JP2000342298A - 核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維並びに該多孔質中空繊維配列体及びその薄片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維並び
に核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維配列体及びその薄
片。 【効果】 核酸が任意に高密度且つ正確に配列された核
酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維配列体の繊維断面を有
する薄片を再現性よく効率的に得ることができる。この
薄片を用いて、検体中の核酸の種類および量を調べるこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査、食品検
査等の分野などに利用できる核酸が固定化された高分子
材料に関する。詳しくは、多孔質中空繊維の中空部及び
多孔質部に核酸固定化ゲルが保持された核酸固定化ゲル
保持多孔質中空繊維並びに該多孔質中空繊維配列体及び
その薄片に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、各種生物におけるゲノムプロジェ
クトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多
数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつあ
る。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各
種の方法で調べることができるが、その有力な方法の一
つとして、明らかにされた塩基配列情報を利用した遺伝
子発現解析が知られている。例えば、ノーザンハイブリ
ダイゼーションに代表されるような、各種の核酸：核酸
間ハイブリダイゼーション反応や各種のPCR反応を利用
した方法が開発され、当該方法により各種遺伝子とその
生体機能発現との関係を調べることができる。しかしな
がら、これらの方法では適用し得る遺伝子の数に制限が
ある。したがって、今日のゲノムプロジェクトを通して
明らかにされつつあるような、一個体レベルという極め
て多数の遺伝子から構成される複雑な反応系全体からみ
ると、上記方法により遺伝子の総合的・系統的解析を行
うことは困難である。

【０００３】最近になって、多数遺伝子の一括発現解析
を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ
法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発さ
れ、注目を集めている。

【０００４】これらの方法は、いずれも核酸：核酸間ハ
イブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法で
ある点で原理的には従来の方法と同じであるが、マイク
ロアレイ又はチップと呼ばれる平面基盤片上に、多数の
ＤＮＡ断片が高密度に整列固定化されたものが用いられ
ている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体
的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子
等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基盤片上でハ
イブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮ
ＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を蛍光色
素等でラベル後、高解像度解析装置で高速に読みとる方
法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺
伝子量を迅速に推定できる。即ち、この新しい方法の本
質は、基本的には反応試料の微量化と、その反応試料を
再現性よく多量・迅速・系統的に分析、定量しうる形に
配列・整列する技術との統合であると理解される。

【０００５】核酸を基盤上に固定化するための技術とし
ては、上記ノーザン法同様、ナイロンシート等の上に高
密度に固定化する方法の他、更に密度を高めるため、ガ
ラス等の基盤の上にポリリジン等をコーティングして固
定化する方法、あるいはシリコン等の基盤の上に短鎖の
核酸を直接固相合成していく方法などが開発されてい
る。

【０００６】しかし、例えば、ガラス等の固体表面を化
学的又は物理的に修飾した基盤上に核酸をスポッティン
グ固定化する方法[Science 270, 467-470(1995)]は、ス
ポット密度でシート法より優れるものの、スポット密度
及びスポット当たり固定できる核酸量がシリコン基盤上
における直接合成法(U.S.Patent 5,445,934、U.S.Paten
t 5,774,305）と比較して少量であり、再現が困難であ
る点が指摘されている。他方、シリコン等の基盤の上に
フォトリソグラフィー技術を用い、多種の短鎖核酸をそ
の場で規則正しく固相合成していく方法に関しては、単
位面積当たりに合成しうる核酸種数（スポット密度）及
びスポット当たりの固定化量（合成量）、並びに再現性
等において、スポッティング法より優れるとされるもの
の、固定化しうる化合物種は、フォトリソグラフィーに
より制御可能な比較的短鎖の核酸に限られる。さらに、
高価な製造装置と多段の製造プロセスにより、チップ当
たりの大きなコストダウンが困難とされる。その他、微
小な担体上に核酸を固相合成しライブラリー化する手法
として、微小なビーズを利用する方法が知られている。
この方法は、チップ法より長鎖の核酸を多種・安価に合
成することが可能であり、またｃＤＮＡ等より長鎖の核
酸も固定可能と考えられる。しかしながら、チップ法と
異なり、指定の化合物を指定の配列基準で再現性よく整
列させたものを作製することは困難である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】このような状況下、鎖
長によらず核酸を所定の濃度に固定化でき、測定可能な
形に高密度に再現よく配列化可能で、安価な大量製造に
適応しうる新たな体系的方法論の確立は、今後重要性を
増すと考えられる遺伝子解析に強く求められるものであ
り、本発明が解決しようとする課題である。

【０００８】具体的には、本発明が解決しようとする課
題は、ナイロンシートやガラス基盤のような二次元担体
上への微量スポッティングや微量分注による核酸配列体
製造法に比べ、核酸固定化量が高く、単位面積あたり配
列される核酸分子種の高密度化が可能で、大量生産によ
り適した配列体、すなわち核酸が固定化された二次元的
（平面的）配列体（固定化核酸二次元配列体という）の
製造法の確立である。また、本発明が解決しようとする
課題はシリコン基盤上へのフォトリソグラフィーと固相
合成との組み合わせによる高密度オリゴ核酸配列体製造
法と比べ、ｃＤＮＡを含む長鎖の核酸にも適応可能で、
製造コストのより低い固定化核酸二次元配列体製造法の
確立である。そこで、本発明は、核酸固定化ゲル保持多
孔質中空繊維並びに核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維
配列体及びその薄片を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上述の如
き課題を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、核酸整列
化プロセスと固定化プロセスとを同一の二次元担体上で
行う従来法の発想を改め、核酸の固定化プロセスを一次
元構造体としての繊維上（1本の繊維上）に独立して行
い、それらの整列化プロセスに各種の繊維賦形技術を導
入することにより三次元構造体としての繊維束を作製
し、得られる繊維束の切片化プロセスを経ることで、固
定化核酸二次元高密度配列体を作製し得ることを見いだ
し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
多孔質中空繊維の中空部及び多孔質部に核酸固定化ゲル
が保持された核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維であ
る。

【００１０】さらに、本発明は、前記核酸固定化ゲル保
持多孔質中空繊維の束を含む核酸固定化ゲル保持多孔質
中空繊維配列体である。該配列体中としては、例えば前
記核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維が規則的に配列さ
れたものが挙げられ、１ｃｍ ²あたり１００本以上の繊
維を含むものが挙げられる。また、上記配列体中に固定
化された核酸の種類としては、各繊維の全部又は一部に
おいて異なるものが挙げられる。さらに、本発明は、前
記核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維配列体の繊維軸と
交差する切断面を有する、前記核酸固定化ゲル保持多孔
質中空繊維配列体の薄片である。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。本
発明の繊維は、核酸が固定化されたゲルを保持する中空
繊維であって、該中空繊維が多孔質のもの（以下、「核
酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維」ともいう。）であ
る。多孔質とは、繊維に無数に存在する空隙（隙間）を
意味する。

【００１２】本発明において、ゲルに固定化する対象と
なる核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ
核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。本発明に用いる核酸は、
市販のものでもよく、また、生細胞などから得られた核
酸でもよい。

【００１３】生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、
公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Blinらの
方法（ Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (19
76)）等により、また、ＲＮＡの抽出については、Faval
oroらの方法（ Favaloro etal., Methods Enzymol.65:
718 (1980) ）等により行うことができる。固定化する
核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤ
ＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは
化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により
合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチ
ド等を用いることもできる。

【００１４】本発明に用いることができるゲルの種類は
特に制限されないが、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−
ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ
−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールア
クリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチ
ルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキス
トリン等の単量体の一種類または二種類以上と、メチレ
ンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコー
ルジ（メタ）アクリレート等との多官能性単量体を共重
合したゲルを用いることができる。その他本発明におい
て使用できるゲルとして、例えばアガロース、アルギン
酸、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレ
ングリコール等のゲル、またはこれらを架橋したゲルを
用いることができる。

【００１５】本発明では、核酸をそのままゲルに固定化
してもよく、また、核酸に化学的修飾を施した誘導体
や、必要に応じて変成させた核酸を固定化してもよい。
核酸のゲルへの固定化には、ゲルに物理的に包括する方
法や、ゲル構成成分への直接的な結合を利用してもよ
く、核酸を一旦高分子体や無機粒子などの担体にに共有
結合あるいは非共有結合により結合させ、その担体をゲ
ルに固定化してもよい。

【００１６】例えば、核酸の末端基にビニル基を導入し
（WO98/39351）、アクリルアミド等のゲルの構成成分と
共重合させることができる。共重合においては、単量
体、多官能性単量体及び重合開始剤と共に共重合する方
法、単量体及び重合開始剤と共に共重合したのち、架橋
剤でゲル化する方法などがある。

【００１７】また、アガロースを臭化シアン法でイミド
カルボネート化しておき、末端アミノ化した核酸のアミ
ノ基と結合させてからゲル化することもできる。この
際、核酸固定化したアガロースと他のゲル（例えばアク
リルアミドゲル等）との混合ゲルにしてもよい。

【００１８】その他のゲル化方法としては、高分子粒子
や無機粒子等の担体に核酸を結合し、該粒子を上述のゲ
ルに包括固定化する方法が挙げられる。例えば、ビオチ
ン化した核酸とアビジン化したアガロースビーズ（シグ
マ社製 アビジン化アガロース等）を反応させることに
よって、核酸が固定化されたアガロースビーズを得るこ
とができる。核酸固定化アガロースビーズはアクリルア
ミドゲル等に包括固定化することができる。

【００１９】また、ゲルや担体への結合においては、グ
ルタルアルデヒドや１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド(EDC)等の架橋剤を用い
て結合させることもできる。

【００２０】核酸の一般的な化学的修飾としては、アミ
ノ化、ビオチン化、ディゴキシゲニン化等が知られてい
るが[Current Protocols In Molecular Biology, Ed.;
Frederick M. Ausubel et al.(1990)、脱アイソトープ
実験プロトコール(1)ＤＩＧハイブリダイゼーション
（秀潤社）]、本発明ではこれらのいずれの修飾法も採
用することができる。一例として、核酸へのアミノ基導
入に関して説明する。

【００２１】アミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖と一本
鎖核酸との結合位置は特に限定されるものではなく、核
酸の５’末端または３’末端のみならず核酸の鎖中（例
えば、リン酸ジエステル結合部位または塩基部位）であ
ってもよい。この一本鎖核酸誘導体は、特公平3-74239
号公報、米国特許4,667,025号、米国特許4,789,737号等
に記載の方法にしたがって調製することができる。この
方法以外にも、例えば、市販のアミノ基導入用試薬［例
えば、アミノリンクII（商標名）； ＰＥバイオシステ
ムズジャパン社、Amino Modifiers（商標名）；クロン
テック社］などを用いて、又はＤＮＡの５’末端のリン
酸にアミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖を導入する周知
の方法（Nucleic Acids Res.,11(18),6513-(1983) ）に
したがって調製することができる。

【００２２】本発明において、核酸固定化ゲル保持多孔
質中空繊維として用いることができる多孔質中空繊維と
しては、多孔質中空繊維の中空部及び多孔質部に核酸固
定化ゲルを固定化できるものであれば特に限定されるも
のではないが、合成繊維、半合成繊維、再生繊維、無機
繊維のごとき化学繊維、及び天然繊維等が挙げられる。

【００２３】合成繊維の代表例としては、ナイロン６、
ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系の各
種繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテ
レフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のポリエ
ステル系の各種繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリ
ル系の各種繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポ
リオレフィン系の各種繊維、ポリビニルアルコール系の
各種繊維繊維、ポリ塩化ビニリデン系の各種繊維、ポリ
塩化ビニル系繊維、ポリウレタン系の各種繊維、フェノ
ール系繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオ
ロエチレン等からなるフッ素系繊維、ポリアルキレンパ
ラオキシベンゾエート系の各種繊維などが挙げられる。
また、衣料用以外の、例えば、ポリメチルメタクリレー
トやポリスチレンなどの透明非晶質高分子を主材料とし
た光学繊維なども用いることができる。

【００２４】半合成繊維の代表例としては、セルロース
ジアセテート、セルローストリアセテート、キチン、キ
トサン等を原料としたセルロース系誘導体各種繊維、プ
ロミックスと呼称される蛋白質系の各種繊維などが挙げ
られる。再生繊維の代表例としては、ビスコース法や銅
−アンモニア法、或いは有機溶剤法によるセルロース系
の各種再生繊維（レーヨン、キュプラ、ポリノジック
等）などが挙げられる。

【００２５】無機繊維の代表例としては、ガラス繊維、
炭素繊維などが挙げられる。天然繊維の代表例として
は、綿、亜麻、苧麻、黄麻などの植物繊維、羊毛、絹な
どの動物繊維、石綿などの鉱物繊維などが挙げられる。

【００２６】特に天然繊維以外の中空繊維は、特殊なノ
ズルを用いて公知の方法で製造することができる。ポリ
アミド、ポリエステル、ポリオレフィン等は溶融紡糸法
が好ましく、ノズルとしては馬蹄型やC型ノズル、２重
環ノズルなどを使用することができる。本発明において
は、連続した均一な中空部を形成させることができる点
で２重環ノズルを用いるのが好ましい。

【００２７】溶融紡糸ができない合成高分子、半合成繊
維又は再生繊維に用いられる高分子の紡糸は溶剤紡糸が
好ましく用いられる。この場合も、溶融紡糸と同じく２
重環ノズルを用いて、中空部に芯材として適切な液体を
充填しながら紡糸することにより連続した中空部を有す
る中空繊維を得ることができる。本発明に用いる多孔質
中空繊維は、溶融紡糸法又は溶液紡糸法に延伸法、ミク
ロ相分離法、抽出法などの公知の多孔化技術を組み合わ
せることにより得ることができる。

【００２８】本発明に用いられる多孔質中空繊維の構造
は、核酸が固定化されたゲルの充填が可能であれば特に
制限はされないが、多孔質中空繊維の外表面から内表面
まで孔が連通した三次元網目構造、フィブリル状のもの
により構成された連通した孔を有する構造、指型構造、
独立気泡構造、一部が連通した気泡構造であるものを用
いることができ、特に三次元網目構造、フィブリル状の
ものにより構成される構造が好ましい。また、孔の大き
さは、およそ0.01μm〜数十μm程度まで用いることがで
き、多孔質層の一表面から他表面にわたって均一の孔径
であってもよいし、多孔質層の厚み方向に孔径の変化が
ある対称/非対称な傾斜構造を持つ多孔質体であっても
よい。更に、その空孔率及び比表面積は、核酸を固定化
したゲルをより強固に保持するという観点から、多孔質
中空繊維としての取り扱い性を損なわない程度であれ
ば、高いほど好ましい。

【００２９】従って、市販されている精密ろ過、限外濾
過を目的とした多孔質中空糸膜、多孔質な中空糸膜の外
表面に無孔性の均質膜を被覆した逆浸透膜、ガス分離
膜、多孔質層の中間に無孔性の均質層を挟んだ膜などを
用いることができる。

【００３０】いずれの場合も、高密度に核酸が固定化さ
れ多孔質中空繊維配列体の薄片を得るべく多孔質中空繊
維を配列させるためには、多孔質中空繊維の外径は細い
方が好ましい。本発明の好ましい実施態様においては、
核酸の固定化は１cm²あたり１００以上の高密度である
が、これを達成するためには１本の多孔質中空繊維の外
径はおよそ１mm以下であることが必要である。例えば、
外径が500μm程度の多孔質中空糸膜を用いれば、１cm²
あたり４００以上の核酸が固定化された多孔質中空繊維
配列体の薄片を得ることができ、中空繊維紡糸技術を応
用して外径が30μｍ程度の多孔質中空繊維を製造し、こ
れを用いれば、１cm²あたり１０００００以上の核酸が
固定化された多孔質中空繊維配列体の薄片を得ることが
可能である。

【００３１】本発明に用いる多孔質中空繊維は、そのま
ま用いてもよいが、核酸が固定化されたゲルとの親和性
等を向上させるため、必要に応じて、反応性官能機を導
入してもよく、また、プラズマ処理やγ線、電子線など
の放射線による表面処理を施してもよい。

【００３２】核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維を作製
する方法は、特に制限されるものではないが、例えば単
量体、多官能性単量体、開始剤及び核酸または末端にビ
ニル基を有する核酸を混合した液に多孔質中空繊維を浸
し重合、ゲル化させる方法が挙げられる。また、単量
体、多官能性単量体、開始剤及び高分子粒子や無機粒子
等の担体に核酸を結合したものを混合した液に多孔質中
空繊維を浸し重合、ゲル化させる方法が挙げられる。

【００３３】その他に、単量体、開始剤及び末端にビニ
ル基を有する核酸を共重合したものと架橋剤を混合した
液に多孔質中空繊維を浸しゲル化する方法、単量体を開
始剤で重合したもの、架橋剤および核酸または高分子粒
子や無機粒子等の担体に核酸を結合した粒子を混合した
液に多孔質中空繊維を浸しゲル化する方法、核酸を固定
化したアガロース等を加熱溶解し、多孔質中空繊維を浸
し、冷却ゲル化させる方法等が挙げられる。

【００３４】また、上述の方法において、核酸等を含む
液に多孔質中空繊維を浸漬する代わりに、該液を多孔質
中空繊維の中空部及び多孔質部に注入又は吸引すること
により充填した後ゲル化させてもよい。多孔質中空繊維
の中空部及び多孔質部に核酸が固定化されたゲルを固定
する手順は、後述する多孔質中空繊維束となす前でもよ
いし、後でもよい。

【００３５】上述の方法により得られた核酸固定化ゲル
保持多孔質中空繊維は、ゲルが破壊されない限りにおい
て適当な処理をすることができる。例えば、熱処理、ア
ルカリ処理、界面活性剤処理などを行うことにより、固
定化された核酸を変成させる。あるいは、細胞、菌体な
どの生材料から得られた核酸を使用する場合は、不要な
細胞成分などを除去する。そして、処理後の核酸固定化
ゲル保持多孔質中空繊維を核酸を検出する材料として用
いることができる。なお、これらの処理は別々に実施し
てもよく、同時に実施してもよい。また、核酸を含む試
料をゲルに固定化する前に実施してもよいし、核酸を含
む試料をゲルに固定化した後、繊維に固定化する前に適
宜実施してもよい。

【００３６】上述の方法により得られた、核酸固定化ゲ
ルがその中空部及び多孔質部に保持された多孔質中空繊
維は、その中空部のみならず多孔質部までゲルが充填さ
れることにより、核酸が固定化されたゲルと多孔質中空
繊維との接触面積が大きく、複雑に入り組んだ形状とな
るなどのため、核酸が固定化されたゲルが強固に多孔質
中空繊維に保持されることとなる。

【００３７】上記の通り調製された核酸固定化ゲル保持
多孔質中空繊維は、本発明の核酸固定化ゲル保持多孔質
中空繊維配列体を構成する基本単位とすることができ
る。そして、これらの核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊
維を集束した後に接着して、核酸固定化ゲル保持多孔質
中空繊維配列体となすことができる。この際、核酸固定
化ゲル保持多孔質中空繊維を規則的に配列し、樹脂接着
剤等で接着することにより、例えば、縦横に核酸固定化
ゲル保持多孔質中空繊維が整然と規則的に配列した核酸
固定化ゲル保持多孔質中空繊維配列体を得ることができ
る。核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維配列体の形状は
特に限定されるものではないが、通常は、核酸固定化ゲ
ル保持多孔質中空繊維を規則的に配列させることにより
正方形又は長方形に形成される。

【００３８】「規則的に」とは、一定の大きさの枠の中
に含まれる核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維の本数が
一定となるように順序よく配列させることをいう。例え
ば、直径１ｍｍの核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維を
束にして断面が縦１０ｍｍ、横１０ｍｍの正方形となる
ように配列させようとする場合は、その正方形の枠内
（１ｃｍ²）における１辺に含まれる核酸固定化ゲル保
持多孔質中空繊維の数を10本とし、この10本の核酸固定
化ゲル保持多孔質中空繊維を1列に束ねて1層のシートと
した後、このシートが10層になるように重ねる。その結
果、縦に10本、横に10本、合計100本の核酸固定化ゲル
保持多孔質中空繊維を配列させることができる。但し、
核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維を規則的に配列させ
る手法は、上記のようにシートを重層するものに限定さ
れるものではない。

【００３９】この場合に、特定の核酸が固定化された核
酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維の位置があらかじめ決
められた状態で配列することが望ましいが、必ずしもそ
のように配列させる必要はない。その理由は、配列体を
形成した段階では特定の核酸を固定化した核酸固定化ゲ
ル保持多孔質中空繊維がどの位置に存在するのかが不明
でも、配列体の断面を切断した後、一旦ハイブリダイゼ
ーション手法等を用いて断面における核酸の配置位置を
決定することにより、特定の核酸が固定された核酸固定
化ゲル保持多孔質中空繊維の位置を確認することができ
るためである。従って、この手法を用いて、一度、薄片
内に配置された複数種類の核酸の位置を決定しておけ
ば、同一配列体から得られる薄片はすべて同一の位置配
置であるので、同一配列体から得られるすべての薄片の
核酸の位置配置がわかる。

【００４０】なお、本発明において束にする多孔質中空
繊維の本数は１００本以上、好ましくは１,０００〜１
０,０００,０００本であり、目的に応じて適宜設定する
ことができる。但し、配列体における多孔質中空繊維の
密度が、１ｃｍ²当たり１００〜１,０００,０００本と
なるように調製することが好ましい。そして、高密度に
核酸が固定化された繊維配列体の薄片を得るべく多孔質
中空繊維を配列させるためには、多孔質中空繊維の太さ
は細い方が好ましい。本発明の好ましい実施態様におい
ては、多孔質中空繊維１本の太さは１ｍｍ以下であるこ
とが必要である。

【００４１】ゲルに固定化されている核酸の種類は、配
列体中の各繊維ごとにそれぞれ異なるものとすることが
可能であり、また、同一の核酸が固定化された繊維から
任意の本数の繊維を選択し、その選択された繊維を束ね
て適宜配列させることも可能である。即ち、本発明によ
れば、固定化された核酸の種類と配列の順序に関して
は、目的に応じて任意に設定することが可能である。

【００４２】本発明においては、上記の核酸固定化ゲル
保持多孔質中空繊維配列体を繊維軸と交差する方向、好
ましくは繊維軸に対して垂直方向に切断することによ
り、核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維配列体断面を有
する薄片を得ることができる。この際の切断方法として
は、例えば、ミクロトームを用いて配列体から薄片を切
り出す方法等が挙げられる。薄片の厚みは任意に調整す
ることができるが、通常１〜５,０００μｍ、好ましく
は１０〜２,０００μｍである。

【００４３】得られた核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊
維配列体断面を有する薄片には、該配列体を構成する核
酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維の数に応じた核酸が存
在する。薄片の断面積あたりの核酸の数に関しては、用
いる核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維の外径や配列体
作製時の方法等を適宜選択することにより、薄片断面積
１ｃｍ²あたり１００以上、更には１０００以上の核酸
が固定化された薄片を作製することも可能である。

【００４４】これら薄片は、固定化された核酸をプロー
ブとして、検体と反応させてハイブリダイゼーションを
行うことにより、検体中の特定の塩基配列を有する核酸
の検出に用いることができる。本発明で言うプローブと
は、検出すべき遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を
有する核酸を指す。即ち、本発明の核酸固定化ゲル保持
多孔質中空繊維配列体断面を有する薄片を検体と反応さ
せてハイブリダイゼーションを行い、プローブと相補的
な検体中に存在する核酸とのハイブリッドを形成させ、
このハイブリッドを検出することにより、目的とする塩
基配列を有する検体中の核酸を検出することができる。

【００４５】ハイブリッドの検出には、ハイブリッドを
特異的に認識することができる公知の手段を用いること
ができる。例えば、検体中の核酸に、蛍光物質、発光物
質、ラジオアイソトープなどの標識体を作用させ、この
標識体を検出することができる。これら標識体の種類や
標識体の導入方法等に関しては、何ら制限されることは
なく、従来公知の各種手段を用いることができる。

【００４６】これら薄片は、固定化された核酸をプロー
ブとして、検体と反応させてハイブリダイゼーションを
行うことにより、検体中の特定の塩基配列を有する核酸
の検出に用いることができる。本発明で言うプローブと
は、狭義には検出すべき遺伝子の塩基配列に相補的な塩
基配列を有する核酸を指す。即ち、本発明の核酸固定化
繊維配列体断面を有する薄片を検体と反応させてハイブ
リダイゼーションを行い、プローブと相補的な検体中に
存在する核酸とのハイブリッドを形成させ、このハイブ
リッドを検出することにより、目的とする塩基配列を有
する検体中の核酸を検出することができる。また、本発
明で言うプローブとは、広義には検体中に存在するする
タンパク質や低分子化合物等と特異的に結合することが
できる核酸を指す。従って、これらの薄片の利用法とし
ては、固定化された核酸（プローブ）とハイブリッドを
形成する核酸を検出するための利用に留まらず、固定化
された核酸と特異的に結合するタンパク質や低分子化合
物等の各種試料（例えば生体成分等）を検出するための
利用が挙げられる。

【００４７】固定化された核酸とハイブリッドを形成す
る核酸や、固定化された核酸と特異的に結合する各種生
体成分の検出には、公知の手段を用いることができる。
例えば、検体中の核酸、タンパク質又は低分子化合物等
に、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープなどの標
識体を作用させ、この標識体を検出することができる。
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、
何ら制限されることはなく、従来公知の各種手段を用い
ることができる。

【００４８】

〔参考例〕

(a) 5’末端にアミノ基あるいはビオチンを有するオリ
ゴヌクレオチドの調整 以下に示したオリゴヌクレオチド（プローブＡ、プロー
ブＢ）を合成した。 プローブＡ:GCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTC（配列
番号１） プローブＢ:GATGAGGTGGAGGTCAGGGTTTGGGACAGCAG（配列
番号２）

【００４９】オリゴヌクレオチドの合成はＰＥバイオシ
ステムズ社の自動合成機DNA/RNA synthesizer (model39
4)を用いて行い、ＤＮＡ合成の最終ステップで、アミノ
リンクII（商標名）（アプライドバイオシステム社）を
用いてそれぞれのオリゴヌクレオチドの５’未端にＮＨ
₂（ＣＨ₂）₆−を導入しアミノ化したプローブを、およ
びビオチンアミダイトを用いてビオチン化したプローブ
を調製した。これらは、一般的手法により脱保護及び精
製して使用した。

【００５０】(b)核酸の標識 試料核酸のモデルとして、(a)で合成したオリゴヌクレ
オチド（プローブＡ、プローブＢ）の配列の一部に相補
的なオリゴヌクレオチド（Ｃ、Ｄ）を合成した。 オリゴヌクレオチド Ｃ： GAGCCCTCGCTCGTACAGCAAGGTTT
CG（配列番号３） オリゴヌクレオチド Ｄ： CTGCTGTCCCAAACCCTGACCTCCAC
C（配列番号４） これらのオリゴヌクレオチドの5'末端を、(a)と同様に
してアミノリンクII（商標名）（ＰＥバイオシステムズ
ジャパン社）を用いてそれぞれのオリゴヌクレオチドの
５’未端にＮＨ₂（ＣＨ₂）₆−を導入した後、以下のよ
うにしてディゴキシゲニン(DIG: Digoxigenin、ロシュ
・ダイアグノスティックス株式会社)で標識した。

【００５１】末端アミノ化されたオリゴヌクレオチドを
それぞれ100 mMホウ酸緩衝液(pH8.5)に終濃度2 mMにな
るように溶かした。等量のDigoxigenin-3-O-methylcarb
onyl-ε-aminocapronic acid-N-hydroxy-succinimide e
ster (26mg/mlジメチルホルムアミド溶液)を加え、室温
にて一晩静置した。

【００５２】静置後の溶液の量を100μlに調整し、2μl
のグリコーゲン（ロシュ・ダイアグノスティックス株式
会社）、10μlの3M酢酸ナトリウム(pH5.2)、300μlの冷
エタノールを加え、15,000rpm 15分の遠心により沈殿を
回収した。沈殿に500μlの70%エタノールを加え15,000r
pm 5分の遠心により沈殿を再びチューブの底に集めた。
沈殿を風乾し、100μlの10 mM Tris-HCl (pH7.5),1 mM
EDTAに溶かした。このようにして得られたDIG標識オリ
ゴヌクレオチドを核酸の標識モデルとして用いた。

【００５３】〔実施例１〕多孔質中空繊維の作製 以下の組成からなる水溶液Ａを調整し、この水溶液Ａに
無孔質な中間層を有するポリエチレン製多孔質中空糸膜
MHF200TL(三菱レイヨン株式会社製，外径290μm，内径2
00μm)を浸した後、内部が水蒸気で飽和された密閉ガラ
ス容器に移し、８０℃で４時間放置することにより重合
反応を行った。

【００５４】得られた多孔質中空糸膜の中空部及び無孔
質な中間層よりも内側の多孔質層にはオリゴヌクレオチ
ド(プローブＡまたはプローブＢ)がビオチン−アビジン
結合を介して固定化されたゲルが保持されていた（図
１）。図１において、(1)はプローブＡがゲルに固定化
された核酸固定化ゲルを保持する多孔質中空繊維を、
(2)はプローブＢがゲルに固定化された核酸固定化ゲル
を保持する多孔質中空繊維を示す。

【００５５】 水溶液Ａ アクリルアミド 3.7 質量部 メチレンビスアクリルアミド 0.3 質量部 2,2'-アゾビス（2-アミジノプロパン）二塩酸塩 0.1 質量部 ビオチン化オリゴヌクレオチド 0.005 質量部 （プローブＡまたはプローブＢ） アビジン化アガロース（６％）懸濁液 1.0 質量部

【００５６】〔実施例２〕多孔質中空繊維配列体の作製 実施例１により得たプローブＡ固定化ゲルを保持する多
孔質中空繊維20本を、テフロン板上に互いに重なること
なく密着させて配列し両端を固定した。これにポリウレ
タン樹脂接着剤(日本ポリウレタン工業(株)コロネート4
403,ニッポラン4223)を薄く塗布し、核酸固定化多孔質
中空繊維を接着した。ポリウレタン樹脂が十分に固まっ
た後これをテフロン板上から剥がし、核酸固定化ゲルを
保持した多孔質中空繊維が一列に配列したシート状物を
得た。

【００５７】一方、プローブＢ固定化ゲルを保持する多
孔質中空繊維についても同様の操作によりシート状物を
得た。次いで、これらのシート状物を図１(3)の配列と
なるように20枚積層し、上記接着剤で接着し、縦横各々
20本ずつ、計400本の核酸固定化多孔質繊維が正方に規
則的に配列した、核酸固定化ゲルを保持した多孔質中空
繊維配列体を得た（図１(3)）。

【００５８】〔実施例３〕 核酸固定化薄片の作製及び
核酸の検出 実施例２で得た２種のオリゴヌクレオチド(プローブＡ
及びＢ)を含む核酸固定化ゲルを保持した多孔質中空繊
維配列体を、ミクロトームを用いて0.1mmの厚さに切り
出し、縦横各20本ずつ計400本の核酸固定化ゲルを保持
した多孔質中空繊維の断面が規則的に配列した薄片を得
た（図１(4)）。この薄片には１cm²あたり約1100となる
密度で核酸が固定化されていた。

【００５９】この２種のオリゴヌクレオチド(プローブ
Ａ及びプローブＢ)を含む核酸固定化薄片をハイブリダ
イゼーション用バッグに入れ、以下の組成からなるハイ
ブリダイゼーション溶液を注ぎ込み、45℃で30分間プレ
ハイブリダイゼーションを行った。

【００６０】

【００６１】続いて、(b)により得たDIG標識オリゴヌク
レオチドＣを加え、45℃で15時間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。ハイブリダイゼーション終了後、核酸固定
化薄片をあらかじめ保温しておいた50mlの0.1 x SSC、
0.1% SDS溶液に移し、振盪しながら45℃、20分間の洗浄
を３回行った。

【００６２】DIG緩衝液１を加え、室温で振盪しながらS
DSの除去を行った。これを再度繰り返した後、DIG緩衝
液２を加え１時間振盪した。緩衝液を除いた後、DIG緩
衝液２に10000分の１量の抗DIGアルカリフォスファター
ゼ標識抗体溶液を加えた溶液10mlを加え、30分間ゆっく
り振盪させることにより抗原抗体反応を行わせた。次に
0.2% Tween 20を含むDIG緩衝液１で15分間２回振盪する
ことにより洗浄し、引き続き DIG緩衝液３に３分間浸し
た。 DIG緩衝液３を除いた後、AMPPDを含むDIG緩衝液３
mlを加え10分間平衡化した。

【００６３】水分をきり、新しいハイブリダイゼーショ
ン用バッグに移し、37℃で１時間静置した後、X線フィ
ルム用のバインダーにX線フィルムとともに挟みフィル
ムを感光させた。

【００６４】DIG緩衝液１：0.1mol/lマレイン酸、0.15m
ol/l塩化ナトリウム(pH7.5) DIG緩衝液２：緩衝液１に0.5%濃度でブロッキング試薬
を添加したもの DIG緩衝液３：0.1mol/lトリス−塩酸(pH9.5)、0.1mol/l
塩化ナトリウム、0.05mol/l塩化マグネシウム

【００６５】ブロッキング試薬、抗DIGアルカリフォス
ファターゼ標識抗体溶液および AMPPDはDIG Detection
キット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)中
の試薬である。上記オリゴヌクレオチドを用いたハイブ
リダイゼーションと同様の操作をオリゴヌクレオチドＤ
に対しても行った。

【００６６】その結果、核酸固定化薄片中のプローブＡ
を固定化した多孔質繊維断面部にのみオリゴヌクレオチ
ドＣが、プローブＢを固定化した多孔質繊維断面部にの
みオリゴヌクレオチドＤが特異的にハイブリダイゼーシ
ョンしていることが確認できた。

【００６７】〔実施例4〕 核酸固定化薄片の作製及び核
酸の検出 （１）染色体DNAの調製 ロドコッカス・ロドクロウスJ1株を栄養培地(グルコー
ス15ｇ、酵母エキス1ｇ、グルタミン酸ナトリウム10
ｇ、KH₂PO₄ 0.5g,K₂HPO₄ 0.5g,MgSO₄・7H₂O 0.5g/LpH7.
2)100mlで30℃、3日培養し、集菌した。この菌体から染
色体DNAを調製し、PCRの鋳型に用いた。なお、ロドコッ
カス・ロドクロウスJ1株はFERM BP-1478として工業技術
院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番
3号）に寄託されている。

【００６８】（２）プローブの作製 プローブ作製のために合成したオリゴヌクレオチドの位
置を、図２に示した。オリゴヌクレオチドＡ（配列番号
１）はオリゴヌクレオチドＢ（配列番号２）の約400塩
基上流に位置しており、オリゴヌクレオチドＥ（配列番
号5）はオリゴヌクレオチドＡから400塩基、オリゴヌク
レオチドＦ（配列番号６）はオリゴヌクレオチドＢから
600塩基下流に位置している。 オリゴヌクレオチドＥ：GCTCAAGCGC GATTTCGGTT TCGACA
TCCC C（配列番号５） オリゴヌクレオチドＦ：CATGTCGCGT CGTTGTTGGA CGAAGC
GGTA（配列番号６）

【００６９】オリゴヌクレオチドＡ、Ｂの5’末端をア
クリルアミド修飾(WO98/39351)したオリゴヌクレオチド
（5’末端にアクリルアミドが結合したオリゴヌクレオ
チド）（和光純薬に委託合成）を合成し、PCRに使用し
た。

【００７０】PCRは、一方のプライマーを他方の過剰量
存在させるAsymmetric PCRを行い、プライマー濃度を
5’アクリルアミド修飾オリゴヌクレオチドＡ：オリゴ
ヌクレオチドＥ=100：1又は5’アクリルアミド修飾オリ
ゴヌクレオチドＢ：オリゴヌクレオチドＦ=100：1に調
製した。その他の条件はEx-Taq(宝酒造)の仕様書に従
い、TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONALを用いて行っ
た。反応は100μｌで行い、温度条件は93℃ 30秒、65℃
30秒、72℃ 2分を40サイクル行った。このPCRによって
約400（プローブＧ：配列番号7）、600塩基（プローブ
Ｈ：配列番号8）の５'アクリルアミド修飾されたプロー
ブDNAを増幅した。

【００７１】（３）核酸固定化薄片の作製 核酸固定化薄片は、実施例１〜３と同様にして作製し
た。ただし、核酸のゲルへの固定化には工程２で作製し
たアクリルアミド修飾されたプローブDNAを用いた。こ
れに伴い、水溶液Aの組成は以下のように変更した。

【００７２】 水溶液Ａ アクリルアミド 3.7質量部 メチレンビスアクリルアミド 0.3質量部 2,2'-アゾビス（2-アミジノプロパン）二塩酸塩 0.1質量部 プローブＧ（またはプローブＨ） 0.005質量部

【００７３】得られた多孔質中空糸膜の中空部及び無孔
質な中間層よりも内側の多孔質層にはプローブGまたは
Ｈが固定化されたゲルが保持されていた。こうして得ら
れたプローブＧ固定化ゲルを保持する多孔質中空繊維５
本を、フロン板上に互いに重なることなく密着させて配
列し、両端を固定した。これにポリウレタン樹脂接着剤
(日本ポリウレタン工業(株)コロネート4403、ニッポラ
ン4223)を薄く塗布し、核酸固定化多孔質中空繊維を接
着した。ポリウレタン樹脂が十分に固まった後これをテ
フロン板上から剥がし、核酸固定化ゲルを保持した多孔
質中空繊維が一列に配列したシート状物を得た。プロー
ブＨについても同様のものを得た。また、核酸を固定化
していない同様のシート状物を作製した（ブランク）。

【００７４】次いで、これらのシート状物をブランク、
プローブＧ、ブランク、プローブＨ、ブランクの順に５
枚積層し、上記接着剤で接着し、縦横各々５本ずつ、計
２５本の核酸固定化多孔質繊維が正方に規則的に配列し
た、核酸固定化ゲルを保持した多孔質中空繊維配列体を
得た。

【００７５】（４）蛍光標識検体の作製 プローブＧのみにハイブリダイズする検体の作製には、
オリゴヌクレオチドＥとオリゴヌクレオチドＡを用いて
PCRを行い、約400塩基の検体Ｉを調製した。プローブＨ
のみにハイブリダイズする検体の作製には、オリゴヌク
レオチドＦとオリゴヌクレオチドＢを用いてPCRを行
い、約600塩基の検体Ｊを調製した。

【００７６】検体を蛍光標識するために、オリゴヌクレ
オチドE、Fの5’末端がCy5でラベルされたもの（Cy5-オ
リゴヌクレオチドＥ、Cy5-オリゴヌクレオチドＦ）を合
成し（アマシャムファルマシアバイオテク社、OlidoExp
ress）、PCRに使用した。PCRは、プライマー濃度をCy5-
オリゴヌクレオチドＥ：オリゴヌクレオチドA=100：1又
はCy5-オリゴヌクレオチドＦ：オリゴヌクレオチドＢ=1
00：1に調製し、その他はEx-Taq(宝酒造)の仕様書に従
い、TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONALを用いて行っ
た。反応は100μｌで行い、温度条件は93℃ 30秒、65℃
30秒、72℃ 2分を40サイクル行った。このPCRによって
約400（検体Ｉ：配列番号9）、600塩基（検体Ｊ：配列
番号10）のDNAを増幅した。

【００７７】反応終了液はSUPEC-02(宝酒造)を用いて未
反応プライマーを除き、GFX PCR DNA and Gel Band Pur
ification Kit（アマシャムファルマシアバイオテク）
によって回収した。

【００７８】（５）ハイブリダイゼーション 上記工程（３）で得た核酸固定化薄片をハイブリダイゼ
ーション用バッグに入れ、ハイブリダイゼーション溶液
を注ぎ、45℃で30分間プレハイブリダイゼーションを行
った。続いて、蛍光標識検体を加え、さらに45℃で15時
間ハイブリダイゼーションを行った。

【００７９】ハイブリダイゼーション終了後、核酸固定
化薄片をあらかじめ保温しておいた50mlの0.1xSSC、0.1
% SDS溶液に移し、振盪しながら45℃、20分間の洗浄を
３回行った。この後、0.5xSSCに置換し、蛍光検出器
（蛍光顕微鏡）で観察した。その結果、核酸固定化薄片
中のプローブＧを固定化した多孔質繊維断面部にのみ検
体Ｉが、プローブＨを固定化した多孔質繊維断面部にの
み検体Ｊが特異的にハイブリダイゼーションしているこ
とが確認できた。

【００８０】〔実施例5〕 核酸固定化薄片の作製及び核
酸の検出 （１）酵母（JCM7255）染色体DNAの調製 Saccharomyces cerevisiae(JCM7255)をYPD培地(グルコ
ース20ｇ、酵母エキス10ｇ、ポリペプトン20ｇ/L pH6.
0)100mlで30℃、1日培養し、集菌した。この菌体から染
色体DNAを調製し、PCRの鋳型に用いた。

【００８１】（２）プローブの作製 酵母遺伝子群から任意に４種のオープンリーディングフ
レーム(ORF)を選び、そのORFをPCRで増幅した。4種のプ
ローブ（配列番号11、12、13、14）とPCRに使用したオ
リゴの関係を表１に示した。オリゴヌクレオチドのうち
オリゴO、P、Q、Rは、5’末端をアクリルアミド修飾し
たオリゴヌクレオチドであり、合成により得た（製造は
和光純薬に委託）。PCRは、一方のプライマーを他方の
過剰量存在させるAsymmetric PCRを行い、プローブＫを
増幅する場合は、プライマー濃度を5’アクリルアミド
修飾オリゴヌクレオチドO：オリゴヌクレオチドP=100：
1に調製した。その他の条件はEx-Taq(宝酒造)の仕様書
に従い、TaKaRaPCR Thermal Cycler PERSONALを用いて
行った。反応は100μｌで行い、温度条件は93℃ 30秒、
65℃ 30秒、72℃ 2分を40サイクル行った。このPCRによ
って約600（プローブＫ：配列番号11）の５’アクリル
アミド修飾されたプローブDNAを増幅した。同様の方法
で、プローブＬ、Ｍ、Ｎを調製した。

【００８２】（3）核酸固定化薄片の作製 核酸固定化薄片は、実施例１〜３と同様にして作製し
た。ただし、核酸のゲルへの固定化には工程２で作製し
たアクリルアミド修飾されたプローブDNAを用いた。こ
れに伴い、水溶液Aの組成は以下のように変更した。

【００８３】 水溶液Ａ アクリルアミド 3.7質量部 メチレンビスアクリルアミド 0.3質量部 2,2'-アゾビス（2-アミジノプロパン）二塩酸塩 0.1質量部 プローブＫ（またはプローブＬ，Ｍ，Ｎ） 0.005質量部

【００８４】こうして得られたプローブＫ固定化ゲルを
保持する多孔質中空繊維7本を、フロン板上に互いに重
なることなく密着させて配列し、両端を固定した。これ
にポリウレタン樹脂接着剤(日本ポリウレタン工業(株)
コロネート4403、ニッポラン4223)を薄く塗布し、核酸
固定化多孔質中空繊維を接着した。ポリウレタン樹脂が
十分に固まった後これをテフロン板上から剥がし、核酸
固定化ゲルを保持した多孔質中空繊維が一列に配列した
シート状物を得た。プローブＬ、Ｍ、Ｎについても同様
のものを得た。また、核酸を固定化していない同様のシ
ート状物を作製した（ブランク）。

【００８５】次いで、これらのシート状物をブランク、
プローブＫ、プローブＬブランク、プローブＮ、プロー
ブＭ、ブランクの順に7枚積層し、上記接着剤で接着
し、縦横各々7本ずつ、計49本の核酸固定化多孔質繊維
が正方に規則的に配列した、核酸固定化ゲルを保持した
多孔質中空繊維配列体を得た。

【００８６】（４）蛍光標識検体の作製 それぞれのプローブにのみハイブリダイズする検体Ｗ
（配列番号23）及びＺ（配列番号26）はオリゴヌクレオ
チドの5’末端がCy5でラベルされたものを、検体Ｘ（配
列番号24）及びＹ（配列番号25）は5’末端がCy3でラベ
ルされたものを合成（アマシャムファルマシアバイオテ
ク社、OlidoExpress）し、用いた。

【００８７】（５）ハイブリダイゼーション 工程３で得た核酸固定化薄片をハイブリダイゼーション
用バッグに入れ、ハイブリダイゼーション溶液を注ぎ、
45℃で30分間プレハイブリダイゼーションを行った。続
いて、蛍光標識検体を加え、さらに45℃で15時間ハイブ
リダイゼーションを行った。

【００８８】ハイブリダイゼーション終了後、核酸固定
化薄片をあらかじめ保温しておいた50mlの0.1xSSC、0.1
% SDS溶液に移し、振盪しながら45℃、20分間の洗浄を
３回行った。この後、0.5xSSCに置換し、蛍光検出器
（蛍光顕微鏡）で観察した。

【００８９】その結果、核酸固定化薄片中のプローブＫ
を固定化した多孔質繊維断面部にのみ検体Ｗが、プロー
ブＬを固定化した多孔質繊維断面部にのみ検体Ｘが、プ
ローブＭを固定化した多孔質繊維断面部にのみ検体Ｙ
が、プローブＮを固定化した多孔質繊維断面部にのみ検
体Ｚが、特異的にハイブリダイゼーションしていること
が確認できた。

【００９０】

【表１】

【００９１】

【発明の効果】本発明により、核酸を高密度かつ強固に
固定化させた核酸固定化高分子材料を得ることが可能と
なる。また、固定化プロセスを二次元平面上で行わず、
一次元構造体としての繊維上にで分離・独立して行うこ
とにより、鎖長によらず核酸の定量的固定が可能となっ
たこと、整列化プロセスに各種の繊維賦形技術、ないし
織物作製技術の導入により高密度化が可能となったこ
と、その結果得られる選られる三次元構造体としての繊
維束から目的とする二次元配列体を作製するために従来
法にはない切片化プロセスが新たに導入されたが、それ
に伴いスポッティング法のような誤差の多い微量分注操
作が不要となり、連続切片化を可能としたことにより、
わずかな面積に多種多数の核酸を固定化した薄片を多量
にまた容易に得ることができる。これにより、遺伝子構
造解析等を用いた臨床検査や、食品検査等の分野におい
て有用である。

【００９２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> MITSUBISHI RAYON CO., LTD. <120> A POROUS HOLLOW FIBER HOLDING NUCLEIC ACID-FIXED GEL, AN ARRAY OF THE FIBERS AND A SLICE OF THE ARRAY <130> P99-0677 <140> <141> <150> JP99/93044 <151> 1999-03-31 <160> 26 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 gcgatcgaaa ccttgctgta cgagcgaggg ctc 33 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 gatgaggtgg aggtcagggt ttgggacagc ag 32 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 gagccctcgc tcgtacagca aggtttcg 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 ctgctgtccc aaaccctgac ctccacc 27 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 gctcaagcgc gatttcggtt tcgacatccc c 31 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 catgtcgcgt cgttgttgga cgaagcggta 30 <210> 7 <211> 388 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous <400> 7 gcgatcgaaa ccttgctgta cgagcgaggg ctcatcacgc ccgccgcggt cgaccgagtc 60 gtttcgtact acgagaacga gatcggcccg atgggcggtg ccaaggtcgt ggccaagtcc 120 tgggtggacc ctgagtaccg caagtggctc gaagaggacg cgacggccgc gatggcgtca 180 ttgggctatg ccggtgagca ggcacaccaa atttcggcgg tcttcaacga ctcccaaacg 240 catcacgtgg tggtgtgcac tctgtgttcg tgctatccgt ggccggtgct tggtctcccg 300 cccgcctggt acaagagcat ggagtaccgg tcccgagtgg tagcggaccc tcgtggagtg 360 ctcaagcgcg atttcggttt cgacatcc 388 <210> 8 <211> 611 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous <400> 8 gatgaggtgg aggtcagggt ttgggacagc agctccgaaa tccgctacat cgtcatcccg 60 gaacggccgg ccggcaccga cggttggtcc gaggaggagc tgacgaagct ggtgagccgg 120 gactcgatga tcggtgtcag taatgcgctc acaccgcagg aagtgatcgt atgagtgaag 180 acacactcac tgatcggctc ccggcgactg ggaccgccgc accgccccgc gacaatggcg 240 agcttgtatt caccgagcct tgggaagcaa cggcattcgg ggtcgccatc gcgctttcgg 300 atcagaagtc gtacgaatgg gagttcttcc gacagcgtct cattcactcc atcgctgagg 360 ccaacggttg cgaggcatac tacgagagct ggacaaaggc gctcgaggcc agcgtggtcg 420 actcggggct gatcagcgaa gatgagatcc gcgagcgcat ggaatcgatg gccatcatcg 480 actgacatcc cctgtgtctc catctagcag cagtgcgggc gtaccccgac ggtgctgagc 540 cgacggggta cgcccgcact tcatcaatga cggtggttcc taatttggct cggtggatac 600 tgatctcgcg g 611 <210> 9 <211> 388 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous <400> 9 ggatgtcgaa accgaaatcg cgcttgagca ctccacgagg gtccgctacc actcgggacc 60 ggtactccat gctcttgtac caggcgggcg ggagaccaag caccggccac ggatagcacg 120 aacacagagt gcacaccacc acgtgatgcg tttgggagtc gttgaagacc gccgaaattt 180 ggtgtgcctg ctcaccggca tagcccaatg acgccatcgc ggccgtcgcg tcctcttcga 240 gccacttgcg gtactcaggg tccacccagg acttggccac gaccttggca ccgcccatcg 300 ggccgatctc gttctcgtag tacgaaacga ctcggtcgac cgcggcgggc gtgatgagcc 360 ctcgctcgta cagcaaggtt tcgatcgc 388 <210> 10 <211> 611 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous <400> 10 ccgcgagatc agtatccacc gagccaaatt aggaaccacc gtcattgatg aagtgcgggc 60 gtaccccgtc ggctcagcac cgtcggggta cgcccgcact gctgctagat ggagacacag 120 gggatgtcag tcgatgatgg ccatcgattc catgcgctcg cggatctcat cttcgctgat 180 cagccccgag tcgaccacgc tggcctcgag cgcctttgtc cagctctcgt agtatgcctc 240 gcaaccgttg gcctcagcga tggagtgaat gagacgctgt cggaagaact cccattcgta 300 cgacttctga tccgaaagcg cgatggcgac cccgaatgcc gttgcttccc aaggctcggt 360 gaatacaagc tcgccattgt cgcggggcgg tgcggcggtc ccagtcgccg ggagccgatc 420 agtgagtgtg tcttcactca tacgatcact tcctgcggtg tgagcgcatt actgacaccg 480 atcatcgagt cccggctcac cagcttcgtc agctcctcct cggaccaacc gtcggtgccg 540 gccggccgtt ccgggatgac gatgtagcgg atttcggagc tgctgtccca aaccctgacc 600 tccacctcat c 611 <210> 11 <211> 651 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 11 caaccaacca caactacata cacatacata cacaatggtc gctcaagttc aaaagcaagc 60 tccaactttt aagaaaactg ccgtcgtcga cggtgtcttt gacgaagtct ccttggacaa 120 atacaagggt aagtacgttg tcctagcctt tattccattg gccttcactt tcgtctgtcc 180 aaccgaaatc attgctttct cagaagctgc taagaaattc gaagaacaag gcgctcaagt 240 tcttttcgcc tccactgact ccgaatactc ccttttggca tggaccaata tcccaagaaa 300 ggaaggtggt ttgggcccaa tcaacattcc attgttggct gacaccaacc actctttgtc 360 cagagactat ggtgtcttga tcgaagaaga aggtgtcgcc ttgagaggtt tgttcatcat 420 cgacccaaag ggtgtcatta gacacatcac cattaacgat ttgccagtcg gtagaaacgt 480 tgacgaagcc ttgagattgg ttgaagcctt ccaatggacc gacaagaacg gtactgtctt 540 gccatgtaac tggactccag gtgctgctac catcaagcca accgttgaag actccaagga 600 atacttcgaa gctgccaaca aataagacgc ttgcagagtt gtctaaatga c 651 <210> 12 <211> 586 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 12 caaagcatac ctaataacaa tataatccca taatgctagc cctagctgat aacattctac 60 gtataataaa tttcctattt ttggttattt ccatcggttt aatcagttcg ttgttaaaca 120 cccaacatag gcacagctcc agagtaaact actgtatgtt tgcttgtgca tatggtatat 180 tcaccgattc attgtacggt gtctttgcca acttcattga accattggca tggccactag 240 ttttgttcac actggacttt ttgaactttg tgttcacttt cactgccggt acagtgttgg 300 ccgttggtat cagagctcac tcatgtaaca acagctcata cgttgacagt aacaagatta 360 ctcaaggttc cggtaccaga tgtagacaag ctcaagccgc tgttgcattc ctctacttct 420 cttgtgccat ctttttggct aagaccctga tgtctgtttt caacatgatc tccaatggtg 480 cctttggttc tggttctttc tccaagagaa gaagaactgg ccaagtcggt gttccaacca 540 tttcccaagt ctaattgaag cgcaccaact taaattttac gccact 586 <210> 13 <211> 1105 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 13 aagaaacatc cctcatacta ccacacatat gccaactcta gtaaatggac caagaagaga 60 ctctaccgaa gggtttgata ccgatatcat cactcttcct agattcataa tcgagcacca 120 gaagcaattt aagaacgcta ctggtgattt cacattagta ctgaatgcct tgcaattcgc 180 gttcaaattt gtatctcaca ccatcagacg tgctgaattg gttaacttgg ttgggttagc 240 aggcgcttcc aacttcactg gtgaccagca aaagaagttg gacgttctag gtgatgaaat 300 atttatcaat gccatgaggg ctagtgggat catcaaggtc cttgtatctg aagaacagga 360 agacttgatc gtttttccca caaacacggg ctcatacgca gtgtgttgtg atcctattga 420 tggctcctca aatttggacg ccggtgtctc cgttggaact atcgcgtcta tattcagact 480 gctaccagac tcatcaggta ctataaacga cgtactgaga tgtggtaaag aaatggtagc 540 cgcttgctat gccatgtacg gatcctctac gcatctagta ttgacattgg gtgatggagt 600 tgatgggttt accttagaca caaacttggg cgaattcatc ttgactcatc ctaacttaag 660 aattccgcct caaaaggcca tctactcaat taatgaaggt aacaccctct actggaacga 720 gactataaga acatttattg agaaagtcaa acaaccccaa gcagacaaca acaacaagcc 780 tttctcggct aggtatgttg gatccatggt tgctgatgtt cacaggacgt ttctttacgg 840 tggccttttc gcataccctt gcgacaagaa gagccccaac ggaaaactga ggttgcttta 900 tgaggccttc ccaatggctt tcttaatgga acaagcaggg ggaaaagcgg tcaacgatcg 960 cggagagaga atcttggatt tggtgccaag tcatatccat gacaaatctt ctatttggtt 1020 gggttcttca ggtgaaattg acaaattttt agaccatatt ggcaagtcac agtagttcaa 1080 tgatcgcctt cttttcttat tttct 1105 <210> 14 <211> 670 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 14 ctaagaaaac cacgatcaaa caaataaatc agcaatgggt gcctacaaat atttggaaga 60 attgcaaaga aagaagcaat ctgatgtttt gagattcttg caaagagtca gagtctggga 120 atacagacaa aagaatgtca ttcacagagc cgctagacca actagaccag acaaggctag 180 aagattgggt tacaaagcta agcaaggttt cgttatctac cgtgtcagag ttagacgtgg 240 taacagaaag agacctgttc caaagggtgc tacttacggt aagccaacta accaaggtgt 300 caatgaattg aaataccaaa gatccttgag agctaccgct gaagaaagag ttggtcgtcg 360 tgccgctaac ttgagagtct tgaactccta ctgggttaac caagattcta cttacaagta 420 cttcgaagtt atcttggtcg accctcaaca caaggctatc agaagagatg ctcgttacaa 480 ctggatctgt gacccagttc acaagcaccg tgaagctaga ggtttgactg ccactggtaa 540 gaaatccaga ggtatcaaca agggtcacaa attcaacaac accaaggctg gtagaagaaa 600 gacctggaag agacaaaaca ctttgtcctt gtggagatac agaaaataag ctggttgatg 660 gaaaatataa 670 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA bound with acrylamide at 5' terminus <400> 15 caaccaacca caactacata cacatac 27 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA bound with acrylamide at 5' terminus <400> 16 ctaagaaaac cacgatcaaa c 21 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA bound with acrylamide at 5' terminus <400> 17 aagaaacatc cctcatacta ccacac 26 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA bound with acrylamide at 5' terminus <400> 18 ctaagaaaac cacgatcaaa c 21 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 19 gtcatttaga caactctgca agcgt 25 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 20 ttatattttc catcaaccag c 21 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 21 agaaaataag aaaagaaggc gatca 25 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 22 ttatattttc catcaaccag c 21 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA labelled with Cy5 at 5' terminus <400> 23 gaacttgagc gaccattgtg tatgtatgtg tatgtagttg 40 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA labelled with Cy3 at 5' terminus <400> 24 atcagctagg gctagcatta tgggattata ttgttattag 40 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA labelled with Cy3 at 5' terminus <400> 25 gtccatttac tagagttggc atatgtgtgg tagtatgagg 40 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA labelled with Cy5 at 5' terminus <400> 26 atttgtaggc acccattgct gatttatttg tttgatcgtg 40

【００９３】

【配列表フリーテキスト】配列番号１：合成DNA 配列番号２：合成DNA 配列番号３：合成DNA 配列番号４：合成DNA 配列番号５：合成DNA 配列番号６：合成DNA 配列番号15：5’末端にアクリルアミドが結合した合成D
NA 配列番号16：5’末端にアクリルアミドが結合した合成D
NA 配列番号17：5’末端にアクリルアミドが結合した合成D
NA 配列番号18：5’末端にアクリルアミドが結合した合成D
NA 配列番号23：5’末端がCy5でラベルされた合成DNA 配列番号24：5’末端がCy3でラベルされた合成DNA 配列番号25：5’末端がCy3でラベルされた合成DNA 配列番号26：5’末端がCy5でラベルされた合成DNA

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維並び
に核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維配列体及びその薄
片の模式図である。(1)はプローブＡが固定化された核
酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維、(2)はプローブＢが
固定化された核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維、(3)
はこれら２種の核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維から
なる核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維配列体、及び
(4)はこの核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維配列体を
繊維軸に対して垂直方向に切断した断面を示す。

【図２】プローブ作製のために合成したオリゴヌクレオ
チドの位置を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 伊藤 千穂 広島県大竹市御幸町20番１号 三菱レイヨ ン株式会社中央技術研究所内 (72)発明者 湯 不二夫 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 三 菱レイヨン株式会社化学品開発研究所内 (72)発明者 渡辺 文昭 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 三 菱レイヨン株式会社化学品開発研究所内 (72)発明者 藤井 渉 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 三 菱レイヨン株式会社化学品開発研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA11 CA01 CA09 CA11 DA05 DA12 HA11 HA14 4B063 QA01 QA08 QA19 QQ16 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR55 QR56 QR62 QR75 QR76 QR84 QS02 QS03 QS25 QS34 QX02 4B065 AA45Y AA80Y CA41 CA46 4L033 AB01 AB02 CA02

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 多孔質中空繊維の中空部及び多孔質部に
   核酸固定化ゲルが保持された核酸固定化ゲル保持多孔質
   中空繊維。
2. 【請求項２】 請求項１記載の核酸固定化ゲル保持多孔
   質中空繊維の束を含む核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊
   維配列体。
3. 【請求項３】 繊維配列体中の繊維が規則的に配列され
   たものである請求項２記載の核酸固定化ゲル保持多孔質
   中空繊維配列体。
4. 【請求項４】 繊維の束が、１cm²あたり１００本以上
   の繊維を含むものである請求項２又は３記載の核酸固定
   化ゲル保持多孔質中空繊維配列体。
5. 【請求項５】 核酸の種類が、各繊維の全部又は一部に
   おいて異なるものである請求項２〜４のいずれか１項に
   記載の核酸固定化ゲル保持多孔質中空繊維配列体。
6. 【請求項６】 請求項２〜５のいずれか１項に記載の繊
   維配列体の繊維軸と交差する切断面を有する、前記核酸
   固定化ゲル保持多孔質中空繊維配列体の薄片。