JP2000508627A - 潜在ペプチドならびにそれらの同定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、タンパク質のペプチドが潜在ペプチドであるか否かを決定する方法を提供するものであって、ｉ)一次攻撃誘発において、Ｔ細胞をペプチドに暴露する工程と、ii)該工程ｉの該一次攻撃誘発における該ペプチドと該Ｔ細胞の反応性を測定する工程と、iii)該Ｔ細胞を該タンパク質に暴露して得られる予備攻撃誘発されたＴ細胞を、二次攻撃誘発において該ペプチドに暴露する工程と、iv．該工程iiiの該二次攻撃誘発における該ペプチドと該予備攻撃誘発されたＴ細胞の反応性を測定する工程とを含み、Ｔ細胞反応性が二次攻撃誘発において観察され一次攻撃誘発においては観察されない場合に該ペプチドが潜在ペプチドである方法。

Description

【発明の詳細な説明】 潜在ペプチドならびにそれらの同定方法 本発明は、免疫学的潜在ペプチド、個体および集団でのそれらの同定方法、喘 息およびアレルギー等の病理学的状態の診断および治療におけるそれらの使用、 ならびに治療活性についてのスクリーニングにおけるそれらの使用に関する。 特定の分子に対する反応を引き出させる免疫系の能力は、抗原の存在を認識す る能力に決定的に依存する。従来より、抗原という用語は、Ｂ細胞の誘導により 抗体発生元となる分子の能力と関わりがあるとされていた。しかし、現在は、Ｔ 細胞も抗原を認識する能力を所有することが知られている。Ｔ細胞抗原認識には 、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)の分子に関連して抗原フラグメント(ペプチド )を細胞表面に提示する抗原提示細胞(APC)が必要である。Ｔ細胞は、抗原特異的 受容体(TCR)を用いて、APCによって提示される抗原フラグメントを認識する。こ のような認識は、認識された抗原を根絶する一定の反応を引き起こすための免疫 系に対するトリガーとして作用する。 個体Ｔ細胞を誘発するために、必要最小限の数のTCRが、APCに提示されたペプ チド/MHC複合体と結合されなければならない。このために足りる十分な数の、AP Cの表面に到達するペプチドは、他のトリガーペプチド(triggering peptide)と 比べた場合のＴ細胞活性化を誘発する能力によって「優性(dominant)」または「亜 優性(subdominant)」と称することができる。正常な事象の過程においては(即ち 生理学上は)、任意のタンパク質は、Ｔ細胞反応を誘発することのできるペプチ ドを２つ以上生成する。つまり、「優性」という用語は、最も有力な反応または最 も頻繁な反応を誘発するペプチドに適用される。任意のタンパク質配列において は、優性および亜優性エピトープに加えて、反応を誘発するのに足りる十分な数 でAPC表面に到達しない (Ｔ細胞が特異的な)潜在的なＴ細胞ペプチドエピトープがある。換言すると、 APC内における抗原プロセシングのメカニズムにより、特定のペプチドは分解さ れてＴリンパ球に有効に提示され、そのためＴ細胞反応を刺激するが、他方で他 のペプチドは不完全に分解されてＴリンパ球に提示される。これら後者のペプチ ドは、潜在的に反応性のＴリンパ球を刺激するに足りる十分な数でAPC表面にお いて提示されないため「潜在ペプチドエピトープ(cryptic peptide epitope)」と 称されている。 潜在ペプチドエピトープは、通常体内に存在するタンパク質(自己タンパク質) および非自己(すなわち外来)タンパク質の両方に存在する。正常な生理機能にお いては、潜在エピトープと反応する能力を有するＴ細胞は in vitro一次刺激ア ッセイにおいて検出されない、即ち、血液から単離されたばかりのＴ細胞は潜在 ペプチドと共に培養された場合に明らかな増殖を示さない。対照的に、有効に分 解されてAPCによりＴリンパ球に提示される他のペプチドは、一次培養において 増殖応答を刺激し得る。これらが「優性」および「亜優性」エピトープである。 「アトピー性アレルギー」という用語は、高濃度のイムノグロブリンＥ(IgE)に よって特徴づけられるアレルギー群に適用される。これらには、アレルギー性喘 息、花粉症、慢性(perennial)アレルギー性鼻炎、蕁麻疹(urticaria、hives)お よび湿疹等の種類、アレルギー性結膜炎、並びに特定の食物アレルギー(特に食 物過敏症)が含まれる。このようなアトピー症状の病理発生メカニズムは、抗原/ アレルゲン特異的IgEの合成だけでなく、マスト細胞および好酸球などのエフェ クター細胞の分化および成長を伴う。 アレルギー性IgE仲介疾患は、現在、アレルゲン成分または抽出物の周期的な 注射を伴う脱感作処置によって治療されている。脱感作治療は、アレルゲンに対 してIgEと競合するIgG応答を誘発するか、または、アレルゲンに対するIgEの合 成をブロックする特異的サプレッサーＴ細胞を誘発し得る。この治療形態は、必 ずしも有効ではなく特に一般的な過敏症ショックなどの 重度の副作用を引き起こす危険性がある。これは、すぐに認識して、アドレナリ ンで治療しなければ生死に関わる場合もある。他の外来抗原に対する免疫反応性 を変えることなく、またアレルギー反応自体を誘発することなく、特定のアレル ゲンに対する望ましくないアレルギー性免疫反応を低下または除去する治療処置 が、アレルギーをもつ個体にとって大いに有利となる。 時には、自己および非自己が免疫学的に区別される正常なメカニズムが壊れ、 正常な体組織に存在する自己抗原に対して免疫反応が誘引され得る。この「自己 免疫」は、自己免疫甲状腺炎、リウマチ性関節炎、および紅斑性狼瘡等の病理状 態を発症する。治療養生法は、比較的非特異的かつ多くの望ましくない副作用を 有する抗炎症剤または免疫抑制剤の使用にほぼ制限されている。 WO92/11859は、APCの特異的MHCクラスII分子に結合する非アレルゲン由来の非 刺激性ペプチドを特定のアレルゲンに対するＴ細胞反応を阻害するために使用す る、アレルゲンに対する免疫反応を低下する方法を記載している。 WO91/06571は、ネコアレルギーの診断、治療または予防に使用することのでき るヒトＴ細胞反応性ネコタンパク質に由来するペプチドの開示を主旨としている 。 WO94/24281は、主要ハウスダストダニアレルゲンのペプチドおよび改変ペプチ ドに関する。改変ペプチドは、脱感作治療に伴う望ましくない副作用のレベルを 低下することを目的とする。 G.F．Hoyneらは、Immunology 83、190〜195頁(1994)において、主要アレルゲ ンDerpIをコードするｃＤＮＡから作成したペプチドを用いてハウスダストダニ アレルギーを試験した。彼らは、主要エピトープを含むペプチドが、マウスにお いて全アレルゲンに対する経口寛容を誘導できること、また他のペプチドでも寛 容を誘導できることを示すことを主旨としている。この方法において潜在ペプチ ドが役割を果たすことが示唆されているが、それらの同定方法または治療上の使 用については開示されていない。 上記開示のいずれも、潜在ペプチドが、喘息または他のアレルギー疾患等のア トピー症状の病理において役割を果たし得ることを示唆していない。本発明者ら は、潜在ペプチドの同定方法を見いだし、喘息または他のアレルギーに基づく病 理を有する個体が、一次培養において、関係する病状を起こすアレルゲンに由来 する潜在エピトープにより刺激され得るＴリンパ球集団をもつことを認めた。上 記したように、健康な個体から単離されたＴリンパ球は、一次培養において潜在 エピトープによって刺激されるとは考えられない。自己免疫病理においては、同 様に、免疫系に対して通常潜在性である自己ペプチドが認識されるようになり、 免疫反応を誘出する。 従って、本発明により、タンパク質のペプチドが潜在ペプチドであるか否かを 決定する方法が提供される。該方法は、i)一次攻撃誘発においてＴ細胞をペプチ ドに暴露する工程と、ii)該工程ｉの該一次攻撃誘発における該ペプチドと該Ｔ 細胞の反応性を測定する工程と、iii)Ｔ細胞をタンパク質に暴露して得られる予 備攻撃誘発された(pre-challenged)Ｔ細胞を、二次攻撃誘発においてペプチドに 暴露する工程と、二次攻撃誘発における該ペプチドと該予備攻撃誘発Ｔ細胞の反 応性を測定する工程とを含む。 予備攻撃誘発により、APC表面上の優性および亜優性エピトープの発現のみな らず、全ての潜在決定基の発現が可能になる。その後のこれらの細胞のペプチド 再攻撃誘発により、優性、亜優性および潜在エピトープに対するＴ細胞反応性が 明らかになる。ペプチドでの一次攻撃誘発は、正常に発現された優性および亜優 性エピトープの反応だけを引き出すだろう。従って、ペプチド一次攻撃誘発だけ の後に観察されたペプチドではなくて、全抗原一次攻撃誘発の後のペプチド二次 攻撃誘発の後に観察されうるペプチドが潜在エピトープであると定義される。Ｔ 細胞反応性が上記二次攻撃誘発においては認められるが一次攻撃誘発では認めら れない場合、そのペプチドが潜在ペプチドである。 本発明は、以下のように例示的に説明することができる。Ｔ細胞を含む末 梢血単核細胞(PBMC)を個体から直接採取し、タンパク質由来の重複する合成ペプ チドのセットと共に短時間の間(例えば、３〜７日間)インキュベートした場合、 正常な事象の過程においてＴ細胞が認識するペプチド(即ち優性および亜優性エ ピトープ)に対する増殖応答が見られるだろう。しかし、PBMCが高い用量の全分 子(または全てのペプチドの混合物)と共にまず１〜２週間の間培養された場合、 後続するペプチドでの「二次」攻撃誘発によって、可能性のある優性、亜優性およ び潜在Ｔ細胞エピトープが検出されるだろう。これは、全抗原による高い用量で の「一次」攻撃誘発の結果、いずれかのペプチドに対してなんらかの特異性を有す るＴ細胞集団が誘発され増殖(数が増加)するからである。一次アッセイおよび二 次アッセイにおいてPBMCをペプチドで攻撃誘発することにより、集団中の潜在エ ピトープを同定できる。従って、正常集団において潜在エピトープとして作用す るペプチドを除き、喘息患者または関連する病理を有する個体において優性エピ トープとして作用する全てのペプチドがこの一次および二次アッセイの方法を用 いて検出できる。 本発明の好適な実施態様においては、予備攻撃誘発された細胞は、Ｔ細胞をタ ンパク質に暴露することによって、またはＴ細胞を集団培養(bulk culture)でタ ンパク質に暴露することによって得られる。 Ｔ細胞は、多数の個体(例えば、＞20)を含む集団または一個体から得られるこ とができる。集団から得た場合、健康な個体中において潜在的であると同定され たペプチドはいずれも、一般に集団中でも潜在的であると考えられるが、一方、 一個体から単離されたＴ細胞を用いると、その個体において潜在的である(また は潜在的でない)が集団においては潜在でないかもしれないペプチドしか同定さ れないだろう。 上記方法の工程は、記載したような順序で、または本質的に等価な結果を得る のに適した当業者に知られるそれに代わる順序で実施され得る。 本発明の特に好適な実施態様においては、ペプチドが由来するタンパク質は、 Fel dl(飼育猫Felis domesticusのネコ皮膚および唾液腺アレルゲン- このアミノ酸配列はWO 91/06571に開示されている)、Der pI、Der pII、Der fI またはDer fII(ハウスダストダニのヒョウヒダニに由来する主要タンパク質アレ ルゲン-これらのアミノ酸配列はWO 94/24281に開示されている)、並びに、草、 木、雑草(ブタクサを含む)花粉、菌類およびカビ、食物(例えば、魚、貝類、カ ニ、ウミザリガニ、ピーナッツ、ナッツ、卵、および牛乳)、刺毛昆虫(例えば、 ミツバチ(bee)、ジガバチ(wasp)、スズメバチ(hornet))およびユスリカ(非ヌカ カ(non-biting midges))、クモおよびダニ、イヌ、ウマ、ラット、モルモット、 マウス、およびアレチネズミ等の哺乳動物、ラテックス、生物学的洗浄添加剤、 薬剤(例えば、ペニシリン、他の抗生物質および麻酔剤)のいずれかに存在するア レルゲンを含む一覧より選択される。 特に、ペプチドが由来し得る昆虫タンパク質は、イエバエ、ミバエ、羊クロバ エまたはニクバエ(sheep blow fly)、ラセンウジバエ、穀類ゾウムシ(grain wee vel)、蚕、ミツバチ、非ヌカカの幼虫、ハチミツガの幼虫、コメノゴミムシダマ シの幼虫、ゴキブリ、およびテニブリオ・モリター(Tenibrio molitor)甲虫の幼 虫を含む一覧より選択し得る。これらは全て、職場で起きるアレルギー問題に特 に関連する昆虫アレルゲンである。 本発明の方法で使用するのに特に好適なペプチドには、図１、図２および図３ に示すペプチドが含まれる。本方法はまた、配列番号25〜56のいずれか１つに示 されるペプチドを使用し得る。本発明はまた、これらのペプチドを潜在ペプチド として使用することを包含する。 本発明のさらなる態様は、本発明の方法によりスクリーニングされた場合に潜 在的であると同定された全てのペプチドである。 MHCクラスII分子に結合する能力を保持するペプチドは、最高約40、好ましく は31の残基を有し得る。つまり、有用なペプチドは配列番号２〜10および12〜56 のいずれか１つに示される配列を含み得ることが理解されるであろう。従って、 好適な実施例の１つにおいては、連続する14merの配列は、 さらに大きいペプチドの１部(好ましくは最高約31の残基)を構成する。この実施 例においては、14merは、前記大きいペプチド(またはポリペプチド)の約45％を 構成する。好ましくは、この配列は前記大きいペプチドの約50％以上、より好ま しくは約60％以上、さらに好ましくは約70％以上、または約80％以上を構成する 。特に好適な実施態様において、この配列は、前記大きい配列の約90％または約 95％以上を構成する。 また、本発明の更なる態様は、医薬または診断薬として使用される好ましくは 本発明の方法によってスクリーニングされた潜在ペプチドである本発明のペプチ ド、好ましくは本発明の方法によってスクリーニングされた潜在ペプチドである 本発明のペプチドの喘息などのアトピー症状の治療医薬の製造における使用、好 ましくは本発明の方法によってスクリーニングされた潜在ペプチドである本発明 のペプチドの喘息などのアトピー症状の診断のための診断薬の製造における使用 、好ましくは本発明の方法によってスクリーニングされた潜在ペプチドである本 発明のペプチドを、適切な担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む医 薬または診断薬の製造方法、そのような使用および方法から製造された組成物、 好ましくは潜在ペプチドである本発明のペプチドを用いてヒトの身体に対して実 施される治療および/または診断の方法を含む。 本発明のペプチドは未加工のペプチド(raw peptide)として投与することが可 能であるが、それらを医薬組成物として提供することが好ましい。更なる態様に よれば、本発明は、潜在ペプチドと、それの医薬的に許容可能な１つ以上の担体 と、任意に１つ以上の他の治療成分とを含む医薬組成物を提供する。担体は、該 組成物の他の成分と適合しうるという意昧で「許容可能」であり、その受容者に対 して有害でないことが必要である。 前記組成物には、経口(特に吸入)および非経口(皮下、経皮、皮内、筋内、静 脈内、および直腸を含む)投与に適したものが含まれるが、最も適切な経路は例 えば受容者の症状および障害に依存し得る。組成物は、都合よく単位 用量形態で提供されてもよいし、製薬分野の当業者に周知のあらゆる方法で製造 され得る。全ての方法は、本明細書において定義される本発明の化合物あるいは 薬理学的に受容可能なその塩または溶媒化合物(「有効成分」)を、１つ以上の補助 成分を構成する担体と組み合わせる工程を含む。 経口投与に適した本発明の組成物は、それぞれが所定量の有効成分を含むカプ セル、カシエ剤、または錠剤などの別個単位、粉末または顆粒、溶液または水性 液体もしくは非水性液体の懸濁液、あるいは水中油型液体乳濁液または油中水型 液体乳濁液として提供され得る。有効成分はまた、丸薬(bolus)、舐剤、または パスタとして提供され得る。吸入のための組成物は、有効であることが知られて いるあらゆる手法(例えば、計量用量吸入器(metered dose inhalers))で提供さ れ得る。 非経口投与のための組成物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、対象とする受容 者の血液と等張にする溶質を含有し得る水溶性および非水溶性滅菌注射溶液、並 びに、懸濁剤および増量剤を含み得る水溶液および非水溶液滅菌懸濁液を含有す る。組成物は、例えば、封止されたアンプルおよび水薬瓶等の単回用量または多 数回用量容器に入れられて提供されてもよく、また使用直前に例えば注射用水(w ater-for-injection)等の滅菌液体担体を加えるだけでよい凍結乾燥された状態 で保存されてもよい。即席の注射溶液および懸濁剤は、先に記載したような種類 の滅菌粉末、顆粒および錠剤から製造し得る。 直腸投与のための組成物は、カカオ脂またはポリエチレングリコール等の通常 の担体と一緒にされて座薬として提供され得る。 好ましい単位用量組成物は、有効成分を、以下に説明するような有効な用量、 またはその適切な割合で含む。 本発明の化合物は、典型的に１日あたり0.001〜1mg/kgの用量を経口的にまた は注射によって投与され得る。 本発明はまた、本発明の潜在ペプチドを含む診断キットを提供する。各キット は、本発明の方法によって同定された潜在ペプチドに対応する凍結乾燥 されたペプチドを含む微量培養プレートからなる。各ペプチドは、(統計的な評 価のために)最低３つのウェルにおいて存在し得る。スクリーニングされるペプ チドの数によって更に多くの複製体(replicates)を用いることができる。凍結乾 燥されたペプチドを用いることにより、キットを使用前に室温にて数ケ月保存す ることができる。 アッセイを実施するための好適な実施態様によれば、末梢血単核細胞(PBMC)を 標準方法によって患者の血液から単離し得る。約20mlの血液が必要となる。微量 培養プレートのウェルの10⁵細胞を含む200μlの容量の培地中にPBMCを添加する 。空気中５％のCO₂ガスで処理された加湿インキュベータ中で37℃にて６日間培 養した後、³Ｈ-チミジン等の同位体標識、またはブロモデオキシウリジン等の非 同位体標識を各ウェルに所定の時間(約12〜24時間)添加する。存在するペプチド に対する細胞増殖は、あらゆる適切な手法(例えば、ＤＮＡ合成分析、液体シン チレーション分光分析または比色定量)によってアッセイすることができる。 本発明によるペプチド攻撃誘発に対する細胞反応性の測定は、上記したように 細胞増殖の測定によって実施されることが好ましい。しかし、そのような反応性 はまた、他の細胞反応性、例えばアレルギー反応を示す放出プロフィールを示し 得るサイトカインおよびケモカイン(chemokines)等の可溶性仲介物の放出につい てのアッセイ、を測定することにより測定され得る。 ペプチド免疫治療の望ましくない特定の副作用を回避しおよび/またはその効 果を向上するために、治療に使用される本発明の潜在ペプチドを点突然変異させ てもよい。 ペプチド免疫治療は、特異的Ｔ細胞を無能にするペプチドの投与を伴う。Alle rvax Catの治験から得たデータ[J．Allergy Clin．Immunol．1996年1月、要約、 815]は、一部の患者において、投与されたペプチドに対する後期(late-phase)応 答が生じることを示している。この反応は本質的には喘息発作であり、この種の 治療の重度な副作用の代表的なものである。「改変ペプ チドリガンド」の使用によって、後期応答を発症することなく、同じ治療目的(即 ち、反応性Ｔ細胞の機能的消失)が達成され得る。治療上の使用のための潜在ペ プチドを同定した後、密接に関連したペプチドのパネルを作るために残基に対し て一連の点突然変異を行い得る。これらは、a)元のペプチドと同様の親和性を有 して適切なMHC分子に結合する能力、およびb)元のペプチドに対して特異的なＴ 細胞をアネルギーにする(anergise)もしくは死滅させる能力についてスクリーニ ングされ得る。このような改変または合成ペプチドもまた本発明に包含される。 本発明による特に好適な合成ペプチド、また本発明により使用される特に好適 な合成ペプチドには、図３に示すペプチドが含まれる。このようなペプチドは、 本発明により個別にまたは対や複数に組み合わされて使用し得る。 予備攻撃誘発されたＴ細胞は、上記したように生成され得るか、または、１つ の代替としてはＴ細胞を目的とするタンパク質に由来する複数のペプチドもしく は集団培養に暴露することによって生成され得る。 本発明による特に好適な実施態様において、タンパク質のペプチドが潜在ペプ チドであるか否かを決定する方法は以下のように実施され得る。確立された技術 を利用してＴ細胞を末梢血液から単離する[Cellular Immunology LabFax.，P.J ．Delves(Ed)，1994，Tissue and Cell Culture、第４章、45頁、Blackwell Sci entific Publications]。細胞の一部をin vitroにて目的とするタンパク質と６ 〜12日間培養する。残りの細胞を、培養に小分けし、タンパク質に由来する目的 とするペプチドとインキュベートする。３〜６日後、培養中のＤＮＡ合成の量を 一定時間後に(例えば、８〜16時間後に)定量し得ることを可能にする標識を培養 に添加する。培養中のＤＮＡの量を、ペプチドを含まない対照培養と比較して分 析することにより、この「一次」攻撃誘発においてＴ細胞を刺激するタンパク質に 由来するペプチド配列を同定することが可能になる。全タンパク質と共に６〜12 日間の間培養した細胞群をこの培養の終了後に回収し、培地中で数回洗浄した。 ただし、 これらの細胞は、初めに全タンパク質と共に培養されたため(即ち、「予備攻撃誘 発」されたため)、後続するペプチド攻撃誘発は「二次」攻撃誘発と称する。二次攻 撃誘発におけるＤＮＡ合成の量についての後の分析では、個体内のＴ細胞によっ て認識される可能性のあるタンパク質に由来する「全ての」ペプチドを同定する。 要約すると、一次培養は疾患のある個体または疾患のない個体に由来するＴリ ンパ球により認識されたペプチドを同定し、二次培養は疾患のある個体または疾 患のない個体においてＴ細胞が反応し得る全てのペプチドを同定する。集団レベ ルにおいて潜在的なエピトープは、一次培養において、疾患のある個体には認識 されるが疾患のない個体には認識されない。 本発明によるＴ細胞は、ペプチド攻撃誘発における反応性を検出できるのに十 分な純度でＴリンパ球を含む１人以上の個体から得られる単核細胞の調製物とし て採取することができる。上記した全ての技術的方法は、その方法の所望の目的 を達成可能にするために当業者に公知の他の代替方法によって実施してもよい。 本発明の更なる実施態様において、特にアトピー症状、より特定すると喘息に 対する治療活性を所有する化合物を同定するための化合物スクリーニング(compo und screen)における潜在ペプチドの使用が提供される。本発明のこの更なる実 施態様においては、潜在ペプチドは、好ましくは本発明の方法を用いて同定され たものである。 本発明の更なる実施態様によれば、治療化合物を同定するためのスクリーニン グ方法、並びにこのようなスクリーニング方法を実施するのに適したキットが提 供される。本発明のスクリーニング方法は、好ましくはin vitroで実施するが、 in vivoで実施してもよい。好適な実施態様において、本発明のスクリーニング 方法は、in vitroで以下のように実施し得る。単離された末梢血単核細胞または 培養されたＴリンパ球をin vitroにて、好ましくはこれらの細胞において増殖お よび/または他の反応を誘発するのに最適 となるように予め決定された濃度の１つ以上の潜在ペプチドと共に培養する。潜 在ペプチドに対するこれらの細胞の増殖応答を低下する可能性についてスクリー ニングされる化合物を特定の培養ウェルに添加する。このような化合物は、好ま しくは、様々な広範囲の濃度の培養に添加する。例えば、細胞の増殖応答の最大 の低下をもたらす用量を確定するために、化合物を10^-12M〜10^-2Mの範囲で10倍 希釈で培養に添加し得る。細胞増殖は、当該分野において公知のあらゆる技術を 用いて測定することができる。例えば、トリチウム化されたチミジン等の化合物 で細胞を標識化すると、ＤＮＡ合成即ち細胞増殖の定量が可能になり得る。潜在 ペプチドによって誘発された細胞増殖を低下させることができる化合物は、その 潜在ペプチドに関連する医学的症状に対する治療薬であると同定することができ る。in vivoで実施された場合、スクリーニング方法は、潜在ペプチドを好まし くはヒト哺乳動物へ投与してその潜在ペプチドに関連する症状を誘発し、好まし くはそれに続いてスクリーニングされる化合物を投与することを含む。誘発され た症状に関わる症候を緩和できる化合物は、その症状に対する治療薬であると同 定することができる。 好ましくは、in vitroにしろin vivoにしろ、スクリーニングは、喘息等のア トピー症状に関わる潜在ペプチドを使用すること、そして最も好ましくは本明細 書において同定される１つ以上のFClPペプチドを使用することを含む。 以下に、本発明の限定を意図しない実施例を添付の図面を参照しながら記載す る。図面において、 図１は、一文字表記のアミノ酸コードで表した主要ネコアレルゲンFel dIの鎖 １の天然配列、およびそれに由来する９個のペプチドを示す。 図２は、一文字表記のアミノ酸コードで表した主要ネコアレルゲンFel dIの鎖 ２の天然配列、およびそれに由来する11個のペプチドを示す。 図３は、Fel dIの配列に由来する３個の合成ペプチドを示す。３個のペプ チドは集合的にFClPと称する。 図４は、PBMCについて実施例に記載する、FClPでのPBMCの一次および二次攻撃 誘発に反応した細胞増殖レベル(Δcpmとして表示)についての実施例２の結果を 示す。 図５は、実施例に記載する、FClPでのPBMCの一次攻撃誘発に反応した細胞増殖 レベル(Δcpmとして表示)についての実施例３の結果を示す。 図６は、実施例に記載する要因の結果として、時間の経過に対する喘息患者の 肺機能(リットル毎のFEV₁して表示)についての実施例４の結果を示す。 図７は、デキサメタゾンおよびフルチカゾン(fluticazone)による、FClPペプ チドに対するＴ細胞増殖の阻害(トリチウム化されたチミジンの取り込み反応に より測定)についての実施例５の結果を示す。 実施例１ タンパク質のペプチドが潜在ペプチドか否かを決定する方法は、以下のように 実施され得る。 １-Ｔ細胞を末梢血液から単離する。 ２-細胞の一部をin vitroにて目的のタンパク質と共に６〜12日間培養する。 ３-残りの細胞を培養に小分けし、タンパク質に由来する目的とするペプチド とインキュベートする。 ４-３〜６日後、培養に標識を添加し、培養中のＤＮＡ合成量を定量すること を可能にする。 ５-培養中のＤＮＡ合成の量を、ペプチドを含まない対照培養と比較して分析 する。これにより、この「一次」攻撃誘発においてＴ細胞を刺激するタンパク質由 来のペプチド配列を同定する。 ６-全タンパク質と共に６〜12日間培養した細胞群を、この培養終了後 に回収し、培地中で数回洗浄する。 ７-二次攻撃誘発におけるＤＮＡ合成量を分析することによって、個体内のＴ 細胞により認識され得るタンパク質に由来する「全ての」ペプチドを同定する。 上記方法により同定した潜在ペプチドは、二次攻撃誘発においてＴ細胞反応性 を刺激するが、一次攻撃誘発においては刺激しないものである。 実施例２ 末梢血単核細胞を密度勾配遠心法によって単離した。細胞の一部を一次培養に おいてペプチドで攻撃誘発し、残りの細胞を100μg/mlネコ鱗屑抽出物 (Fel dIを含有)と共に10日間培養した。その後、ネコ鱗屑と共に培養した細胞を 回収し、培地中で洗浄し、更に(本明細書の図３に示すように)全体でFClPを構成 する３個のペプチド(濃度36μg/ml)、並びに、同数の照射された自己由来の支持 細胞と共に３日間培養した。細胞増殖(Δcpmとして表示)を、新たに合成したＤ ＮＡへのトリチウム化されたチミジンの取り込み反応により測定することにより 定量した。これは、図４に図示する。 実施例３ 新しく単離した末梢血単核細胞を、細胞増殖を測定するために、トリチウム化 されたチミジンで標識する前に、１ウェル当たり10⁵細胞で６日間培養した。ネ コアレルギー喘息患者(CAA)は、非ネコアレルギー喘息患者(NCA)よりも、FClP(3 6μm/ml)に対してより高い一次増殖応答を示した。結果を図５に示す。 実施例４ ネコアレルギー喘息をもつボランティアのそれぞれの前腕に対して40μgの高 度に精製したFClPペプチドを皮内注射した。これにより、FClPの投与から約３時 間後に単離された後期喘息反応が誘発された。肺機能(FEV₁として定量)は低下し 、その後数時間の間低いままであった。FEV₁の低下は、８時間目のβ₂アゴニス トの投与、およびコルチコステロイドの吸入により逆 転した。この結果を図６に図式化した。 実施例５ 新しく単離したＴリンパ球を、これらの細胞における増殖および/または他の 反応を誘発するのに最適となるように予め決定された濃度のFClPペプチドと共に in vitroにて培養した。特定の培養ウェルに、グルココルチコステロイドのデキ サメタゾンまたはフルチカゾン(fluticazone)を10^-6Mまたは10^-9Mの希釈で培養 に添加した。培養終了後、トリチウム化されたチミジンで細胞を標識化し、ＤＮ Ａ合成即ち細胞増殖の定量を可能にした。結果を図７に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ラルケ，マーク イギリス国 エスダブリュ３ ６エルワイ ロンドン，ドーブハウス ストリート, ナショナル ハート アンド ラング イ ンスティチュート，インペリアル カレッ ジ スクール オブ メディシン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． タンパク質のペプチドが潜在ペプチドであるか否かを決定するための方法 であって、 ｉ．一次攻撃誘発において、Ｔ細胞をペプチドに暴露する工程と、 ii．該工程ｉの該一次攻撃誘発における該ペプチドと該Ｔ細胞の反応性を測定 する工程と、 iii．該Ｔ細胞を該タンパク質に暴露して得られる予備攻撃誘発されたＴ細胞 を、二次攻撃誘発において該ペプチドに暴露する工程と、 iv．該工程iiiの該二次攻撃誘発における該ペプチドと該予備攻撃誘発された Ｔ細胞の反応性を測定する工程とを含み、 Ｔ細胞反応性が二次攻撃誘発において観察され、一次攻撃誘発においては観察 されない場合に、該ペプチドが潜在ペプチドである、上記方法。 ２．前記工程ｉ〜ivはex vivoで実施される、請求項１に記載の方法。 ３．前記予備攻撃誘発された細胞は、前記Ｔ細胞を前記タンパク質に暴露するこ とにより得られる、請求項１または２に記載の方法。 ４．前記工程iiiの前記予備攻撃誘発されたＴ細胞は、集団培養中でＴ細胞をタ ンパク質に暴露することによって製造される、請求項１〜３のいずれか１項に記 載の方法。 ５．前記工程ｉ〜ivは連続的でない、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。 ６．前記タンパク質が、Fel dI、 Der pI、Der pII、Der fI、およびDer fIIの いずれか１つである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 ７．前記タンパク質が、草、木、雑草花粉、菌類、カビ、食物、昆虫、ユスリカ 、クモ、ダニ、哺乳動物、ラテックス、生物学的洗浄添加剤、および薬剤のいず れか１つに由来するアレルゲンタンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項 に記載の方法。 ８．前記雑草はブタクサであり、前記哺乳動物はイヌ、ネコ、ウマ、ラット、モ ルモット、マウス、またはアレチネズミであり、前記薬剤は抗生物質または麻酔 薬であり、前記昆虫はミツバチ、ジガバチ、スズメバチ、イエバエ、ミバエ、羊 クロバエまたはニクバエ、ラセンウジバエ、穀類ゾウムシ、蚕、ミツバチ、非ヌ カカの幼虫、ハチミツガの幼虫、コメノゴミムシダマシの幼虫、ゴキブリ、また はテニブリオ・モリター(Tenibrio Moliter)甲虫の幼虫である、請求項７に記載 の方法。 ９．請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によってスクリーニングされる場 合の潜在ペプチド。 10．化学または組換えＤＮＡ技術を用いて点突然変異を導入する、請求項９に記 載の潜在ペプチドを改変する方法。 11．請求項10に記載の方法により得られる潜在ペプチド。 12．明細書記載の配列番号１〜56のいずれか１つに記載のペプチド。 13．約45％以上が配列番号２〜10および12〜56のいずれか１つの配列で構成され るペプチド。 14．医薬または診断薬として使用される、請求項９および11〜13のいずれか１項 に記載のペプチド。 15．請求項９および11〜13のいずれか１項に記載のペプチドを適切な担体、希釈 剤、または賦形剤と混合することを含む、医薬または診断薬の製造方法。 16．アトピー症状の治療のための医薬の製造における請求項９および11〜13のい ずれか１項に記載のペプチドの使用。 17．前記アトピー症状が喘息である、請求項16に記載の使用。 18．アトピー症状の診断のための診断薬の製造における請求項９および11〜13の いずれか１項に記載のペプチドの使用。 19．前記アトピー症状が喘息である、請求項18に記載の使用。 20．細胞培養中で潜在ペプチドにより誘発された細胞増殖を低下させる化合物の 能力を測定することを含む、治療活性について該化合物をスクリーニン グする方法。 21．前記細胞培養が末梢血単核細胞またはＴリンパ球を含む、請求項20に記載の 方法。 22．前記ペプチドが１つ以上のFClPペプチドである、請求項20または21に記載の 方法。 23．前記潜在ペプチドは請求項９および11〜13のいずれか１項に記載のものであ る、請求項20または21に記載の方法。 24．前記スクリーニングは喘息治療活性についてのものである、請求項20〜23の いずれか１項に記載の方法。 25．請求項20〜24のいずれか１項に記載の方法により治療活性を所有すると同定 された化合物。 26．請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法、または請求項20〜24のいずれか １項に記載の方法での使用に適合された、潜在ペプチドを含むキット。 27．マイクロタイタープレートと細胞増殖を測定するための手段とを含み、請求 項１〜８のいずれか１項に記載の方法または請求項20〜24のいずれか１項に記載 の方法の実施用に適合されたキット。