JP2000279186A - Dnaプローブのシグナル増幅方法 - Google Patents
Dnaプローブのシグナル増幅方法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 下記工程a)及びb)からなる核酸配列
の存在検出方法。 a)核酸を、1)相補的な核酸配列を有せず、かつ2)
核酸配列に対し特異的に結合する分子と接触させ、次い
で b)結合された分子の存在を検出する。 【効果】 SN比の著しく向上したDNAプローブのシ
グナル増幅が得られ、標的核酸の検出感度が上昇した。
の存在検出方法。 a)核酸を、1)相補的な核酸配列を有せず、かつ2)
核酸配列に対し特異的に結合する分子と接触させ、次い
で b)結合された分子の存在を検出する。 【効果】 SN比の著しく向上したDNAプローブのシ
グナル増幅が得られ、標的核酸の検出感度が上昇した。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明はシグナル増幅方法に
関し、更に詳しくはSN比の著しく向上したDNAプローブ
のシグナル増幅方法に関する。
関し、更に詳しくはSN比の著しく向上したDNAプローブ
のシグナル増幅方法に関する。
【0002】
【従来の技術】DNAプローブは細胞及び分子生物学の分
野において重要な研究手段となっている。cDNA及びゲノ
ムライブラリー中に位置していた特定の遺伝子が、この
ようなプローブを介して個々の染色体へと局在させられ
る。更に、標識DNAプローブは生物の液体サンプルや組
織サンプル中のヴィールスやバクテリアのような病原菌
の検出にも用いられてきている。
野において重要な研究手段となっている。cDNA及びゲノ
ムライブラリー中に位置していた特定の遺伝子が、この
ようなプローブを介して個々の染色体へと局在させられ
る。更に、標識DNAプローブは生物の液体サンプルや組
織サンプル中のヴィールスやバクテリアのような病原菌
の検出にも用いられてきている。
【0003】標識DNAプローブとは、典型的には伝達分
子(同様に標識と称する)のような標識に接合したオリ
ゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは合成物で
も天然物であってもよく、標的DNA分子配列部に対し相
補的なものである。伝達分子は放射性のものでも非放射
性のものでもよいが、非放射性であることが一般に、安
全及び環境面から好ましい。非放射性伝達分子として通
常用いられるものには検出可能な酵素、蛍光性分子、ビ
オチンなどがある。
子(同様に標識と称する)のような標識に接合したオリ
ゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは合成物で
も天然物であってもよく、標的DNA分子配列部に対し相
補的なものである。伝達分子は放射性のものでも非放射
性のものでもよいが、非放射性であることが一般に、安
全及び環境面から好ましい。非放射性伝達分子として通
常用いられるものには検出可能な酵素、蛍光性分子、ビ
オチンなどがある。
【0004】プローブは直接標識に付着しうる。プロー
ブは選択的に配位子に接合され、配位子受容体に結合し
ている標識とともに検出されうる。たとえば、プローブ
はビオチンに接合され、伝達分子で標識されているアヴ
ィヂンもしくはストレプトアヴィヂン、又はビオチンに
対する標識抗体の使用により検出されうる。
ブは選択的に配位子に接合され、配位子受容体に結合し
ている標識とともに検出されうる。たとえば、プローブ
はビオチンに接合され、伝達分子で標識されているアヴ
ィヂンもしくはストレプトアヴィヂン、又はビオチンに
対する標識抗体の使用により検出されうる。
【0005】極少量の標的DNA分子を検出するには、検
出感度を向上させることがしばしば必要となる。感度は
標的増幅及びシグナル増幅の2種の方法により向上させ
るとこができる。
出感度を向上させることがしばしば必要となる。感度は
標的増幅及びシグナル増幅の2種の方法により向上させ
るとこができる。
【0006】標的増幅は、米国特許4,683,195号に記載
のセツスコーポレーションによる、いわゆるポリメラー
ゼチェーン(鎖)反応(PCR)法によりなされうる。こ
の方法は、2個のオリゴヌクレオチドを使用し、ポリメ
ラーゼによりDNAを合成しようとするものである。2個
のプライマーは2本鎖DNAの対立鎖配列に対し相補的な
ものである。DNA合成は、増幅された標的DNAの先行部位
により架橋された領域を横断する各鎖で起る。DNA鎖変
性、ヌクレオチドプライマーのアニーリング、及びポリ
メラーゼによるDNA合成開始の繰り返しによって、標的D
NAの対数的増加が達成される。この方法はバイオテクニ
ーク7巻,700〜706頁(1989年)においてギレン
ステンにより追認されている。
のセツスコーポレーションによる、いわゆるポリメラー
ゼチェーン(鎖)反応(PCR)法によりなされうる。こ
の方法は、2個のオリゴヌクレオチドを使用し、ポリメ
ラーゼによりDNAを合成しようとするものである。2個
のプライマーは2本鎖DNAの対立鎖配列に対し相補的な
ものである。DNA合成は、増幅された標的DNAの先行部位
により架橋された領域を横断する各鎖で起る。DNA鎖変
性、ヌクレオチドプライマーのアニーリング、及びポリ
メラーゼによるDNA合成開始の繰り返しによって、標的D
NAの対数的増加が達成される。この方法はバイオテクニ
ーク7巻,700〜706頁(1989年)においてギレン
ステンにより追認されている。
【0007】前記PCR法はいくつかのケースでは有効な
ものではあるものの、過剰なノイズ及び検出誤差といっ
た問題があり、それらについてはギレンステンの前記報
告においても議論されている。
ものではあるものの、過剰なノイズ及び検出誤差といっ
た問題があり、それらについてはギレンステンの前記報
告においても議論されている。
【0008】核酸検出感度を向上させるための他の試み
としては、シグナル増幅が挙げられる。たとえば、ヨー
ロッパ特許出願292,128 号において、セゲヴは感度の向
上したオリゴヌクレオチドプローブについて開示してい
る。上記各プローブは標識しうる多数の分枝を有してい
る。
としては、シグナル増幅が挙げられる。たとえば、ヨー
ロッパ特許出願292,128 号において、セゲヴは感度の向
上したオリゴヌクレオチドプローブについて開示してい
る。上記各プローブは標識しうる多数の分枝を有してい
る。
【0009】その他のシグナル増幅法については、米国
特許4,716,106 号にチスウェルにより開示されている。
チスウェルは一次オリゴヌクレオチドプローブ及び相補
的な二次プローブを用いるアッセイについて開示してい
る。一次プローブは、標的分子とハイブリッドする。二
次プローブは一次プローブとハイブリッドし、多数の標
識基に付着する。
特許4,716,106 号にチスウェルにより開示されている。
チスウェルは一次オリゴヌクレオチドプローブ及び相補
的な二次プローブを用いるアッセイについて開示してい
る。一次プローブは、標的分子とハイブリッドする。二
次プローブは一次プローブとハイブリッドし、多数の標
識基に付着する。
【0010】シュナイダーとシュンクは、米国特許4,88
2,269 号においてハイブリダイゼーションアッセイにつ
いて開示している。それによれば一次プローブが標的核
酸分子とハイブリッドし、更に複数の標識二次プローブ
が一次プローブの異なる配列とハイブリッドする。前記
米国特許4,882,269号記載の一次及び二次プローブはイ
ムクローンシステム社のアンプリプローブシステム(商
標名)を構成するものである。
2,269 号においてハイブリダイゼーションアッセイにつ
いて開示している。それによれば一次プローブが標的核
酸分子とハイブリッドし、更に複数の標識二次プローブ
が一次プローブの異なる配列とハイブリッドする。前記
米国特許4,882,269号記載の一次及び二次プローブはイ
ムクローンシステム社のアンプリプローブシステム(商
標名)を構成するものである。
【0011】パルヴァらも、米国特許4,731,325号にお
いて、ハイブリダイゼーションアッセイについて開示し
ている。それによれば1個より多いプローブが標的核酸
分子と結合する。米国特許4,868,105号には、多くの一
次プローブが標的核酸分子と結合するハイブリダイゼー
ションアッセイが開示されている。標識された二次プロ
ーブは一次プローブとハイブリダイズする。
いて、ハイブリダイゼーションアッセイについて開示し
ている。それによれば1個より多いプローブが標的核酸
分子と結合する。米国特許4,868,105号には、多くの一
次プローブが標的核酸分子と結合するハイブリダイゼー
ションアッセイが開示されている。標識された二次プロ
ーブは一次プローブとハイブリダイズする。
【0012】更に大きなシグナル増幅が要求されたこと
から、一次プローブに結合された標識二次オリゴヌクレ
オチドプローブ鎖が高感度ハイブリダイゼーションアッ
セイを可能にするものと考えが導かれた。たとえば、ウ
ルデアは、欧州特許出願317,077号において、標的核酸
分子のハイブリダイゼーションアッセイについて開示し
ている。「増幅プローブ」と呼ばれる1個以上のプロー
ブが標的分子とハイブリダイズする。「マルチマー」と
呼ばれる二次プローブが一次プローブとハイブリダイズ
する。二次プローブは線状でも枝分れしていてもよい。
二次プローブ配列が多数の標識オリゴヌクレオチドとハ
イブリダイズする。ウルデアらは、二次プローブが互い
に連続的に結合しあっていると考えている。しかしなが
ら、その連続した二次プローブがどのような形態をとっ
ているかは示されていない。ウルデアらによって提案さ
れた連続した二次プローブは、二次プローブ数に等しい
数のオリゴヌクレオチドが準備されなければならない点
からみても、非現実的なものである。
から、一次プローブに結合された標識二次オリゴヌクレ
オチドプローブ鎖が高感度ハイブリダイゼーションアッ
セイを可能にするものと考えが導かれた。たとえば、ウ
ルデアは、欧州特許出願317,077号において、標的核酸
分子のハイブリダイゼーションアッセイについて開示し
ている。「増幅プローブ」と呼ばれる1個以上のプロー
ブが標的分子とハイブリダイズする。「マルチマー」と
呼ばれる二次プローブが一次プローブとハイブリダイズ
する。二次プローブは線状でも枝分れしていてもよい。
二次プローブ配列が多数の標識オリゴヌクレオチドとハ
イブリダイズする。ウルデアらは、二次プローブが互い
に連続的に結合しあっていると考えている。しかしなが
ら、その連続した二次プローブがどのような形態をとっ
ているかは示されていない。ウルデアらによって提案さ
れた連続した二次プローブは、二次プローブ数に等しい
数のオリゴヌクレオチドが準備されなければならない点
からみても、非現実的なものである。
【0013】同様に、コリンズは、欧州特許出願204,51
0 号において、「受容体プローブ」と呼ばれる一次プロ
ーブ、「増幅鎖」と呼ばれる二次プローブ、及び「増幅
鎖」とハイブリッド可能な標識鎖を使用するハイブリダ
イゼーションアッセイについて開示している。「受容体
プローブ」は、標的核酸分子とハイブリッドするもの
で、かつホモポリマーヌクレオチド末端(ポリAとす
る)を有する。「増幅鎖」はホモポリマーヌクレオチド
鎖(ポリTとする)を含むことから、「受容体プロー
ブ」末端とハイブリッドできる。標識鎖は標識ホモポリ
マーヌクレオチド鎖(ポリA*)を含み、「増幅鎖」と
ハイブリッドできる。コリンズは更に、第二ホモポリマ
ー増幅鎖(ポリA)が前記増幅鎖(ポリT)とハイブリ
ッドされ、また第二標識鎖(ポリT*)が増幅鎖とハイ
ブリッドされうる、と考えている。上記工程は、増幅鎖
と標識鎖とのネットワーク構築のため繰り返し行っても
よい。
0 号において、「受容体プローブ」と呼ばれる一次プロ
ーブ、「増幅鎖」と呼ばれる二次プローブ、及び「増幅
鎖」とハイブリッド可能な標識鎖を使用するハイブリダ
イゼーションアッセイについて開示している。「受容体
プローブ」は、標的核酸分子とハイブリッドするもの
で、かつホモポリマーヌクレオチド末端(ポリAとす
る)を有する。「増幅鎖」はホモポリマーヌクレオチド
鎖(ポリTとする)を含むことから、「受容体プロー
ブ」末端とハイブリッドできる。標識鎖は標識ホモポリ
マーヌクレオチド鎖(ポリA*)を含み、「増幅鎖」と
ハイブリッドできる。コリンズは更に、第二ホモポリマ
ー増幅鎖(ポリA)が前記増幅鎖(ポリT)とハイブリ
ッドされ、また第二標識鎖(ポリT*)が増幅鎖とハイ
ブリッドされうる、と考えている。上記工程は、増幅鎖
と標識鎖とのネットワーク構築のため繰り返し行っても
よい。
【0014】コリンズによる前記ホモポリマーヌクレオ
チドプローブは、前記各プローブが相補体とハイブリッ
ドする程度を調節しえないという欠点を有する。たとえ
ば、第二増幅プローブが第一増幅プローブと多量にハイ
ブリッドするため、第三増幅鎖とハイブリッドすべき一
本鎖ヌクレオチドの数が不足してしまう。更に、各増幅
鎖と2個の付加増幅鎖とのハイブリダイゼーションを最
大にして連続増幅鎖の安定性を最大とすることが不可能
となる。
チドプローブは、前記各プローブが相補体とハイブリッ
ドする程度を調節しえないという欠点を有する。たとえ
ば、第二増幅プローブが第一増幅プローブと多量にハイ
ブリッドするため、第三増幅鎖とハイブリッドすべき一
本鎖ヌクレオチドの数が不足してしまう。更に、各増幅
鎖と2個の付加増幅鎖とのハイブリダイゼーションを最
大にして連続増幅鎖の安定性を最大とすることが不可能
となる。
【0015】
【発明が解決しようとする課題】一次プローブと互いに
ハイブリッドされた連続二次プローブからなる鎖とをハ
イブリッドするハイブリダイゼーションアッセイ法につ
いて前記欠点を是正することが望まれていた。したがっ
て、本発明の第一の目的は、そのようなハイブリダイゼ
ーションアッセイ法を提供することにある。本発明の第
二の目的は、従来のアッセイ法に比べ低ノイズかつ高感
度、すなわち、高SN比を有し、かつ迅速アッセイの可能
なハイブリダイゼーションアッセイ法を提供することに
ある。本発明は更に、対数的なシグナル増幅の可能な方
法を提供することを目的とする。
ハイブリッドされた連続二次プローブからなる鎖とをハ
イブリッドするハイブリダイゼーションアッセイ法につ
いて前記欠点を是正することが望まれていた。したがっ
て、本発明の第一の目的は、そのようなハイブリダイゼ
ーションアッセイ法を提供することにある。本発明の第
二の目的は、従来のアッセイ法に比べ低ノイズかつ高感
度、すなわち、高SN比を有し、かつ迅速アッセイの可能
なハイブリダイゼーションアッセイ法を提供することに
ある。本発明は更に、対数的なシグナル増幅の可能な方
法を提供することを目的とする。
【0016】
【課題を解決するための手段】本発明の前記諸目的は、
下記のシグナル増幅方法により達成される。
下記のシグナル増幅方法により達成される。
【0017】すなわち、本発明のシグナル増幅方法は、
標的核酸分子検出の際に下記a)、b)、及びc)から
なる工程を含むことを特徴とする。 a)一次ヌクレオチドプローブの第一配列を標的核酸分
子とハイブリッドさせる(ここで、一次プローブは架橋
(ブリッジング)核酸分子との結合手段を有し、架橋分
子は少なくとも1個の展開剤(ディヴェロッパー)核酸
分子とハイブリッド可能である)。 b)一次プローブを架橋分子、第一展開剤分子及び第二
展開剤分子に作用させる(ここで各展開剤分子は、同一
又は異なる構造を有し、 1)2個以上の異なるヌクレオチド、及び他の展開剤分
子の第一部分枝配列と相補的な総計6個以上のヌクレオ
チドからなる第一部分枝; 2)2個以上の異なるヌクレオチド、及び他の展開剤分
子の第二部分枝配列と相補的な総計6個以上のヌクレオ
チドからなる第二部分枝; 3)検出可能標識を有する展開剤分子に変換される検出
可能標識又は手段、を有する)。 前記工程a)及びb)は下記条件イ)及びロ)の下で行
なわれる; イ)架橋分子が一次プローブと結合し、第一展開剤分子
とハイブリッドし、かつ ロ)結合された第一展開剤分子が第二展開剤分子とハイ
ブリッドし、展開剤鎖を形成する。 c)展開剤鎖中の標識展開剤分子を検出する。
標的核酸分子検出の際に下記a)、b)、及びc)から
なる工程を含むことを特徴とする。 a)一次ヌクレオチドプローブの第一配列を標的核酸分
子とハイブリッドさせる(ここで、一次プローブは架橋
(ブリッジング)核酸分子との結合手段を有し、架橋分
子は少なくとも1個の展開剤(ディヴェロッパー)核酸
分子とハイブリッド可能である)。 b)一次プローブを架橋分子、第一展開剤分子及び第二
展開剤分子に作用させる(ここで各展開剤分子は、同一
又は異なる構造を有し、 1)2個以上の異なるヌクレオチド、及び他の展開剤分
子の第一部分枝配列と相補的な総計6個以上のヌクレオ
チドからなる第一部分枝; 2)2個以上の異なるヌクレオチド、及び他の展開剤分
子の第二部分枝配列と相補的な総計6個以上のヌクレオ
チドからなる第二部分枝; 3)検出可能標識を有する展開剤分子に変換される検出
可能標識又は手段、を有する)。 前記工程a)及びb)は下記条件イ)及びロ)の下で行
なわれる; イ)架橋分子が一次プローブと結合し、第一展開剤分子
とハイブリッドし、かつ ロ)結合された第一展開剤分子が第二展開剤分子とハイ
ブリッドし、展開剤鎖を形成する。 c)展開剤鎖中の標識展開剤分子を検出する。
【0018】更に、本発明の標的核酸分子検出の際のシ
グナル増幅方法は、特に好ましい態様として、下記工程
a)、b)及びc)を有することを特徴とする。 a)一次オリゴヌクレオチドプローブの第一配列と標的
核酸分子とをハイブリッドさせる(ここで、一次プロー
ブは架橋分子との結合手段を有し、架橋分子は少なくと
も1個の展開剤分子とハイブリッド可能である)。 b)プローブを架橋分子、及び3個以上の部分枝を有す
る複数の展開剤分子に作用させる(ここで各展開剤分子
の各部分枝は、他の少なくとも1個の同一又は異なる展
開剤分子の部分枝配列と相補的な6個以上のヌクレオチ
ド配列を有し、また各展開剤分子は、 1)他の3個以上の展開剤分子とハイブリッド可能であ
り、かつ 2)検出可能標識を有する、又は有することができ
る)。 前記a)及びb)は下記条件イ)〜ハ)の下で行なわれ
る; イ)架橋分子が一次プローブと結合し、かつ少なくとも
1個の展開剤分子とハイブリッドし、 ロ)2個以上の付加展開剤分子が第一展開剤分子とハイ
ブリッドし、かつ ハ)他の複数の展開剤分子がハイブリッドされた付加展
開剤分子とハイブリッドし、展開剤鎖を形成する。 c)展開剤鎖中の標識展開剤分子を検出する。
グナル増幅方法は、特に好ましい態様として、下記工程
a)、b)及びc)を有することを特徴とする。 a)一次オリゴヌクレオチドプローブの第一配列と標的
核酸分子とをハイブリッドさせる(ここで、一次プロー
ブは架橋分子との結合手段を有し、架橋分子は少なくと
も1個の展開剤分子とハイブリッド可能である)。 b)プローブを架橋分子、及び3個以上の部分枝を有す
る複数の展開剤分子に作用させる(ここで各展開剤分子
の各部分枝は、他の少なくとも1個の同一又は異なる展
開剤分子の部分枝配列と相補的な6個以上のヌクレオチ
ド配列を有し、また各展開剤分子は、 1)他の3個以上の展開剤分子とハイブリッド可能であ
り、かつ 2)検出可能標識を有する、又は有することができ
る)。 前記a)及びb)は下記条件イ)〜ハ)の下で行なわれ
る; イ)架橋分子が一次プローブと結合し、かつ少なくとも
1個の展開剤分子とハイブリッドし、 ロ)2個以上の付加展開剤分子が第一展開剤分子とハイ
ブリッドし、かつ ハ)他の複数の展開剤分子がハイブリッドされた付加展
開剤分子とハイブリッドし、展開剤鎖を形成する。 c)展開剤鎖中の標識展開剤分子を検出する。
【0019】本発明は更にDNAハイブリダイゼーション
アッセイにおける検出方法を提供する。この方法は、下
記工程を有する核酸配列の存在を検出することを特徴と
する。 a)核酸を下記1)及び2)で示される分子と接触させ
る: 1)核酸配列と非相補的、かつ 2)核酸配列と特異的に結合する;次いで b)結合分子の存在を検出する。
アッセイにおける検出方法を提供する。この方法は、下
記工程を有する核酸配列の存在を検出することを特徴と
する。 a)核酸を下記1)及び2)で示される分子と接触させ
る: 1)核酸配列と非相補的、かつ 2)核酸配列と特異的に結合する;次いで b)結合分子の存在を検出する。
【0020】
【発明の実施の形態】本発明の概要を添付の図面を参照
して説明する。図1において、標的核酸分子(2)が固
体表面(5)に固定される。一次プローブ(15)の第
一配列(10)は標的分子(2)の配列と特異的にハイ
ブリダイズする。一次プローブ(15)が手段(30)
を介して架橋分子(20)と結合する。展開剤分子(4
0)は架橋分子(20)及び付加展開剤分子(40)と
結合する。展開剤分子は標識(45)を介して検出され
る。
して説明する。図1において、標的核酸分子(2)が固
体表面(5)に固定される。一次プローブ(15)の第
一配列(10)は標的分子(2)の配列と特異的にハイ
ブリダイズする。一次プローブ(15)が手段(30)
を介して架橋分子(20)と結合する。展開剤分子(4
0)は架橋分子(20)及び付加展開剤分子(40)と
結合する。展開剤分子は標識(45)を介して検出され
る。
【0021】図2は、一次プローブ(15)と架橋分子
(20)との結合手段が架橋分子(20)の配列とハイ
ブリダイズする一次プローブ(50)の第二配列である
ことを除き、第1図と同様の工程を示す。図3において
は、各展開剤分子のすべてのヌクレオチドは、末端展開
剤分子を除き、架橋分子及び他の少なくとも1個の展開
剤分子、又は他の2個以上の展開剤鎖中の展開剤分子と
ハイブリダイズする。この態様においては、鎖中の展開
剤分子間にギャップは生じていない。展開剤分子は連結
してコンカタマー(60)を形成してもよい。
(20)との結合手段が架橋分子(20)の配列とハイ
ブリダイズする一次プローブ(50)の第二配列である
ことを除き、第1図と同様の工程を示す。図3において
は、各展開剤分子のすべてのヌクレオチドは、末端展開
剤分子を除き、架橋分子及び他の少なくとも1個の展開
剤分子、又は他の2個以上の展開剤鎖中の展開剤分子と
ハイブリダイズする。この態様においては、鎖中の展開
剤分子間にギャップは生じていない。展開剤分子は連結
してコンカタマー(60)を形成してもよい。
【0022】図4においては、展開剤分子は枝分れして
いる(70)。枝分れした各展開剤分子は3個以上の展
開剤分子、又は他の2個以上の展開剤分子及び架橋分子
とハイブリダイズ可能である。
いる(70)。枝分れした各展開剤分子は3個以上の展
開剤分子、又は他の2個以上の展開剤分子及び架橋分子
とハイブリダイズ可能である。
【0023】以下に本発明を詳細に説明する。標的核酸分子 本発明により検出される標的核酸分子には制限がなく、
たとえば、アデニン(A)、チミン(T)、シトシン
(C)、及びグアニン(G)、更にRNAの場合ウうシル
(U)の任意の配列を有するDNA又はRNAが挙げられる。
核酸は一本鎖でも、また二本鎖のものでもよい。標的核
酸分子の長さにも上限はない。分子は6個以上のヌクレ
オチド塩基を有する。
たとえば、アデニン(A)、チミン(T)、シトシン
(C)、及びグアニン(G)、更にRNAの場合ウうシル
(U)の任意の配列を有するDNA又はRNAが挙げられる。
核酸は一本鎖でも、また二本鎖のものでもよい。標的核
酸分子の長さにも上限はない。分子は6個以上のヌクレ
オチド塩基を有する。
【0024】本発明に使用可能なハイブリダイゼーショ
ンアッセイは液中でも実施できるが、標的核酸分子を固
体表面に固定して行なうことが好ましい。標的核酸分子
を固定すれば、核酸分子浮遊成分を単純な洗浄により分
離することが容易となる。標的核酸分子の固定は検出に
先立つアッセイのどの段階でも行なうことができる。本
発明においては、標的核酸分子を固定できるものならば
いかなる固体表面も使用することができる。好ましい固
形支持体としては、ニトロセルロース、アガローズビー
ズ、修飾セルロース繊維、ポリプロピレンなどが挙げら
れる。固体表面をアッセイが行なわれる管壁とすること
が実用的であり好ましい。
ンアッセイは液中でも実施できるが、標的核酸分子を固
体表面に固定して行なうことが好ましい。標的核酸分子
を固定すれば、核酸分子浮遊成分を単純な洗浄により分
離することが容易となる。標的核酸分子の固定は検出に
先立つアッセイのどの段階でも行なうことができる。本
発明においては、標的核酸分子を固定できるものならば
いかなる固体表面も使用することができる。好ましい固
形支持体としては、ニトロセルロース、アガローズビー
ズ、修飾セルロース繊維、ポリプロピレンなどが挙げら
れる。固体表面をアッセイが行なわれる管壁とすること
が実用的であり好ましい。
【0025】標的核酸分子配列は、公知の方法により固
体表面に結合される。これらの方法においては、共有結
合及び/又は非共有結合が行なわれる。
体表面に結合される。これらの方法においては、共有結
合及び/又は非共有結合が行なわれる。
【0026】非共有結合例としては、固体表面に固定さ
れたヌクレオチド配列と相補的な標的分子のヌクレオチ
ド配列のハイブリダイゼーションが挙げられる。このよ
うな固定配列は、しばしば「捕獲プローブ」と称され
る。
れたヌクレオチド配列と相補的な標的分子のヌクレオチ
ド配列のハイブリダイゼーションが挙げられる。このよ
うな固定配列は、しばしば「捕獲プローブ」と称され
る。
【0027】非共有結合法以外では、標的核酸分子は固
体表面上の受容体と特異的に結合する配位子を含む。標
的核酸分子と一次プローブとのハイブリダイゼーション
を阻害しないかぎり、任意の配位子−受容体の組合せが
本発明に好適に使用される。たとえば、ビオチン−アビ
ヂン、チロキシン−チロキシン結合グロブリン、カルボ
ヒドラート−レクチン、抗原−抗体などが挙げられる。
このような組合せのうちのいずれが配位子又は受容体を
構成してもよい。
体表面上の受容体と特異的に結合する配位子を含む。標
的核酸分子と一次プローブとのハイブリダイゼーション
を阻害しないかぎり、任意の配位子−受容体の組合せが
本発明に好適に使用される。たとえば、ビオチン−アビ
ヂン、チロキシン−チロキシン結合グロブリン、カルボ
ヒドラート−レクチン、抗原−抗体などが挙げられる。
このような組合せのうちのいずれが配位子又は受容体を
構成してもよい。
【0028】一次プローブ 一次プローブは、標的分子配列とハイブリッド可能なヌ
クレオチドの第一配列を有する枝分れした、あるいは枝
分れしていない核酸である。ハイブリダイゼーション
は、たとえば15〜60℃、pH6〜8といった通常のハ
イブリダイゼーション条件下で行なわれる。一次プロー
ブは、標的分子中の6個以上のヌクレオチドと相補的な
配列を有することが好ましい。
クレオチドの第一配列を有する枝分れした、あるいは枝
分れしていない核酸である。ハイブリダイゼーション
は、たとえば15〜60℃、pH6〜8といった通常のハ
イブリダイゼーション条件下で行なわれる。一次プロー
ブは、標的分子中の6個以上のヌクレオチドと相補的な
配列を有することが好ましい。
【0029】一次プローブはまた架橋分子との結合手段
を有する。一次プローブを架橋分子に結合させる手段
は、図1においてX・・・Y(30)として示されてい
るように、前記の配位子−受容体関係にある任意のもの
である。しかしながら、一次プローブ(15)は、架橋
分子の6個以上の隣接ヌクレオチドと相補的な一次プロ
ーブの第二配列により、架橋分子(20)と結合するこ
とが好ましい。一次プローブ及び架橋分子の相補的な配
列は、標的分子が一次プローブと架橋分子とのハイブリ
ダイゼーションを妨げないように選択する。
を有する。一次プローブを架橋分子に結合させる手段
は、図1においてX・・・Y(30)として示されてい
るように、前記の配位子−受容体関係にある任意のもの
である。しかしながら、一次プローブ(15)は、架橋
分子の6個以上の隣接ヌクレオチドと相補的な一次プロ
ーブの第二配列により、架橋分子(20)と結合するこ
とが好ましい。一次プローブ及び架橋分子の相補的な配
列は、標的分子が一次プローブと架橋分子とのハイブリ
ダイゼーションを妨げないように選択する。
【0030】一次プローブの長さは、通常のハイブリダ
イゼーション条件下で安定に標的分子とハイブリダイズ
し、かつ架橋分子と結合する限り、制限されないが、必
要以上に長くないことが好ましい。たとえば、直鎖状一
次プローブはオリゴヌクレオチド塩基を12〜100個
有するヌクレオチドであることが好ましい。ヌクレオチ
ド数も制限されないが、合成の容易性及びハイブリダイ
ゼーションに要する時間といった利便性により決定され
る。
イゼーション条件下で安定に標的分子とハイブリダイズ
し、かつ架橋分子と結合する限り、制限されないが、必
要以上に長くないことが好ましい。たとえば、直鎖状一
次プローブはオリゴヌクレオチド塩基を12〜100個
有するヌクレオチドであることが好ましい。ヌクレオチ
ド数も制限されないが、合成の容易性及びハイブリダイ
ゼーションに要する時間といった利便性により決定され
る。
【0031】架橋分子 架橋分子は一次プローブ及び1個以上の展開剤分子と結
合する直鎖状又は枝分れした核酸分子である。架橋分子
と一次プローブとの結合は図1の手段(30)により、
前述のように行なわれる。架橋分子は、図2に示すよう
に、一次プローブの第二配列(50)とハイブリダイズ
する配列を有することが好ましい。
合する直鎖状又は枝分れした核酸分子である。架橋分子
と一次プローブとの結合は図1の手段(30)により、
前述のように行なわれる。架橋分子は、図2に示すよう
に、一次プローブの第二配列(50)とハイブリダイズ
する配列を有することが好ましい。
【0032】架橋分子は、一次プローブが標的分子とハ
イブリダイズする条件とほぼ同条件で展開剤分子とハイ
ブリダイズする。これらの条件については前述した。
イブリダイズする条件とほぼ同条件で展開剤分子とハイ
ブリダイズする。これらの条件については前述した。
【0033】架橋分子は、展開剤分子の6個以上の隣接
ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を有すること
が好ましい。架橋分子の長さは、安定に一次プローブと
結合し、かつ少なくとも1個の展開剤分子と通常核酸が
ハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする限り、
制限されない。たとえば、直鎖状架橋分子は12〜10
0のヌクレオチド塩基を有するオリゴヌクレオチドであ
ることが好ましい。架橋分子は直鎖状であっても、枝分
れしたものであってもよい。
ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を有すること
が好ましい。架橋分子の長さは、安定に一次プローブと
結合し、かつ少なくとも1個の展開剤分子と通常核酸が
ハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする限り、
制限されない。たとえば、直鎖状架橋分子は12〜10
0のヌクレオチド塩基を有するオリゴヌクレオチドであ
ることが好ましい。架橋分子は直鎖状であっても、枝分
れしたものであってもよい。
【0034】展開剤分子 展開剤分子は直鎖状又は枝分れしたものであり、自己相
補性を有していてもよい。本明細書において「自己相補
性」とは、各展開剤分子が前述したように通常核酸がハ
イブリダイズする条件下で他のすべての展開剤分子とハ
イブリダイズ可能であることを意味する。各展開剤分子
は複数の部分枝(特定の部分配列)からなり、各部分枝
は他の展開剤分子のヌクレオチド配列と相補的であるヌ
クレオチド配列を有する。直鎖状展開剤分子は2個の部
分枝を有するとみなされることから、枝分れした展開剤
分子は2個よりも多い部分枝を有する。
補性を有していてもよい。本明細書において「自己相補
性」とは、各展開剤分子が前述したように通常核酸がハ
イブリダイズする条件下で他のすべての展開剤分子とハ
イブリダイズ可能であることを意味する。各展開剤分子
は複数の部分枝(特定の部分配列)からなり、各部分枝
は他の展開剤分子のヌクレオチド配列と相補的であるヌ
クレオチド配列を有する。直鎖状展開剤分子は2個の部
分枝を有するとみなされることから、枝分れした展開剤
分子は2個よりも多い部分枝を有する。
【0035】各展開剤分子は、相補的配列により、他の
2個以上の展開剤分子、又は架橋分子及び他の少なくと
も1個の展開剤分子とハイブリダイズ可能である。各展
開剤分子の相補的配列は6個以上の隣接ヌクレオチド塩
基を有する。展開剤分子を他の展開剤分子と結合させる
配列と同一のものが、また展開剤分子を架橋分子とも結
合させる。
2個以上の展開剤分子、又は架橋分子及び他の少なくと
も1個の展開剤分子とハイブリダイズ可能である。各展
開剤分子の相補的配列は6個以上の隣接ヌクレオチド塩
基を有する。展開剤分子を他の展開剤分子と結合させる
配列と同一のものが、また展開剤分子を架橋分子とも結
合させる。
【0036】ハイブリダイズ条件下で展開剤分子鎖も形
成される。各展開剤分子は、標識されているため、上記
方法によりもたらされる増幅度は、上記鎖中の展開剤分
子数の増大に伴ない増大する。鎖中の展開剤分子数に制
限はなく、100でも、1,000でも、10,000でも、更にそれ
以上でもよい。
成される。各展開剤分子は、標識されているため、上記
方法によりもたらされる増幅度は、上記鎖中の展開剤分
子数の増大に伴ない増大する。鎖中の展開剤分子数に制
限はなく、100でも、1,000でも、10,000でも、更にそれ
以上でもよい。
【0037】各展開剤分子鎖においては、各展開剤分子
は他の2個以上の展開剤分子とハイブリダイズする。展
開剤分子鎖中の末端分子は、先の展開剤分子のみとハイ
ブリダイズする。
は他の2個以上の展開剤分子とハイブリダイズする。展
開剤分子鎖中の末端分子は、先の展開剤分子のみとハイ
ブリダイズする。
【0038】展開剤分子の標識 展開剤分子は公知の方法に従い標識される。このような
方法については、たとえば、リーリーら,Proc. Natl.
Acad. Sci. USA(1983) 80:4045; レンツ及びクルツ,Nu
cl. Acids Res. (1984) 12:3435;リチャードソン及びガ
ンポート,Nucl. Acids Res. (1983) 11:6167;スミス
ら, Nucl. Acids Res. (1985) 13:2399;マインコス及び
ワール, Anal. Biochem. (1984) 138:267,などに記載さ
れている。
方法については、たとえば、リーリーら,Proc. Natl.
Acad. Sci. USA(1983) 80:4045; レンツ及びクルツ,Nu
cl. Acids Res. (1984) 12:3435;リチャードソン及びガ
ンポート,Nucl. Acids Res. (1983) 11:6167;スミス
ら, Nucl. Acids Res. (1985) 13:2399;マインコス及び
ワール, Anal. Biochem. (1984) 138:267,などに記載さ
れている。
【0039】標識は放射性のものであってもよい。有用
な標識剤としては32P,125I,131I及び3Hが挙げら
れる。放射性標識の使用については英国特許2,034,323
号、米国特許4,358,535号及び4,302,204号等に記載され
ている。
な標識剤としては32P,125I,131I及び3Hが挙げら
れる。放射性標識の使用については英国特許2,034,323
号、米国特許4,358,535号及び4,302,204号等に記載され
ている。
【0040】非放射性標識の例としては、酵素、クロモ
フォア、電子顕微鏡で検出可能な原子又は分子、磁気的
性質により検出可能な金属イオン等が挙げられる。
フォア、電子顕微鏡で検出可能な原子又は分子、磁気的
性質により検出可能な金属イオン等が挙げられる。
【0041】有用な酵素標識のいくつかは、基質中で検
出可能な変化をもたらす酵素を含む。有用な酵素及びそ
の基質(かっこ内)としては、たとえばホースラディシ
ュパーオキシダーゼ(ピロガロール)及びO−フェニレ
ンジアミン)、ベータ−ガラクトシダーゼ(フルオレセ
イン、ベータ−D−ガラクトピラノシド)、及びアルカ
リフォスファターゼ(5−ブロモ−4−クロロ−3−イ
ンドリルフォスフェート/ニトロブルーテトラゾリウ
ム)が挙げられる。酵素標識については、英国特許2,01
9,404 号、欧州特許63,879号、及びロートマン, Proc.
Natl. Acad. Sci., 47巻, 1981〜1991頁(1961)に記載さ
れている。
出可能な変化をもたらす酵素を含む。有用な酵素及びそ
の基質(かっこ内)としては、たとえばホースラディシ
ュパーオキシダーゼ(ピロガロール)及びO−フェニレ
ンジアミン)、ベータ−ガラクトシダーゼ(フルオレセ
イン、ベータ−D−ガラクトピラノシド)、及びアルカ
リフォスファターゼ(5−ブロモ−4−クロロ−3−イ
ンドリルフォスフェート/ニトロブルーテトラゾリウ
ム)が挙げられる。酵素標識については、英国特許2,01
9,404 号、欧州特許63,879号、及びロートマン, Proc.
Natl. Acad. Sci., 47巻, 1981〜1991頁(1961)に記載さ
れている。
【0042】有用な発色団としては、たとえば、染料の
ほか、蛍光性、化学発光性、及び生物発光性分子が挙げ
られる。本発明に特に有用な発色団は、たとえば、フル
オレセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリ
スリン、ウンベリフェロン、及びルミノールである。
ほか、蛍光性、化学発光性、及び生物発光性分子が挙げ
られる。本発明に特に有用な発色団は、たとえば、フル
オレセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリ
スリン、ウンベリフェロン、及びルミノールである。
【0043】標識は、よく知られている方法により展開
剤分子に接合される。標識を展開剤分子上の官能基によ
り展開剤分子に直接結合させてもよい。展開剤分子はこ
のような官能基を含むか、又は含ませることができる適
当な官能基は、たとえば、アミノ、カルボキシル、スル
フィドリル、マレイミド、イソシアネート、及びイソチ
オシアネート基である。
剤分子に接合される。標識を展開剤分子上の官能基によ
り展開剤分子に直接結合させてもよい。展開剤分子はこ
のような官能基を含むか、又は含ませることができる適
当な官能基は、たとえば、アミノ、カルボキシル、スル
フィドリル、マレイミド、イソシアネート、及びイソチ
オシアネート基である。
【0044】標識はまた、前記方法により展開剤分子に
結合された配位子及び標識に結合された配位子の受容体
によって展開剤分子に接合される。前記任意の組合せの
配位子−受容体が好適に使用される。なかでもビオチン
−アヴィジンの組合せが好ましい。
結合された配位子及び標識に結合された配位子の受容体
によって展開剤分子に接合される。前記任意の組合せの
配位子−受容体が好適に使用される。なかでもビオチン
−アヴィジンの組合せが好ましい。
【0045】展開剤分子の標識方法においては、検出可
能な2個の分子を互いにある距離を置いて配することに
より、標的核酸分子を固形支持体に固定し、かつ浮遊成
分を除去する必要性を免れる可能性がある。このような
標識は、たとえば、それらの間で非放射性エネルギー移
動が生じた場合、検出可能となるであろう。一方の標識
によって吸収された他方からのエネルギーが異なる波長
で再放出された場合、標識が検出されうる。このような
吸収及び再放出は、2個の標識が特に近接している場合
に起る。展開剤分子は、化学発光性触媒に、たとえば約
10〜90%、好ましくは約25〜75%、より好まし
くは約40〜60%接合される。展開剤分子の残分は、
吸収剤/放出剤部分に接合される。
能な2個の分子を互いにある距離を置いて配することに
より、標的核酸分子を固形支持体に固定し、かつ浮遊成
分を除去する必要性を免れる可能性がある。このような
標識は、たとえば、それらの間で非放射性エネルギー移
動が生じた場合、検出可能となるであろう。一方の標識
によって吸収された他方からのエネルギーが異なる波長
で再放出された場合、標識が検出されうる。このような
吸収及び再放出は、2個の標識が特に近接している場合
に起る。展開剤分子は、化学発光性触媒に、たとえば約
10〜90%、好ましくは約25〜75%、より好まし
くは約40〜60%接合される。展開剤分子の残分は、
吸収剤/放出剤部分に接合される。
【0046】化学発光性触媒を含む展開剤分子と吸収剤
/放出剤部分を含む展開剤分子とが、互いにハイブリダ
イズすることにより化学発光性触媒と吸収剤/放出剤部
分とがごく近接することとなり、非放射性エネルギー移
動がひき起される。化学発光性触媒と吸収剤/放出剤部
分との間の距離は、一般におよそ100Å以下である。
化学発光性触媒からの光放出を誘起する試薬の存在下で
は、測定可能量の光が検出可能波長で吸収剤/放出剤部
分により吸収される。吸収剤/放出剤部分は、燐光性又
は蛍光性試薬であってもよい。化学発光性触媒の有用例
としては、パーオキシダーゼ及びルシフェラーゼが挙げ
られ、これらはルミノール酸化を促進する。ルミノール
化学発光反応に有用な吸収剤/発光剤部分は、ウロポル
フィリン及びテトラカルボキシフェニルポルフィリンの
ような遊離塩基ポルフィリン、マグネシウム又は亜鉛の
ような金属を含むメタロポルフィリン、テトラフェニル
カルボキシポルフィリン、ペリレン、アンスラセン、7
−メチルジベンゾ(a,h)ピレン、及びルミノール化
学発光領域(400nmと450nmとの間)に強い吸収を
有するために十分な大きさの共役環を有する多環芳香族
などである。エネルギー移動型の標識の使用については
欧州特許出願70,685号に開示されており、関連するもの
としては米国特許4,868,103 号及び4,822,733 号があ
る。
/放出剤部分を含む展開剤分子とが、互いにハイブリダ
イズすることにより化学発光性触媒と吸収剤/放出剤部
分とがごく近接することとなり、非放射性エネルギー移
動がひき起される。化学発光性触媒と吸収剤/放出剤部
分との間の距離は、一般におよそ100Å以下である。
化学発光性触媒からの光放出を誘起する試薬の存在下で
は、測定可能量の光が検出可能波長で吸収剤/放出剤部
分により吸収される。吸収剤/放出剤部分は、燐光性又
は蛍光性試薬であってもよい。化学発光性触媒の有用例
としては、パーオキシダーゼ及びルシフェラーゼが挙げ
られ、これらはルミノール酸化を促進する。ルミノール
化学発光反応に有用な吸収剤/発光剤部分は、ウロポル
フィリン及びテトラカルボキシフェニルポルフィリンの
ような遊離塩基ポルフィリン、マグネシウム又は亜鉛の
ような金属を含むメタロポルフィリン、テトラフェニル
カルボキシポルフィリン、ペリレン、アンスラセン、7
−メチルジベンゾ(a,h)ピレン、及びルミノール化
学発光領域(400nmと450nmとの間)に強い吸収を
有するために十分な大きさの共役環を有する多環芳香族
などである。エネルギー移動型の標識の使用については
欧州特許出願70,685号に開示されており、関連するもの
としては米国特許4,868,103 号及び4,822,733 号があ
る。
【0047】本発明は更に、これまで議論されていない
DNAプローブへの標識方法を提供する。この方法は、分
子が相補的DNA配列を含んでいなくても、特定のDNA配列
を認識する分子を存在させて行なうものである。結合
は、相補性DNA配列のハイブリダイゼーション以外の手
段、たとえばインターカレーションにより行なわれる。
DNAプローブへの標識方法を提供する。この方法は、分
子が相補的DNA配列を含んでいなくても、特定のDNA配列
を認識する分子を存在させて行なうものである。結合
は、相補性DNA配列のハイブリダイゼーション以外の手
段、たとえばインターカレーションにより行なわれる。
【0048】たとえば、よく知られている薬品であるジ
スタミシンA及びニトロプシン、及び染料であるヘキス
ト33258 はA−Tリッチの二本鎖DNAに選択的に結合す
る。A−T領域はAATT、ATTT、又はAAATTTからなること
が好ましい。同様に、公知薬であるアクチノミシンD及
びクロモミシンはG−Cリッチの二本鎖DNAに特異的に
結合する。これら薬品のDNAとの結合については、スコ
ットらBiochemistry 27巻, 7940〜7951頁(1988)、及び
ガオらBiochemistry 28巻, 751 〜762 頁(1989)に記載
されている。ヘキスト33258 については、テングらNuc
l. Acids Res. 16巻, 2671〜2690頁(1988)に記載されて
いる。DNA中の特定のペプチド及びプロテインもまた公
知であり、本発明に用いてもよい。
スタミシンA及びニトロプシン、及び染料であるヘキス
ト33258 はA−Tリッチの二本鎖DNAに選択的に結合す
る。A−T領域はAATT、ATTT、又はAAATTTからなること
が好ましい。同様に、公知薬であるアクチノミシンD及
びクロモミシンはG−Cリッチの二本鎖DNAに特異的に
結合する。これら薬品のDNAとの結合については、スコ
ットらBiochemistry 27巻, 7940〜7951頁(1988)、及び
ガオらBiochemistry 28巻, 751 〜762 頁(1989)に記載
されている。ヘキスト33258 については、テングらNuc
l. Acids Res. 16巻, 2671〜2690頁(1988)に記載されて
いる。DNA中の特定のペプチド及びプロテインもまた公
知であり、本発明に用いてもよい。
【0049】本方法にしたがえば、DNAの特定部位に結
合した化合物は前記方法により展開剤分子に付着する。
これら化合物は、結合していない化合物とは異なる性質
に基づいて検出される。このような性質の相違は、たと
えば、UV、NMR 、円二色性によるスペクトルの違いその
他により検出できる。
合した化合物は前記方法により展開剤分子に付着する。
これら化合物は、結合していない化合物とは異なる性質
に基づいて検出される。このような性質の相違は、たと
えば、UV、NMR 、円二色性によるスペクトルの違いその
他により検出できる。
【0050】展開剤分子には多重標識を施こすことがで
きる。展開剤分子のような核酸分子に多重標識を付着さ
せる方法はよく知られている。多重標識は、たとえばセ
ゲヴによる欧州特許292,128 号に記載のごとく枝分れし
た連結分子によって行なうことができる。
きる。展開剤分子のような核酸分子に多重標識を付着さ
せる方法はよく知られている。多重標識は、たとえばセ
ゲヴによる欧州特許292,128 号に記載のごとく枝分れし
た連結分子によって行なうことができる。
【0051】プローブの構造 本発明には3種のプローブが使用される。一次プローブ
は特に標的分子とハイブリダイズする。二次プローブは
(ここでは架橋分子と称されるが)一次プローブに結合
し、更には三次プローブ(ここでは展開剤分子と称され
るが)とハイブリダイズする。展開剤分子は自己相補性
を有してもよい。
は特に標的分子とハイブリダイズする。二次プローブは
(ここでは架橋分子と称されるが)一次プローブに結合
し、更には三次プローブ(ここでは展開剤分子と称され
るが)とハイブリダイズする。展開剤分子は自己相補性
を有してもよい。
【0052】プローブ相互の関係は重要である。三種の
直鎖状プローブは下記式で示される。 一次プローブ: Zz-Aa-Zz-X 〔1〕 Zz-Aa-Zz-Bb 〔2〕 架橋分子: Yz-Cc 〔3〕 Zz-B′b-Zz-Cc-Zz 〔4〕 展開剤分子: Zz-C′c-Zz-C′c-Zz 〔5〕
直鎖状プローブは下記式で示される。 一次プローブ: Zz-Aa-Zz-X 〔1〕 Zz-Aa-Zz-Bb 〔2〕 架橋分子: Yz-Cc 〔3〕 Zz-B′b-Zz-Cc-Zz 〔4〕 展開剤分子: Zz-C′c-Zz-C′c-Zz 〔5〕
【0053】上記式中、“Z”はヌクレオチド配列を示
す。“Z”で表わされるヌクレオチド配列は、“Z”で
表わされる他のすべてのヌクレオチド配列から独立して
いる。“z”は0〜100を表わすが、0であることが
好ましい。
す。“Z”で表わされるヌクレオチド配列は、“Z”で
表わされる他のすべてのヌクレオチド配列から独立して
いる。“z”は0〜100を表わすが、0であることが
好ましい。
【0054】図面中の一次プローブ(15)は式〔1〕で表
わされる。“A”は一次オリゴヌクレオチドプローブ(1
0)の第一配列を表わす。“A”は、標的分子(2) の配列
に相補的なヌクレオチド配列を含む。第一配列中のヌク
レオチド数は“a”で表わされる。“a”は6〜100
の整数を表わすが、好ましくは8〜30、更に好ましく
は10〜26である。
わされる。“A”は一次オリゴヌクレオチドプローブ(1
0)の第一配列を表わす。“A”は、標的分子(2) の配列
に相補的なヌクレオチド配列を含む。第一配列中のヌク
レオチド数は“a”で表わされる。“a”は6〜100
の整数を表わすが、好ましくは8〜30、更に好ましく
は10〜26である。
【0055】“X”は、一次プローブと架橋分子(20)と
の結合手段部を表わす。“X”は、たとえば、受容体
(“Y”)を架橋分子(20)に結合できる配位子を表わす
が、架橋分子配列に相補的な一次プローブの第二配列を
表わすことが好ましい。この一次プローブの第二配列
は、図2に(50)として示されており、〔2〕式の“B”
に相当する。配列“B”中のヌクレオチド数は“b”で
表わされる。“b”は6〜100の整数を表わすが、好
ましくは8〜26、より好ましくは12〜24である。
の結合手段部を表わす。“X”は、たとえば、受容体
(“Y”)を架橋分子(20)に結合できる配位子を表わす
が、架橋分子配列に相補的な一次プローブの第二配列を
表わすことが好ましい。この一次プローブの第二配列
は、図2に(50)として示されており、〔2〕式の“B”
に相当する。配列“B”中のヌクレオチド数は“b”で
表わされる。“b”は6〜100の整数を表わすが、好
ましくは8〜26、より好ましくは12〜24である。
【0056】架橋分子(20)は〔3〕式で表わされる。
〔3〕式中の“Y”は一次プローブの架橋分子への結合
手段部を表わす。“Y”は、たとえば、一次プローブの
配位子“X”の受容体であってもよい。しかしながら、
“Y”は、〔2〕式中“B”で表わされる一次プローブ
の第二配列(50)とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配
列“B′”を表わすことが好ましい。配列“B′”中の
ヌクレオチド数は前記“b”で表わされる。
〔3〕式中の“Y”は一次プローブの架橋分子への結合
手段部を表わす。“Y”は、たとえば、一次プローブの
配位子“X”の受容体であってもよい。しかしながら、
“Y”は、〔2〕式中“B”で表わされる一次プローブ
の第二配列(50)とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配
列“B′”を表わすことが好ましい。配列“B′”中の
ヌクレオチド数は前記“b”で表わされる。
【0057】〔3〕式及び〔4〕式中の“C”は、展開
剤分子中の配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列
を表わす。配列“C”中のヌクレオチド数は“c”で表
わされるが、これは前記“b”と同様に定義される。
剤分子中の配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列
を表わす。配列“C”中のヌクレオチド数は“c”で表
わされるが、これは前記“b”と同様に定義される。
【0058】〔5〕式には展開剤分子(40)が示されてい
る。“C′”は〔3〕式及び〔4〕式中の配列“C”と
ハイブリダイズする展開剤分子中の配列を表わす。配列
“C′”中のヌクレオチド数は前記“c”で表わされる
“C″”は、他の1個以上の展開剤分子中の1個以上の
配列と相補的な展開剤分子中の配列であり、配列
“C′”と相補的であってもよい。“C″”中のヌクレ
オチド数は前記“c”である。“C”と“C″”とは同
一でも異なっていてもよいが、同一であることが好まし
い。“C”と“C″”とが同一のものでない場合、それ
らはそれぞれ展開剤分子中の異なる配列とハイブリダイ
ズする。これらの配列は、必らずしも同一のものではな
いが、ともに“C′”で表わされる。
る。“C′”は〔3〕式及び〔4〕式中の配列“C”と
ハイブリダイズする展開剤分子中の配列を表わす。配列
“C′”中のヌクレオチド数は前記“c”で表わされる
“C″”は、他の1個以上の展開剤分子中の1個以上の
配列と相補的な展開剤分子中の配列であり、配列
“C′”と相補的であってもよい。“C″”中のヌクレ
オチド数は前記“c”である。“C”と“C″”とは同
一でも異なっていてもよいが、同一であることが好まし
い。“C”と“C″”とが同一のものでない場合、それ
らはそれぞれ展開剤分子中の異なる配列とハイブリダイ
ズする。これらの配列は、必らずしも同一のものではな
いが、ともに“C′”で表わされる。
【0059】“B”と“B′”、“C”と“C′”、及
び“C′”と“C″”は、それぞれが互にハイブリダイ
ズすることが好ましい。したがって、これらの配列は、
多数のヌクレオチドを含む標的分子の配列と相補的であ
る必要はない。
び“C′”と“C″”は、それぞれが互にハイブリダイ
ズすることが好ましい。したがって、これらの配列は、
多数のヌクレオチドを含む標的分子の配列と相補的であ
る必要はない。
【0060】自己相補性展開剤分子 本発明の一態様においては、展開剤分子は自己相補性を
有する。展開剤分子の部分枝配列を注意深く選択すれば
重要な利点が得られる。すなわち、〔5〕式における
C′とC″のように互にハイブリダイズする展開剤分子
の配列は独自にハイブリダイズするため、ハイブリダイ
ゼーションにおいていくつの展開剤分子中のヌクレオチ
ドが関与するかを予測することが可能となる。前記のよ
うに展開剤分子中のすべてのヌクレオチドがハイブリダ
イズすることが好ましい。
有する。展開剤分子の部分枝配列を注意深く選択すれば
重要な利点が得られる。すなわち、〔5〕式における
C′とC″のように互にハイブリダイズする展開剤分子
の配列は独自にハイブリダイズするため、ハイブリダイ
ゼーションにおいていくつの展開剤分子中のヌクレオチ
ドが関与するかを予測することが可能となる。前記のよ
うに展開剤分子中のすべてのヌクレオチドがハイブリダ
イズすることが好ましい。
【0061】更に、ハイブリダイズに関与する各部分枝
配列は4個の異なるヌクレオチド(又はハイブリダイズ
可能なこれらの類似物)のうちの2個以上を含むことが
好ましく、3個以上含むことがより好ましいく、また4
個すべてを含むことが最も好ましい。4個のヌクレオチ
ド又はその類似物の各々は相補性配列(A、B、B′、
C、C′及びC″;〔1〕〜〔4〕式中)中の全ヌクレ
オチド数の好ましくは5%以上、より好ましくは10%
以上、更に好ましくは15%以上を構成する。
配列は4個の異なるヌクレオチド(又はハイブリダイズ
可能なこれらの類似物)のうちの2個以上を含むことが
好ましく、3個以上含むことがより好ましいく、また4
個すべてを含むことが最も好ましい。4個のヌクレオチ
ド又はその類似物の各々は相補性配列(A、B、B′、
C、C′及びC″;〔1〕〜〔4〕式中)中の全ヌクレ
オチド数の好ましくは5%以上、より好ましくは10%
以上、更に好ましくは15%以上を構成する。
【0062】検定に使用する異種展開剤分子数は減少さ
せることが望ましい。展開剤分子数を減少させるために
は、各展開剤分子のそれぞれの部分枝を他の展開剤分子
の多数の部分枝とハイブリダイズさせることが好まし
い。あらゆる展開剤分子のあらゆる部分枝と他のあらゆ
る展開剤分子のあらゆる部分枝とをハイブリダイズさせ
ることが更に好ましい。2成分からなるヌクレオチド配
列を有する部分枝を供することにより上記結論が得られ
る。配列が2本鎖である場合、2成分はパリンドローム
状を呈する。反転した相補性配列の好適な例としては下
記〔6〕式で示されるものが挙げられる。 (Zz)CCAAG(Zz)CTTGG(Zz) 〔6〕 ここでZ及びzはさきに定義されたものである。このよ
うに反転した相補性配列はいずれも好適に使用される。
せることが望ましい。展開剤分子数を減少させるために
は、各展開剤分子のそれぞれの部分枝を他の展開剤分子
の多数の部分枝とハイブリダイズさせることが好まし
い。あらゆる展開剤分子のあらゆる部分枝と他のあらゆ
る展開剤分子のあらゆる部分枝とをハイブリダイズさせ
ることが更に好ましい。2成分からなるヌクレオチド配
列を有する部分枝を供することにより上記結論が得られ
る。配列が2本鎖である場合、2成分はパリンドローム
状を呈する。反転した相補性配列の好適な例としては下
記〔6〕式で示されるものが挙げられる。 (Zz)CCAAG(Zz)CTTGG(Zz) 〔6〕 ここでZ及びzはさきに定義されたものである。このよ
うに反転した相補性配列はいずれも好適に使用される。
【0063】前記〔6〕式で例示されるような反転した
相補性配列の利点は、それが独自の自己相補性を示すこ
とにある。ハイブリダイズに関与するヌクレオチドにつ
いては正確に知られている。
相補性配列の利点は、それが独自の自己相補性を示すこ
とにある。ハイブリダイズに関与するヌクレオチドにつ
いては正確に知られている。
【0064】展開剤分子が反転した相補性配列を有する
部分枝からなる場合、各部分枝は、好適な条件下で同一
配列を有する他の展開剤分子の部分枝とハイブリダイズ
する。このような展開剤分子をここでは自己相補性展開
剤分子と称する。このような展開剤分子の各々は他のす
べての展開剤分子と同一構造をとり、それにより調製す
べき部分枝及び展開剤分子の数を最小にする。
部分枝からなる場合、各部分枝は、好適な条件下で同一
配列を有する他の展開剤分子の部分枝とハイブリダイズ
する。このような展開剤分子をここでは自己相補性展開
剤分子と称する。このような展開剤分子の各々は他のす
べての展開剤分子と同一構造をとり、それにより調製す
べき部分枝及び展開剤分子の数を最小にする。
【0065】展開剤分子内の反転相補性配列からなる各
部分枝は同一であっても異なっていてもよい。各部分枝
が反転相補性を有する配列からなる限り、展開剤分子内
の部分枝と同程度の数の異種部分枝が存在する。このよ
うな部分枝のいくつかは同一であり、またいくつかは異
なるものであってもよい。調製すべきオリゴヌクレオチ
ド数及びハイブリダイズに要する時間を最小にするに
は、各展開剤分子が同一の部分枝からなることが好まし
い。2個の異なる反転相補性部分枝を有する展開剤分子
例は〔6′〕式で示される。 CGCATGCGATGATCAT 〔6′〕
部分枝は同一であっても異なっていてもよい。各部分枝
が反転相補性を有する配列からなる限り、展開剤分子内
の部分枝と同程度の数の異種部分枝が存在する。このよ
うな部分枝のいくつかは同一であり、またいくつかは異
なるものであってもよい。調製すべきオリゴヌクレオチ
ド数及びハイブリダイズに要する時間を最小にするに
は、各展開剤分子が同一の部分枝からなることが好まし
い。2個の異なる反転相補性部分枝を有する展開剤分子
例は〔6′〕式で示される。 CGCATGCGATGATCAT 〔6′〕
【0066】同一展開剤分子内の相補性部分枝が互にハ
イブリダイズすることを防ぐようにすることが望まし
く、このことは適当な対称性をする分子を調製すること
により達成される。それぞれが反転相補性配列からなる
2個の部分枝を有する展開剤分子は、たとえば、zが0
を表わす場合の〔6〕式に示されるように、〔6A〕式
又は〔6B〕式に示す構造をとることができる。 CCAAGCTTGGCCAAGCTTGG 〔6A〕 CCAAGCTTGGGGTTCGAACC 〔6B〕
イブリダイズすることを防ぐようにすることが望まし
く、このことは適当な対称性をする分子を調製すること
により達成される。それぞれが反転相補性配列からなる
2個の部分枝を有する展開剤分子は、たとえば、zが0
を表わす場合の〔6〕式に示されるように、〔6A〕式
又は〔6B〕式に示す構造をとることができる。 CCAAGCTTGGCCAAGCTTGG 〔6A〕 CCAAGCTTGGGGTTCGAACC 〔6B〕
【0067】〔6A〕式中、1個の分子内部分枝を構成
する10個のヌクレオチドは折れ曲り、他部分枝の10
個のヌクレオチドとハイブリダイズすることができる
が、このような内部ハイブリダイゼーションは好ましい
ものではない。部分枝の内部ハイブリダイゼーションは
〔6B〕式の構造では起りえない。したがって、〔6
B〕式の構造が好ましい。
する10個のヌクレオチドは折れ曲り、他部分枝の10
個のヌクレオチドとハイブリダイズすることができる
が、このような内部ハイブリダイゼーションは好ましい
ものではない。部分枝の内部ハイブリダイゼーションは
〔6B〕式の構造では起りえない。したがって、〔6
B〕式の構造が好ましい。
【0068】反転相補性配列からなる2個の部分枝を有
する直鎖状オリゴヌクレオチドの2つの可能な構造のう
ちのいずれが部分枝の内部ハイブリダイゼーションを阻
止しうるかを予測することができる。内部ハイブリダイ
ゼーションを回避する分子としては、2個対称軸を有す
る立体配座、すなわちC2対称を想定すればよい。一般
に、展開剤分子はCn(nは部分枝数を表わす)対称を
有することが好ましい。展開剤分子が枝分れする場合、
nは3以上である。Cn対称を有する展開剤分子の場
合、各部分枝は他の展開剤分子の各部分枝とハイブリダ
イズすることができるが、同一展開剤分子の部分枝とハ
イブリダイズすることができない。〔6A〕及び〔6
B〕式で示されるヌクレオチドに加えて、各部分枝は、
zが0以外を表わす場合の〔6〕式のZzで示される付
加的ヌクレオチドを有してもよい。このような付加的ヌ
クレオチドの存在は、正確なCn対称配座を破壊してし
まう。反転相補性配列を構成する各部分枝に保持される
対称関係が重要である。Zで表わされるヌクレオチド配
列は展開剤分子の好ましい対称を決定するうえでは無視
してよい。
する直鎖状オリゴヌクレオチドの2つの可能な構造のう
ちのいずれが部分枝の内部ハイブリダイゼーションを阻
止しうるかを予測することができる。内部ハイブリダイ
ゼーションを回避する分子としては、2個対称軸を有す
る立体配座、すなわちC2対称を想定すればよい。一般
に、展開剤分子はCn(nは部分枝数を表わす)対称を
有することが好ましい。展開剤分子が枝分れする場合、
nは3以上である。Cn対称を有する展開剤分子の場
合、各部分枝は他の展開剤分子の各部分枝とハイブリダ
イズすることができるが、同一展開剤分子の部分枝とハ
イブリダイズすることができない。〔6A〕及び〔6
B〕式で示されるヌクレオチドに加えて、各部分枝は、
zが0以外を表わす場合の〔6〕式のZzで示される付
加的ヌクレオチドを有してもよい。このような付加的ヌ
クレオチドの存在は、正確なCn対称配座を破壊してし
まう。反転相補性配列を構成する各部分枝に保持される
対称関係が重要である。Zで表わされるヌクレオチド配
列は展開剤分子の好ましい対称を決定するうえでは無視
してよい。
【0069】反転相補性配列及び前記で定義されたCn
対称を有する展開剤分子内の部分枝は、同一展開剤分子
内の他の部分枝とはハイブリダイズできないけれども、
反転相補性配列の各半分は、同一部分枝内又は同一分子
の他の部分枝内で、他の半分とハイブリダイズすること
ができる。自己ハイブリダイズする3つの枝分れした展
開剤分子の部分枝例は〔7〕式に示される。
対称を有する展開剤分子内の部分枝は、同一展開剤分子
内の他の部分枝とはハイブリダイズできないけれども、
反転相補性配列の各半分は、同一部分枝内又は同一分子
の他の部分枝内で、他の半分とハイブリダイズすること
ができる。自己ハイブリダイズする3つの枝分れした展
開剤分子の部分枝例は〔7〕式に示される。
【0070】
【化1】
【0071】内部ハイブリダイゼーションについては、
好ましからざる部分枝内ハイブリダイゼーションが異な
る展開剤分子の2個の部分枝間で好ましくハイブリダイ
ズしているヌクレオチドの半数に関与している事実を考
慮すれば問題視するには及ばない。〔8〕式で示される
例においては、展開剤分子内の部分枝の好ましからざる
ハイブリダイズに5個のヌクレオチドが包含されてい
る。異なる展開剤分子の2個の部分枝間での好ましいハ
イブリダイゼーションには10個のヌクレオチドが包含
されている。したがって、ハイブリダイズの条件は、5
個のヌクレオチドは安定にハイブリダイズせず、一方1
0個のヌクレオチドは安定にハイブリダイズするよう厳
密に選ばれる。たとえば、22〜30℃では、5個のヌ
クレオチドは安定にはハイブリダイズしないが、10個
のヌクレオチドは安定してハイブリダイズする。
好ましからざる部分枝内ハイブリダイゼーションが異な
る展開剤分子の2個の部分枝間で好ましくハイブリダイ
ズしているヌクレオチドの半数に関与している事実を考
慮すれば問題視するには及ばない。〔8〕式で示される
例においては、展開剤分子内の部分枝の好ましからざる
ハイブリダイズに5個のヌクレオチドが包含されてい
る。異なる展開剤分子の2個の部分枝間での好ましいハ
イブリダイゼーションには10個のヌクレオチドが包含
されている。したがって、ハイブリダイズの条件は、5
個のヌクレオチドは安定にハイブリダイズせず、一方1
0個のヌクレオチドは安定にハイブリダイズするよう厳
密に選ばれる。たとえば、22〜30℃では、5個のヌ
クレオチドは安定にはハイブリダイズしないが、10個
のヌクレオチドは安定してハイブリダイズする。
【0072】2個のヌクレオチド配列は、それらが通常
条件下でハイブリダイズするのに互に十分に相補的であ
る場合、互にハイブリダイズし、又は互に相補的である
と考えられる。ハイブリダイゼーションのための通常の
条件については前述した。互にハイブリダイズする(す
なわち、Aと標的分子の配列、BとB′、CとC′、及
びC′とC″)ヌクレオチド配列は相補的であることが
好ましい。しかしながら、ハイブリダイゼーション配列
においては、相補性にはよく知られているように例外が
ある。ハイブリダイゼーション配列が長くなるにしたが
い、通常条件下でのハイブリダイズ能力は失なわれない
が、多くの例外が生じてくる。
条件下でハイブリダイズするのに互に十分に相補的であ
る場合、互にハイブリダイズし、又は互に相補的である
と考えられる。ハイブリダイゼーションのための通常の
条件については前述した。互にハイブリダイズする(す
なわち、Aと標的分子の配列、BとB′、CとC′、及
びC′とC″)ヌクレオチド配列は相補的であることが
好ましい。しかしながら、ハイブリダイゼーション配列
においては、相補性にはよく知られているように例外が
ある。ハイブリダイゼーション配列が長くなるにしたが
い、通常条件下でのハイブリダイズ能力は失なわれない
が、多くの例外が生じてくる。
【0073】更に、ハイブリダイゼーション配列中の相
補性ヌクレオチド数(〔1〕〜〔5〕式中のa、b、及
びc)についての前記した範囲は臨界的なものではな
い。相補性配列中のヌクレオチドの最小数は、前記通常
のハイブリダイゼーション条件下で安定にハイブリダイ
ズする数である。相補性ヌクレオチドの数が増加した場
合、一般に前記条件はますます厳密なものとなる。相補
性配列の最小数は、通常は6であり、好ましくは12、
更に好ましくは16である。
補性ヌクレオチド数(〔1〕〜〔5〕式中のa、b、及
びc)についての前記した範囲は臨界的なものではな
い。相補性配列中のヌクレオチドの最小数は、前記通常
のハイブリダイゼーション条件下で安定にハイブリダイ
ズする数である。相補性ヌクレオチドの数が増加した場
合、一般に前記条件はますます厳密なものとなる。相補
性配列の最小数は、通常は6であり、好ましくは12、
更に好ましくは16である。
【0074】互にハイブリダイズ可能な相補性ヌクレオ
チド数についてはその上限を規定する必要はない。上限
は、むしろ、コストやハイブリダイゼーションに要する
時間といった実用的観点から設定されるべきである。し
たがって、本発明においては、他の配列とハイブリダイ
ズする配列中のヌクレオチドの最大数は、通常100を
超えることはなく、好ましくは40以下、更に好ましく
は24以下である。
チド数についてはその上限を規定する必要はない。上限
は、むしろ、コストやハイブリダイゼーションに要する
時間といった実用的観点から設定されるべきである。し
たがって、本発明においては、他の配列とハイブリダイ
ズする配列中のヌクレオチドの最大数は、通常100を
超えることはなく、好ましくは40以下、更に好ましく
は24以下である。
【0075】標的核酸分子とハイブリダイズする配列を
有する展開剤分子を設計することは可能である。この場
合、標的核酸分子とハイブリダイズする第一展開剤分子
は一次プローブと考えられ、一次プローブとハイブリダ
イズする第二展開剤分子は架橋分子と考えられる。
有する展開剤分子を設計することは可能である。この場
合、標的核酸分子とハイブリダイズする第一展開剤分子
は一次プローブと考えられ、一次プローブとハイブリダ
イズする第二展開剤分子は架橋分子と考えられる。
【0076】本発明の方法の効率と形成される核酸分子
コンプレックスの安定性とを最大にするためには、架橋
分子のすべてのヌクレオチドを一次プローブの第二セグ
メント又は少なくとも1個の展開剤分子とハイブリダイ
ズさせることが好ましい。その結果、ハイブリダイズさ
れた架橋分子中には未ハイブリダイズのヌクレオチドは
残存していない。更に、30〜70%、好ましくは40
〜60%、より好ましくは45〜55%の直鎖状架橋分
子のヌクレオチドを一次プローブとハイブリダイズさせ
ることが好ましく、一方70〜30%、好ましくは60
〜40%、より好ましくは55〜45%の残分は1個以
上の展開剤分子とハイブリダイズさせることが好まし
い。同様に、展開剤分子のすべてのヌクレオチドを、他
の1個程度の展開剤分子とハイブリダイズする展開剤分
子鎖内の末端展開剤分子を除いて、架橋分子及び少なく
とも1個の展開剤分子、又は他の2個以上の展開剤鎖中
の展開剤分子とハイブリダイズさせることが好ましい。
その結果、展開剤分子のすべてのヌクレオチドがハイブ
リダイズされることになる。更に、展開剤鎖中の各直鎖
状展開剤分子の30〜70%、好ましくは40〜60
%、より好ましくは45〜55%を架橋分子又は少なく
とも1個の付加展開剤分子とハイブリダイズさせること
が好ましく、一方、70〜30%、好ましくは60〜4
0%、より好ましくは55〜45%の残分は、鎖内の末
端展開剤分子を除き、少なくとも1個の付加展開剤分子
とハイブリダイズさせることが好ましい。
コンプレックスの安定性とを最大にするためには、架橋
分子のすべてのヌクレオチドを一次プローブの第二セグ
メント又は少なくとも1個の展開剤分子とハイブリダイ
ズさせることが好ましい。その結果、ハイブリダイズさ
れた架橋分子中には未ハイブリダイズのヌクレオチドは
残存していない。更に、30〜70%、好ましくは40
〜60%、より好ましくは45〜55%の直鎖状架橋分
子のヌクレオチドを一次プローブとハイブリダイズさせ
ることが好ましく、一方70〜30%、好ましくは60
〜40%、より好ましくは55〜45%の残分は1個以
上の展開剤分子とハイブリダイズさせることが好まし
い。同様に、展開剤分子のすべてのヌクレオチドを、他
の1個程度の展開剤分子とハイブリダイズする展開剤分
子鎖内の末端展開剤分子を除いて、架橋分子及び少なく
とも1個の展開剤分子、又は他の2個以上の展開剤鎖中
の展開剤分子とハイブリダイズさせることが好ましい。
その結果、展開剤分子のすべてのヌクレオチドがハイブ
リダイズされることになる。更に、展開剤鎖中の各直鎖
状展開剤分子の30〜70%、好ましくは40〜60
%、より好ましくは45〜55%を架橋分子又は少なく
とも1個の付加展開剤分子とハイブリダイズさせること
が好ましく、一方、70〜30%、好ましくは60〜4
0%、より好ましくは55〜45%の残分は、鎖内の末
端展開剤分子を除き、少なくとも1個の付加展開剤分子
とハイブリダイズさせることが好ましい。
【0077】架橋分子(20)のすべてのヌクレオチドが一
次プローブ(15)の第二セグメント(50)のすべてのヌクレ
オチド、又は少なくとも1個の展開剤分子(40)のすべて
のヌクレオチドとハイブリダイズする場合、架橋分子内
のヌクレオチドはすべてハイブリダイズされる。このよ
うな状況下では、一次プローブ(50)の第二セグメントの
一端は、図2に示されるように、第一展開剤分子(50)の
一端にすき間なく隣接する。一次プローブの第二セグメ
ント末端は、図3に示されるように、展開剤分子の隣接
端に連結される。
次プローブ(15)の第二セグメント(50)のすべてのヌクレ
オチド、又は少なくとも1個の展開剤分子(40)のすべて
のヌクレオチドとハイブリダイズする場合、架橋分子内
のヌクレオチドはすべてハイブリダイズされる。このよ
うな状況下では、一次プローブ(50)の第二セグメントの
一端は、図2に示されるように、第一展開剤分子(50)の
一端にすき間なく隣接する。一次プローブの第二セグメ
ント末端は、図3に示されるように、展開剤分子の隣接
端に連結される。
【0078】各展開剤分子のすべてのヌクレオチドが架
橋分子及び他の少なくとも1個の展開剤分子と、又は2
個以上の展開剤鎖中の展開剤分子とハイブリダイズする
場合、他の1個程度の展開剤分子とハイブリダイズする
展開剤鎖の展開剤分子末端を除き、架橋分子と展開剤鎖
の第二展開剤分子(54)末端間、又は展開剤鎖の展開剤分
子末端間にギャップは生じない。このとき、図2に示さ
れるように、第一展開剤分子(56)の末端は、第三展開剤
分子の末端に隣接する。第三展開剤分子の他端は第五展
開剤分子末端に、等々と順次隣接する。同様に、第二展
開剤分子の一端は第四展開剤分子末端に隣接する。第四
展開剤分子の他端は第六展開剤分子末端に隣接すること
となる。このような条件下では、架橋分子及び展開剤分
子の隣接端がすべて互に連結してもよい。
橋分子及び他の少なくとも1個の展開剤分子と、又は2
個以上の展開剤鎖中の展開剤分子とハイブリダイズする
場合、他の1個程度の展開剤分子とハイブリダイズする
展開剤鎖の展開剤分子末端を除き、架橋分子と展開剤鎖
の第二展開剤分子(54)末端間、又は展開剤鎖の展開剤分
子末端間にギャップは生じない。このとき、図2に示さ
れるように、第一展開剤分子(56)の末端は、第三展開剤
分子の末端に隣接する。第三展開剤分子の他端は第五展
開剤分子末端に、等々と順次隣接する。同様に、第二展
開剤分子の一端は第四展開剤分子末端に隣接する。第四
展開剤分子の他端は第六展開剤分子末端に隣接すること
となる。このような条件下では、架橋分子及び展開剤分
子の隣接端がすべて互に連結してもよい。
【0079】前記を考慮して、一次プローブ、架橋分子
及び展開剤鎖中の展開剤分子を互に連結させコンカタマ
ーを形成することができる。このようなコンカタマーは
図3に(60)として示されている。コンカタマー中の展開
剤分子数は100、 1,000、10,000あるいはそれ以上で
もよい。各展開剤分子への標識については、シグナル増
幅が重要なものとなる。安定性を最大にするためには、
連結した展開剤鎖のうちの一本鎖は一次プローブに、ま
た他鎖は架橋分子にそれぞれ連結させる。このような構
造は図3に示されている。更に、標的核酸分子が直鎖状
であり、かつ一次プローブにハイブリダイズする標的核
酸分子の配列が標的核酸分子の一端に生じる場合、標的
核酸分子は架橋分子とハイブリダイズしてもよい。前記
連結は適当な酵素を用いて行われる。好適な酵素として
は、たとえばT4リガーゼが挙げられる。
及び展開剤鎖中の展開剤分子を互に連結させコンカタマ
ーを形成することができる。このようなコンカタマーは
図3に(60)として示されている。コンカタマー中の展開
剤分子数は100、 1,000、10,000あるいはそれ以上で
もよい。各展開剤分子への標識については、シグナル増
幅が重要なものとなる。安定性を最大にするためには、
連結した展開剤鎖のうちの一本鎖は一次プローブに、ま
た他鎖は架橋分子にそれぞれ連結させる。このような構
造は図3に示されている。更に、標的核酸分子が直鎖状
であり、かつ一次プローブにハイブリダイズする標的核
酸分子の配列が標的核酸分子の一端に生じる場合、標的
核酸分子は架橋分子とハイブリダイズしてもよい。前記
連結は適当な酵素を用いて行われる。好適な酵素として
は、たとえばT4リガーゼが挙げられる。
【0080】枝分れしたプローブ及び分子 一次プローブ、架橋分子及び展開剤分子は直鎖状でも、
また枝分れしていてもよい。本明細書では、2個の部分
枝を有する場合には直鎖状と、3個以上の部分枝を有す
る場合に枝分れしているとみなす。各部分枝は、標的分
子もしくは一次プローブの部分枝内配列、架橋分子又は
展開剤分子とハイブリダイゼーション可能な配列からな
る。枝分れしたプローブ及び分子の部分枝は、本発明に
したがえば、直鎖状プローブ及び分子の部分枝とは異な
るものでなくともよい。
また枝分れしていてもよい。本明細書では、2個の部分
枝を有する場合には直鎖状と、3個以上の部分枝を有す
る場合に枝分れしているとみなす。各部分枝は、標的分
子もしくは一次プローブの部分枝内配列、架橋分子又は
展開剤分子とハイブリダイゼーション可能な配列からな
る。枝分れしたプローブ及び分子の部分枝は、本発明に
したがえば、直鎖状プローブ及び分子の部分枝とは異な
るものでなくともよい。
【0081】枝分れしたオリゴヌクレオチドの個々の部
分枝と同様に直鎖状オリゴヌクレオチドは、公知の方法
により合成できる。その方法としては、たとえば、ワー
ナーら,DNA3巻,401頁(1984)記載の自動フォ
スフォルアミダイト法がある。
分枝と同様に直鎖状オリゴヌクレオチドは、公知の方法
により合成できる。その方法としては、たとえば、ワー
ナーら,DNA3巻,401頁(1984)記載の自動フォ
スフォルアミダイト法がある。
【0082】DNA配列を含む枝分れした分子は、公知
の方法により適当に調製できる。枝分れ分子は、たとえ
ば、連結基を介して部分枝を結合することにより調製で
きる。連結基は、オリゴヌクレオチドと、好ましくはオ
リゴヌクレオチドの5′又は3′末端と結合可能な多官
能分子からなる。好適な多官能基については、セゲヴに
よる欧州特許出願292,128 号に記載されている。連結基
はまたオリゴヌクレオチド中の1個以上のヌクレオチド
に結合した基であってもよい。
の方法により適当に調製できる。枝分れ分子は、たとえ
ば、連結基を介して部分枝を結合することにより調製で
きる。連結基は、オリゴヌクレオチドと、好ましくはオ
リゴヌクレオチドの5′又は3′末端と結合可能な多官
能分子からなる。好適な多官能基については、セゲヴに
よる欧州特許出願292,128 号に記載されている。連結基
はまたオリゴヌクレオチド中の1個以上のヌクレオチド
に結合した基であってもよい。
【0083】本発明に使用される枝分れ核酸分子は、ウ
ルデアらの欧州特許317,077 号に記載の方法にしたがい
調製される。前記特許によれば、たとえば、くし形構造
が図3−1及び8頁38行等に、フォーク形構造が図3
−2及び10頁7行等に、多重フォーク及びフォーク状
くし形構造がそれぞれ図3−3、図3−4及び10頁2
6行等に、更に多重くし形構造が図3−5及び10頁3
0行等に開示されている。このような枝分れ構造の合成
については上記実施例2Bに記載されている。展開剤分
子が枝分れしている場合、各部分枝は他の展開剤分子の
少なくとも1個の部分枝とハイブリダイズ可能である。
同一分子の他の部分枝と分子内でハイブリダイズ可能な
展開剤分子の部分枝は存在しないことが好ましい。
ルデアらの欧州特許317,077 号に記載の方法にしたがい
調製される。前記特許によれば、たとえば、くし形構造
が図3−1及び8頁38行等に、フォーク形構造が図3
−2及び10頁7行等に、多重フォーク及びフォーク状
くし形構造がそれぞれ図3−3、図3−4及び10頁2
6行等に、更に多重くし形構造が図3−5及び10頁3
0行等に開示されている。このような枝分れ構造の合成
については上記実施例2Bに記載されている。展開剤分
子が枝分れしている場合、各部分枝は他の展開剤分子の
少なくとも1個の部分枝とハイブリダイズ可能である。
同一分子の他の部分枝と分子内でハイブリダイズ可能な
展開剤分子の部分枝は存在しないことが好ましい。
【0084】それぞれが前記〔6〕式で示される反転相
補性配列からなる3個の部分枝を有する展開剤分子は、
たとえば、〔8〕式で示される構造を有していてもよ
い。
補性配列からなる3個の部分枝を有する展開剤分子は、
たとえば、〔8〕式で示される構造を有していてもよ
い。
【0085】
【化2】
【0086】すなわちC3対称に近い配座が含まれる。
したがって、同一分子中の他の部分枝と分子内ハイブリ
ダイゼーション可能な部分枝は存在しない。
したがって、同一分子中の他の部分枝と分子内ハイブリ
ダイゼーション可能な部分枝は存在しない。
【0087】架橋分子もまた枝分れしていてよい、架橋
分子の1個の部分枝(〔2〕式中B′)は、一次プロー
ブの第二配列(〔1〕式中B)とハイブリダイズする。
部分枝の残分は、展開剤分子中で使用される配列と同一
の反転相補性配列からなることが好ましい。一次プロー
ブの第二配列は、展開剤分子の各部分枝で生じるものと
同一の反転相補性配列からなることが更に好ましい。こ
のような場合、架橋分子は、本発明のアッセイに必要な
異分子数を最小にすることにより、展開剤分子と同一の
ものになる。
分子の1個の部分枝(〔2〕式中B′)は、一次プロー
ブの第二配列(〔1〕式中B)とハイブリダイズする。
部分枝の残分は、展開剤分子中で使用される配列と同一
の反転相補性配列からなることが好ましい。一次プロー
ブの第二配列は、展開剤分子の各部分枝で生じるものと
同一の反転相補性配列からなることが更に好ましい。こ
のような場合、架橋分子は、本発明のアッセイに必要な
異分子数を最小にすることにより、展開剤分子と同一の
ものになる。
【0088】一次プローブもまた枝分れしていてよい。
一次プローブの第一配列は標的分子の配列と相補的であ
る。一次プローブの第二配列は、架橋分子とハイブリダ
イズするものであるが、多数の部分枝上に生じてもよ
い。
一次プローブの第一配列は標的分子の配列と相補的であ
る。一次プローブの第二配列は、架橋分子とハイブリダ
イズするものであるが、多数の部分枝上に生じてもよ
い。
【0089】一次プローブ中の部分枝、架橋分子及び展
開剤分子の総数は、2個以上であり、3個以上が好まし
い。部分枝数の上限は、過剰な立体障害を防止する必要
から定まり、通常5以下、好ましくは3以下である。展
開剤分子及び/又は架橋分子及び/又は一次プローブ中
の部分枝数は3〜5であることが好ましい。架橋分子又
は一次プローブよりも展開剤分子の数が多いことから、
展開剤分子が枝分れしていることが最も重要である。枝
分れした展開剤分子の存在により、対数的なシグナル増
幅(Q−1)rがもたらされる。ここで“Q”は(部分枝
数、とくに自己相補性部分枝の数を、“r”は展開剤鎖
(とくにハイブリダイズする鎖)中の展開剤分子数を表
わす。
開剤分子の総数は、2個以上であり、3個以上が好まし
い。部分枝数の上限は、過剰な立体障害を防止する必要
から定まり、通常5以下、好ましくは3以下である。展
開剤分子及び/又は架橋分子及び/又は一次プローブ中
の部分枝数は3〜5であることが好ましい。架橋分子又
は一次プローブよりも展開剤分子の数が多いことから、
展開剤分子が枝分れしていることが最も重要である。枝
分れした展開剤分子の存在により、対数的なシグナル増
幅(Q−1)rがもたらされる。ここで“Q”は(部分枝
数、とくに自己相補性部分枝の数を、“r”は展開剤鎖
(とくにハイブリダイズする鎖)中の展開剤分子数を表
わす。
【0090】非自己ハイブリダイゼーション性展開剤分
子対 自己相補性を有する枝分れした展開剤分子の代りに、直
鎖状又は枝分れした展開剤分子対を使用することができ
る。上記対の各成分は非自己相補性である異なる構造を
有する。このような対の一成分の各部分枝は上記対の他
の成分の少なくとも1個の部分枝とハイブリダイズす
る。対の各成分中の各部分枝の配列は同一であることが
好ましい。そうであれば、対の1成分の各部分枝は他の
成分中の各部分枝とハイブリダイズする。
子対 自己相補性を有する枝分れした展開剤分子の代りに、直
鎖状又は枝分れした展開剤分子対を使用することができ
る。上記対の各成分は非自己相補性である異なる構造を
有する。このような対の一成分の各部分枝は上記対の他
の成分の少なくとも1個の部分枝とハイブリダイズす
る。対の各成分中の各部分枝の配列は同一であることが
好ましい。そうであれば、対の1成分の各部分枝は他の
成分中の各部分枝とハイブリダイズする。
【0091】このような展開剤分子の部分枝をその相補
性対と独自にハイブリダイズさせることが好ましい。本
明細書で「独自にハイブリダイズ」とは、配列がその相
補性対とハイブリダイズする場合、毎時同数のヌクレオ
チドがハイブリダイズすることを意味する。ホモポリマ
ーオリゴヌクレオチド(ポリ−A)からなる部分枝は、
たとえば、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドとほと
んど同様にその相補性対(ポリ−T)とハイブリダイズ
することができる。このようなことが予測できなければ
不利な結果しかえられない。したがって、各部分枝配列
は好ましくは2個以上、より好ましくは3個以上、更に
好ましくは全4個のヌクレオチドを含む。上記それぞれ
の配列の半分と他の半分とがハイブリダイズするのを避
けるには、部分枝が反転相補性を有する配列を含まなけ
ればよい。上記の場合を除いて、非自己相補性展開剤分
子対の部分枝は、前述した自己相補性展開剤分子の部分
枝と類似しており、同様に調製される。
性対と独自にハイブリダイズさせることが好ましい。本
明細書で「独自にハイブリダイズ」とは、配列がその相
補性対とハイブリダイズする場合、毎時同数のヌクレオ
チドがハイブリダイズすることを意味する。ホモポリマ
ーオリゴヌクレオチド(ポリ−A)からなる部分枝は、
たとえば、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドとほと
んど同様にその相補性対(ポリ−T)とハイブリダイズ
することができる。このようなことが予測できなければ
不利な結果しかえられない。したがって、各部分枝配列
は好ましくは2個以上、より好ましくは3個以上、更に
好ましくは全4個のヌクレオチドを含む。上記それぞれ
の配列の半分と他の半分とがハイブリダイズするのを避
けるには、部分枝が反転相補性を有する配列を含まなけ
ればよい。上記の場合を除いて、非自己相補性展開剤分
子対の部分枝は、前述した自己相補性展開剤分子の部分
枝と類似しており、同様に調製される。
【0092】本発明において有用な非自己相補性展開剤
分子対の例は下記
分子対の例は下記
〔9〕及び〔10〕式で例示される。
【0093】
【化3】
【0094】アッセイ 本発明は、公知のハイブリダイゼーション工程の種々の
場合に有用である。アッセイは、本発明にしたがって下
記工程を経る。 i) 標的核酸分子を一次プローブの第一配列とハイブリ
ダイズさせる。 ii) 一次プローブを、好ましくは架橋分子上のヌクレオ
チド配列と相補的な一次プローブの第二配列を介して架
橋分子に結合する。 iii)架橋分子を少なくとも1個の標識展開剤分子とハイ
ブリダイズさせる。 iv) 少なくとも1個の付加標識展開剤分子をハイブリダ
イズさせ、それにより標識展開剤分子鎖を形成する。更
に、 v) 標識展開剤分子を検出する。
場合に有用である。アッセイは、本発明にしたがって下
記工程を経る。 i) 標的核酸分子を一次プローブの第一配列とハイブリ
ダイズさせる。 ii) 一次プローブを、好ましくは架橋分子上のヌクレオ
チド配列と相補的な一次プローブの第二配列を介して架
橋分子に結合する。 iii)架橋分子を少なくとも1個の標識展開剤分子とハイ
ブリダイズさせる。 iv) 少なくとも1個の付加標識展開剤分子をハイブリダ
イズさせ、それにより標識展開剤分子鎖を形成する。更
に、 v) 標識展開剤分子を検出する。
【0095】アッセイは、たとえば、液相で行なわれる
が、標的核酸分子を固体表面上に固定することが好まし
い。標的核酸分子を共有結合的に固体表面上に既述のご
とく結合させてもよい。上記方法については、たとえ
ば、アルバレラら欧州特許144,914 号、ダッタグプタら
欧州特許130,523 号、ヤブサルら国際公開85/02628号に
記載されている。標的核酸分子は非共有結合手段により
固体表面上に固定させてもよい。たとえば、配位子−受
容体相互作用により、固形支持体に結合される。サンド
ウィッチハイブリダイゼーション方法(標的核酸分子
が、標的と一次プローブとのハイブリダイゼーションを
妨げずに固定されたヌクレオチド配列とハイブリダイズ
する)によってもよい。
が、標的核酸分子を固体表面上に固定することが好まし
い。標的核酸分子を共有結合的に固体表面上に既述のご
とく結合させてもよい。上記方法については、たとえ
ば、アルバレラら欧州特許144,914 号、ダッタグプタら
欧州特許130,523 号、ヤブサルら国際公開85/02628号に
記載されている。標的核酸分子は非共有結合手段により
固体表面上に固定させてもよい。たとえば、配位子−受
容体相互作用により、固形支持体に結合される。サンド
ウィッチハイブリダイゼーション方法(標的核酸分子
が、標的と一次プローブとのハイブリダイゼーションを
妨げずに固定されたヌクレオチド配列とハイブリダイズ
する)によってもよい。
【0096】標的核酸分子の固定は、一次プローブと標
的核酸分子とのハイブリダイゼーション前に行なっても
よい。標的核酸分子は、一次プローブ、架橋分子又は展
開剤分子との結合後に固定してもよい。固定工程は、他
の工程と同時に行なってもよい。標的核酸分子の固定
は、検出前に固定コンプレックスから非ハイブリダイゼ
ーション標識分子を除去できる点で有利である。それに
よりバックグランウドが低下し、SN比が増大すること
となる。
的核酸分子とのハイブリダイゼーション前に行なっても
よい。標的核酸分子は、一次プローブ、架橋分子又は展
開剤分子との結合後に固定してもよい。固定工程は、他
の工程と同時に行なってもよい。標的核酸分子の固定
は、検出前に固定コンプレックスから非ハイブリダイゼ
ーション標識分子を除去できる点で有利である。それに
よりバックグランウドが低下し、SN比が増大すること
となる。
【図1】図1は本発明の工程の概要を示す図である。
【図2】図2は、一次プローブ(15)と架橋分子(20)との
結合手段が、架橋分子(20)の配列とハイブリダイズする
一次プローブ(50)の第二配列である場合の本発明の工程
の概要を示す図である。
結合手段が、架橋分子(20)の配列とハイブリダイズする
一次プローブ(50)の第二配列である場合の本発明の工程
の概要を示す図である。
【図3】図3は、展開剤分子が連結してコンカタマー(6
0)を形成する場合の本発明の工程の概要を示す図であ
る。
0)を形成する場合の本発明の工程の概要を示す図であ
る。
【図4】図4は、枝分れした展開剤分子(70)を使用した
場合の本発明の工程の概要を示す図である。
場合の本発明の工程の概要を示す図である。
Claims (5)
- 【請求項1】 下記工程a)及びb)からなる核酸配列
の存在検出方法。 a)核酸を、1)相補的な核酸配列を有せず、かつ2)
核酸配列に対し特異的に結合する分子と接触させ、次い
で b)結合された分子の存在を検出する。 - 【請求項2】 分子がディスタミシンA、ネトロプシ
ン、及びヘキスト33258である請求項1記載の検出方
法。 - 【請求項3】 分子がディスタミシンAである請求項2
記載の検出方法。 - 【請求項4】 核酸配列がA−Tリッチである請求項2
記載の検出方法。 - 【請求項5】 核酸配列がAATT又はATTTからなる請求項
4記載の検出方法。
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US07/503621 | 1990-04-03 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP03071114A Expired - Fee Related JP3142888B2 (ja) | 1990-04-03 | 1991-04-03 | Dnaプローブのシグナル増幅方法 |
JP2000065961A Pending JP2000279186A (ja) | 1990-04-03 | 2000-03-10 | Dnaプローブのシグナル増幅方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP03071114A Expired - Fee Related JP3142888B2 (ja) | 1990-04-03 | 1991-04-03 | Dnaプローブのシグナル増幅方法 |
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US6180338B1 (en) | 1992-08-04 | 2001-01-30 | Beckman Coulter, Inc. | Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences |
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WO1995016788A1 (en) * | 1993-12-17 | 1995-06-22 | Cubicciotti Roger S | Nucleotide-directed assembly of bimolecular and multimolecular drugs and devices |
US6986985B1 (en) | 1994-01-13 | 2006-01-17 | Enzo Life Sciences, Inc. | Process for producing multiple nucleic acid copies in vivo using a protein-nucleic acid construct |
CA2140081C (en) | 1994-01-13 | 2008-04-01 | Dean L. Engelhardt | Process, construct and conjugate for producing multiple nucleic acid copies |
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US5561043A (en) * | 1994-01-31 | 1996-10-01 | Trustees Of Boston University | Self-assembling multimeric nucleic acid constructs |
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CA2218440A1 (en) * | 1996-12-21 | 1998-06-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method of analysis using signal amplification |
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ATE327344T1 (de) * | 1997-07-29 | 2006-06-15 | Polyprobe Inc | Dendritische nukleinsäuren mit maximaler selbstzusammenlagerung |
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US6120995A (en) * | 1997-08-07 | 2000-09-19 | Thomas Jefferson University | Compositions that specifically bind to colorectal cancer cells and methods of using the same |
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CA2313641A1 (en) * | 1997-12-12 | 1999-06-24 | Digene Corporation | Universal collection medium |
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