mMの各dNTP、1.5mMのMgCl₂、および0.25UのTa qポリメラーゼ。プログラム：95℃で５分、20サイクルの94℃で30秒、55℃で30 秒、72℃で１分。PCR産物を精製し、NdeIおよびBamHIで消化し、pBE3シャトルベクターヘサブクローニングする。この遺伝子ライブラリーを、E．coli HB101で増幅し、他に記載されているように(35)、発現およびスクリーニングのために、 B．subtilis DB428コンピテント細胞へ導入する。酵素変異体の熱安定性を、以前に記載された96ウェルプレートフォーマット（33）で測定する。このプロトコールは、親配列からの変異ならびに新規点変異の新規組換えを含有する新規配列の産生をもたらす。スクリーニングは、実施例１のような、親酵素よりも熱安定性である、酵素変異体の同定を可能にする。上記実施例から明白であるように、プライマーに基づく組換えは、広範囲の適用における最適実施のための潜在的に有用な触媒の広大な空間を調査するため、ならびに基本的な構造機能研究のための新規酵素の開発または発展のために使用され得る。本明細書は、DNA依存性DNAポリメラーゼおよび鋳型としての一本鎖DNAを使用して記載しているが、代替プロトコールはまた、鋳型として一本鎖RNAを使用するのに適している。鋳型としての特定のタンパク質mRNA、および触媒としてのRN A依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）を使用することによって、本明細書に記載されている方法は、タンパク質機能を最適化する目的を達成するために、変異を導入し、cDNAクローンに交叉し、mRNAレベルから直接的に分子多様性を作り出すように、改変され得る。これは、新規触媒の発見のためにETS（発現-タグストラテジー）を大いに容易にする。上記に加えて、本発明はまた、真正の細胞内病原体または目的の細胞が増殖され得ないその他の系からのタンパク質をプローブするのに有用である（38）。このように本発明の例示のための実施態様を記載してきたが、開示に含まれるのは例示だけであり、種々の代替、付加、および改変が、本発明の範囲内でなされ得ることは、当業者によって留意されるはずである。従って、本発明は、本明細書に例示されているような特定の実施態様に限定されず、以下の請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号６０／０４６，２５６ (32)優先日平成９年５月12日(1997．5．12) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／９０５，３５９ (32)優先日平成９年８月４日(1997．8．4) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者シャオ，ジーシンアメリカ合衆国カリフォルニア 91106, パサデナ，ナンバー７，エス．ミシガンアベニュー 110 (72)発明者アフホルター，ジョセフエイ. アメリカ合衆国ミシガン 48642，ミッドランド，イー．サンフォードロード 823 (72)発明者ジャオ，フイミンアメリカ合衆国カリフォルニア 91106, パサデナ，コードバストリート 1324 (72)発明者ギバー，ロレインジェイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 91106, パサデナ，ナンバー４，エス．カタリナアベニュー 140

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１つのテンプレートポリヌクレオチドから２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法であって、ここで該変異誘発ポリヌクレオチドは、該テンプレートポリヌクレオチドにおける同じ位置のヌクレオチドと異なる少なくとも１つのヌクレオチドを有し、該方法は以下の工程：ａ）該テンプレートポリヌクレオチドの存在下でランダム配列プライマーまたは定義配列プライマーから酵素触媒DNA重合合成を行い、短いポリヌクレオチドフラグメントおよび該テンプレートポリヌクレオチドを含むDNAプールを形成する工程；ｂ）該ＤＮＡプールを１本鎖フラグメントのプールに変性する工程；ｃ）該１本鎖フラグメントをアニーリング条件下でアニーリングさせて、アニーリングされたフラグメントのプールを形成する工程；ｄ）該２本鎖フラグメントの伸長をもたらし、伸長された１本鎖フラグメントを含むフラグメントプールを形成する条件下で、ポリメラーゼと、該アニーリングされたフラグメントのプールをインキュベートする工程；ｅ）該フラグメントプールが該変異誘発ポリヌクレオチドを含むまで、工程ｂ）からｄ）を反復する工程、を包含する、方法。２．請求項１に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法であって、ここで前記１本鎖フラグメントが相補性領域を有し、そして前記アニーリングされたフラグメントのプールをインキュベートする工程が、該アニーリングされたフラグメントのそれぞれの短いポリヌクレオチド鎖または伸長された短いポリヌクレオチド鎖が互いにプライムして、前記フラグメントプールを形成する条件下で行われる、方法。３．請求項１に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法であって、ここで前記アニーリングされたフラグメントのプールをインキュベートする工程が、前記１本鎖ポリヌクレオチドおよび前記テンプレートポリヌクレオチドのランダム再プライミングを提供するために該テンプレートポリヌクレオチドの存在下で行われる、方法。４．前記プライマーの少なくとも１つが定義配列プライマーである、請求項１に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。５．前記プライマーの少なくとも１つが定義配列プライマーである、請求項２に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。６．前記プライマーの少なくとも１つが定義配列プライマーである、請求項３に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。７．前記プライマーが６〜100ヌクレオチドである、請求項４に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。８．前記プライマーが６〜100ヌクレオチドである、請求項５に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。９．前記プライマーが６〜100ヌクレオチドである、請求項６に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。１０．少なくとも１つの定義末端プライマーが使用される、請求項４に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。１１．少なくとも１つの定義末端プライマーが使用される、請求項５に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。１２．少なくとも１つの定義末端プライマーが使用される、請求項６に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。１３．前記プライマーが、プライマー内の１つ以上のヌクレオチド位置で制限されたランダム性を示す定義配列プライマーである、請求項１に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。１４．前記プライマーが６〜100ヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。１５．前記テンプレートの任意の領域に特異的な２つ以上の定義プライマーが使用される、請求項１３に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。１６．前記プライマーが、プライマー内の30％より多いヌクレオチド位置で制限されたランダム性を示す定義配列プライマーである、請求項１に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。１７．前記プライマーが６〜100ヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。１８．前記テンプレートの任意の領域に特異的な２つ以上の定義プライマーが使用される、請求項１６に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。１９．前記プライマーが、プライマー内の60％より多いヌクレオチド位置で制限されたランダム性を示す定義配列プライマーである、請求項１に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。２０．前記プライマーが６〜100ヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。２１．前記テンプレートの任意の領域に特異的な２つ以上の定義プライマーが使用される、請求項１９に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。２２．前記プライマーがランダム配列プライマーである、請求項１に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。２３．前記プライマーの長さが６〜24ヌクレオチド長である、請求項２２に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。２４．前記テンプレートポリヌクレオチドが、前記短いポリヌクレオチドフラグメントの作製後に前記DNAプールから除去される、請求項２２に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。２５．請求項１に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法であって、該方法は、該変異誘発２本鎖ポリヌクレオチドを前記DNAプールから単離し、そして該変異誘発２本鎖ポリヌクレオチドを増幅するさらなる工程を包含する、方法。２６．前記変異誘発２本鎖ポリヌクレオチドはポリメラーゼ連鎖反応により増幅される、請求項２５に記載の２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを作るための方法。２７．酵素を生成するための方法であって、該方法は以下の工程：ａ）請求項１に従って作られた２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドをベクターに挿入して、発現ベクターを形成する工程であって、該変異誘発ポリヌクレオチドは酵素をコードする、工程；ｂ）宿主細胞を該発現ベクターで形質転換する工程；およびｃ）該変異誘発ポリヌクレオチドによりコードされる該酵素を発現させる工程、を包含する、方法。２８．２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを少なくとも１つのテンプレートポリヌクレオチドから調製するプロセスであって、該変異誘発ポリヌクレオチドは、該テンプレートポリヌクレオチドに対応する位置のヌクレオチドとは異なる少なくとも１つのヌクレオチドを有し、ここで該プロセスは以下の工程：（ａ）酵素触媒ＤＮＡ重合を該テンプレートポリヌクレオチドの存在下でランダム配列プライマーまたは定義配列プライマーから行い、短いポリヌクレオチドフラグメントおよび該テンプレートポリヌクレオチドを含むDNAプールを形成する工程；（ｂ）該ＤＮＡプールを１本鎖フラグメントポリヌクレオチドおよび１本鎖テンプレートポリヌクレオチドの両方のプールに変性する工程；（ｃ）該プールの該１本鎖ポリヌクレオチドをアニーリング条件下でアニーリングさせて、２本鎖のアニーリングされたポリヌクレオチドのプールを形成する工程；（ｄ）該２本鎖ポリヌクレオチドの伸長をもたらし、伸長された２本鎖ポリヌクレオチドを含むDNAプールを形成する条件下で、DNAポリメラーゼと、該アニーリングされたポリヌクレオチドのプールをインキュベートする工程；および（ｅ）該伸長された２本鎖ポリヌクレオチドを含むDNAプールが該変異誘発ポリヌクレオチドを含むまで、工程（ｂ）から（ｄ）を反復する工程、を包含する、プロセス。２９．請求項２８に記載のプロセスであって、１本鎖フラグメントポリヌクレオチドおよび１本鎖テンプレートポリヌクレオチドの該プールが、該プール中の他の１本鎖フラグメントポリヌクレオチドの領域に相補的な領域を有する１本鎖フラグメントポリヌクレオチドを含み、その結果これらのフラグメントポリヌクレオチドが工程（ｃ）において互いにアニーリングし、そして工程（ｄ）において互いにプライムする、プロセス。３０．請求項２８に記載のプロセスであって、前記１本鎖テンプレートポリヌクレオチドは、工程（ｃ）において前記１本鎖フラグメントポリヌクレオチドの少なくともいくつかにアニーリングして、工程（ｄ）において該１本鎖フラグメントポリヌクレオチドのランダム再プライミングを提供する、プロセス。３１．２本鎖変異誘発ポリヌクレオチドを少なくとも２つのテンプレートポリヌクレオチドから調製するプロセスであって、該テンプレートポリヌクレオチドは、互いに異なる第１のテンプレートポリヌクレオチドおよび第２のテンプレートポリヌクレオチドを含み、該変異誘発ポリヌクレオチドは、該第１のテンプレートポリヌクレオチドにおける対応する位置のヌクレオチドとは異なる少なくとも１つのヌクレオチドおよび該第２のテンプレートポリヌクレオチドに対応する位置のヌクレオチドとは異なる少なくとも１つの他のヌクレオチドを有し、ここで該プロセスは以下の工程：（ａ）酵素触媒DNA重合を、標準的なDNA重合条件下または部分的伸長のみをもたらす条件下で、該テンプレートポリヌクレオチド上でランダム配列プライマーの１セットまたは少なくとも１つの定義配列プライマーのいずれかから行い、ポリヌクレオチドフラグメントおよび該テンプレートポリヌクレオチドを含むDNA プールを形成する工程；（ｂ）該ＤＮＡプールを１本鎖フラグメントポリヌクレオチドおよび１本鎖テンプレートポリヌクレオチドの両方のプールに変性する工程；（ｃ）該プールの該１本鎖ポリヌクレオチドをアニーリング条件下でアニーリングさせて、２本鎖のアニーリングされたポリヌクレオチドのプールを形成する工程；（ｄ）該アニーリングされたポリヌクレオチドのプールを、該２本鎖ポリヌクレオチドの全伸長または部分的伸長をもたらす条件下でDNAポリメラーゼとインキュベートして、伸長された２本鎖ポリヌクレオチドを含むDNAプールを形成する工程；および（ｅ）該伸長された２本鎖ポリヌクレオチドを含むDNAプールが該変異誘発ポリヌクレオチドを含むまで、工程（ｂ）から（ｄ）を反復する工程；であって、（１）標準的DNA重合条件が工程（ｂ）において使用されるか、または（２）全伸長が工程（ｄ）における結果である場合、少なくとも１つの定義プライマーが使用される場合、少なくとも１つのこのようなプライマーは非末端プライマーでなければならないという条件を包含する、プロセス。３２．請求項３１に記載のプロセスであって、ここで前記第１のテンプレートポリヌクレオチドが、少なくとも２塩基対で前記第２のテンプレートポリヌクレオチドとは異なる、プロセス。３３．請求項３２に記載のプロセスであって、ここで前記２塩基対が互いから分離されている、プロセス。３４．請求項３３に記載のプロセスであって、ここで前記２塩基対が、少なくとも約15塩基対だけ互いから分離されている、プロセス。