JP2000501933A

JP2000501933A - ウイルスベクター

Info

Publication number: JP2000501933A
Application number: JP9521095A
Authority: JP
Inventors: エフスタシオ，ステーシー; ラクマン，ロビン，ヘンリー
Original assignee: ケンブリッジユニバーシティテクニカルサービシズリミティド
Priority date: 1995-12-06
Filing date: 1996-12-06
Publication date: 2000-02-22
Also published as: GB9524973D0; WO1997020935A3; CA2238981A1; AU712793B2; EP0865493A2; AU1102997A; US6193980B1; WO1997020935A2; US20010012516A1

Abstract

(57)【要約】注目の配列の細胞への送達のための構成体は、潜伏関連転写(LAT)領域のヘルペスウイルス潜伏活性プロモーター(LAP) を包含する。内部リボソーム侵人部位（IRES）はLAPの下流に位置し、注目のヌクレオチド配列をIRESの下流に有する。mRNAの細胞質への運び出し及びコードされたポリペプチドの翻訳を包含する、安定な長期間の発現がニューロン及び非−ニューロンの細胞に見い出される。

Description

【発明の詳細な説明】ウイルスベクター本発明は、個体の細胞に当該配列を、たとえば組換えウイルスを用いて送達するための構成体に関する。これは治療目的をもつことがあり、それらを含有する構成体及び細胞の例は、たとえば、次いで所望のように（たとえば免疫原として）用い得る、たとえばペプチドの生産にも有用であることができる。ヘルペス単純ウイルスの潜伏関連転写（latency associated transcript）(LAT)領域の潜伏活性プロモーターを用いることにより、レポーター配列の長期間の高レベルの発現を達成することができる。欠失遺伝子を供給するか、異常な細胞の行動を正すのを助けるために外因性の DNA を細胞に送達することが、しばしば望ましい。本発明は一般に核酸を細胞に送達するのに伴うかもしれないいかなる困難性にも係わらない。多くのウイルスは核酸を細胞の核に送達するように進化し、そこで核酸は発現することができる。あるウイルスは、送達されるべき遺伝子を運ぶように遺伝子的に設計され、ウイルスが普通に感染するような宿主細胞に遺伝子を送達することができる。遺伝子送達ベクターは弱毒化されたまたは遺伝子的に無力にされたウイルスをも基礎とした。多数の遺伝子的に設計されたウイルスがインビトロ及びインビボの両方で細胞に外来遺伝子を送達するのに用いられた。特定の目的のためには、生物学的に活性な量のその産物を長期間生産する安定に発現される遺伝子が望ましい。これは多くの状況で問題を残す。ヘルペス単純ウイルス(HSV)は、多くの細胞型を急性感染可能な人の偏在する病原体であって、宿主の脊髄神経節の知覚神経中に長期間存続することができる。ウイルスの潜伏と呼ばれるこの状態は、いかなる検出可能なウイルスタンパク質の生産、または通常の細胞の代謝の妨害なしで、神経の核内でのウイルスゲノムの存続を特徴とする。神経における潜伏を確立するヘルペス単純ウイルスの能力は、HSV を神経系のための遺伝子送達ベクターの魅力的な候補にする。ウイルスは潜伏の間にいかなる検出可能なタンパク質も生産しないけれども継続するRNA の転写がある。この潜伏と関連する転写はウイルスのゲノムの単独の領域（潜伏と関連する転写またはLAT 領域）から生じ、潜伏活性プロモーター(L AP) により駆動される。LAT プロモーターのコアを構成する、TATAボックス及び基本の転写制御配列は２Kbの主要LAT の約 700bp上流にある。 HSV−１は、ヒトの知覚神経に終生潜伏感染を確立可能であるからCNS 遺伝子治療のための良い候補ベクターと考えられている。潜伏の間ウイルスのゲノムはエピソーム的に維持されているようにみえ、したがって、宿主遺伝子の挿入突然変異または不活性化の危険はないようにみえる。さらに、潜伏の間ウイルスのタンパク質の検出可能な生産はなく、潜伏状態が通常の宿主細胞の代謝を防害する証拠がない。潜伏の間のウイルスの遺伝子の発現は、潜伏ウイルス(LAT) が潜伏する知覚神経に高レベルで蓄積する２または３の核RNA 種に限られるようにみえる（３）。これらの転写は複合プロモーター領域(LAP) により駆動される（４）。機能性の LAT 領域は潜伏の確立に必須ではなく、LAT 領域が欠失してしまったウイルスもなお潜伏を確立することができ（５）、ある場合にはLAT を発現する（６）。実際、LAT 陰性ウイルスは効率的に再活性化しないので、LAT が再活性化に関係するようである（７）。潜伏はいかなるウイルス遺伝子の発現もなく確立でき、生産的な感染が可能でない細胞に入った時にウイルスへの欠場経路(d efault pathway) となるようである。動物モデルにおけるレポーター遺伝子（通常β−ガラクトシダーゼ）の発現を駆動する多様なプロモーターを用いる研究は一時的なレポーター遺伝子の発現を立証したが、これが永続しないことを立証した。これは、LAT 領域及びプロモーター(LAT) のどのような要素が、長期の転写活性を維持するのに関係するかを明らかにしようとするのに多くの研究をもたらした。レポーター遺伝子の長期の発現を容易にするためにLAT 領域におけるLAP 及び他の配列要素を利用することを試みるために、さらに研究がなされた。 LAP のTATAボックスの下流に挿入された兎β−グロブリン遺伝子は潜伏感染の間β−グロブリンRNA を作ったが、野生型感染におけるLAT よりも少ないレベルであった（８）。β−ガラクトシダーゼまたは神経成長因子遺伝子を駆動する外因性LAT プロモーターを用いて実験を繰り返した時、何等のRNA もin situ ハイブリッド形成により検出できなかった（９）。同じグループは、それ以来、LTR，ICP4 に挿入したLacZ構成体及びLAT の５’ 部分の欠損を備えたモロニーマウス白血病ウイルス（Moloney Murine Leukaemia Virus，MMLV）組換え欠損ウイルスを用い、知覚神経節におけるβ−ガラクトシダーゼの発現を立証した（10）。遺伝子の発現は舌下の核の運動ニューロンにおいても評価され、そこでは多量の一時的な発現があった。その結果は、運動ニューロンにおける潜伏の間、MMLV LTRは活性を維持しなかったことを示すことになった。MMLV VTRをウイルスの反復（外因性LAT 配列に近い）から動かし、gC遺伝子座に挿入すると、もはや長期の遺伝子の発現を生産することができなかった。また、LAP の上流領域がLT RのgC遺伝子座上流に挿入されるなら、このウイルスは知覚神経節に遺伝子発現を生産可能である。LAT 配列は、ネズミのメタロチオネインプロモーターの上流に挿入した時、同様な促進効果を有しなかった（11）。他のグループもベクター中のLAT プロモーターを用いた。ウォルフェ他は、GU SB欠失マウスにおける欠失を直す試みにおいて、LAPのLAT 欠失下流に挿入されたβ−グルコロニダーゼ（GUSB）遺伝子を有する組換えウイルスを用いた（12）。角膜感染ルートが用いられ、マウスの症状に表現型の改良はなかったけれども、接種後18週までいくらかのGUSB陽性細胞を検出することができた。ミヤノハラ他は多数の HSV−１ベクターを用いて、マウスの肝臓に遺伝子を送達することを試みた（13）。Hbs Agまたはイヌの因子IXを駆動するLAT プロモーターを用いて、肝臓にベクターを直接注入後、約３週間の間血清中に低レベルのタンパク質を認めた。これらの研究はLAT プロモーターは、CNS 中に、及び非−ニューロンの細胞中においてすら、たとえ低レベルであってでも、外来遺伝子の長い発現を生産することができるかもしれないことを示唆している。ゴイン他の「J．Virol．」68．第2239〜2252頁（1994年）及びWO96/27627号は、HSVI U_Lフランキング反復中に位置し、一時的な遺伝子発現に関係することについて実験により試験された、第２潜伏活性プロモーターの存在を前提とした。 WO96/27672号明細書（本出願のために請求された優先日よりもおそく公開された）（Glorioso及びFink）は、ヘルペスウイルスに潜伏感染された細胞、たとえば末梢ニューロン及び頭部神経節中の非−ヘルペス遺伝子の転写のためのヘルペスウイルスプロモーターの構造に関する。 HSV−１を基礎とするベクターも、溶菌サイクルHSV プロモーター（gC (14)， IE110（15））、強い非−特異的プロモーター(CMVIE MMLV LTR)及びニューロン特異的プロモーター（NSE（16））を用いて構築された。全体として、これらの研究は末梢ニューロン及びCNS ニューロンの両方において、一時的のみの遺伝子の発現を示す。上述のように、MMLV LTRは、長期の発現を示すことができるがLA T 要素の近くに挿入された時だけである。本発明は、今や実験的に、（効率的な翻訳を可能にするために）LAT 領域においてLAP の下流にレポーター遺伝子の前に内部リボソーム侵入部位(internal ri bosomal entry site)を挿入することにより、ウイルスの潜伏の間に安定で高レベルのレポーター遺伝子の発現を与えるベクターを生産することができる。長期間の遺伝子発現を与えるであろうHSV ベクターを構築する最初の試みにおいて、本発明者は、LAT 領域に挿入したマウスRNA ポリメラーゼＩ（RNA pol Ｉ）プロモーターレポーター遺伝子構成体を用いることを決心した。RNA pol ＩはリボソームRNA の転写の原因であり、そしてすべての細胞型に活性である。本来のRNA pol Ｉ転写物はキャップされず、細胞の翻訳装置により認識されないが、レポーター遺伝子のすぐ上流に内部リボソーム侵入部位（IRES）配列を挿入することによりこのような転写物からの効率的な翻訳を得ることが可能である（17）。この構成体を、潜伏の間転写的に活性であることが公知である、HSV のLAT 領域に挿入することにより、本発明者は潜伏感染の間にRNA pol Ｉ活性を証明することを望んだ。実験的研究は下記に詳細に記載されている。予想外の結果が得られた。レポーター構成体がLAT 転写方向に対して逆方向にLAT 領域のHpa Ｉ欠失中に挿入された時、潜伏の間にRNA pol Ｉの活性は検出されなかった。しかしながら、細胞質に運び出された転写物の潜伏発現の間に LAT 領域がLAP 活性を駆動するように修飾されたことを示して、レポーター遺伝子配列のアンチセンス転写が、細胞質中に検出された。（Lachmann，Brown 及び Efstathion「J．Gen．Virol.」77，第2575〜2582頁、1996年）。正しい方向で発現のために同じ部位に挿入された酵素レポーター遺伝子構成体は酵素活性の効率的な長期間の発現を示した。本発明の第１の面によると、（ｉ）ヘルペス単純ウイルス(HSV)ゲノムの潜伏に関連する転写(LAT) 領域の部分であって、潜伏性活性プロモーター(LAP) を含む前記部分、(ii)内部リボソーム侵入部位（IRES）及び(iii)前記ヘルペスウイルスLAT 領域に異種のヌクレオチド配列を含む核酸構成体を提供する。異種ヌクレオチド配列はアミノ酸配列の発現のためにLAP 及びIRESに「操作可能に結合」しているということができる。ヌクレオチド配列（たとえばコード配列）及びプロモーターに関して「操作可能に結合」という用語は、ヌクレオチド配列がプロモーターに対して、ヌクレオチド配列の転写のために、プロモーターの制御下にあるように核酸構成体中に適切に位置するか配列されていることを意味する。ヌクレオチド配列及びIRESに関して、「操作可能に結合」は、ヌクレオチド配列が核酸構成体中でIRESに対して、IRESがその機能を実施する、すなわち、配列のmRNA転写物の翻訳が剌激または促進される（すなわち、ヌクレオチドに操作可能に結合したIRESを欠いている同等な構成体と比較して）のに適切なように位置するか、配列されていることを意味する。長期間の遺伝子発現のために重要なLAT プロモーターの要素はLAT 転写部位の下流に外来のDNA 配列を挿入することにより中断されない。本発明による構成体中の異種配列の転写は、LAT 転写開始部位である。潜伏感染した細胞の細胞質に運び出された転写されたRNA から開始するかもしれない。 IRESは、リボソームの付着及びATG メチオニンコドンからの翻訳を促進するRN A 配列である。自体公知の例はピコルナウイルスによりコードされた配列を包含する。これらは、３つの群、すなわち、エンテロウイルス及びライノウイルスからのIRES配列、カルジオウイルス及びアプトウイルスからのIRES配列並びにＡ型肝炎ウイルスからのIRES配列に分割された。IRES配列は他のウイルス、たとえばＣ型肝炎及び最近、他のいくつかの非ウイルス生物体中にも記載されている。天然のIRES配列の突然変異体、変異体及び誘導体は、翻訳を増強する能力を維持しているなら本発明に用いることができる。 LAP を含むLAT の部分は、たとえば挿入、付加、欠失または置換により、１以上のヌクレオチドの変異または変更を受けさせて天然の配列の突然変異体、変異体または誘導体を提供することができる。当業者はその機能に効果がないかまたは関心のある活性のレベルを調節するのいずれかである核酸分子を変えることが可能であることを理解する。効果がある変更は、たとえば、発現のレベルまたは他のあらゆる所望の性質のレベルを増加させるのに有用であるように活性のレベルを調節することができる。本発明は適切な宿主細胞中で発現が実行可能でありさえすれば、LAT 配列の突然変異体、変異体または誘導体を含む構成体に広がるものと解せねばならない。たとえば核酸構成体の製造、変異誘発配列決定、DNA の細胞への導入及び遺伝子発現並びにタンパク質の分析における、核酸の取り扱いのための多くの公知の技術及びプロトコルは「Molecular Cloning：a Laboratory Manual：第２版」(S ambrook他、1989年、Co ld Spring Harbor Laboratory Press)及び「Molecular Biology,第２版」（Ausu bel 他編、Johon Wiley & Sons，1992年）に詳細に記載されている。サムブルック他及びオースベル他の開示は参考文献により本明細書に組み入れる（すべての参考文献が本明細書に言及されるので）。 IRESは一般にLAP の下流に置かれ、一方異種ヌクレオチド配列はIRESの下流に置かれる。異種ヌクレオチド配列及びIRESはLAT プロモーターの転写開始部位の約 1.5Kb下流に置かれる。本発明者は、特にLAT 領域のHpa Ｉ制限フラグメントの代りにIRES及びコード配列がLAP の下流に挿入されるところでは前記構成体は効率的な、高レベルで長期間の発現を提供するのに用いることができることを見い出した。Hpa Ｉは、HS V−１ゲノムのヌクレオチド120,301の後で、ヌクレオチド 120,469の前で切断する。HSV−１ゲノム配列は「J．Gen．Virol.」69：第2831〜2846頁（Perry 及びMcGeoch)1989年）に示されている。ぺリー及びマクジョーにより提供された配列情報に注目が向けられる（参考文献により本明細書に組み入れる）。LAT プロモーターの境界は位置 117,010〜120,301 の間にあると予想される。それらは 118,439〜120,301 の間にあるかもしれない。このように、本発明の更なる面によると、（ｉ）ヘルペス単純ウイルス(HSV) ゲノムの潜伏関連転写(LAT) 領域の部分であって、潜伏活性プロモーター(LAP) を含む部分及び(ii)LAPの下流でLAT領域のHpa Ｉ制限フラグメントの領域に挿入された異種ヌクレオチド配列を含む核酸構成体を提供する。異種配列をHpa Ｉ制限フラグメントの代りに、または隣接もしくは近くの部位に挿入してもよい。当業者は、本開示により導びかれた及びそうでなければ自体周知の手順を含む実験により、長期間の遺伝子発現を無効にすることなく、本明細書に記載された特異的挿入から可能である変形を容易に決定することができる。用いられるHSV ゲノム領域がHSV−１よりもむしろ HSV−２から由来する場合には、異種ヌクレオチド配列をLAP 転写開始部位から等距離付近または HSV−２配列における同等なゲノム位置に挿入することができる。HSV−１及び HSV−２のプロモーター領域は非常に類似している。Hpa Ｉ挿入部位と同等である、HSV −２における配列の領域にいくらかの相違があっても、本開示により導びかれた及びそうでなければ自体周知の手順を含む実験により、異種配列の挿入のための開示された長期間の遺伝子発現を与える、HSV−２のLAP に関して同等な位置を当業者は容易に決定できる。用語「異種」は、LAT 領域内の特定の位置に通常または本来見い出されないヌクレオチド配列に関して用いられる。したがって、ヘルペス単純ウイルスのLAT 領域における２つのHpa Ｉ制限部位の間に本来見い出されるフラグメント、すなわち、Hpa Ｉ制限フラグメントの配列と異なるあらゆるヌクレオチド配列であることができる。ヘルペスウイルスに関して用いる時、「異種」は、非−ヘルペスウイルス配列または当該特異的ヘルペスウイルスのではない配列に関して用いることができる。可能な代替の用語は「外来の」または「外因性の」を包含する。異種ヌクレオチド配列は、アミノ酸の配列、すなわち、ペプチドまたはポリペプチドをコードし得る。このようなヌクレオチド配列は、上記のように、IRESの下流及び／またはHpa Ｉ制限フラグメントの領域にある本発明の構成体に包含されていてもよい。有利には、アミノ酸の配列は、タンパク質、たとえば、個体の細胞における構成体からの発現が治療効果を有する生物学的に機能性のタンパク質である。代りに、ヌクレオチド配列は、アンチセンス制御により他の遺伝子の発現に影響を及ぼすことができるRNA 分子を転写により生産してもよい。遺伝子発現をダウンレギュレートするアンチセンス遺伝子配列または部分遺伝子配列を用いることは現在定着している。二本鎖DNA は、DNA の「アンチセンス」鎖の転写が、標的遺伝子の「センス」鎖から転写された正常なmRNAに相補性であるRNA を生産するように「逆方向」でプロモーターの制御下に置かれる。相補性のアンチセンス RNA 配列は次にmRNAと結合して二本鎖を形成し、標的遺伝子からの内因性mRNAのタンパク質への翻訳を禁止すると考えられる。これが実際の作用の様式であるかどうかはいまだに確かではない。しかしながら、この技術がうまくいくことは既定の事実である。他の可能性は転写に関するヌクレオチド配列が、特異的部位で核酸を切断することができ、したがって遺伝子発現に影響を及ぼすのにも有用である、リボザイムを生産することである。リボザイムについての背景の参考文献は「Cancer Gen e Therapy」２（３）、第２13〜223 頁（Kashan−Sabet及び Scanlon，1995年）及び「CancerGene Therapy」２（１）、第47〜59頁（Mercola 及び Cohen，1995 年）を包含する。前記異種ヌクレオチド配列、たとえばコード配列に加えて、異種ヌクレオチド配列は、転写及び／または（コード配列のための）転写を増強または改良する１以上の調節要素を含んでよい。更なる面では、本発明は（ａ）ヘルペスウイルスのLAT プロモーター、（ｂ）そのプロモーターの下流に位置する異種ヌクレオチド配列（ポリヌクレオチド）及び（ｃ）ヌクレオチド配列（ｂ）の下流に位置するポリＡ尾をコードするさらなる異種ヌクレオチド配列を包含する核酸構成体を提供する。上記のように、構成体を含有する細胞の核中での転写のためのプロモーターの下流に位置する異種ヌクレオチド配列は、ポリペプチド、アンチセンスRNA 及び／またはリボザイムを包含するいかなる所望の産物をコードしてもよい。本発明の種々の面の好ましい態様では、異種ヌクレオチド配列はコード配列の翻訳を増強するための内部リボソーム侵入部位（IRES）を含む。本発明による構成体を担持する細胞核における転写のためのポリヌクレオチドがアンチセンスまたはリボザイム配列をコードするところでは、リボソーム侵入部位を供給する必要はない。本発明による構成体は長期間の発現のために用い得る。たとえば、発現は少なくとも約26日、好ましくは少なくとも約82日、より好ましくは少なくとも 140日、少なくとも約 190日、少なくとも約 257日または少なくとも、約 307日であり得る。我々は末梢神経系において感染後２５７日で並びに舌下核、顔面神経核及び頸部脊髄を含有する、中枢神経系における感染後９〜10ヶ月までの長期間のニューロンの遺伝子発現を認めた。（表１及び下記実験の部の検討参照。）長期間の遺伝子発現のために重要なLAT プロモーターの要素はLAT 転写部位の下流に外来DNA 配列を挿入することにより中断されない。本発明による構成体における異種配列の転写はLAT 転写開始部位である、潜伏感染した細胞の細胞質に運び出された転写されたRNA から開始することができる。本発明の態様はウイルスの使用、たとえば潜伏感染した細胞において長期間の遺伝子発現を得るための欠損ウイルスの複製を包含する。この点について、その構成体は細胞への導入のためのベクターの部分を形成してもよい。ベクターはプラスミドでよい。ウイルスベクターは、たとえば、HSV ベクターまたはHSV 由来ベクター、たとえば、生産的感染サイクルを開始することができず、したがって、潜伏状態に至らされる突然変異体もしくはニューロン以外の細胞型で潜伏性を確立することができる突然変異体として用い得る。欠損及び／または弱毒化されたウイルスの複製が特定の目的のためには好ましいかもしれない。欠損ヘルペスウイルスの複製は、調節タンパク質ICPO，ICP4，ICP22,ICP27及びICP47 の１以上の機能的な形を欠き、付加的にまたは代りに必須糖タンパク質Ｈ（gH）遺伝子もしくはその機能的な形を欠いてもよい。複製欠損ウイルスの繁殖は相補細胞系を必要とする。ICP4及びICP27 遺伝子欠損の両方を相補し得る細胞系はサマニーゴ他（「J．Virol．」69：第5705〜5715頁、1995年）により構築された。CRＩ細胞はgHをトランスに供給することができる。本発明による構成体は、たとえばgH遺伝子並びに任意にまた、ICP4遺伝子及び ICP27 遺伝子の欠失を含有する複製欠損ウイルスに包含され、そのウイルスを適切な相補する宿主細胞中で繁殖できる。したがって、本発明の更なる面によると、その遺伝子的構造またはゲノムの部分として、開示された構成体を含むウイルスまたはウイルス粒子を供給する。これはその構成体を細胞、たとえば個体の細胞に導入するのに用い得る。本発明による構成体を含む細胞は、本発明の更なる面として、構成体が導入されている細胞を提供する。このような細胞はインビトロの培養中にあって、発現の研究等のために有用であるか、または哺乳動物、特に非−ヒト哺乳動物、たとえば霊長類または齧歯類、たとえばマウスの部分であってもよい。開示された構成体を含む細胞を含んでなるトランスジェニック動物も本発明の面である。特にその構成体の性質及び／または体細胞、たとえばニューロンへの任意の特定のヌクレオチド配列の送達の治療的可能性を研究するために実験的に用いることができる非−ヒト哺乳動物を表わす。本発明による構成体の、たとえばウイルス感染による、細胞への導入を含む方法も本発明により提供される。これは体外（インビトロ）またはインビボで実施し得る。本発明による方法は、構成体の細胞またはその子孫への導入に続いて、たとえば細胞内で、核酸構成体中の異種ヌクレオチドの発現を引き起こしまたは可能とすることを包含する。たとえば、構成体の細胞またはその子孫への導入の結果として、本発明による構成体を含有する細胞を患者に投与することができる。上記導入に続き、細胞は体外で培養または維持され、次いで細胞が得られた（または子孫が得られた）患者または別の患者のいずれかに送達される。細胞が免疫原（たとえば）として用いられるところでは、投与の前に殺すか不活性化することができる。開示された構成体を含む組成物の個体への投与を含む方法も提供される。投与は構成体を含むウイルスベクターを用いる感染によってもよい。裸のDNA 送達も用い得る。デュリング他（参考文献２）によって記載された治療的なウイルスの神経系への定位の注射はヒト及び動物のCNS の特異的領域へ物質を導入するか、またはそこから生検をするための受け入れられ、効率的で広く用いられる手順である。本発明の面による更なる方法は、開示された構成体を含有するヘルペスウイルスの投与を包含する。投与は好ましくは「治療上有効な量」（これは患者に利益を示すのに十分である）である。上記利益は少なくとも１つの症状の少なくとも改良であり得る。投与される実際の量並びに投与の速度及びタイムコースは治療されるものの性質及びひどさに依存するだろう。治療の処方箋、たとえば投与量の決定等は一般開業医及び他の内科医の責任の内にある。組成物は単独で、または他の治療といっしょに、治療されるべき症状に依存して同時または連続的のいずれかで投与し得る。本発明による及び本発明に従う使用のための医薬組成分は、活性成分に加えて、医薬として許容し得る補形剤、担体、緩衝剤、安定化剤または当業者に周知の他の物質を含むことができる。このような物質は非毒性でなければならず、そして活性成分の効能を防害すべきではない。担体または他の物質の正確な性質は、経口または注射、たとえば皮内、皮下もしくは静脈注射によってもよい、投与の経路に依存するだろう。静脈注射、皮内注射、筋肉注射、眼内注射もしくは頭蓋内注射または脳脊髄内への直接注射、胆管への注射または苦痛の部位での注射のために、活性成分は発熱性物質のない、適切なpHで等張性で安定性である非経口的に許容し得る水溶液である。当業者はたとえば等張媒体、たとえば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸塩化（Lactated）リンゲル注射液を用いて適切な溶液を上手に製造することができる。保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／または他の添加剤を所望により用いることができる。本発明はヒトまたは動物の体の治療方法に用いるための開示された構成体またはベクター、たとえば前記構成体を含むウイルス並びにヒト及び動物体の治療に用いるための医薬または組成物の製造における前記構成体もしくは前記ベクターの使用を提供する。治療は上記に開示された投与によることができる。核酸構成体及びそれらを含有する細胞は治療の文脈では全く有用ではない。宿主細胞内にインビトロで核酸を安定に発現することができることが一般に有用である。本明細書に報告された結果は本発明の構成体を用いて安定な長期間の発現を達成することができることを示す。したがって、これは注目のヌクレオチド配列によりコードされ、ヘルペスウイルスのLAT 領域に異種の産物の生産に用いることができ、必要なら速続する使用のために宿主細胞から回収してもよい。ポリペプチドは、たとえば、モノクローナル抗体のためのハイブリドーマの発生に用い得る動物中で抗体を生じさせるのに及びカラムでの、またはバクテリオファージディスプレイによる抗体または他の結合分子の選択に有用である。本発明による構成体中に包含される異種ヌクレオチド配列から発現により生産されたポリペプチドは、もちろん、ポリペプチド自体の性質に依存して多数の他の用途を有することができる。本発明による細胞は、たとえば異種ポリヌクレオチドの発現を可能とするために体外での培養または維持期間の後、及び任意にその細胞を殺すもしくは不活性化する処置の後、免疫原として用いることができる。本発明による構成体、ベクター及び細胞のための多数の他の実際的な用途を実験結果により示唆する。神経系用途種々のベクター系 HSV は個体の生涯を存続できる知覚神経節ニューロンに生得の潜伏状態を確立する。生産的急性感染に必要な特定の遺伝子を欠失した、欠損HSV 変異体もCNS ニューロンに潜伏性を確立できる実験的な証拠もある。本発明による構成体を含有するこのようなベクターは同様にこれらの細胞の長期間の発現をもたらすべきである。アンプリコン（amplicon）ベクター系は、複製及びシグナルをパッケージする HSV 起原並びにプロモーターレポーター遺伝子構成体を含有するプラスミドからなり、それは送達のためにヘルペスビリオンにパッケージされ得る（１）。このようなベクターは組織培養で、細胞に良好なレポーター遺伝子発現を生じさせる。しかしながら、動物実験において、ニューロンに遺伝子を標的することを試みるために用いた時、ほとんど成功しなかった。それは、感染後長期間高レベルの遺伝子発現を可能にするプロモーター構成体を見つけることは非常に難かしいことを立証した。本発明による構成体のアンプリコンベクターへの挿入は、生来のウイルスゲノム中に長期間の遺伝子発現を起こす、LA T 領域配列を維持し、したがって、挿入された遺伝子の長期間の高レベルの発現を生じさせるべきである。同様に、その構成体は他のウイルスのベクター系（すなわち、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたはレトロウイルス系）または非ウイルス送達系（たとえば、リポソーム）で用いられるプラスミドに、神経系における長期間レポーター遺伝子発現を達成するために挿入することができる。代謝病神経系内には多くの可能性のある遺伝子療法の用途がある。主要な目的の１つは、欠けている遺伝子のコピーの送達により、CNS に影響を及ぼす、種々の先天的な誤りを相補することが可能なことである。多くのこのような症状（たとえばゴーシエ(Gaucher)病）について、代謝の欠陥は、薬理学的量の欠けているタンパク質を供給することにより直すことができることが分かった。薬理療法のために大量のこのような酵素を供給することは、しばしば可能ではなく、可能な場合にも極端に高価である。しかしながら、本発明を用いる欠けている遺伝子を直接神経細胞への生理学的なレベルのタンパク質の長期間の発現を伴う送達は１回の治療で代謝欠陥の補正をもたらす。したがって、本発明は多数のこのような遺伝症状、たとえばニューロパシー性のゴーシエ病及び他のリソソーム蓄積症、Ｇ_M2ガングリオシドーシス、ハンチントン病などを治療するために用いることができる。他の後天的な代謝異常による神経学的病気もある。パーキンソン病においては、尾状核中の神経伝達ドーパミンの欠失をもたらす、黒質における細胞の喪失がある。患者はドーパミン作用性の薬に良好な治療応答を示すことがあるが、経口で与えられるなら大量の投与が必要であって、しばしば副作用が治療を制限する。この症状においては、脳幹神経節に欠けている化学薬品の局所源を供給することは症状の劇的消散をもたらすことがある。チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子（ドーパミンを作る酵素をコードする）を脳幹神経節に送達することにより、病気の実験モデルに症状の軽減を得ることが可能である（２）。再び、本発明はこれらのいかなる用途にも有用である長期間の遺伝子の発現を得る方法をもたらす。このアプローチは多数の他の神経系の退歩する病気、たとえばある痴呆のために用い得るかもしれない。新形成の病気遺伝子治療はがんの治療にも用途を有する。遺伝する遺伝子欠失（すなわち、網膜芽腫、多発性内分泌腺腫症、神経芽腫）による少々まれながん及び新形成症候群がある。これらの内には、欠けている遺伝子を遺伝子療法により供給することにより治療または防止することもできるものもある。多数のこれらの病気は神経系の細胞に影響を与えることができる。再び本発明によるベクター構成体は治療に有用であり得る。すべてのがんは制御されない細胞分裂及び増殖を導びくことに結びつける多数の獲得した遺伝子異常物の蓄積に関係する。我々がもっと新形成を学ぶと、多数のがんの病因に非常に重要である少数の遺伝子があることが明らかになってきている。腫瘍抑制因子、たとえばｐ53は、多くの新形成の細胞型において不活性化された遺伝子の良い例である。遺伝子療法は、変異された遺伝子の機能的なコピーを新形成の細胞に導入し、したがってそれらの増殖を止めるのに用いることができる。本明細書に開示されたベクターは神経系内でのこのような用途のために有用であることができる。がんに対する遺伝子療法への他のアプローチは、直接的にまたは間接的に死をもたらすことができる産物を生産する悪性細胞に特異的な自殺遺伝子を送達することである。そのような方策の例は、悪性細胞に特異的に形質導入を生じさせるベクターを含有するHSV チミジンキナーゼ（TK）遺伝子を用いることである。次に患者にアシクロビル（HSV TK遺伝子を含有する細胞で代謝されてその活性で、毒性な代謝物にのみなる）を与える。このような自殺遺伝子の新形成の細胞への特異的な送達で、本発明の構成体は神経系由来の組織で遺伝子発現を生ずるのに用いることができる。神経系の外での用途 LSP はたぶんニューロン中で最も活性であるけれど、組織培養中での実験は、広範囲の他の細胞型で活性であることがあることを示した。生来の潜伏性の唯一の公知の部位はニューロンであるが、HSV はほとんどすべての細胞型に感染することができる。しかしながら上記のように、生産的感染のサイクルを開始できない欠損ウイルスを作ることが可能であり、そのようなウイルスを他の細胞型において潜伏状態に追いやることができる。次に、ニューロンでよりもたぶん低いレベルであるが、LAT 領域はいまだに転写的に活性であり得る。IRESを用いる利点は（前述のように）mRNAの非常に効率的な翻訳を可能とし、少量の転写物からですら、かなりのレベルのタンパク質産物を得ることが可能であることである。これはアンプリコンベクター並びに欠損HSV ベクターを保有する。したがって、本発明による遺伝子構成体を含有するHSV ベクターをあらゆる広範囲の細胞型への、たとえば、前記のように代謝の及び新形成の病気と取り組むための、遺伝子の送達のために用いることができる。本発明の更なる面及び態様は、特に下記の、説明のためであって限定のためにではない、提供される実験例及び添付された図面を考慮することにより当業者に明らかであろう。ここで、図１は、マウスのRNA ポリメラーゼ１プロモーター、EMCV IRES 及びネオマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドpMENA を示す（参考文献１７）。図２は HSV−１によりコードされたLAT 領域のマップを示す。pbluescribe (S trategene)中にクローン化された一連の制限フラグメントが示されている。これらのプラスミドはpSLAT1−pSLAT7と呼ばれる。HSV ゲノムへの外来DNA 配列の導入はpSLAT1のHpa Ｉフラグメント(HSV−１ノム配列に関してヌクレオチド位置 1 20,301〜120,469)を欠失させることに行なわれた。この遺伝子座に末端修復した外来DNA を挿入した。直鎖状にした組換えpSLAT1を、ウイルスのDNA 及びトランスフェクトされた子孫から選択された組換えウイルスを用いて同時トランスフェクトした。図３はウイルスC3b，C3b⁺，C3bneo及び C3bΔneo の構造を示すマップを示す。 C3b 及び C3b⁺を作るために、β−ガラクトシダーゼを駆動するCMV IE１プロモーターのカセットをpSLAT1におけるHpa Ｉ欠失にブラント末端クローン化した（図１参照）。各方向に挿入断片を含有するクローンを選択した。組換えウイルスはPvu Ｉ直線化されたプラスミド及びHSV 株SC16 DNAを用いるベロ（vero）細胞の同時トランスフェクトにより作られた。トランスフェクト子孫をウイルスを含有するβ−ガラクトシダーゼについてスクリーンし、それをプラーク精製した。同様な方策をウイルスC3bneo及び C3bΔneo を作るのに用いた。挿入断片を、 Xho Ｉ Not ＩフラグメントとしてpMENEA及び pΔMENA（図２）から製造した。これらをpSLAT1のHpa Ｉ欠失にクローン化した。組換えウイルスをベロ細胞を直線化されたプラスミドとC3b ウイルスDNA を用いて同時トランスフェクトすることにより作った。もはやβ−ガラクトシダーゼを含有しない組換え体をプラーク精製した。図４はプラスミドpCA1を示す。このプラスミドはレトロウイルスベクターpBABE を基礎とする（参考文献、「 Nucleic Acids Research」18，p．3587，1990年）。これにβ−ガラクトシダーゼネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合遺伝子(β−geo)を駆動する脳心筋炎ウイルスIRESを含有するカセットをクローン化した。IRESはプラスミド pEMC2（Ann Kaminski、ケンブリッジ、生化学部）から由来する。図５はウイルスＬβＡ及びＬβＢの構造を示すためのマップを示す。これらのウイルスをXba ＩフラグメントとしてpCA1から切除したIRES−β−ge o 挿入断片を用いて構築した。これをpSLAT1のHpa Ｉ欠失にクローン化した（図１）。組換えウイルスを C3b⁺ウイルスDNA との直線化されたプラスミドの同時トランスフェクトにより作った（図３）。その組換え体はインビトロでの急性感性における限定されたβ−ガラクトシダーゼ活性を発現し、ウイルスはＸ−gal 試薬で青く染まらなかったプラークを選択することによって精製された。このウイルスの構造のサザンブロット分析は組換え体がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子内に生じ、 neoＲ配列は存在しなかったことを示す。ＬβＢはC3b ウイルスDNA との同時トランスフェクトにより作られ（図３）、組換え体ウイルスを上記のように精製した。このウイルスは完全なIRESfβgeo 配列を含有する。図６は感染したマウスのLβＡ（図６ａ）及びＬβＢ（図６ｂ）からのPNS におけるβ−ガラクトシダーゼ発現を示す。各時点で（ＬβＡに対して４，26，82及び 190日及びLβＢに対して、５，32 及び 140日）、頸部DRG ＣII−ＣIVを５〜６匹のマウスから切除し、β−ガラクトシダーゼ活性の組織化学的検査のためにプールした。３時間の染色後、反応を止め、顕微鏡検査及びニューロンを発現するβ−ガラクトシダーゼの数を数え上げる前にグリセロール中で神経節を澄ませた。本明細書に引用したすべての文献は参照により組み入れる。例１ RNA ポリメラーゼＩ構成体を含有するベクターレポーター遺伝子の直ぐ５’に挿入された脳心筋炎ウイルスを有する、ネオマイシン耐性遺伝子の発現を駆動するRNA pol Ｉプロモーターを含有する一連のプラスミド（pMENA 系のプラスミド）がブライアンマクステイ（Brian McStay）から得られた（参考文献17）（図１）。MENA構成体をXho Ｉ Not Ｉフラグメントとして切除し、末端修復し、ゲル精製した。この挿入断片を次に、HSV−１のL AT 領域への同種組換えを可能とするように設計されたプラスミドである、pSLAT １の小さなHpa Ｉ欠失にブラント末端クローン化した（図２）。アンピシリン耐性コロニーを選び、制限酵素分析は両方向にMENA挿入断片を含有するクローンが得られたことを確認した。 LAP 活性との混同を避けるために、RNA pol Ｉ転写がLAT 転写と逆方向であるようにMENA構成体を挿入することを決定した（図３）。正しい方向にMENA挿入断片を含有するpSLAT1クローンをCsCl超遠心分離により製造し、Pvu Ｉを用いる消化により直線化した。ウイルスのDNA をC3b で１ pfu／細胞の多数回、感染させたベロ細胞から製造し、Lac Ｚ遺伝子を含有するHSV−１を基礎とするウイルスをLAT 遺伝子座に挿入した（図３）。ベロ細胞の同時トランスフェクトをCaCl₂沈澱／DMSOショックプロトコルを用いて行ない、子孫ウイルスを３日後に、プラークを形成し始めたときに回収した。プラーク精製をＸ−gal 基質を含有するアガロース上塗りの下に実施し、それはβ−ガラクトシダーゼが存在するところに青い沈澱を示し、白いプラークを選んだ。３回のプラーク精製後、ウイルスDNA が製造され、ウイルスの構造を確認するためにサザンプロット分析を行なった。 LAT 転写に対してアンチセンス方向にLAT 領域に挿入されたMENA構成体を含有する、このウイルスをC3bNeoと呼ぶ。さらに、同様なウイルスである C3bΔN eo を、同じ方法を用いて、LAT領域にΔMENA構成体（変異した不活性RNA pol Iプロモーターを含有する）を挿入して作った（図３）。これらのウイルスからのRNA pol Ｉ活性を最初に組織培養における細胞の急性感染の間に、評価した。BHK、ベロ及び3T3 細胞の単層を多数回感染させ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性の検定のために種々の時点で溶解物を調製した。その結果はBHK細胞において最も活性な、特異的RNA pol Ｉ活性があり、IRESは効率的翻訳とタンパク質産物の生産を可能にすることができることを示した。 C3bNeoウイルスが潜伏の間に何らかのRNA pol Ｉ活性を表わすかどうかを調べるために、６週令の雌のBalb／Ｃマウスに左の耳への皮下注射によって、C3bNeo の２×10⁶ プラーク形成単位(pfu) で感染させた（20μｌの注射容量を用いた）。10匹のマウスの群を感染後30日及び 180日に犠牲にした。２〜４の左頸部脊髄神経節を各マウスから切除し、プールし、過ヨウ素酸リシンパラホルムアルデヒド(PLP) 固定液中で１時間固定した。次に、それらを50％エタノールに移した後、ワックス中に固定した。５μの切片を切断し、ジゴキシゲニル標識化リボプローブを用いて、in situ ハイブリッド形成をセンス及びアンチセンス（対照として）Neo Ｒ転写の両方について行なった。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼmRNAは検出されず、ウイルス潜伏においてRNApol Ｉプロモーターからの検出可能な転写がなかったことを示した。しかしながら、驚くべきことに我々はMENA挿入断片にアンチセンス方向に作られた転写物を検出することができた。これらの転写物は細胞質に制限され、試験された神経節切片当り0.8陽性ニューロンの頻度で発生した。これらの転写物はLAP 活性を表わし、そして、LAT 領域に大きな挿入をすることにより、我々がその転写物がもはや核内に維持されずに、細胞質に運び出されるようにLAT 加工を変更したことが最もありそうなことである。我々はさらに２ KB LATのためのプローブを用いるISH により、これらの細胞質転写物がLAT 配列を含有していないことを確認した。我々はウイルスC3b 及びC3b⁺ に伴う潜伏における細胞質のLAT転写物も説明した（図３）。これはこの現象はMENA挿入断片に特異的でないが、いかなる挿入断片がこの小さなHpa Ｉ欠失中に置かれても起こるようであることを示す。核内で翻訳を行なうことはできないので、野生型HSV 潜伏において見られる核のLAT はmRNAを表わさないようである。それらは大きいmRNAから切除された安定なイントロンを表わすことが示唆されたが、そのような大きなmRNAについての決定的な証拠は見つかってない。我々のLAT 領域への挿入はmRNAのように分散されたLAT 種の生産をもたらしたようである。事実上、これは、LAP が潜伏の間高レベルで検出できるmRNA種の発現を駆動するウイルスである。このことから、この遺伝子座または他の主要なLAT 内で隣接する遺伝子座へレポーター遺伝子を挿入すると、長期間の遺伝子発現の情報が予期された。しかしながら、LAPのTATAボックス及びコード配列の挿入のために用いられるHpaＩの間に多数の終結コドンがあり、この遺伝子座に直接的に挿入されたレポーター遺伝子は発現しそうもないようである。例２ LAT 領域にIRES−レポーター遺伝子構成体を含有するベクター Lac Ｚ／Neo Ｒ融合遺伝子（β−Geo という）に結合した脳心筋炎ウイルスIR ESを含有するプラスミド（pCal、図４）をClare Abram（ケンブリッジ、病理学部）から得た。IRES−β−geo 挿入断片をXba Ｉフラグメントとして切り出し、 pSLAT １のHpa Ｉ欠失にブラント末端クローン化した。正しい方向、すなわち、 LAT にセンス方向 (pSLAT １β−Geo)に挿入断片を含有するクローンを単離し、 CsCl超遠心分離によりDNA を製造した。２つのウイルスをこの挿入プラスミドを用いて作った。第１のものは C3b⁺からのウイルスのDNA と共に同時トランスフェクトにより作った（図３）。組換え体をプラーク精製し、その配列をサザンブロットハイブリッド形成により分析した。これは、組換えの間に Lac Ｚ遺伝子の間に交差が起こったこと及びウイルスはいかなるNeo Ｒ配列も含有しないことを示した。このウイルスをＬβＡと呼ぶ（図５）。第２のウイルスをpSLAT 1β−Geo 及びC3b DNAを用いたベロ細胞の同時トランスフェクトにより作った。再び組換え体をプラーク精製し、その構造をサザンブロットにより確認した。このウイルスをＬβＢと呼ぶ（図５）。これらのウイルスは両方共、組織培養におけるベロ細胞の急性感染に共有した表現型を有する。分散プラーク検定を行ない、そしてβ−ガラクトシダーゼについての染色を行なうなら、プラークは主として白色だが、顕微鏡で調べると、各プレートは少数の強い陽性の青い細胞を含有し、特有の小さな斑点のついた結果を示すだろう。したがって、これらの非−ニューロン細胞の急性感染の間、LAPは活性であることがあるが、細胞の一部のみであるようである。何がLAP 活性のためのスイッチを構成するかは明らかでない。 LAP はニューロンの特異性の程度を示すものと考えられ、だからこれらのウイルスからのLAP活性をマウスの急性及び潜伏感染の間研究した。５〜６週令の11匹の雌のBalb／Ｃマウスを左耳に５×10⁶pfu のLβＡで感染させ、５匹のマウスを５×10⁶pfuのC3b で感染させた。各群からの５匹のマウスを感染後５日で犠牲にし、残りのＬβＡマウスを感染後26日で犠牲にした。左の頸部神経節２〜４を切断して出し、これらを３群にプールした。神経節を氷上で２％ PBS中のパラホルムアルデヒド／0.2％グルタルデヒドで１時間固定した。次にそれらをＸ−gal 試薬を用いてβ−ガラクトシダーゼについて染色した。神経節をカバー片の下に全体固定し、顕微鏡で調べた。C3b⁺感染マウスでは、神経節の内３つは高レベルβ−ガラクトシダーゼの発現を有し、非常に強く陽性で、個々のニューロンを数え上げることができなかった。その日に５つのＬβＡ感染神経節は多少の陽性染色を示したが、これはCMV IEプロモーターを含有するウイルスに見られたのとほぼ同じ位強くはなかった。１神経節当り平均8.4の陽性ニューロンがあった。ＬβＡ感染後26日までに、継続するβ−ガラクトシダーゼの発現があり、これは高レベルで、より多くのすなわち平均１神経節当り20.3 のニューロンが見られた。したがって本来のLAP の活性は、予想されたように急性感染したニューロンよりも潜伏感染した方が大きく、IRES−レポーター遺伝子構成体からの効率的な発現は潜伏性に固執する。ＬβＡウイルスによる、感染後82日で、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ発現は、試験された１神経節当り平均20.5の青色ニューロンで、なお、脊髄神経節に見られた。この時点での脳幹及び脊髄の試験は多数のニューロンにおいて、莫大なβ−ガラクトシダーゼの発現を示した。さらに神経節及びCNS 組織におけるβ −gal 発現を未確認の非ニューロン細胞型（これは新しい発見である）において検出した。β−ガラクトシダーゼを発現する多数のニューロンを含有する神経節を感染後 190日に容易に検出した。データを図６ａ及び表１に示す。β−ガラクトシダーゼ発現細胞の平均数の明らかな減少は実験のタイムコース中明らかではなかった。感染後82日及び 190日に標本を採取した全体を固定された神経節におけるβ− gal 陽性ニューロンの数を数えた後、組織をパラフィンに埋め込み、ミクロトーム上で切片にした。これは作成された神経節の切片内の青色のニューロンの輪隔の数の査定を可能にした。感染後82日に、全271 神経節切片中に261 の青色のニューロンの輪隔が検出された（１神経節当り平均0.96「青色の」ニューロンの輪隔）。これらのデータから、結論は感染後82日及び 190日の間でマウスから除去した神経節において、β−ガラクトシダーゼを発現するニューロンの数の減少は明らかでなかったことである。 LβＢで感染されたマウスの末梢神経系におけるβ−ガラクトシダーゼの発現も試験した。図６ｂは感染後種々の時点で動物から取り出した全体を固定した神経節からの「青色の」ニューロンの数を示す。LβＡについて認められたように、感染後 140日までの潜伏感染した知覚ニューロンの内に長期間のβ−ガラクトシダーゼ発現を示すことができた。しかしながら、この実験のコースを通して、１神経節当りのβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞の数及び細胞の染色の強度はＬβ Ａについて認められたのよりこのウイルスでは少ないように見えることが認められた。感染後 140日にＬβＢ感染動物から標本を採取した全体が固定された神経節をパラフィン中に埋め込み、切片を「青色の」ニューロンの輪隔について数えた。全612 の神経節の切片の内59の陽性のニューロンの輪隔が認められた（１神経節当り平均0.1の「青色の」ニューロンの輪隔）、すなわち、同様な方法で感染後82日及び 190日に標本を採取し、分析したLβＡ材料から得られたものより約10倍低い数字である。LβＡ及びＬβＢのこれらの認められた相違が潜伏の間のlac Ｚの効率における相違によるものかどうかを決定するために、in situ ハイブリッド形成(ISH) 分析を行なった。種々の時点でＬβＡ及びＬβＢ潜伏感染したマウスから頸部神経節（ＣII〜Ｃ IV）を切除し、プールし、ISH のために加工した。ISH は、lac Ｚ mRNA の検出に特異的なジゴキシゲニン標識化リボプローブを用いてISH を行なった。これらの実験からのデータを表１に要約した。LβＡによる感染後82日で、試験した167 の神経節切片の内44のlac Ｚ RNA陽性のニューロンの輪隔を検出し（１神経節切片当り平均 0.26 lac Ｚ陽性のニューロンの輪隔）、感染後190日に、試験された162の神経節切片から42のlacＺRNA 陽性のニューロンの輪隔を検出した（１神経節当り平均0.26 lacＺ陽性のニューロンの輪隔）。各ケースで、得られたシグナルは主に細胞質のであって、シグナルの強度及び１切片当りの検出されたlacＺ陽性のニューロンの輪隔の数は両時点で同様であった。これらのデータはＬβＡに潜伏感染した知覚神経節における lac Ｚ特異的RNA の安定な継続した転写を示している。 LAT 特異的プローブを用いるISH 分析も潜伏感染したニューロンの細胞質内の転写物の検出をもたらし、それは、野生型ウイルスの潜伏の間に認められたLAT の特徴的核局在化と鮮明な対照をなしている。ニューロンの細胞質におけるLAT 及びlac Ｚ特異的シグナルの局在化は、ハイブリッド転写物が生じ、潜伏感染したニューロンの細胞質に輸送されるという見解を支持する。面白いことに、Ｌβ Ｂに潜伏感染した神経節におけるlac Ｚ特異的RNAのISH 検出は、ＬβＡに認められたのとは異なるシグナルの型を明らかにした。LβＡに認められた均一な細胞質のlacＺ特異的シグナルの代りに、ＬI3Ｂに潜伏感染した動物は、主に核の斑点状のシグナルを示し、細胞質のシグナルはより強く染色された細胞にほんのわずかに認められる。 LβＢに感染後 140日で、ISH 分析は試験した128 神経節の切片の内で23のlac Ｚ陽性のニューロン陽性輪隔を明らかにし（平均0.18ニューロンのlac Ｚ陽性輪隔／神経節の切片）、感染後 257日で試験した288 の神経節の切片中に102 の lac Ｚ陽性輪隔を認めた（平均0.36 lac Ｚ陽性のニューロンの輪隔／神経節の切片）。したがって、Ｌβ ＢはＬβＡに匹敵する効率で転写的に活性な潜伏性を確立した。しかしながら、同様な数の潜伏感染したニューロンが転写的に活性なＬβＡゲノムまたはＬβＢゲノムをかくまっているにもかかわらず、機能的なβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現について陽性のＬI3Ｂに潜伏感染したニューロンの数は少ない。ISH データはこれが、LAT プロモータ一仲介転写の失敗というよりもＬβＢで潜伏感染したニューロンの核から細胞質への、転写物を含有するlac Ｚのかなり非効率的な転座の結果であるかもしれないことを示唆する。 LβＡに潜伏感染したマウスからの中枢神経系のニューロンにおけるβ−ガラクトシダーゼの発現マウスの耳のモデルを用いて、急性相感染の分析に続いて、動物が脳幹及び脊髄組織の両方並びに末梢知覚神経節に潜伏ウイルスをかくまっていることが過去に明らかにされた（Ef stathion 他「J.Virol．」57：p．446〜495 , 1986年）。このモデルの感染を用いて、ウイルスが顔面神経（耳の筋肉に運動性繊維を供給する）を経て脳幹に接近することも十分に立証されている（Hill他「Prog．Br ain Res.」59:p．173〜184 , 1983年）。したがって、我々は潜伏感染した動物がこれらの部位にβ−ガラクトシダーゼを発現しているニューロンを含有しているかどうかを決定することに興味をもった。今日まで、我々の研究は組換えウイルスＬβＡで潜伏感染させたマウスの脳幹及び頸部脊髄の試験に注意を集中させ、感染後２〜３ヶ月で標本を採取した３匹のマウス、感染後４ヶ月で標本を採取した２匹のマウス、感染後６ヶ月で標本をとった１匹のマウス及び感染後９〜10ヶ月で標本を採取した11匹のマウスの分析に関係した。潜伏感染した知覚神経節におけるβ− ガラクトシダーゼの発現の我々の試験において前に認められたように、確立された転写的に活性な潜伏のレベルにおいてかなりのマウスからマウスへの変異があった。しかしながら、β−ガラクトシダーゼの発現の解剖上の分布は維持され、 β−ガラクトシダーゼを発現するニューロンは首尾一貫して頸部脊髄並びに顔面神経核及び舌下神経核の左右両側に検出された。 β−ガラクトシダーゼの発現は、顔面神経核に最もしばしば検出され（試験された17匹のマウスの内14匹）、「青色の」ニューロンは、樹状突起管系及び軸索へのβ−ガラクトシダーゼの追跡を示す多少のニューロンを有しつつ、核全体にしばしば認められた（13までの連続する60μｍの切片に）。顔面神経内の潜伏感染された「青色の」ニューロンの広い分布は急性感染の間の核内に広がったウイルスを表わすだろう。β−ガラクトシダーゼ陽性のニューロンを試験した17匹の動物の内８匹の舌下核中に検出した。潜伏感染した「青色の」ニューロンは、再び核中に普通に認められる（15までの連続する60μｍの切片に）。頸部脊髄はすべてのマウスから得られなかったが、β−ガラクトシダーゼの発現は試験した14匹のマウスの内６匹に、前角及び後角ニューロンの両方に認められた。我々は時たまβ−ガラクトシダーゼを発現するニューロンをいくらかのマウスの後尾髄質内の後柱知覚核の領域並びにこの領域を横切る「青色の」軸索の輪隔に認めた。これらは、脊髄神経節に位置する潜伏感染した知覚ニューロンから突き出た軸索を表わすようである。本発明の態様を用いて得られた結果は、HSV を基礎とするベクターから長期間の遺伝子発現を得るためのほとんどの他の試みと鮮明な対照をなしており、そこでは、遺伝子発現は急性感染の間に最も強く、次に潜伏性の確立の間に次第に小さくなった。 LβＡに潜伏感染したマウスの脳幹及び脊髄組織の試験は感染後 72〜307 日の範囲の時点で多数のCNS の明確な領域においてβ−ガラクトシダーゼ陽性ニューロンを明らかにした。他のベクタ一系で用いることができる長期間発現カセットの構築のために、LA P−IRES β−geo カセットをウイルスの他の領域及びアンプリコンベクタ一中にクローン化する。これはLAP（118,439〜122,025bp)及び／またはHSV−１のBam HＩＢフラグメントからのHpaＩフラグメント（ヌクレオチド117,010−120,301 )を含有するNot−１フラグメントをpcDNA3（Invitrogen）のNotＩ部位にクローン化してpcDNA3／LATを生じさせることである。pCA−のXba Ｉフラグメントを次にpcDNA3／LATのHSVヌクレオチド120,301に相当する位置であって、LAP 配列の下流にクローン化する。さて、 LAP−IRES β−geo カセットをNot Ｉフラグメントとして切除し、HSV アンプリコンもしくは他のウイルスの遺伝子座にクローン化するかまたは裸のDNA の送達のためのプラスミドとして用いることができる。参考文献１．Spaete及びFrenkel、「Cell」 30，295-304 (1982)。２．During他、「Science」266，1399-403 (1994)。３．Feldman、「Seminars in virology」5，207-212 (1994)。４．Goins 他、「JVirol」68，2239-52 (1994)。５．Deshmane 他、「Virology」 196，868-72 (1993)。６．Nicosia 他、「JVirol」67，7276-83 (1993)。７．Block 他、「Virology」 192，618-30 (1993)。８．Dobson 他、「J Virol」63，3844-51 (1989)。９．Margolis 他、「Virology」 197，585-92 (1993)。 10．Dobson 他、「Neuron」5，353-60 (1990)。 11．Lokensgard 他、「J Virol」68，7148-58 (1994)。 12．Wolfe 他、「Nat Genet」1，379-84 (1992)。 13．Miyanohara 他、「New Biol」L4，238-46 (1992)。 14．Fink 他、「HumGene There」3，11-9 (1992)。 15．Weir 他、「PNAS USA」90，9140-4 (1993)。 16．Andersen 他、「HumGene There」3，487-99 (1992)。 17．Palmer 他、「Nucleic Acid Res」21，3451-7 (1993)。ＬβＡ及びＬβＢに感染させたマウスの末梢神経系におけるmRNAについての組織化学的染色及びISH によるβ−ガラクトシダーゼ発現の検出

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】ｌ．（ｉ）ヘルペスウイルスのゲノムの潜伏に関連する転写(LAT)領域の一部分であって、潜伏活性プロモーター(LAP)を包含する部分、(ii)前記プロモーターの下流の内部リボソーム侵入部位（IRES）及び(iii)前記IRESの下流の、前記L AT 領域に異種のヌクレオチド配列を包含する核酸構成体。２．前記異種のヌクレオチド配列がポリペプチドをコードするものである請求項１に記載の核酸構成体。３．ベクターの部分である請求項１または請求項２に記載の核酸構成体。４．前記ベクターがウイルスベクターである請求項３に記載の核酸構成体。５．前記ベクターがヘルペスウイルスベクターである請求項４に記載の核酸構成体。６．前記LAT 領域がヘルペスウイルスベクターに生来のものである請求項５に記載の核酸構成体。７．前記ウイルスベクターが複製欠損である請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸構成体。８．前記ヘルペスウイルスがヘルペス単純ウイルス１（HSV １）である請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸構成体。９．前記IRESがピコルナウイルスIRESである請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸構成体。 10．請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸構成体を含有する細胞。 11．前記異種のヌクレオチド配列が発現されている請求項10に記載の細胞。 12．神経細胞である請求項10または請求項11に記載の細胞。 13．哺乳動物の部分である請求項10〜12のいずれか１項に記載の細胞。 14．請求項10〜12のいずれか１項に記載の細胞を有する哺乳動物。 15．請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸構成体を含有する哺乳動物。 16．請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸構成体を細胞に導入することを含む方法。 17．前記細胞が神経細胞である請求項16に記載の方法。 18．前記導入が体外で行なわれる請求項16または請求項17に記載の方法。 19．細胞中で請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸構成体における異種のヌクレオチド配列の発現を引き起こすか、または可能とすることを含む方法。 20．前記細胞が哺乳動物の一部である請求項19に記載の方法。 21．ヘルペスウイルスのゲノム中に、ヘルペスウイルス潜伏活性プロモーター (LAP)の下流の内部リボソーム侵入部位（IRES）及び前記IRESの下流の非−ヘルペスウイルスヌクレオチドを包含する前記ヘルペスウイルス。 22．複製欠損であるかまたは弱毒化されている請求項21に記載のヘルペスウイルス。 23．請求項21または請求項22に記載のヘルペスウイルスを含有する細胞。 24．請求項23に記載の細胞を有する哺乳動物。 25．請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸構成体を哺乳動物に投与することを包含する方法。 26．前記核酸構成体を含有するウイルスを哺乳動物に投与する請求項25に記載の方法。 27．請求項10〜12のいずれか１項に記載の細胞を哺乳動物に投与することを包含する方法。 28．請求項21または請求項22に記載のヘルペスウイルスを哺乳動物に投与することを包含する方法。