JP2000356623A - 電気泳動分離検出方法 - Google Patents
電気泳動分離検出方法Info
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- JP2000356623A JP2000356623A JP2000152742A JP2000152742A JP2000356623A JP 2000356623 A JP2000356623 A JP 2000356623A JP 2000152742 A JP2000152742 A JP 2000152742A JP 2000152742 A JP2000152742 A JP 2000152742A JP 2000356623 A JP2000356623 A JP 2000356623A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 単一のレーザ光で多種の標識蛍光体を励起す
る電気泳動分離検出方法を提供する。 【解決手段】 蛍光体が標識された核酸断片試料を電気
泳動し，蛍光体からの蛍光を検出して核酸断片試料を検
出する電気泳動分離検出方法において，核酸試料７３，
７４，７５，７６の種類毎に蛍光体７１，７２の相互の
距離を変化させて標識された二種類以上の蛍光体のうち
少なくとも一種類の蛍光体７１が励起されて発する蛍光
と，少なくとも一種類の励起された蛍光体７１からのエ
ネルギーの移動により他の種類の蛍光体７２から発する
蛍光との強度比を計測することにより，核酸試料の種類
の識別を行う。 【効果】 蛍光検出において励起光の波長と発光波長を
十分離すことができ，多種類の蛍光体を高い効率で励起
でき，高感度かつ高スループットが実現できる。
る電気泳動分離検出方法を提供する。 【解決手段】 蛍光体が標識された核酸断片試料を電気
泳動し，蛍光体からの蛍光を検出して核酸断片試料を検
出する電気泳動分離検出方法において，核酸試料７３，
７４，７５，７６の種類毎に蛍光体７１，７２の相互の
距離を変化させて標識された二種類以上の蛍光体のうち
少なくとも一種類の蛍光体７１が励起されて発する蛍光
と，少なくとも一種類の励起された蛍光体７１からのエ
ネルギーの移動により他の種類の蛍光体７２から発する
蛍光との強度比を計測することにより，核酸試料の種類
の識別を行う。 【効果】 蛍光検出において励起光の波長と発光波長を
十分離すことができ，多種類の蛍光体を高い効率で励起
でき，高感度かつ高スループットが実現できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はヒトおよびその他生
物の遺伝物質であるＤＮＡ，ＲＮＡの解析手法に関す
る。特にＤＮＡ，ＲＮＡの塩基配列決定，あるいは個体
の塩基配列の多様性に基づく制限酵素断片の多型性の計
測に有効な電気泳動分離検出方法に関する。
物の遺伝物質であるＤＮＡ，ＲＮＡの解析手法に関す
る。特にＤＮＡ，ＲＮＡの塩基配列決定，あるいは個体
の塩基配列の多様性に基づく制限酵素断片の多型性の計
測に有効な電気泳動分離検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡの塩基配列決定，すなわちシーケ
ンシングを蛍光検出を用いて自動的に行う方法について
はバイオテクニクス ５巻(１９８７年)第３４２頁から
３４８頁（Bio-Techniques ５(１９８７）３４２〜３４
８）に記載がある。この方法では，ＤＮＡのシーケンシ
ング反応に用いるプライマーに蛍光体を標識している。
この時，ＤＮＡの四種の塩基に対応する四種類の反応に
用いるプライマーをそれぞれ別々の蛍光体で標識してお
き，電気泳動により，生成したそれぞれのＤＮＡ断片を
同一の泳動路で分子量分離する。電気泳動媒質であるゲ
ルを一定距離泳動してきたところで，蛍光体で標識され
たＤＮＡ断片をレーザ光で励起する。この時に発する蛍
光を検出し波長選別することにより蛍光体を識別し，Ｄ
ＮＡ断片の分子量分離パターンを得る。このパターンを
解析することによりＤＮＡの塩基配列を決定している。
ンシングを蛍光検出を用いて自動的に行う方法について
はバイオテクニクス ５巻(１９８７年)第３４２頁から
３４８頁（Bio-Techniques ５(１９８７）３４２〜３４
８）に記載がある。この方法では，ＤＮＡのシーケンシ
ング反応に用いるプライマーに蛍光体を標識している。
この時，ＤＮＡの四種の塩基に対応する四種類の反応に
用いるプライマーをそれぞれ別々の蛍光体で標識してお
き，電気泳動により，生成したそれぞれのＤＮＡ断片を
同一の泳動路で分子量分離する。電気泳動媒質であるゲ
ルを一定距離泳動してきたところで，蛍光体で標識され
たＤＮＡ断片をレーザ光で励起する。この時に発する蛍
光を検出し波長選別することにより蛍光体を識別し，Ｄ
ＮＡ断片の分子量分離パターンを得る。このパターンを
解析することによりＤＮＡの塩基配列を決定している。
【０００３】ＤＮＡの制限酵素切断断片の分子量分布の
計測を蛍光検出により行う方法が，ジェノミックス ４
巻（１９８９年）第１２９頁から１３６頁（GENOMICS
４(１９８９)１２９〜１３６）に記載されている。この
方法では，コスミドあるいはプラスミドＤＮＡを制限酵
素で切断し，その断片の両端にある切断部位に，蛍光体
標識二本鎖ＤＮＡオリゴマーをライゲーション反応によ
り結合させ，前の段落で説明した方法で用いたのと同様
な装置を用いて，生成した蛍光体標識ＤＮＡ断片の分子
量分離パターンを得ている。
計測を蛍光検出により行う方法が，ジェノミックス ４
巻（１９８９年）第１２９頁から１３６頁（GENOMICS
４(１９８９)１２９〜１３６）に記載されている。この
方法では，コスミドあるいはプラスミドＤＮＡを制限酵
素で切断し，その断片の両端にある切断部位に，蛍光体
標識二本鎖ＤＮＡオリゴマーをライゲーション反応によ
り結合させ，前の段落で説明した方法で用いたのと同様
な装置を用いて，生成した蛍光体標識ＤＮＡ断片の分子
量分離パターンを得ている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】電気泳動により，ＤＮ
Ａの塩基配列決定あるいは制限酵素切断断片の分子量分
布の計測を蛍光検出を用いて行う上記従来技術では，励
起光の波長と蛍光を検出する波長を十分離すことができ
ないため，励起光の散乱光成分あるいはゲルからの背景
蛍光の低減が不十分であり，これにより検出感度が決ま
ってしまうという問題点があった。また，四種類の蛍光
体を単一のレーザ光で励起するため，検出感度が四種類
のうちで最も励起効率の低い蛍光体で決まってしまうと
いう問題点があった。従来は，四種類以上の多種類の蛍
光体を単一のレーザ光で励起するのは，実質的に不可能
であった。
Ａの塩基配列決定あるいは制限酵素切断断片の分子量分
布の計測を蛍光検出を用いて行う上記従来技術では，励
起光の波長と蛍光を検出する波長を十分離すことができ
ないため，励起光の散乱光成分あるいはゲルからの背景
蛍光の低減が不十分であり，これにより検出感度が決ま
ってしまうという問題点があった。また，四種類の蛍光
体を単一のレーザ光で励起するため，検出感度が四種類
のうちで最も励起効率の低い蛍光体で決まってしまうと
いう問題点があった。従来は，四種類以上の多種類の蛍
光体を単一のレーザ光で励起するのは，実質的に不可能
であった。
【０００５】本発明の目的は，電気泳動における蛍光検
出によるＤＮＡの分子量分離パターンの計測を高感度に
行う電気泳動分離検出方法を提供することにあり，単一
のレーザ光で多種類の蛍光体を励起し，多種類のＤＮＡ
試料を識別して検出する方法を提供することにある。本
発明の他の目的は，蛍光の多色検出によるＤＮＡの分子
量分離パターンの計測を高感度に行う電気泳動分離検出
方法を提供することにある。
出によるＤＮＡの分子量分離パターンの計測を高感度に
行う電気泳動分離検出方法を提供することにあり，単一
のレーザ光で多種類の蛍光体を励起し，多種類のＤＮＡ
試料を識別して検出する方法を提供することにある。本
発明の他の目的は，蛍光の多色検出によるＤＮＡの分子
量分離パターンの計測を高感度に行う電気泳動分離検出
方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明では上記目的を達
成するために，電気泳動により分子量分離パターンを計
測する核酸断片試料に二類種以上の蛍光体を標識し，そ
の内の少なくとも一種類の蛍光体を励起して生じる蛍光
のエネルギーの移動により，発光した他の種類の蛍光体
からの蛍光を検出することにより，分子量分離パターン
を計測する。また，二種類以上の核酸断片試料を，電気
泳動媒質中で一定距離泳動した場所で分子量分離し，そ
のパターンを計測するために，それぞれの核酸断片試料
に組み合わせの異なる二種類以上の蛍光体を標識し，標
識蛍光体のうちの少なくとも一種類の蛍光体を励起して
生じる蛍光のエネルギーの移動により，発光する他の種
類の標識蛍光体の発光波長の違いにより，核酸断片試料
の識別を行う。
成するために，電気泳動により分子量分離パターンを計
測する核酸断片試料に二類種以上の蛍光体を標識し，そ
の内の少なくとも一種類の蛍光体を励起して生じる蛍光
のエネルギーの移動により，発光した他の種類の蛍光体
からの蛍光を検出することにより，分子量分離パターン
を計測する。また，二種類以上の核酸断片試料を，電気
泳動媒質中で一定距離泳動した場所で分子量分離し，そ
のパターンを計測するために，それぞれの核酸断片試料
に組み合わせの異なる二種類以上の蛍光体を標識し，標
識蛍光体のうちの少なくとも一種類の蛍光体を励起して
生じる蛍光のエネルギーの移動により，発光する他の種
類の標識蛍光体の発光波長の違いにより，核酸断片試料
の識別を行う。
【０００７】また上記目的を達成するため別の方法とし
て，識別して検出すべき複数種類の核酸断片試料に，二
種以上の蛍光体を標識し，かつ該核酸試料の種類ごとに
標識蛍光体間の距離を変え，該蛍光体の少なくとも一つ
の蛍光体を励起し，該蛍光体およびエネルギー移動によ
り発光する別の蛍光体からの蛍光の強度比を計測する。
て，識別して検出すべき複数種類の核酸断片試料に，二
種以上の蛍光体を標識し，かつ該核酸試料の種類ごとに
標識蛍光体間の距離を変え，該蛍光体の少なくとも一つ
の蛍光体を励起し，該蛍光体およびエネルギー移動によ
り発光する別の蛍光体からの蛍光の強度比を計測する。
【０００８】特にＤＮＡシーケンス用に，シーケンス反
応に用いる一本鎖ＤＮＡオリゴマーであるプライマーに
二種類の蛍光体を標識し，四種類の塩基種を識別するた
めに，蛍光標識されたプライマーにおいて標識蛍光体間
の距離を１５塩基以下の４種類の距離を有するようにす
る。
応に用いる一本鎖ＤＮＡオリゴマーであるプライマーに
二種類の蛍光体を標識し，四種類の塩基種を識別するた
めに，蛍光標識されたプライマーにおいて標識蛍光体間
の距離を１５塩基以下の４種類の距離を有するようにす
る。
【０００９】エネルギー供与体およびエネルギー受容体
となる二種類の蛍光体間のエネルギー移動の効率につい
ては，フェルスター（Von Th. Foerster)による式が知
られている（アンナーレン デア フュジーク シリーズ
６.２巻(１９４８年)第５５頁から７５頁(Annalen der
Physik. ６．Folge. Band２.(１９４８)pp.５５−７
５）参照）。これによれば，エネルギー移動速度はエネ
ルギー供与体，受容体間の距離の６乗に反比例し，供与
体の発光スペクトルと受容体の吸収スペクトルの重なり
に比例する。また，供与体，受容体間の配向によっても
影響を受ける。
となる二種類の蛍光体間のエネルギー移動の効率につい
ては，フェルスター（Von Th. Foerster)による式が知
られている（アンナーレン デア フュジーク シリーズ
６.２巻(１９４８年)第５５頁から７５頁(Annalen der
Physik. ６．Folge. Band２.(１９４８)pp.５５−７
５）参照）。これによれば，エネルギー移動速度はエネ
ルギー供与体，受容体間の距離の６乗に反比例し，供与
体の発光スペクトルと受容体の吸収スペクトルの重なり
に比例する。また，供与体，受容体間の配向によっても
影響を受ける。
【００１０】エネルギー移動の供与体，受容体間の距離
依存性の実験的研究がストライヤー(L. Stryer)とホー
グランド(R. P. Haugland)によって報告されている(プ
ロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オ
ブ サイエンシズ オブ ユー エス エー ５８巻（１９６
７年）第７１９頁から７２６頁（Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA ５８（１９６７）７１９−７２６）参照)。これ
は，ポリペプチドオリゴマーのペプチドの個数を変える
ことにより，その両端にある供与体と受容体の距離を変
化させたもので，エネルギー移動の距離依存性がフェル
スターの式とよく一致していることを示している。また
エネルギー移動の効率として，供与体，受容体間の距離
１.２ｎｍのときの１００％，４.６ｎｍのときの１６％
という値を得ている。
依存性の実験的研究がストライヤー(L. Stryer)とホー
グランド(R. P. Haugland)によって報告されている(プ
ロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オ
ブ サイエンシズ オブ ユー エス エー ５８巻（１９６
７年）第７１９頁から７２６頁（Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA ５８（１９６７）７１９−７２６）参照)。これ
は，ポリペプチドオリゴマーのペプチドの個数を変える
ことにより，その両端にある供与体と受容体の距離を変
化させたもので，エネルギー移動の距離依存性がフェル
スターの式とよく一致していることを示している。また
エネルギー移動の効率として，供与体，受容体間の距離
１.２ｎｍのときの１００％，４.６ｎｍのときの１６％
という値を得ている。
【００１１】したがって，一本鎖あるいは二本鎖ＤＮＡ
に標識されたエネルギー供与体と受容体となる蛍光体間
の距離が数ｎｍ以下で，前者の発光スペクトルと後者の
吸収スペクトルの重なりが大きければ，両者の間でエネ
ルギー移動が生ずることになり，しかも，１０％以上１
００％に近い効率のエネルギー移動が期待できる。すな
わちエネルギー供与体となる蛍光体を励起すると，エネ
ルギー受容体からの高効率な発光が観測できる。また，
エネルギー供与体となる蛍光体だけが標識されている場
合と比較して，発光波長が長波長側にシフトするため励
起光の波長と発光の波長が離れる。このため，計測に際
して励起光の散乱などの影響を受けにくくなる。以上の
理由により高感度な蛍光計測が実現できる。
に標識されたエネルギー供与体と受容体となる蛍光体間
の距離が数ｎｍ以下で，前者の発光スペクトルと後者の
吸収スペクトルの重なりが大きければ，両者の間でエネ
ルギー移動が生ずることになり，しかも，１０％以上１
００％に近い効率のエネルギー移動が期待できる。すな
わちエネルギー供与体となる蛍光体を励起すると，エネ
ルギー受容体からの高効率な発光が観測できる。また，
エネルギー供与体となる蛍光体だけが標識されている場
合と比較して，発光波長が長波長側にシフトするため励
起光の波長と発光の波長が離れる。このため，計測に際
して励起光の散乱などの影響を受けにくくなる。以上の
理由により高感度な蛍光計測が実現できる。
【００１２】また，同一の波長で励起できる複数の発光
体を選択する場合に，エネルギー移動による発光を利用
すれば，同一のエネルギー供与体に対して高い効率でエ
ネルギー移動を受ける複数の受容体の組み合わせ，ある
いは，同一の波長で高効率で励起できる複数の蛍光体と
それぞれから高い効率でエネルギー移動を受ける受容体
の組み合わせなどが可能となり，高効率に励起できる，
すなわち高感度に検出できる蛍光体の選択の幅が広が
る。
体を選択する場合に，エネルギー移動による発光を利用
すれば，同一のエネルギー供与体に対して高い効率でエ
ネルギー移動を受ける複数の受容体の組み合わせ，ある
いは，同一の波長で高効率で励起できる複数の蛍光体と
それぞれから高い効率でエネルギー移動を受ける受容体
の組み合わせなどが可能となり，高効率に励起できる，
すなわち高感度に検出できる蛍光体の選択の幅が広が
る。
【００１３】以上，エネルギー供与体と受容体間の，二
分子間のエネルギー移動の場合を説明したが，励起波長
と発光波長のシフトをより大きくしたり，同時に検出で
きる発光体の数をより多くするためには，三分子あるい
はそれ以上の分子間のエネルギー移動を利用することが
できる。すなわち，まず最も短波長側の蛍光体を励起し
て，この蛍光体の蛍光スペクトルと重なりの大きな励起
スペクトルを持つ第二の蛍光体との間でエネルギー移動
を起こして，これを励起する。次にこの第二の蛍光体の
蛍光スペクトルと重なりの大きな励起スペクトルを持つ
第三の蛍光体との間でエネルギー移動を起こして，これ
を励起する。このように順次長波長側の蛍光スペクトル
を持つ蛍光体を励起することにより，励起波長と発光波
長のシフトを大きくしたり，同時に検出できる発光体の
数を多くすることが可能となる。
分子間のエネルギー移動の場合を説明したが，励起波長
と発光波長のシフトをより大きくしたり，同時に検出で
きる発光体の数をより多くするためには，三分子あるい
はそれ以上の分子間のエネルギー移動を利用することが
できる。すなわち，まず最も短波長側の蛍光体を励起し
て，この蛍光体の蛍光スペクトルと重なりの大きな励起
スペクトルを持つ第二の蛍光体との間でエネルギー移動
を起こして，これを励起する。次にこの第二の蛍光体の
蛍光スペクトルと重なりの大きな励起スペクトルを持つ
第三の蛍光体との間でエネルギー移動を起こして，これ
を励起する。このように順次長波長側の蛍光スペクトル
を持つ蛍光体を励起することにより，励起波長と発光波
長のシフトを大きくしたり，同時に検出できる発光体の
数を多くすることが可能となる。
【００１４】一方，エネルギー供与体と受容体間の距離
を変化させるとエネルギー移動の効率も変化することに
なる。すなわち，エネルギー供与体と受容体間の距離を
変化させることにより，エネルギー供与体からの発光と
受容体からの発光の強度比を変化させることができる。
したがって，同一の組み合わせのエネルギー供与体と受
容体で，核酸試料の種類ごとにその距離を変えることに
より，エネルギー供与体からの発光と受容体からの発光
の強度比を計測することにより，該核酸試料の識別が可
能となる。
を変化させるとエネルギー移動の効率も変化することに
なる。すなわち，エネルギー供与体と受容体間の距離を
変化させることにより，エネルギー供与体からの発光と
受容体からの発光の強度比を変化させることができる。
したがって，同一の組み合わせのエネルギー供与体と受
容体で，核酸試料の種類ごとにその距離を変えることに
より，エネルギー供与体からの発光と受容体からの発光
の強度比を計測することにより，該核酸試料の識別が可
能となる。
【００１５】エネルギー移動の効率として１０％程度以
上あれば，単一のレーザで四種類の蛍光体を励起する場
合に比較して十分な発光が得られる。したがって，一本
鎖状態のＤＮＡおよび二本鎖状態のＤＮＡとも，エネル
ギー供与体，受容体間の距離は，１５塩基程度以下であ
ればよい。すなわち，二本鎖状態では塩基対の間隔は１
５塩基で数ｎｍであり，１本鎖状態でも鎖の折れたたみ
を考慮すれば，平均距離は数ｎｍ以下になる。
上あれば，単一のレーザで四種類の蛍光体を励起する場
合に比較して十分な発光が得られる。したがって，一本
鎖状態のＤＮＡおよび二本鎖状態のＤＮＡとも，エネル
ギー供与体，受容体間の距離は，１５塩基程度以下であ
ればよい。すなわち，二本鎖状態では塩基対の間隔は１
５塩基で数ｎｍであり，１本鎖状態でも鎖の折れたたみ
を考慮すれば，平均距離は数ｎｍ以下になる。
【００１６】ＤＮＡシーケンシングの場合には，シーケ
ンシング反応に用いる，塩基種ごとの四種類のプライマ
ー，すなわち一本鎖ＤＮＡオリゴマーの種類ごとにエネ
ルギー供与体と受容体間の距離を変えることにより，シ
ーケンス反応生成物である種々の長さのＤＮＡ断片の塩
基種を識別できる。
ンシング反応に用いる，塩基種ごとの四種類のプライマ
ー，すなわち一本鎖ＤＮＡオリゴマーの種類ごとにエネ
ルギー供与体と受容体間の距離を変えることにより，シ
ーケンス反応生成物である種々の長さのＤＮＡ断片の塩
基種を識別できる。
【００１７】
【発明の実施の形態】第１の実施例 以下，本発明による第１の実施例を図１から図３により
説明する。本実施例では，λファージＤＮＡをモデル物
質として，これを異なる組み合わせの制限酵素で切断し
た試料をそれぞれ異なる組み合わせの蛍光体で標識して
おき，それを同一泳動路で，同時に電気泳動し，そのパ
ターンの違いを発光波長の違いにより識別する。
説明する。本実施例では，λファージＤＮＡをモデル物
質として，これを異なる組み合わせの制限酵素で切断し
た試料をそれぞれ異なる組み合わせの蛍光体で標識して
おき，それを同一泳動路で，同時に電気泳動し，そのパ
ターンの違いを発光波長の違いにより識別する。
【００１８】本実施例では，制限酵素HindIIIの切断部
位に，その間でエネルギー移動を生ずる二種類の蛍光体
を標識した二本鎖ＤＮＡオリゴマー１ａ，１ｂをライゲ
ーション反応により導入する。図１に示すように，エネ
ルギー供与体としてはアルゴンイオンレーザ（発振波長
４８８ｎｍ）で効率よく励起できるフルオレセインイソ
チオシアネイト（ＦＩＴＣ）２を用いる。エネルギー受
容体として，励起スペクトルがＦＩＴＣ２の蛍光スペク
トルと重なりが大きいテトラメチルローダミンイソチオ
シアネイト（ＴＲＩＴＣ）３，スルフォローダミン１０
１の塩化スルフォン酸誘導体（商品名テキサスレッド）
４を用いる。
位に，その間でエネルギー移動を生ずる二種類の蛍光体
を標識した二本鎖ＤＮＡオリゴマー１ａ，１ｂをライゲ
ーション反応により導入する。図１に示すように，エネ
ルギー供与体としてはアルゴンイオンレーザ（発振波長
４８８ｎｍ）で効率よく励起できるフルオレセインイソ
チオシアネイト（ＦＩＴＣ）２を用いる。エネルギー受
容体として，励起スペクトルがＦＩＴＣ２の蛍光スペク
トルと重なりが大きいテトラメチルローダミンイソチオ
シアネイト（ＴＲＩＴＣ）３，スルフォローダミン１０
１の塩化スルフォン酸誘導体（商品名テキサスレッド）
４を用いる。
【００１９】ライゲーション反応による標識蛍光体の導
入に用いるＤＮＡ二本鎖オリゴマーは以下の配列番号１
の構造を有し，右端の一本鎖部分がHindIIIによる切断
形状と一致しており，ライゲーション反応により，Hind
III切断断片の切断部位に選択的に結合する。
入に用いるＤＮＡ二本鎖オリゴマーは以下の配列番号１
の構造を有し，右端の一本鎖部分がHindIIIによる切断
形状と一致しており，ライゲーション反応により，Hind
III切断断片の切断部位に選択的に結合する。
【００２０】 ５′−ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３′ ３′−ＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＴＣＧＡ−５′ 蛍光体の標識位置は，ＦＩＴＣ２が下側の鎖の３′側か
ら１２番目のＣと１３番目のＴの間のリンの部分で，Ｔ
ＲＩＴＣ３及びテキサスレッド４が上側の鎖の５′から
３番目のＴと４番目のＴの間のリンの部分とする。エネ
ルギー供与体および受容体のオリゴヌクレオチドへの標
識には特開昭61−44353号公報に開示の方法を用いる。
この方法は，ポリヌクレオチドの蛍光体標識部位のリン
酸結合を官能基を有するホスホン酸結合に置き換え，こ
の官能基と蛍光体を結合させることにより蛍光体標識を
実現するものであり，任意の位置に標識物を導入できる
手法である。
ら１２番目のＣと１３番目のＴの間のリンの部分で，Ｔ
ＲＩＴＣ３及びテキサスレッド４が上側の鎖の５′から
３番目のＴと４番目のＴの間のリンの部分とする。エネ
ルギー供与体および受容体のオリゴヌクレオチドへの標
識には特開昭61−44353号公報に開示の方法を用いる。
この方法は，ポリヌクレオチドの蛍光体標識部位のリン
酸結合を官能基を有するホスホン酸結合に置き換え，こ
の官能基と蛍光体を結合させることにより蛍光体標識を
実現するものであり，任意の位置に標識物を導入できる
手法である。
【００２１】本実施例では，蛍光体標識をヌクレオチド
骨格のリン原子に結合させる場合を説明したが，標識位
置はこれに限定されるものではなく，サイエンス，２３
８巻（１９８７年）３３６頁〜３４１頁（Science，２
３８(１９８７)pp.３３６〜３４１）に記載されている
のと同様な方法を用いて，塩基に標識することも可能で
ある。
骨格のリン原子に結合させる場合を説明したが，標識位
置はこれに限定されるものではなく，サイエンス，２３
８巻（１９８７年）３３６頁〜３４１頁（Science，２
３８(１９８７)pp.３３６〜３４１）に記載されている
のと同様な方法を用いて，塩基に標識することも可能で
ある。
【００２２】二本鎖オリゴマーは，それを構成する各鎖
を別々に合成し，後からアニーリングにより二本鎖とす
る。
を別々に合成し，後からアニーリングにより二本鎖とす
る。
【００２３】蛍光体標識した二本鎖ＤＮＡオリゴマー１
ａ，１ｂのそれぞれの蛍光スペクトルを図２に示す。こ
れはアルゴンレーザの発振波長である４８８ｎｍで励起
した場合のスペクトルで，それぞれのエネルギー供与体
と受容体の間で充分な量のエネルギー移動が起こってい
る。しかもＴＲＩＴＣ３とテキサスレッド４を共通に励
起できる発振波長５４３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザで励起
した場合と同等以上の発光強度が得られる。したがっ
て，それぞれのレーザ（アルゴンレーザ，〜１０ｍＷ，
Ｈｅ−Ｎｅレーザ，〜１ｍＷ）で得られる励起光の強
度，および励起波長と発光波長の差による散乱光強度の
強弱を考えると，エネルギー移動を利用した方が，より
高感度な蛍光検出が実現できることになる。
ａ，１ｂのそれぞれの蛍光スペクトルを図２に示す。こ
れはアルゴンレーザの発振波長である４８８ｎｍで励起
した場合のスペクトルで，それぞれのエネルギー供与体
と受容体の間で充分な量のエネルギー移動が起こってい
る。しかもＴＲＩＴＣ３とテキサスレッド４を共通に励
起できる発振波長５４３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザで励起
した場合と同等以上の発光強度が得られる。したがっ
て，それぞれのレーザ（アルゴンレーザ，〜１０ｍＷ，
Ｈｅ−Ｎｅレーザ，〜１ｍＷ）で得られる励起光の強
度，および励起波長と発光波長の差による散乱光強度の
強弱を考えると，エネルギー移動を利用した方が，より
高感度な蛍光検出が実現できることになる。
【００２４】ＤＮＡ試料の調製は以下の手順で行う。λ
ファージＤＮＡを制限酵素HindIIIで消化した分解生成
物(λ／HindIII；市販品）５に，それぞれ約十倍量の蛍
光標識した二本鎖ＤＮＡオリゴマー１ａ，１ｂを加え，
市販のライゲーションキットを用いて，１６℃で３０分
間ライゲーション反応６を行ない，反応生成物をエタノ
ール沈殿により精製する。次にテキサスレッド４を含む
反応生成物を５０ｍＭのTris−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)，１
０ｍＭのＭｇＣｌ2，１ｍＭのDithiothreitol,５０ｍＭ
のＮａＣｌからなる，３７℃のバッファー中で制限酵素
HinfＩにより制限酵素消化反応７を行ない，反応生成物
をエタノール沈殿により精製する。
ファージＤＮＡを制限酵素HindIIIで消化した分解生成
物(λ／HindIII；市販品）５に，それぞれ約十倍量の蛍
光標識した二本鎖ＤＮＡオリゴマー１ａ，１ｂを加え，
市販のライゲーションキットを用いて，１６℃で３０分
間ライゲーション反応６を行ない，反応生成物をエタノ
ール沈殿により精製する。次にテキサスレッド４を含む
反応生成物を５０ｍＭのTris−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)，１
０ｍＭのＭｇＣｌ2，１ｍＭのDithiothreitol,５０ｍＭ
のＮａＣｌからなる，３７℃のバッファー中で制限酵素
HinfＩにより制限酵素消化反応７を行ない，反応生成物
をエタノール沈殿により精製する。
【００２５】次に，これら反応生成物を混合８し，同一
の電気泳動路に注入し，電気泳動９を行う。ガラス板６
１に挟まれる電気泳動用のゲル６０としては，３％のア
クリルアミドゲルを用いる。ゲル６０の上端と下端の間
に３０Ｖ／cm程度の電圧を印加する。蛍光の計測は，泳
動距離１０cmのところで，ゲル６０の端面より，レーザ
光源６２からのアルゴンレーザ光６３を反射鏡６４によ
り，ＤＮＡ断片７０の泳動方向に垂直に入射させること
により行う。反応生成物中の各ＤＮＡ断片７０がレーザ
光の照射部位を通過するときに発する発光像を蛍光二色
検出装置で受光する。蛍光二色検出装置は，レーザ光照
射部位の線状の像を二つに分割するプリズム６５，それ
ぞれの像からのビームが通過するそれぞれ透過特性の異
なる光学フィルター６６，像を結像せしめるレンズ系６
７と二次元検出器６８から構成される。光学フィルター
６６として，ＴＲＩＴＣ３からの発光を主に透過させる
中心波長５８０ｎｍで半値幅４０ｎｍのものと，テキサ
スレッド４からの発光を主に透過させる中心波長６１５
ｎｍで半値幅３０ｎｍのものを用いた。二次元検出器６
８としては，イメージインテンシファイア付きのＣＣＤ
カメラを用いた。二次元検出器６８からの信号はデータ
処理装置６９で処理し，色補正計算によりそれぞれの蛍
光体からの発光を識別する。色補正計算は，それぞれの
発光スペクトルと光学フイルターの透過特性から求まる
パラメータにより，観測された二種類の発光スペクトル
の発光強度値の線形結合により，それぞれの蛍光体の発
光強度を求めるものである。観測された信号の一例を図
３に示す。λファージＤＮＡをHindIIIで消化した断片
からの信号とそれをさらにHinfＩで消化した断片からの
信号を明瞭に識別して検出することができる。
の電気泳動路に注入し，電気泳動９を行う。ガラス板６
１に挟まれる電気泳動用のゲル６０としては，３％のア
クリルアミドゲルを用いる。ゲル６０の上端と下端の間
に３０Ｖ／cm程度の電圧を印加する。蛍光の計測は，泳
動距離１０cmのところで，ゲル６０の端面より，レーザ
光源６２からのアルゴンレーザ光６３を反射鏡６４によ
り，ＤＮＡ断片７０の泳動方向に垂直に入射させること
により行う。反応生成物中の各ＤＮＡ断片７０がレーザ
光の照射部位を通過するときに発する発光像を蛍光二色
検出装置で受光する。蛍光二色検出装置は，レーザ光照
射部位の線状の像を二つに分割するプリズム６５，それ
ぞれの像からのビームが通過するそれぞれ透過特性の異
なる光学フィルター６６，像を結像せしめるレンズ系６
７と二次元検出器６８から構成される。光学フィルター
６６として，ＴＲＩＴＣ３からの発光を主に透過させる
中心波長５８０ｎｍで半値幅４０ｎｍのものと，テキサ
スレッド４からの発光を主に透過させる中心波長６１５
ｎｍで半値幅３０ｎｍのものを用いた。二次元検出器６
８としては，イメージインテンシファイア付きのＣＣＤ
カメラを用いた。二次元検出器６８からの信号はデータ
処理装置６９で処理し，色補正計算によりそれぞれの蛍
光体からの発光を識別する。色補正計算は，それぞれの
発光スペクトルと光学フイルターの透過特性から求まる
パラメータにより，観測された二種類の発光スペクトル
の発光強度値の線形結合により，それぞれの蛍光体の発
光強度を求めるものである。観測された信号の一例を図
３に示す。λファージＤＮＡをHindIIIで消化した断片
からの信号とそれをさらにHinfＩで消化した断片からの
信号を明瞭に識別して検出することができる。
【００２６】本実施例は，λファージＤＮＡをモデル試
料として用いたものであるが，本手法は以下のような用
途に有効である。まず第一に，その制限酵素切断断片の
分子量分布を調査したいＤＮＡの，ある制限酵素消化物
と，その切断断片の分子量分布が知られている特定の制
限酵素消化物を，それぞれ異なる蛍光体の組み合わせで
標識しておき，それぞれの電気泳動パターンの比較をそ
れぞれの発光の波長を識別して行う。これにより前記の
ＤＮＡ断片の分子量分布を求めることが可能となる。他
の例として，例えば菌株の異なる細菌類のゲノムＤＮＡ
をそれぞれ異なる蛍光体の組み合わせで標識しておき，
それぞれの同じ制限酵素の組合せによる消化断片の電気
泳動パターンの比較を，それぞれの蛍光体の発光の波長
を識別して，その差を求めることにより，菌株の違いに
よるＤＮＡ消化断片の相違の部分のみを選択的に検出す
ることができる。後者の例は，遺伝性の疾患を有する個
体と正常な個体間の比較を行う場合にも有効である。
料として用いたものであるが，本手法は以下のような用
途に有効である。まず第一に，その制限酵素切断断片の
分子量分布を調査したいＤＮＡの，ある制限酵素消化物
と，その切断断片の分子量分布が知られている特定の制
限酵素消化物を，それぞれ異なる蛍光体の組み合わせで
標識しておき，それぞれの電気泳動パターンの比較をそ
れぞれの発光の波長を識別して行う。これにより前記の
ＤＮＡ断片の分子量分布を求めることが可能となる。他
の例として，例えば菌株の異なる細菌類のゲノムＤＮＡ
をそれぞれ異なる蛍光体の組み合わせで標識しておき，
それぞれの同じ制限酵素の組合せによる消化断片の電気
泳動パターンの比較を，それぞれの蛍光体の発光の波長
を識別して，その差を求めることにより，菌株の違いに
よるＤＮＡ消化断片の相違の部分のみを選択的に検出す
ることができる。後者の例は，遺伝性の疾患を有する個
体と正常な個体間の比較を行う場合にも有効である。
【００２７】第２の実施例 本発明による第２の実施例を図４および図５により説明
する。本実施例は，ＤＮＡの塩基配列の決定を対象にし
たものである。ＤＮＡのシーケンス反応はサンガー法に
よる。ＤＮＡの４種の塩基に対応する，シーケンス用の
プライマー３３，３４，３５，３６として以下の４種の
蛍光体の組み合わせを用いる。最初の二つは，第一の実
施例と同じ組み合わせ，ＦＩＴＣ２８とＴＲＩＴＣ２
９，およびテキサスレッド３０であり，残りの二つとし
て，ＦＩＴＣ２８と５２６ｎｍに発光のピークをもつサ
クシニルフルオレセイン誘導体(ＳＦ５２６)３１，およ
びＦＩＴＣ２８と６８０ｎｍに発光のピークをもつフタ
ロシアニン誘導体３２の組み合わせを用いた。ＦＩＴＣ
２８と上記の各蛍光体はプライマー上で４塩基程度離し
て標識する。エネルギー供与体および受容体のオリゴヌ
クレオチドへの標識には，第１の実施例と同じように，
特開昭61−44353号公報に開示の方法を用いる。エネル
ギー供与体および受容体をオリゴヌクレオチドに一個ず
つ標識するために以下の標識法を用いる。上記の標識位
置にホスホン酸を導入したオリゴヌクレオチドにまずＦ
ＩＴＣ２８を標識する反応を行う。この時反応生成物を
液体クロマトグラフィーで随時モニターし，ＤＮＡ由来
の２６０ｎｍの吸光度とＦＩＴＣ２８由来の４９０ｎｍ
の吸光度を比較することにより，ＦＩＴＣ２８がある程
度導入されて，しかも，ＦＩＴＣ２８が２個導入されて
いるものがそれほど多くない段階で反応を停止する。こ
の反応生成物をアクリルアミドゲル中で電気泳動し，無
標識のオリゴヌクレオチドとＦＩＴＣ２８が一個および
二個導入されたものを分離し，ＦＩＴＣ２８が一個導入
された部分を含むゲルを切り出し，その中に含まれるオ
リゴヌクレオチドを精製する。このようにして生成した
ＦＩＴＣ標識ＤＮＡオリゴマーに，ＴＲＩＴＣ２９，テ
キサスレッド３０，ＳＦ５２６ ３１，フタロシアニン
誘導体３２をそれぞれ標識する反応を行う。以上の反応
プロセスにより，ＴＲＩＴＣ２９，テキサスレッド３
０，ＳＦ526 ３１，フタロシアニン誘導体３２のいずれ
かと，ＦＩＴＣ２８が一個ずつ標識されたＤＮＡオリゴ
マー３３，３４，３５，３６が得られる。なお，サキシ
ニルフルオレセイン誘導体およびフタロシアニン誘導体
はそれぞれ特開平1−180455号公報，ＰＣＴ出願ＷＯ８
８／０４７７７号公報に開示の方法で合成できる。
する。本実施例は，ＤＮＡの塩基配列の決定を対象にし
たものである。ＤＮＡのシーケンス反応はサンガー法に
よる。ＤＮＡの４種の塩基に対応する，シーケンス用の
プライマー３３，３４，３５，３６として以下の４種の
蛍光体の組み合わせを用いる。最初の二つは，第一の実
施例と同じ組み合わせ，ＦＩＴＣ２８とＴＲＩＴＣ２
９，およびテキサスレッド３０であり，残りの二つとし
て，ＦＩＴＣ２８と５２６ｎｍに発光のピークをもつサ
クシニルフルオレセイン誘導体(ＳＦ５２６)３１，およ
びＦＩＴＣ２８と６８０ｎｍに発光のピークをもつフタ
ロシアニン誘導体３２の組み合わせを用いた。ＦＩＴＣ
２８と上記の各蛍光体はプライマー上で４塩基程度離し
て標識する。エネルギー供与体および受容体のオリゴヌ
クレオチドへの標識には，第１の実施例と同じように，
特開昭61−44353号公報に開示の方法を用いる。エネル
ギー供与体および受容体をオリゴヌクレオチドに一個ず
つ標識するために以下の標識法を用いる。上記の標識位
置にホスホン酸を導入したオリゴヌクレオチドにまずＦ
ＩＴＣ２８を標識する反応を行う。この時反応生成物を
液体クロマトグラフィーで随時モニターし，ＤＮＡ由来
の２６０ｎｍの吸光度とＦＩＴＣ２８由来の４９０ｎｍ
の吸光度を比較することにより，ＦＩＴＣ２８がある程
度導入されて，しかも，ＦＩＴＣ２８が２個導入されて
いるものがそれほど多くない段階で反応を停止する。こ
の反応生成物をアクリルアミドゲル中で電気泳動し，無
標識のオリゴヌクレオチドとＦＩＴＣ２８が一個および
二個導入されたものを分離し，ＦＩＴＣ２８が一個導入
された部分を含むゲルを切り出し，その中に含まれるオ
リゴヌクレオチドを精製する。このようにして生成した
ＦＩＴＣ標識ＤＮＡオリゴマーに，ＴＲＩＴＣ２９，テ
キサスレッド３０，ＳＦ５２６ ３１，フタロシアニン
誘導体３２をそれぞれ標識する反応を行う。以上の反応
プロセスにより，ＴＲＩＴＣ２９，テキサスレッド３
０，ＳＦ526 ３１，フタロシアニン誘導体３２のいずれ
かと，ＦＩＴＣ２８が一個ずつ標識されたＤＮＡオリゴ
マー３３，３４，３５，３６が得られる。なお，サキシ
ニルフルオレセイン誘導体およびフタロシアニン誘導体
はそれぞれ特開平1−180455号公報，ＰＣＴ出願ＷＯ８
８／０４７７７号公報に開示の方法で合成できる。
【００２８】シーケンス反応３７は通常の反応プロトコ
ルに準じて行う。塩基種ごとの反応生成物３８，３９，
４０，４１を混合８して，図５に示すように，ガラス板
６１に挟まれ，ウレアを混合した変性条件下のアクリル
アミドゲル６０の同一泳動路で電気泳動９を行い，ＤＮ
Ａ断片をその分子量によって分離し，レーザ光４７を泳
動路と垂直なゲル６０の側面方向から入射して，ＤＮＡ
断片から発する蛍光を検出する。ＤＮＡ断片上の標識蛍
光体からの発光の計測４４は，第１の実施例と同様な励
起用レーザ光，電気泳動装置，および光検出器の組合せ
により検出する。第１の実施例との違いは，図５に示し
た発光像の像分割部分にあり，本実施例では４種類の発
光を検出するために，五角形のプリズム４８と透過特性
のことなる４種類の光学フィルター４９を用い，結像レ
ンズ系５０により結像面５１に像５２を結像させる。
ルに準じて行う。塩基種ごとの反応生成物３８，３９，
４０，４１を混合８して，図５に示すように，ガラス板
６１に挟まれ，ウレアを混合した変性条件下のアクリル
アミドゲル６０の同一泳動路で電気泳動９を行い，ＤＮ
Ａ断片をその分子量によって分離し，レーザ光４７を泳
動路と垂直なゲル６０の側面方向から入射して，ＤＮＡ
断片から発する蛍光を検出する。ＤＮＡ断片上の標識蛍
光体からの発光の計測４４は，第１の実施例と同様な励
起用レーザ光，電気泳動装置，および光検出器の組合せ
により検出する。第１の実施例との違いは，図５に示し
た発光像の像分割部分にあり，本実施例では４種類の発
光を検出するために，五角形のプリズム４８と透過特性
のことなる４種類の光学フィルター４９を用い，結像レ
ンズ系５０により結像面５１に像５２を結像させる。
【００２９】なお本実施例では，４番目のプローブの代
替例として図６に示すように，ＦＩＴＣ２８，テキサス
レッド３０，フタロシアニン誘導体３２の３種類の蛍光
体を４塩基程度ずつ離してプライマーを標識し，Ｔ反応
用プライマー３６を得て，フタロシアニン誘導体３２か
らの発光を高い効率で観測することができる。
替例として図６に示すように，ＦＩＴＣ２８，テキサス
レッド３０，フタロシアニン誘導体３２の３種類の蛍光
体を４塩基程度ずつ離してプライマーを標識し，Ｔ反応
用プライマー３６を得て，フタロシアニン誘導体３２か
らの発光を高い効率で観測することができる。
【００３０】この例では，三分子の分子間のエネルギー
移動を利用している。すなわち，まず最も短波長側に発
光ピークを有する蛍光体ＦＩＴＣ２８を励起して，この
蛍光体の蛍光スペクトルと重なりの大きな励起スペクト
ルを持つ第二の蛍光体，テキサスレッド３０との間でエ
ネルギー移動を起こして，これを励起する。次にこの第
二の蛍光体の蛍光スペクトルと重なりの大きな励起スペ
クトルを持つ第三の蛍光体，フタロシアニン誘導体３２
との間でエネルギー移動を起こして，これを励起する。
このように順次長波長側の蛍光スペクトルを持つ蛍光体
を励起することにより，励起波長と発光波長のシフトを
大きくしている。
移動を利用している。すなわち，まず最も短波長側に発
光ピークを有する蛍光体ＦＩＴＣ２８を励起して，この
蛍光体の蛍光スペクトルと重なりの大きな励起スペクト
ルを持つ第二の蛍光体，テキサスレッド３０との間でエ
ネルギー移動を起こして，これを励起する。次にこの第
二の蛍光体の蛍光スペクトルと重なりの大きな励起スペ
クトルを持つ第三の蛍光体，フタロシアニン誘導体３２
との間でエネルギー移動を起こして，これを励起する。
このように順次長波長側の蛍光スペクトルを持つ蛍光体
を励起することにより，励起波長と発光波長のシフトを
大きくしている。
【００３１】第３の実施例 以下，本発明による第３の実施例を図７により説明す
る。本実施例は，ＤＮＡの塩基配列の決定を対象にした
ものである。ＤＮＡのシーケンス反応はサンガー法によ
る。本実施例では，シーケンス用のプライマーとして以
下のものを用いる。蛍光体の組み合わせとしては，エネ
ルギー供与体としてアルゴンイオンレーザ（発振波長４
８８ｎｍ）で効率よく励起できるフルオレセインイソチ
オシアネイト（ＦＩＴＣ）７１，エネルギー受容体とし
て励起スペクトルがＦＩＴＣ７１の蛍光スペクトルと重
なりが大きくかつ蛍光スペクトルの極大がＦＩＴＣ７１
のそれと１００ｎｍ近く離れているスルフォローダミン
１０１の塩化スルフォン酸誘導体（商品名テキサスレッ
ド）７２を用いる。４種のプライマー７３，７４，７
５，７６に対応して，それぞれプライマー上でのＦＩＴ
Ｃ７１とテキサスレッド７２の距離を変える。すなわ
ち，ＦＩＴＣ７１とテキサスレッド７２を２塩基，５塩
基，９塩基，１２塩基離して標識する。プライマーの塩
基配列としては，Ｍ１３ファージの制限酵素によるカッ
ティングサイトのすぐ上流の３０ｍｅｒとした。
る。本実施例は，ＤＮＡの塩基配列の決定を対象にした
ものである。ＤＮＡのシーケンス反応はサンガー法によ
る。本実施例では，シーケンス用のプライマーとして以
下のものを用いる。蛍光体の組み合わせとしては，エネ
ルギー供与体としてアルゴンイオンレーザ（発振波長４
８８ｎｍ）で効率よく励起できるフルオレセインイソチ
オシアネイト（ＦＩＴＣ）７１，エネルギー受容体とし
て励起スペクトルがＦＩＴＣ７１の蛍光スペクトルと重
なりが大きくかつ蛍光スペクトルの極大がＦＩＴＣ７１
のそれと１００ｎｍ近く離れているスルフォローダミン
１０１の塩化スルフォン酸誘導体（商品名テキサスレッ
ド）７２を用いる。４種のプライマー７３，７４，７
５，７６に対応して，それぞれプライマー上でのＦＩＴ
Ｃ７１とテキサスレッド７２の距離を変える。すなわ
ち，ＦＩＴＣ７１とテキサスレッド７２を２塩基，５塩
基，９塩基，１２塩基離して標識する。プライマーの塩
基配列としては，Ｍ１３ファージの制限酵素によるカッ
ティングサイトのすぐ上流の３０ｍｅｒとした。
【００３２】エネルギー供与体および受容体のオリゴヌ
クレオチドへの標識には，第１の実施例と同じように，
特開昭６１−４４３５３号公報に開示の方法を用いる。
エネルギー供与体および受容体をオリゴヌクレオチドに
一個ずつ標識するために以下の標識法を用いる。上記の
標識位置にホスホン酸を導入したオリゴヌクレオチドに
まずＦＩＴＣ７１を標識する反応を行う。この時反応生
成物を液体クロマトグラフィーで随時モニターし，ＤＮ
Ａ由来の２６０ｎｍの吸光度とＦＩＴＣ７１由来の４９
０ｎｍの吸光度を比較することにより，ＦＩＴＣ７１が
ある程度導入されて，しかも，ＦＩＴＣ７１が２個導入
されているものがそれほど多くない段階で反応を停止す
る。この反応生成物をアクリルアミドゲル中で電気泳動
し，無標識のオリゴヌクレオチドとＦＩＴＣ７１が一個
および二個導入されたものを分離し，ＦＩＴＣ７１が一
個導入された部分を含むゲルを切り出し，その中に含ま
れるオリゴヌクレオチドを精製する。このようにして生
成したＦＩＴＣ標識ＤＮＡオリゴマーにテキサスレッド
７２を標識する反応を行う。以上の反応プロセスにより
ＦＩＴＣ７１とテキサスレッド７２が一個ずつ標識され
たＤＮＡオリゴマー７３，７４，７５，７６が得られ
る。
クレオチドへの標識には，第１の実施例と同じように，
特開昭６１−４４３５３号公報に開示の方法を用いる。
エネルギー供与体および受容体をオリゴヌクレオチドに
一個ずつ標識するために以下の標識法を用いる。上記の
標識位置にホスホン酸を導入したオリゴヌクレオチドに
まずＦＩＴＣ７１を標識する反応を行う。この時反応生
成物を液体クロマトグラフィーで随時モニターし，ＤＮ
Ａ由来の２６０ｎｍの吸光度とＦＩＴＣ７１由来の４９
０ｎｍの吸光度を比較することにより，ＦＩＴＣ７１が
ある程度導入されて，しかも，ＦＩＴＣ７１が２個導入
されているものがそれほど多くない段階で反応を停止す
る。この反応生成物をアクリルアミドゲル中で電気泳動
し，無標識のオリゴヌクレオチドとＦＩＴＣ７１が一個
および二個導入されたものを分離し，ＦＩＴＣ７１が一
個導入された部分を含むゲルを切り出し，その中に含ま
れるオリゴヌクレオチドを精製する。このようにして生
成したＦＩＴＣ標識ＤＮＡオリゴマーにテキサスレッド
７２を標識する反応を行う。以上の反応プロセスにより
ＦＩＴＣ７１とテキサスレッド７２が一個ずつ標識され
たＤＮＡオリゴマー７３，７４，７５，７６が得られ
る。
【００３３】以上により調製されたＤＮＡオリゴマー，
すなわちプライマー７３，７４，７５，７６を用いて塩
基種ごとにシーケンス反応３７を行う。次に，これら反
応生成物３８，３９，４０，４１を混合８し，同一の泳
動路で電気泳動９を行う。電気泳動用のゲル６０とし
て，ガラス板６１に挟まれる，変性剤としてウレアを混
入した，４.５％のアクリルアミドゲルを用いる。ゲル
６０の上端と下端の間に３０Ｖ／cm程度の電圧を印加す
る。蛍光の計測は，泳動距離３０cmのところで，ゲル６
０の端面よりレーザ光源６２からのアルゴンレーザ光６
３を，反射鏡６４を使用し泳動方向に垂直に入射させる
ことにより行う。反応生成物中の各ＤＮＡ断片７０がレ
ーザ光の照射部位を通過するときに発する発光像を蛍光
二色検出装置で受光する。蛍光二色検出装置は，第１の
実施例で説明した図１に示すものと同様である。光学フ
ィルター６６として，ＦＩＴＣ７１からの発光を透過さ
せる中心波長５２０ｎｍで半値幅３０ｎｍのものと，テ
キサスレッド７２からの発光を透過させる中心波長６１
５ｎｍで半値幅３０ｎｍのものを用いた。
すなわちプライマー７３，７４，７５，７６を用いて塩
基種ごとにシーケンス反応３７を行う。次に，これら反
応生成物３８，３９，４０，４１を混合８し，同一の泳
動路で電気泳動９を行う。電気泳動用のゲル６０とし
て，ガラス板６１に挟まれる，変性剤としてウレアを混
入した，４.５％のアクリルアミドゲルを用いる。ゲル
６０の上端と下端の間に３０Ｖ／cm程度の電圧を印加す
る。蛍光の計測は，泳動距離３０cmのところで，ゲル６
０の端面よりレーザ光源６２からのアルゴンレーザ光６
３を，反射鏡６４を使用し泳動方向に垂直に入射させる
ことにより行う。反応生成物中の各ＤＮＡ断片７０がレ
ーザ光の照射部位を通過するときに発する発光像を蛍光
二色検出装置で受光する。蛍光二色検出装置は，第１の
実施例で説明した図１に示すものと同様である。光学フ
ィルター６６として，ＦＩＴＣ７１からの発光を透過さ
せる中心波長５２０ｎｍで半値幅３０ｎｍのものと，テ
キサスレッド７２からの発光を透過させる中心波長６１
５ｎｍで半値幅３０ｎｍのものを用いた。
【００３４】これら塩基種ごとのＤＮＡ断片を発振波長
４８８ｎｍのアルゴンレーザで励起すると，ＦＩＴＣ７
１とテキサスレッド７２の距離に対応して，エネルギー
移動の効率が違うため，５２０ｎｍにピークをもつＦＩ
ＴＣ７１による発光と６２０ｎｍにピークをもつテキサ
スレッド７２による発光の強度比を計測することにより
４種のプライマー３８，３９，４０，４１を識別でき
る。すなわち，二次元検出器６８からの信号をデータ処
理装置６９で処理し，それぞれの蛍光体からの発光を識
別し，その強度比を計算し塩基種を特定する。
４８８ｎｍのアルゴンレーザで励起すると，ＦＩＴＣ７
１とテキサスレッド７２の距離に対応して，エネルギー
移動の効率が違うため，５２０ｎｍにピークをもつＦＩ
ＴＣ７１による発光と６２０ｎｍにピークをもつテキサ
スレッド７２による発光の強度比を計測することにより
４種のプライマー３８，３９，４０，４１を識別でき
る。すなわち，二次元検出器６８からの信号をデータ処
理装置６９で処理し，それぞれの蛍光体からの発光を識
別し，その強度比を計算し塩基種を特定する。
【００３５】本実施例では，平板状のゲル６０を用いた
電気泳動によるシーケンシングを説明したが，本発明は
それに限定されるものではない。特に，５０μｍから１
００μｍ程度の単一細管中のゲルまたは電解液中での電
気泳動，すなわちキャピラリー電気泳動によるシーケン
シングでは，塩基種ごとの４種の試料を同時に泳動する
ことが必須なため，効果が大きい。
電気泳動によるシーケンシングを説明したが，本発明は
それに限定されるものではない。特に，５０μｍから１
００μｍ程度の単一細管中のゲルまたは電解液中での電
気泳動，すなわちキャピラリー電気泳動によるシーケン
シングでは，塩基種ごとの４種の試料を同時に泳動する
ことが必須なため，効果が大きい。
【００３６】また，本実施例ではその間でエネルギー移
動を生ずる蛍光体の組み合わせとしてアルゴンイオンレ
ーザで励起できる，ＦＩＴＣ７１とテキサスレッド７２
を選定したが，本発明はそれに限定されるものではな
い。特に，官能基あるいは中心金属を変えることによ
り，６５０ｎｍから７５０ｎｍの領域で，その蛍光スペ
クトルを変化させることが可能な，フタロシアニン誘導
体の適当な組み合わせを選択すれば，半導体レーザで励
起することが可能となり，装置の小型化，低価格化も実
現できる。
動を生ずる蛍光体の組み合わせとしてアルゴンイオンレ
ーザで励起できる，ＦＩＴＣ７１とテキサスレッド７２
を選定したが，本発明はそれに限定されるものではな
い。特に，官能基あるいは中心金属を変えることによ
り，６５０ｎｍから７５０ｎｍの領域で，その蛍光スペ
クトルを変化させることが可能な，フタロシアニン誘導
体の適当な組み合わせを選択すれば，半導体レーザで励
起することが可能となり，装置の小型化，低価格化も実
現できる。
【００３７】第４の実施例 本発明による第４の実施例を図８により説明する。本実
施例は，ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の同一泳動
路での同時シーケンスを実現するものである。本実施例
では，プラスミドＰＵＣ１８にインサートされたＤＮＡ
試料を対象とする。センス鎖方向プライマー８７，８
８，８９，９０は，エネルギー供与体として，アルゴン
イオンレーザで効率よく励起でき，かつその蛍光スペク
トルがテキサスレッド８４の励起スペクトルと重なりの
大きな５２６ｎｍに発光のピークをもつサクシニルフル
オレセイン誘導体（ＳＦ５２６）８３，エネルギー受容
体としてテキサスレッド８４により標識される。上記四
種のプライマーにおけるエネルギー供与体と受容体間の
距離は第３の実施例で用いたのと同様，２塩基，５塩
基，９塩基，１２塩基である。反対方向のシーケンシン
グ用プライマー，アンチセンス鎖方向プライマー９１，
９２，９３，９４は，エネルギー供与体として，やはり
アルゴンイオンレーザで効率よく励起でき，かつＳＦ５
２６ ８３の蛍光スペクトルと明瞭に識別できる，５０
５ｎｍに発光のピークをもつサクシニルフルオレセイン
誘導体（ＳＦ５０５）８５，エネルギー受容体として励
起スペクトルがＳＦ５０５ ８５の蛍光スペクトルと重
なりが大きくかつ蛍光スペクトルの極大が５８０ｎｍで
ＳＦ５０５ ８５,ＳＦ５２６ ８３およびテキサスレッ
ド８４のそれと明瞭に識別が可能なテトラメチルローダ
ミンイソチオシアネイト（ＴＲＩＴＣ）８６により標識
される。上記四種のプライマーにおけるエネルギー供与
体と受容体間の距離は第３の実施例で用いたのと同様，
２塩基，５塩基，９塩基，１２塩基である。また塩基配
列はＰＵＣのカッティングサイトのすぐ下流の３０塩基
とする。なおＳＦ５０５およびＳＦ５２６は，特開平1
−180455号公報に開示の方法で合成できる。
施例は，ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の同一泳動
路での同時シーケンスを実現するものである。本実施例
では，プラスミドＰＵＣ１８にインサートされたＤＮＡ
試料を対象とする。センス鎖方向プライマー８７，８
８，８９，９０は，エネルギー供与体として，アルゴン
イオンレーザで効率よく励起でき，かつその蛍光スペク
トルがテキサスレッド８４の励起スペクトルと重なりの
大きな５２６ｎｍに発光のピークをもつサクシニルフル
オレセイン誘導体（ＳＦ５２６）８３，エネルギー受容
体としてテキサスレッド８４により標識される。上記四
種のプライマーにおけるエネルギー供与体と受容体間の
距離は第３の実施例で用いたのと同様，２塩基，５塩
基，９塩基，１２塩基である。反対方向のシーケンシン
グ用プライマー，アンチセンス鎖方向プライマー９１，
９２，９３，９４は，エネルギー供与体として，やはり
アルゴンイオンレーザで効率よく励起でき，かつＳＦ５
２６ ８３の蛍光スペクトルと明瞭に識別できる，５０
５ｎｍに発光のピークをもつサクシニルフルオレセイン
誘導体（ＳＦ５０５）８５，エネルギー受容体として励
起スペクトルがＳＦ５０５ ８５の蛍光スペクトルと重
なりが大きくかつ蛍光スペクトルの極大が５８０ｎｍで
ＳＦ５０５ ８５,ＳＦ５２６ ８３およびテキサスレッ
ド８４のそれと明瞭に識別が可能なテトラメチルローダ
ミンイソチオシアネイト（ＴＲＩＴＣ）８６により標識
される。上記四種のプライマーにおけるエネルギー供与
体と受容体間の距離は第３の実施例で用いたのと同様，
２塩基，５塩基，９塩基，１２塩基である。また塩基配
列はＰＵＣのカッティングサイトのすぐ下流の３０塩基
とする。なおＳＦ５０５およびＳＦ５２６は，特開平1
−180455号公報に開示の方法で合成できる。
【００３８】シーケンス反応９５，６は通常の反応プロ
トコルに準じて行う。塩基種ごとの反応生成物９７ａ，
９７ｂを混合８して，図５に示すように，ガラス板６１
に挟まれる，ウレアを混合した変性条件下のアクリルア
ミドゲル６０中の同一の泳動路で電気泳動３９により，
ＤＮＡ断片をその分子量によって分離する。ＤＮＡ断片
上の蛍光標識からのエネルギー移動に基づく蛍光体の発
光の計測４４は，図１に示す，第１の実施例と同様な励
起用レーザ光，電気泳動装置，および光検出器の組合せ
により検出する。第１の実施例との違いは，図５に示し
た発光像の像分割部分で，本実施例ではレーザ光４７に
より励起される四種類の発光を検出するために，五角形
のプリズム４８と透過特性の異なる四種類の光学フィル
ター４９を用いる。以上の光学系により四種類の蛍光体
からの発光を識別して検出することが可能となる。デー
タ処理装置６９でＳＦ５２６ ８３とテキサスレッド８
４，ＳＦ５０５ ８５とＴＲＩＴＣ２６の発光強度比を
計算することによって，解析しようとするＤＮＡの方向
および塩基種の配列を特定できる。
トコルに準じて行う。塩基種ごとの反応生成物９７ａ，
９７ｂを混合８して，図５に示すように，ガラス板６１
に挟まれる，ウレアを混合した変性条件下のアクリルア
ミドゲル６０中の同一の泳動路で電気泳動３９により，
ＤＮＡ断片をその分子量によって分離する。ＤＮＡ断片
上の蛍光標識からのエネルギー移動に基づく蛍光体の発
光の計測４４は，図１に示す，第１の実施例と同様な励
起用レーザ光，電気泳動装置，および光検出器の組合せ
により検出する。第１の実施例との違いは，図５に示し
た発光像の像分割部分で，本実施例ではレーザ光４７に
より励起される四種類の発光を検出するために，五角形
のプリズム４８と透過特性の異なる四種類の光学フィル
ター４９を用いる。以上の光学系により四種類の蛍光体
からの発光を識別して検出することが可能となる。デー
タ処理装置６９でＳＦ５２６ ８３とテキサスレッド８
４，ＳＦ５０５ ８５とＴＲＩＴＣ２６の発光強度比を
計算することによって，解析しようとするＤＮＡの方向
および塩基種の配列を特定できる。
【００３９】第５の実施例 本発明による第５の実施例を図９により説明する。本実
施例では，λファージＤＮＡをモデル物質として，これ
を異なる組み合わせの制限酵素で切断した試料を相互の
距離がそれぞれ異なるエネルギー供与体と受容体で標識
しておき，それを同一泳動路で，同時に電気泳動し，そ
のパターンの違いを供与体と受容体からの発光強度比の
違いにより識別する。
施例では，λファージＤＮＡをモデル物質として，これ
を異なる組み合わせの制限酵素で切断した試料を相互の
距離がそれぞれ異なるエネルギー供与体と受容体で標識
しておき，それを同一泳動路で，同時に電気泳動し，そ
のパターンの違いを供与体と受容体からの発光強度比の
違いにより識別する。
【００４０】本実施例では，制限酵素HindIIIの切断部
位に，その間でエネルギー移動を生ずる二種類の蛍光体
を標識した二本鎖ＤＮＡオリゴマー１ｃ，１ｄをライゲ
ーション反応６により導入する。エネルギー供与体とし
てはＦＩＴＣ２，エネルギー受容体としてテキサスレッ
ド４ａ，４ｂを用いる。ライゲーション反応６による標
識蛍光体の導入に用いるＤＮＡ二本鎖オリゴマーは以下
の配列番号１の構造を有し，右端の一本鎖部分がHindII
Iによる切断形状と一致しており，ライゲーション反応
６により，HindIII切断断片の切断部位に選択的に結合
する。
位に，その間でエネルギー移動を生ずる二種類の蛍光体
を標識した二本鎖ＤＮＡオリゴマー１ｃ，１ｄをライゲ
ーション反応６により導入する。エネルギー供与体とし
てはＦＩＴＣ２，エネルギー受容体としてテキサスレッ
ド４ａ，４ｂを用いる。ライゲーション反応６による標
識蛍光体の導入に用いるＤＮＡ二本鎖オリゴマーは以下
の配列番号１の構造を有し，右端の一本鎖部分がHindII
Iによる切断形状と一致しており，ライゲーション反応
６により，HindIII切断断片の切断部位に選択的に結合
する。
【００４１】 ５′−ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３′ ３′−ＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＴＣＧＡ−５′ 蛍光体の標識位置は，ＦＩＴＣ２が上側の鎖の５′側か
ら３番目のＴと４番目のＴの間のリンの部分とし，テキ
サスレッド４ａ，４ｂがそれぞれ下側の鎖の３′側から
７番目のＴと８番目のＴの間のリンの部分，同じく３′
側から１２番目のＣと１３番目のＴの間のリンの部分で
あり，エネルギー供与体および受容体のオリゴヌクレオ
チドへの標識には第３の実施例と同様な方法を用いる。
二本鎖オリゴマーは，それを構成する各鎖を別々に合成
し，後からアニーリングにより二本鎖とする。
ら３番目のＴと４番目のＴの間のリンの部分とし，テキ
サスレッド４ａ，４ｂがそれぞれ下側の鎖の３′側から
７番目のＴと８番目のＴの間のリンの部分，同じく３′
側から１２番目のＣと１３番目のＴの間のリンの部分で
あり，エネルギー供与体および受容体のオリゴヌクレオ
チドへの標識には第３の実施例と同様な方法を用いる。
二本鎖オリゴマーは，それを構成する各鎖を別々に合成
し，後からアニーリングにより二本鎖とする。
【００４２】ＤＮＡ試料の調製は以下の手順で行う。λ
ファージＤＮＡを制限酵素HindIIIで消化した分解生成
物(λ／HindIII；市販品）５に，それぞれ約十倍量の蛍
光標識した二本鎖ＤＮＡオリゴマー１ｃ，１ｄを加え，
市販のライゲーションキットを用いて，１６℃で３０分
間ライゲーション反応６を行ない，反応生成物をエタノ
ール沈殿により精製する。次に，３′側から１２番目の
Ｃと１３番目のＴの間にテキサスレッド４ｂを含む反応
生成物を５０ｍＭのTris−ＨＣｌ(ｐＨ７.５),１０ｍＭ
のＭｇＣｌ2，１ｍＭのDithiothreitol，５０ｍＭのＮ
ａＣｌからなる，３７℃のバッファー中で制限酵素Hinf
Ｉにより制限酵素消化反応７を行い，反応生成物をエタ
ノール沈殿により精製する。
ファージＤＮＡを制限酵素HindIIIで消化した分解生成
物(λ／HindIII；市販品）５に，それぞれ約十倍量の蛍
光標識した二本鎖ＤＮＡオリゴマー１ｃ，１ｄを加え，
市販のライゲーションキットを用いて，１６℃で３０分
間ライゲーション反応６を行ない，反応生成物をエタノ
ール沈殿により精製する。次に，３′側から１２番目の
Ｃと１３番目のＴの間にテキサスレッド４ｂを含む反応
生成物を５０ｍＭのTris−ＨＣｌ(ｐＨ７.５),１０ｍＭ
のＭｇＣｌ2，１ｍＭのDithiothreitol，５０ｍＭのＮ
ａＣｌからなる，３７℃のバッファー中で制限酵素Hinf
Ｉにより制限酵素消化反応７を行い，反応生成物をエタ
ノール沈殿により精製する。
【００４３】次に，これら反応生成物を混合８し，同一
の泳動路で電気泳動９を次の条件で行う。電気泳動９の
ゲルとしては，３％のアクリルアミドゲルを用いる。ゲ
ルの上端と下端の間に３０Ｖ／cm程度の電圧を印加し，
発光の計測４４は，泳動距離１０cmのところで，ゲルの
端面よりアルゴンレーザ光を泳動方向に垂直に入射させ
て行う。反応生成物中の各ＤＮＡ断片７０がレーザ光の
照射部位を通過するときに発する発光像を図７に示すよ
うな蛍光二色検出装置で検出する。蛍光二色検出装置は
第３の実施例と同じものを用いる。５２０ｎｍ近辺の発
光強度と６２０ｎｍ近辺の発光強度をデータ解析するこ
とにより，λファージＤＮＡをHindIIIで消化した断片
からの信号とそれをさらにHinfＩで消化した断片からの
信号を明瞭に識別して検出することができる。
の泳動路で電気泳動９を次の条件で行う。電気泳動９の
ゲルとしては，３％のアクリルアミドゲルを用いる。ゲ
ルの上端と下端の間に３０Ｖ／cm程度の電圧を印加し，
発光の計測４４は，泳動距離１０cmのところで，ゲルの
端面よりアルゴンレーザ光を泳動方向に垂直に入射させ
て行う。反応生成物中の各ＤＮＡ断片７０がレーザ光の
照射部位を通過するときに発する発光像を図７に示すよ
うな蛍光二色検出装置で検出する。蛍光二色検出装置は
第３の実施例と同じものを用いる。５２０ｎｍ近辺の発
光強度と６２０ｎｍ近辺の発光強度をデータ解析するこ
とにより，λファージＤＮＡをHindIIIで消化した断片
からの信号とそれをさらにHinfＩで消化した断片からの
信号を明瞭に識別して検出することができる。
【００４４】本実施例は，λファージＤＮＡをモデル試
料として用いたものであるが，本手法が以下のような用
途に有効である。まず第一に，その制限酵素切断断片の
分子量分布を調査したいＤＮＡの，ある制限酵素消化物
と，その切断断片の分子量分布が知られている特定の制
限酵素消化物を，それぞれ相互の距離の異なる蛍光体の
組み合わせで標識しておき，それぞれの電気泳動パター
ンの比較をそれぞれの蛍光体の発光強度を識別して行
う。これにより前記のＤＮＡ断片の分子量分布を求める
ことができる。他の例として，例えば菌株の異なる細菌
類のゲノムＤＮＡをそれぞれ相互の距離が異なる蛍光体
の組み合わせで標識しておき，それぞれの同じ制限酵素
の組合せによる消化断片の電気泳動パターンの比較を，
それぞれの発光強度を識別して，その差を求めることに
より，菌株の違いによるＤＮＡ消化断片の相違の部分の
みを選択的に検出することができる。後者の例は，遺伝
性の疾患を有する個体と正常な個体間の比較を行う場合
にも有効である。
料として用いたものであるが，本手法が以下のような用
途に有効である。まず第一に，その制限酵素切断断片の
分子量分布を調査したいＤＮＡの，ある制限酵素消化物
と，その切断断片の分子量分布が知られている特定の制
限酵素消化物を，それぞれ相互の距離の異なる蛍光体の
組み合わせで標識しておき，それぞれの電気泳動パター
ンの比較をそれぞれの蛍光体の発光強度を識別して行
う。これにより前記のＤＮＡ断片の分子量分布を求める
ことができる。他の例として，例えば菌株の異なる細菌
類のゲノムＤＮＡをそれぞれ相互の距離が異なる蛍光体
の組み合わせで標識しておき，それぞれの同じ制限酵素
の組合せによる消化断片の電気泳動パターンの比較を，
それぞれの発光強度を識別して，その差を求めることに
より，菌株の違いによるＤＮＡ消化断片の相違の部分の
みを選択的に検出することができる。後者の例は，遺伝
性の疾患を有する個体と正常な個体間の比較を行う場合
にも有効である。
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば，電気泳動において同一
泳動路での蛍光検出を，励起光の波長と発光波長を十分
離して行うことができるため，高感度なＤＮＡの分子量
分離パターンの計測が実現できる。また，多種類の蛍光
体を単一のレーザ光で高い効率で励起できるので，高感
度かつスループットの大きなＤＮＡの分子量分離パター
ンの計測が実現できる。
泳動路での蛍光検出を，励起光の波長と発光波長を十分
離して行うことができるため，高感度なＤＮＡの分子量
分離パターンの計測が実現できる。また，多種類の蛍光
体を単一のレーザ光で高い効率で励起できるので，高感
度かつスループットの大きなＤＮＡの分子量分離パター
ンの計測が実現できる。
【００４６】また，本発明によれば二種類の蛍光体（色
素）で四種以上のＤＮＡ試料の識別が実現でき，同一の
泳動路で，単一のレーザ光で多数のＤＮＡ試料を同時に
識別して検出することが可能となる。しかも，ＤＮＡ試
料の種類ごとに蛍光体を変えて検出する場合よりも高感
度な検出が実現できる。したがって，ＤＮＡシーケンシ
ングのスループットの大幅な向上が可能となる。例え
ば，四種以上のＤＮＡ試料の同時シーケンシング，セン
ス鎖，アンチセンス鎖の同時シーケンシングなどが可能
となる。さらに，四種以上のＤＮＡ試料の制限酵素切断
断片の分子量分布の同時計測も実現できる。特に，キャ
ピラリー電気泳動を用いたシーケンシングでは塩基種ご
との四種の試料の識別が必須なため，本発明の効果が大
きい。
素）で四種以上のＤＮＡ試料の識別が実現でき，同一の
泳動路で，単一のレーザ光で多数のＤＮＡ試料を同時に
識別して検出することが可能となる。しかも，ＤＮＡ試
料の種類ごとに蛍光体を変えて検出する場合よりも高感
度な検出が実現できる。したがって，ＤＮＡシーケンシ
ングのスループットの大幅な向上が可能となる。例え
ば，四種以上のＤＮＡ試料の同時シーケンシング，セン
ス鎖，アンチセンス鎖の同時シーケンシングなどが可能
となる。さらに，四種以上のＤＮＡ試料の制限酵素切断
断片の分子量分布の同時計測も実現できる。特に，キャ
ピラリー電気泳動を用いたシーケンシングでは塩基種ご
との四種の試料の識別が必須なため，本発明の効果が大
きい。
【００４７】
【配列表】SEQUENCE LISTING 〈110〉 HITACH,LTD. 〈120〉 Electrophoresis Separation and Detection M
ethod 〈130〉 H91010622A 〈160〉 1 〈210〉 1 〈211〉 21 〈212〉 DNA 〈213〉 artificial Sequence 〈220〉 〈222〉 21 〈223〉 Complementary strand has a single stranded
-DNA " 3'- tcga -5' "extending from this point in
a direction 3' → 5', and double stranded-DNA olig
omer can be ligated with a double stranded-DNA fra
gment digestedby HindIII. 〈400〉 １ ｃｇｔｔｇｔａａａａ ｃｇａｃｇｇｃｃａｇ ｔ
２１ 配列表フリーテキスト （１）配列番号１の配列に関する他の関連する情報の記
載 末端に１本鎖「３’− ｔｃｇａ −５’」を有し，Ｈ
ｉｎｄＩＩＩによる切断部にライゲーション反応により
結合可能な２本鎖ＤＮＡ。
ethod 〈130〉 H91010622A 〈160〉 1 〈210〉 1 〈211〉 21 〈212〉 DNA 〈213〉 artificial Sequence 〈220〉 〈222〉 21 〈223〉 Complementary strand has a single stranded
-DNA " 3'- tcga -5' "extending from this point in
a direction 3' → 5', and double stranded-DNA olig
omer can be ligated with a double stranded-DNA fra
gment digestedby HindIII. 〈400〉 １ ｃｇｔｔｇｔａａａａ ｃｇａｃｇｇｃｃａｇ ｔ
２１ 配列表フリーテキスト （１）配列番号１の配列に関する他の関連する情報の記
載 末端に１本鎖「３’− ｔｃｇａ −５’」を有し，Ｈ
ｉｎｄＩＩＩによる切断部にライゲーション反応により
結合可能な２本鎖ＤＮＡ。
【図１】本発明による第１の実施例を示す模式図。
【図２】本発明による第１の実施例における構成成分の
特性を示すグラフ。
特性を示すグラフ。
【図３】本発明による第１の実施例における結果の一例
を示すグラフ。
を示すグラフ。
【図４】本発明による第２の実施例を示す模式図。
【図５】本発明による第２の実施例における検出部の構
成図。
成図。
【図６】本発明による第２の実施例におけるＴ反応用プ
ライマーの代替例。
ライマーの代替例。
【図７】本発明による第３の実施例を示す模式図。
【図８】本発明による第４の実施例を示す模式図。
【図９】本発明による第５の実施例を示す模式図。
１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｄ…蛍光標識された二本鎖オリゴ
マー，２，２８，７１…ＦＩＴＣ，３，２９，８６…Ｔ
ＲＩＴＣ，４，４ａ，４ｂ，３０，７２，８４…テキサ
スレッド，５…λ／ＨｉｎｄＩＩＩ，６…ライゲーショ
ン反応，７…制限酵素消化反応，８…混合，９…電気泳
動，１９…受容体がＴＲＩＴＣの時のスペクトル，２０
…受容体がテキサスレッドの時のスペクトル，２１…Ｆ
ＩＴＣのピーク，２２…ＴＲＩＴＣのピーク，２３…テ
キサスレッドのピーク，２４…５８０ｎｍの信号，２５
…６１５ｎｍの信号，２６…ＴＲＩＴＣの信号，２７…
テキサスレッドの信号，３１，８３…ＳＦ５２６，３２
…フタロシアニン誘導体，３３，７３…Ａ反応用プライ
マー，３４，７４…Ｃ反応用プライマー，３５，７５…
Ｇ反応用プライマー，３６，７６…Ｔ反応用プライマ
ー，３７…シーケンス反応，３８…Ａ反応生成物，３９
…Ｃ反応生成物，４０…Ｇ反応生成物，４１…Ｔ反応生
成物，４４…発光の計測，４７…レーザ光，４８…五角
形プリズム，４９…光学フィルター，５０…結像レンズ
系，５１…結像面，５２…像，６０…ゲル，６１…ガラ
ス板，６２…レーザ光源，６３…レーザ光，６４…反射
鏡，６５…プリズム，６６…光学フィルター，６７…結
像レンズ系，６８…二次元検出器，６９…データ処理装
置，７０…ＤＮＡ断片，８５…ＳＦ５０５，８７，８
８，８９，９０…センス鎖方向プライマー，９１，９
２，９３，９４…アンチセンス鎖方向プライマー，９５
…センス鎖方向シーケンス反応，９６…アンチセンス鎖
方向シーケンス反応，９７ａ，９７ｂ…シーケンス反応
生成物。
マー，２，２８，７１…ＦＩＴＣ，３，２９，８６…Ｔ
ＲＩＴＣ，４，４ａ，４ｂ，３０，７２，８４…テキサ
スレッド，５…λ／ＨｉｎｄＩＩＩ，６…ライゲーショ
ン反応，７…制限酵素消化反応，８…混合，９…電気泳
動，１９…受容体がＴＲＩＴＣの時のスペクトル，２０
…受容体がテキサスレッドの時のスペクトル，２１…Ｆ
ＩＴＣのピーク，２２…ＴＲＩＴＣのピーク，２３…テ
キサスレッドのピーク，２４…５８０ｎｍの信号，２５
…６１５ｎｍの信号，２６…ＴＲＩＴＣの信号，２７…
テキサスレッドの信号，３１，８３…ＳＦ５２６，３２
…フタロシアニン誘導体，３３，７３…Ａ反応用プライ
マー，３４，７４…Ｃ反応用プライマー，３５，７５…
Ｇ反応用プライマー，３６，７６…Ｔ反応用プライマ
ー，３７…シーケンス反応，３８…Ａ反応生成物，３９
…Ｃ反応生成物，４０…Ｇ反応生成物，４１…Ｔ反応生
成物，４４…発光の計測，４７…レーザ光，４８…五角
形プリズム，４９…光学フィルター，５０…結像レンズ
系，５１…結像面，５２…像，６０…ゲル，６１…ガラ
ス板，６２…レーザ光源，６３…レーザ光，６４…反射
鏡，６５…プリズム，６６…光学フィルター，６７…結
像レンズ系，６８…二次元検出器，６９…データ処理装
置，７０…ＤＮＡ断片，８５…ＳＦ５０５，８７，８
８，８９，９０…センス鎖方向プライマー，９１，９
２，９３，９４…アンチセンス鎖方向プライマー，９５
…センス鎖方向シーケンス反応，９６…アンチセンス鎖
方向シーケンス反応，９７ａ，９７ｂ…シーケンス反応
生成物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 吉田 基子 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者 川本 和子 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者 高橋 智 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者 西川 哲夫 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内
Claims (21)
- 【請求項１】蛍光体が標識された核酸断片試料を電気泳
動し，前記蛍光体からの蛍光を検出して前記核酸断片試
料を検出する電気泳動分離検出方法において，核酸試料
の種類毎に前記蛍光体の相互の距離を変化させて標識さ
れた二種類以上の前記蛍光体のうち少なくとも一種類の
前記蛍光体が励起されて発する蛍光と，少なくとも一種
類の励起された前記蛍光体からのエネルギーの移動によ
り他の種類の前記蛍光体から発する蛍光との強度比を計
測することにより，前記核酸試料の種類の識別を行うこ
とを特徴とする電気泳動分離検出方法。 - 【請求項２】請求項１に記載の電気泳動分離検出方法に
おいて，前記蛍光体が二種類であって，前記蛍光体はＤ
ＮＡ鎖の同一鎖上に結合することを特徴とする電気泳動
分離検出方法。 - 【請求項３】請求項２に記載の電気泳動分離検出方法に
おいて，前記蛍光体の間の距離が１５塩基以下であるこ
とを特徴とする電気泳動分離検出方法。 - 【請求項４】請求項１に記載の電気泳動分離検出方法に
おいて，前記蛍光体が二種類であって，前記蛍光体はそ
れぞれＤＮＡ二本鎖の各々の鎖上にあることを特徴とす
る電気泳動分離検出方法。 - 【請求項５】請求項４に記載の電気泳動分離検出方法に
おいて，前記蛍光体の間の距離が１５塩基以下であるこ
とを特徴とする電気泳動分離検出方法。 - 【請求項６】光の照射により励起されるエネルギー供与
体と，励起された前記エネルギー供与体からのエネルギ
ーの移動により蛍光を発するエネルギー受容体とが結合
される核酸断片試料であり，前記核酸断片試料の末端塩
基の種類毎に，前記エネルギー供与体と前記エネルギー
受容体との間の距離を異ならせて結合された前記核酸断
片試料を電気泳動により分離し，分離された前記核酸断
片試料に前記光を照射し前記エネルギー受容体から発す
る蛍光を検出することを特徴とする電気泳動分離検出方
法。 - 【請求項７】レーザ光で励起されるエネルギー供与体
と，励起された前記エネルギー供与体からのエネルギー
の移動により蛍光を発するエネルギー受容体とが結合さ
れた核酸断片試料であり，前記核酸断片試料の末端塩基
の種類毎に異なる前記エネルギー受容体が結合された前
記核酸断片試料を電気泳動により分離し，分離された前
記核酸断片試料に前記レーザ光を照射し前記エネルギー
受容体から発する蛍光を検出することを特徴とする電気
泳動分離検出方法。 - 【請求項８】レーザ光で励起されるエネルギー供与体
と，励起された前記エネルギー供与体からのエネルギー
の移動により蛍光を発するエネルギー受容体とが結合さ
れた核酸断片試料であり，前記核酸断片試料の末端塩基
の種類毎に異なる前記エネルギー受容体が結合された前
記核酸断片試料を電気泳動により分離し，分離された前
記核酸断片試料に前記レーザ光を照射し前記エネルギー
受容体から発する蛍光の波長によって前記核酸断片試料
の種類の識別を行うことを特徴とする電気泳動分離検出
方法。 - 【請求項９】アルゴンレーザ光により励起されるエネル
ギー供与体と，励起された前記エネルギー供与体からの
エネルギーの移動により蛍光を発するエネルギー受容体
とが結合された核酸断片試料であり，前記核酸断片試料
の末端塩基の種類毎に異なる前記エネルギー受容体が結
合された前記核酸断片試料を電気泳動により分離し，分
離された前記核酸断片試料に前記アルゴンレーザ光を照
射し前記エネルギー受容体から発する蛍光を検出するこ
とを特徴とする電気泳動分離検出方法。 - 【請求項１０】請求項９に記載の電気泳動分離検出方法
に於いて，波長が５２６ｎｍから６８０ｎｍの範囲の前
記蛍光を検出することを特徴とする電気泳動分離検出方
法。 - 【請求項１１】アルゴンレーザ光により励起されるエネ
ルギー供与体と，励起された前記エネルギー供与体から
のエネルギーの移動により蛍光を発するエネルギー受容
体とが結合された核酸断片試料であり，前記核酸断片試
料の末端塩基の種類毎に異なる前記エネルギー受容体が
結合された前記核酸断片試料を電気泳動により分離し，
分離された前記核酸断片試料に前記アルゴンレーザ光を
照射し前記エネルギー受容体から発する蛍光の波長によ
って前記核酸断片試料の種類の識別を行うことを特徴と
する電気泳動分離検出方法。 - 【請求項１２】請求項１１に記載の電気泳動分離検出方
法に於いて，波長が５２６ｎｍから６８０ｎｍの範囲の
前記蛍光を検出することを特徴とする電気泳動分離検出
方法。 - 【請求項１３】複数の核酸断片試料にそれぞれ結合され
た組み合わせの異なる複数種類の蛍光体のうち少なくと
も一種類の励起された前記蛍光体からのエネルギーの移
動により他の種類の前記蛍光体から発する蛍光を検出す
ることを特徴とする電気泳動分離検出方法。 - 【請求項１４】複数の核酸断片試料にそれぞれ結合され
た組み合わせの異なる複数種類の蛍光体のうち少なくと
も一種類の励起された前記蛍光体からのエネルギーの移
動により他の種類の蛍光体から発する蛍光を検出し，前
記蛍光の波長の違いにより前記核酸断片試料を識別する
ことを特徴とする電気泳動分離検出方法。 - 【請求項１５】二種類以上の蛍光体が結合された核酸断
片試料であって，前記蛍光体が核酸試料の種類毎に前記
蛍光体の相互の距離を異ならせて結合され，前記蛍光体
のうち少なくとも一種類の前記蛍光体が励起されて発す
る蛍光と，少なくとも一種類の励起された前記蛍光体か
らのエネルギーの移動により他の種類の前記蛍光体から
発する蛍光との強度比を計測することにより，前記核酸
試料の種類の識別することを特徴とする核酸断片試料。 - 【請求項１６】請求項１５に記載の核酸断片試料におい
て，前記蛍光体が二種類であって，前記蛍光体はそれぞ
れＤＮＡ鎖の同一鎖上に結合することを特徴とする核酸
断片試料。 - 【請求項１７】請求項１６に記載の核酸断片試料におい
て，前記蛍光体の相互の距離が１５塩基以下であること
を特徴とする核酸断片試料。 - 【請求項１８】請求項１５に記載の核酸断片試料におい
て，前記蛍光体が二種類であって，前記蛍光体はそれぞ
れＤＮＡ二本鎖の各々の鎖上にあることを特徴とする核
酸断片試料。 - 【請求項１９】請求項１８に記載の核酸断片試料におい
て，前記蛍光体の間の距離が１５塩基以下であることを
特徴とする電気泳動分離検出方法。 - 【請求項２０】光の照射により励起されるエネルギー供
与体と，励起された前記エネルギー供与体からのエネル
ギーの移動により蛍光を発するエネルギー受容体とが結
合された核酸断片試料であり，前記核酸断片試料の末端
塩基の種類毎に，前記エネルギー供与体と前記エネルギ
ー受容体との間の距離が異ならせて結合されたことを特
徴とする核酸断片試料。 - 【請求項２１】エネルギー供与体とエネルギー受容体と
が結合された核酸断片試料を泳動分離して，前記エネル
ギー供与体から前記エネルギー受容体へのエネルギーの
移動により生じる蛍光を検出することを特徴とする電気
泳動分離検出方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000152742A JP3255169B2 (ja) | 1991-09-05 | 2000-05-19 | 電気泳動分離検出方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000152742A JP3255169B2 (ja) | 1991-09-05 | 2000-05-19 | 電気泳動分離検出方法 |
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| JP03225649A Division JP3097205B2 (ja) | 1991-09-05 | 1991-09-05 | 電気泳動分離検出方法 |
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