JP2000247868A

JP2000247868A - リポソーム用時調製用キット

Info

Publication number: JP2000247868A
Application number: JP11048320A
Authority: JP
Inventors: Tsuneji Nagai; 恒司永井; Yoshie Yonetani; 芳枝米谷; Shunpei O; 俊平王
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1999-02-25
Filing date: 1999-02-25
Publication date: 2000-09-12
Anticipated expiration: 2019-02-25
Also published as: JP4444385B2

Abstract

(57)【要約】【課題】調製方法が容易で、有害な有機溶媒を使用せ
ず、リポソームの粒径が小さく、凝集物がなく、薬物が
効率良くリポソームに含有されるという特徴を同時に満
足する薬物のリポソーム組成物を提供することである。【解決手段】次の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）からな
るカチオン性薬物のリポソーム用時調製用キット。（Ａ）リン脂質から成るリポソーム膜形成物質（１）、
リポソームゼータポテンシャル増加剤（２）、及びグリ
セリンを含んでなる溶媒（３）を構成成分とする不活性
ガス雰囲気下で容器内に密閉されたリン脂質組成物。（Ｂ）カチオン性薬物。（Ｃ）水性溶媒。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は調製方法が容易なカ
チオン性薬物のリポソーム用時調製用キットに関する。
また、本発明は平均粒子径が小さいリポソームを調製で
きるカチオン性薬物のリポソーム用時調製用キットに関
する。また、本発明は凝集物の少ないリポソームを調製
できるカチオン性薬物のリポソーム用時調製用キットに
関する。また、本発明はカチオン性薬物の包含率が高い
リポソームを調製できるリポソーム用時調製用キットに
関する。また、更に本発明は上述の、調製方法が容易
で、リポソームの粒径が小さく、凝集物がなく、カチオ
ン性薬物が効率良くリポソームに含有されるという特徴
を同時に満足するカチオン性薬物のリポソーム用時調製
用キットに関する。また、本発明は調製方法が容易で、
リポソームの粒径が小さく、凝集物がなく、ドキソルビ
シン（アドリアマイシン）が効率良くリポソームに含有
されるという特徴を同時に満足するドキソルビシン（ア
ドリアマイシン）のリポソーム用時調製用キットに関す
る。

【０００２】さらにまた、本発明はリン脂質組成物
（Ａ）にカチオン性薬物（Ｂ）を混合してカチオン薬物
（Ｂ）を溶解せしめ、ついで該溶液を水性溶媒（Ｃ）と
混合して得られたリポソーム組成物であって、９０重量
％以上のリポソーム粒子の粒径が１００ｎｍ以下であ
り、リポソーム粒子の平均粒径が７０ｎｍ以下であり、
該カチオン性薬物（Ｂ）の９０重量％以上がリポソーム
粒子に包含されていることを特徴とするリポソーム組成
物に関する。

【０００３】

【従来の技術】薬物のリポソーム組成物は薬物がリン脂
質などからなる脂質二重膜に包含された微粒子状組成物
である。単独に薬物を生体内に投与する時と比較して、
分解酵素から薬物を保護して例えば血中半減期が延長し
たり、消化酵素から薬物を保護して消化管からの薬物が
吸収可能となったりする特徴が認められてきた。また、
微粒子として挙動することから肝臓、脾臓などの組織、
マクロファージなどの細胞に選択的に取り込まれたり、
癌組織、炎症部位などに高濃度に集積することも知られ
ている。従って単独では副作用が強い薬物の副作用を低
下させ薬効を最大限発揮させるための方法として知られ
ている。このようなリポソームの特徴、製造方法などに
ついては既に成書が多くある。（例えば、“ライフサイ
エンスにおけるリポソーム”（シュプリンガー・フェア
ラーク東京社刊、1994年）を参照されたい。）

【０００４】一方、ドキソルビシンは制癌活性をもつ抗
生物質として知られている。しかし、心臓に対する毒性
が強く、優れた制癌活性を有するものの幅広い使用が制
限されている。この副作用を軽減するためにドキソルビ
シンをリポソーム組成物とし心臓組織へのドキソルビシ
ンの分布を抑制することは古くから研究され、既に製品
化されている。例えば、Sequus Pharmaceuticals社
（米国）からDoxilという商品名で販売されている。こ
の製品においては20mgのドキソルビシンが10mlのリポソ
ームサスペンションになっており通常250mlの5%グルコ
ース水溶液で希釈して３０分かけて点滴静注される。

【０００５】また、K.K.Chakrabortyらはリン脂質、ア
ンホテリシンBを含むエタノールとトリス緩衝液の組成
物を調製し、次いでその組成物にポリソルベート８０を
含むトリス緩衝液を滴下してアンホテリシンBを含有す
るリポソームを用時に調製している。(Proc.Symposiumu
on Natural Origin Substances in Drug Formulation,
Beijing, 4/4 November, 1998の39-40頁）ここで開示さ
れた方法は本リポソームを用時に調製しているという点
で本発明と同じであるが、粒径の小さいリポソームを製
造するために生体にとって有害となる可能性のある合成
界面活性剤のポリソルベート80を使用せざるを得ないの
が欠点であり、本発明と異なるところである。

【０００６】従来、用時調製用リポソームにはいくつか
の方法が提案されてきた。例えば、水性溶媒として提供
されるリポソームに用時薬物をエタノールなどの溶媒に
溶解した溶液として添加する方法がある。しかし、この
方法ではリポソームを調製するのに例えばボルテックス
ミキサーでガラス壁に付着したリン脂質を水性溶媒中に
強制的にリポソーム状粒子として分離分散させたり、リ
ン脂質の分散液に超音波などのエネルギーを照射した
り、リン脂質分散液を細孔のあいた膜を通過させたりす
る必要があり、本発明の要件の簡易なリポソーム製造法
ではない。また、リポソームを水性溶媒に溶解・分散し
た状態で保存すると保存中にリン脂質の酸化がおきた
り、リポソーム粒子の凝集が発生して巨大な二次粒子が
生成するという欠点がある。また、水性溶媒に溶解・分
散を避けるために、調製したリポソームを噴霧乾燥した
り凍結乾燥して固体とし、用時に薬物と水性溶媒を添加
する方法もあるが、本方法でも噴霧乾燥時あるいは凍結
乾燥時に煩雑な操作を必要とし、本発明の要件の簡易な
リポソーム製造法ではない。また、固体となったリポソ
ームに水性溶媒を添加してリポソームを再生する際に粒
子が凝集したままで一次粒子にまで復元しないことが認
められ好ましくない。

【０００７】従って、予めリポソームを調製しそれを液
体あるいは固体状態で保存することは困難であり、何ら
かの手段で用時にリポソームを調製する方法が必須のこ
ととなる。しかも調製時に格別の機器・器具を用いず簡
潔な方法でリポソームを調製しかつ薬物を包含させるこ
とがのぞまれており、それを可能とする本発明の進歩性
・有用性は高い。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかし、リポソームに
は製造上あるいは製造後の品質などにいくつかの課題が
あることが認められている。

【０００９】先ず、リポソームを調製するには通常エネ
ルギーを要する。例えばボルテックスミキサーでガラス
壁に付着したリン脂質を水性溶媒中に強制的にリポソー
ム状粒子として分離分散させたり、リン脂質の分散液に
超音波などのエネルギーを照射したり、リン脂質分散液
を細孔のあいた膜を通過させたりする方法が知られてい
る。従ってこれらの方法は調製する際に機器・器具を必
要としまた時間がかかる。また、リン脂質をクロロホル
ムなどの有機溶媒に溶解した後に該溶媒を蒸発させてガ
ラス壁に付着させるが、この際概溶媒の残留量が問題と
なる。

【００１０】また、リポソーム粒子が保存中に凝集して
粒径が巨大な二次粒子を生成しやすい。リポソーム粒子
の粒径は目的に応じて異なる範囲に調製されるが、静脈
注射して使用する場合には血管に詰まることを避けるた
めに１μｍ以上の巨大粒子があってはならない。通常、
１μｍ以上の粒子がなく、かつ平均粒子径は０．１μｍ
以下にすることが推奨されている。

【００１１】また、薬物のリポソームへの包含率はリポ
ソームの調製方法によって異なる。包含率が高ければ高
いほど薬物をリポソーム組成物として期待する特性が見
られることは当然である。従って高い包含率、具体的に
は100％に近い包含率が望まれる。

【００１２】従って、上述の課題を解決したリポソーム
製剤、特にこれらの課題を同時に解決した製剤、すなわ
ち、調製方法が容易で、有害な有機溶媒を使用せず、リ
ポソームの粒径が小さく、凝集物がなく、薬物が効率良
くリポソームに含有されるという特徴を同時に満足する
薬物のリポソーム組成物が望まれている。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決すべく
本発明者らは研究を開始したが、リポソームの組成、安
定性、物性などはその中に包含される薬物によって大き
く影響されることは公知である。そこで、本発明者らは
上述の如く優れた制癌活性がありながら副作用のために
その使用が制限されているドキソルビシンに注目し、ド
キソルビシンのように生体内の環境で正電荷をもつ薬物
について鋭意研究した。

【００１４】その結果、驚くべきことに、リン脂質から
成るリポソーム膜形成物質（１）を、リポソームゼータ
ポテンシャル増加剤（２）とともにグリセリンを含んで
なる溶媒（３）に溶解し不活性ガス雰囲気下で容器内に
密閉したリン脂質組成物（Ａ）をカチオン性薬物（Ｂ）
に用時添加して更にこの溶液を静脈用注射に適した水性
溶媒（Ｃ）に添加するだけで粒径が小さく、凝集物がな
く、薬物が効率良く包含されたリポソームが調製される
ことを見出した。従って、リン脂質組成物（Ａ）、カチ
オン性薬物（Ｂ）、及び水性溶媒（Ｃ）はキットとして
医療現場に提供される。

【００１５】すなわち本発明は次の（Ａ）、（Ｂ）、及
び（Ｃ）からなるカチオン性薬物のリポソーム用時調製
用キットを提供するものである。（Ａ）リン脂質から成るリポソーム膜形成物質（１）、
リポソームゼータポテンシャル増加剤（２）、及びグリ
セリンを含んでなる溶媒（３）を構成成分とする不活性
ガス雰囲気下で容器内に密閉されたリン脂質組成物。（Ｂ）カチオン性薬物。（Ｃ）水性溶媒。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明に使用されるリポソーム膜
形成物質（１）としては通常電気的に中性のリン脂質の
１種以上が好ましく、その例としてホスファチジルコリ
ン（卵黄由来あるいは大豆由来）、ジパルミトイルホス
ファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリ
ン、水添大豆レシチン、カルジオリピッド、ポリエチレ
ングリコール化リン脂質類などが挙げられる。また、生
成したリポソームの血中濃度を持続するためにポリエチ
レングリコール化されたリン脂質も使用される。ポリエ
チレングリコール化されたリン脂質としてはポリエチレ
ングリコール化ジステアロイルホスファチジルエタノー
ルアミン、ポリエチレングリコール化卵黄ホスファチジ
ルエタノールアミン、ポリエチレングリコール化１−パ
ルミチル−２−オレイルホスファチジルエタノールアミ
ン、ポリエチレングリコール化水添大豆ホスファチジル
エタノールアミンなどが挙げられる。これらの中でもホ
スファチジルコリン（卵黄由来あるいは大豆由来）がド
キソルビシンリポソームを調製するには望ましい。

【００１７】本発明に使用されるリポソームゼータポテ
ンシャル増加剤（２）としては電気的に負に帯電した脂
質あるいはリン脂質が好ましく、その例として、オレイ
ン酸、リノール酸、リノレイン酸などの不飽和脂肪酸
類、コレステロール硫酸ナトリウム、ホスファチジルエ
タノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジ
ン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイ
ノシトール、カルジオリピン、セラミドホスホリルエタ
ノールアミン、セラミドホスホリルグリセロールなどが
挙げられる。これらの中でもオレイン酸とコレステロー
ル硫酸ナトリウムがドキソルビシンリポソームを調製す
るには望ましい。

【００１８】本発明に使用されるグリセリンを含んでな
る溶媒（３）はグリセリンを必須成分とする溶媒であり
上記のリポソーム膜形成物質（１）とリポソームゼータ
ポテンシャル増加剤（２）とを溶解するものである。し
かし、本発明においてグリセリンは単に上記２成分の溶
媒ではなく、生成するリポソームの粒径を小さく保つと
いう本発明にとって極めて重要な役割を果たしている。
グリセリンに加えられる溶媒としてはエタノール、水、
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール類など
が挙げられるが、全体の７０重量％以上はグリセリンで
あることが好ましい。

【００１９】本発明の、リン脂質から成るリポソーム膜
形成物質（１）、リポソームゼータポテンシャル増加剤
（２）、及びグリセリンを含んでなる溶媒（３）を構成
成分とするリン脂質組成物（Ａ）を保存容器内に密封す
る際に使用される不活性ガスとしては窒素、アルゴンな
どが挙げられるが、中でも窒素が望ましい。

【００２０】本発明に使用されるカチオン性薬物（Ｂ）
としてはドキソルビシン、ビンクリスチン、ダウノルビ
シン及びこれらの薬学的に許容される塩などが挙げられ
るが、中でもドキソルビシンが好ましい。これらの薬物
は固体状態でバイアル、アンプルなどに密封されてもよ
いし、安定性が良好であれば溶媒、好ましくはグリセリ
ンを含んでなる溶媒（３）に溶解してもよい。また溶解
が可能であれば上記のリン脂質組成物と併せて密封され
てもよい。

【００２１】本発明に使用される水性溶媒（Ｃ）として
は通常輸液に使用されるものでよく例えば、0.9％塩化
ナトリウム溶液、リンゲル液、ブドウ糖リンゲル液、ハ
ルトマン液などが挙げられ市販品をそのまま使用でき
る。

【００２２】本発明に使用されるカチオン性薬物（Ｂ）
の量はキット製品であることから１回の治療に使用され
る量が望ましいが、通常、使用量は適宜増減されること
を考慮すると最小必要量を単位として提供されてもよ
い。ドキソルビシンの場合には通常1回10mgであるので1
0mgをガラスバイアル中に密封するのがよい。

【００２３】本発明に使用されるリポソームゼータポテ
ンシャル増加剤（２）の量は、これがもつ負電荷の量が
リポソーム内に包含されるカチオン性薬物（Ｂ）の正電
荷よりも多くなるように使用される。ドキソルビシンの
場合には負電荷をもつオレイン酸とコレステロール硫酸
ナトリウムが使用されるが、オレイン酸はドキソルビシ
ンと当量以上、コレステロール硫酸ナトリウムはドキソ
ルビシンの当量の0.5倍量以上使用するとドキソルビシ
ンのリポソームへの包含率が特に高くなることが知見さ
れている。ドキソルビシンを10mg使用する場合にはオレ
イン酸は5-10mgを、コレステロール硫酸ナトリウムは10
-20mgを使用するのが望ましい。

【００２４】本発明に使用されるリポソーム膜形成物質
の量はリポソームゼータポテンシャル増加剤（２）の10
倍量程度が望ましく、ドキソルビシンでは100-200mgが
使用される。

【００２５】本発明に使用されるグリセリンを含んでな
る溶媒（３）の量は溶解されるリポソーム膜形成物質と
リポソームゼータポテンシャル増加剤（２）の量に依存
するが通常1-5mlの範囲で使用される。

【００２６】また、本発明に使用される水性溶媒（Ｃ）
の量は市販のガラス容器入り製品に収納されている量に
依存するが、通常250-500mlが使用される。

【００２７】本発明においては、例えばリン脂質から成
るリポソーム膜形成物質（１）を、リポソームゼータポ
テンシャル増加剤（２）とともにグリセリンを含んでな
る溶媒（３）に溶解し不活性ガス雰囲気下で容器内に密
閉したリン脂質組成物（Ａ）をカチオン性薬物（Ｂ）に
用時添加して更にこの溶液を静脈用注射に適した水性溶
媒（Ｃ）に添加することによりリポソームを調製するこ
とができる。

【００２８】上記の添加という操作は液を適当な容器内
で混合し必要に応じて軽く手で振トウするだけであり攪
拌振動を与えるための機器・器具類は全く必要ではな
い。また、上記リン脂質組成物（Ａ）を調製するにもリ
ポソーム膜形成物質（１）、リポソームゼータポテンシ
ャル増加剤（２）を不活性ガス雰囲気下グリセリンを含
んでなる溶媒（３）に溶解し密封する操作だけであり容
易である。更に、カチオン性薬物（Ｂ）もバイアルなど
に必要量を採取し必要であればグリセリンを含んでなる
溶媒に溶解したり不活性ガスなどの雰囲気下密封するだ
けであり操作は容易である。また、上記リン脂質組成物
（Ａ）ではリン脂質は無水状態かあるいは存在しても最
少量の水に接触するのみであり安定性を損なう要因はほ
とんどない。

【００２９】以下に、本発明を実施例で詳細に説明する
がこれらによって限定されるものではない。

【００３０】

【実施例】［実施例１］卵黄由来ホスファチジルコリン
（Sigma社製）80mg、オレイン酸（Sigma社製）5mg、コ
レステロール硫酸ナトリウム（Sigma社製）14mgをと
り、グリセリン（和光純薬製）とエタノール（米山薬品
製）の4:1（重量比）混液2.5gに溶解する。これを窒素
雰囲気下でガラスバイアルに封入する（ａ）。一方、ド
キソルビシン（Sigma社製）を10mgとり窒素雰囲気下に
ガラスバイアルに封入する（ｂ）。更に市販の生理食塩
水250ml（扶桑薬品製）（ｃ）を用意し、以上３点でキ
ットとする。用時は、先ず上記のリン脂質組成物溶液
（ａ）をバイアルから取り、これをドキソルビシンが封
入されているバイアル（ｂ）中に添加し、手で穏やかに
攪拌してドキソルビシンを溶解する。溶解後できたドキ
ソルビシン溶液を生理食塩水中（ｃ）に滴下し、手で穏
やかに振トウしてドキソルビシンのリポソーム溶液とす
る。得られたリポソーム溶液は赤色澄明であり、その他
に下記の性質を示した。（１）粒度分布大塚電子製電気泳動光散乱光度計（ELS-800型）により
測定した結果を示す。平均径：54.5nm 1ミクロン以上の粒子の比率（重量基準）：５％以下（２）ドキソルビシンのリポソーム包含率ゲルろ過法によりリポソーム外に遊離しているドキソル
ビシンとリポソーム内に包含されているドキソルビシン
を定量した結果、仕込みの10mgのドキソルビシンのうち
9.85mgが包含されていりことが判明した。従ってリポソ
ーム包含率は98.5%となる。

【００３１】［実施例２−４、対照例１−２］実施例１
に準じて、リポソームゼータポテンシャル増加剤のオレ
イン酸（Sigma社製）5mg、コレステロール硫酸ナトリウ
ム（Sigma社製）14mgの替わりに次の組成のものを用い
て同様の操作でリポソームを製造し、ドキソルビシンの
リポソーム包含率を比較した。

【００３２】

【表１】

【００３３】［実施例５−６、対照例３−４］実施例１
に準じてグリセリン（和光純薬製）とエタノール（米山
薬品製）の4:1（重量比）混液2.5gのかわりに下記の組
成の溶媒を使用して同様の操作でリポソームを製造しリ
ポソームの性質を比較した。

【００３４】

【表２】

【００３５】［対照例５−６］リポソーム製造法の違い本発明で調製したリポソームと別の方法で調製したリポ
ソームとの特性を比較した。すなわち、通常の方法とし
ては、クロロホルムに溶解したリポソーム膜形成物質を
ビーカーにいれ溶媒を乾固した後ドキソルビシンの生理
食塩水溶液を添加しボルテックスミキサーで振トウさせ
て製造した。（対照例５）また、この方法でドキソルビシンを加えないで製造した
リポソームを凍結乾燥して固体とし、これにドキソルビ
シンの生理食塩水を加えて製造したリポソームについて
も比較検討した。（対照例６）

【００３６】

【表３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/24 Ａ６１Ｋ 47/24 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 AA99 CC27 CC50 DD37 DD38 DD41 DD63 DD67 DD70 FF36 FF67 4C086 AA01 AA02 CB21 EA10 MA03 MA05 MA24 NA04 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）からな
るカチオン性薬物のリポソーム用時調製用キット。（Ａ）リン脂質から成るリポソーム膜形成物質（１）、
リポソームゼータポテンシャル増加剤（２）、及びグリ
セリンを含んでなる溶媒（３）を構成成分とする不活性
ガス雰囲気下で容器内に密閉されたリン脂質組成物。（Ｂ）カチオン性薬物。（Ｃ）水性溶媒。
【請求項２】該リン脂質から成るリポソーム膜形成物
質（１）がホスファチジルコリン、ジパルミトイルホス
ファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリ
ン、水添大豆レシチン、カルジオリピッド、及びポリエ
チレングリコール化リン脂質類からなる群から選ばれる
１種以上である請求項１記載のリポソーム用時調製用キ
ット。
【請求項３】該ポリエチレングリコール化リン脂質類
がポリエチレングリコール化ジステアロイルホスファチ
ジルエタノールアミン、ポリエチレングリコール化卵黄
ホスファチジルエタノールアミン、ポリエチレングリコ
ール化１−パルミチルー２−オレイルホスファチジルエ
タノールアミン、及びポリエチレングリコール化水添大
豆ホスファチジルエタノールアミンからなる群から選ば
れる１種以上である請求項２記載のリポソーム用時調製
用キット。
【請求項４】該リポソームゼータポテンシャル増加剤
（２）がマイナスの荷電を有する脂質である請求項１記
載のリポソーム用時調製用キット。
【請求項５】該マイナスの荷電を有する脂質がコレス
テロール硫酸ナトリウム塩及びオレイン酸である請求項
４記載のリポソーム用時調製用キット。
【請求項６】該グリセリンを含んで成る溶媒（３）が
グリセリン、グリセリン及びエタノール、あるいはグリ
セリン及びエタノール及び水のいずれかであり、重量比
で７０％以上がグリセリンである請求項１記載のリポソ
ーム用時調製用キット。
【請求項７】該不活性ガスが窒素、アルゴンからなる
群から選ばれる１種以上である請求項１記載のリポソー
ム用時調製用キット。
【請求項８】該カチオン性薬物（Ｂ）がドキソルビシ
ン、ビンクリスチン、及びダウノルビシンからなる群か
ら選ばれる１種以上である請求項１記載のリポソーム用
時調製用キット。
【請求項９】該カチオン性薬物（Ｂ）が固体あるい
は、該グリセリンを含んでなる溶媒（３）で溶解された
溶液である請求項１〜８記載のいずれか一項に記載のリ
ポソーム用時調製用キット。
【請求項１０】該水性溶媒（Ｃ）が0.9％塩化ナトリ
ウム溶液、リンゲル液、ブドウ糖リンゲル液、及びハル
トマン液からなる群から選ばれる１種以上である請求項
１記載のリポソーム用時調製用キット。
【請求項１１】該リン脂質組成物（Ａ）に該カチオン
性薬物（Ｂ）を混合して該カチオン薬物（Ｂ）を溶解せ
しめ、ついで該溶液を該水性溶媒（Ｃ）と混合して得ら
れたリポソーム組成物であって、９０重量％以上のリポ
ソーム粒子の粒径が１００ｎｍ以下であり、リポソーム
粒子の平均粒径が７０ｎｍ以下であり、カチオン性薬物
（Ｂ）の９０重量％以上がリポソーム粒子に包含されて
いることを特徴とするリポソーム組成物。
【請求項１２】ホスファチジルコリン、オレイン酸及
びコレステロール硫酸ナトリウムがグリセリン・エタノ
ール混合液に溶解され窒素雰囲気下で封入されたアンプ
ルと、ドキソルビシンを収納したガラスバイアルと、生
理食塩水ガラスボトルとからなるドキソルビシンのリポ
ソーム用時調製用キット。