JP2000224982A - 短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌 - Google Patents
短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌Info
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 短鎖分岐脂肪酸生産酵素遺伝子であるロ
イシンデヒドロゲナーゼ遺伝子および／または分岐ケト
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の機能を低下または欠損さ
せ、それらの酵素活性を低下または消失させることによ
り短鎖分岐脂肪酸生産能を低下または消失させた納豆菌
を育種開発し、その納豆菌を用いて納豆を生産する方法
を提供する。 【効果】 本発明によれば、不快臭の一つであるムレ臭
が低下したまたはムレ臭のない高品質の納豆を生産する
ことができる。
イシンデヒドロゲナーゼ遺伝子および／または分岐ケト
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の機能を低下または欠損さ
せ、それらの酵素活性を低下または消失させることによ
り短鎖分岐脂肪酸生産能を低下または消失させた納豆菌
を育種開発し、その納豆菌を用いて納豆を生産する方法
を提供する。 【効果】 本発明によれば、不快臭の一つであるムレ臭
が低下したまたはムレ臭のない高品質の納豆を生産する
ことができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、納豆の不快臭のひ
とつであるムレ臭の低下ないし消失システムに関するも
のである。特に本発明は、納豆のムレ臭の原因物質が短
鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪
酸）であることをはじめて見出しただけでなく、その生
成メカニズムをはじめて解明してそれに関与する酵素に
着目し、該酵素活性を遺伝子操作などによって低下ない
し失活せしめることによりムレ臭の低下ないし消失を確
認し、これらの新規知見に基きはじめて完成されたもの
である。さらに、納豆中の短鎖分岐脂肪酸のより好まし
い含有量についても明らかにし、ムレ臭が低下したまた
はムレ臭のない納豆を提供することを可能として、本発
明は完成されたものである。
とつであるムレ臭の低下ないし消失システムに関するも
のである。特に本発明は、納豆のムレ臭の原因物質が短
鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪
酸）であることをはじめて見出しただけでなく、その生
成メカニズムをはじめて解明してそれに関与する酵素に
着目し、該酵素活性を遺伝子操作などによって低下ない
し失活せしめることによりムレ臭の低下ないし消失を確
認し、これらの新規知見に基きはじめて完成されたもの
である。さらに、納豆中の短鎖分岐脂肪酸のより好まし
い含有量についても明らかにし、ムレ臭が低下したまた
はムレ臭のない納豆を提供することを可能として、本発
明は完成されたものである。
【０００２】すなわち、本発明は、納豆のムレ臭原因物
質である短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−
メチル酪酸）の生産能が低下または消失した納豆菌とそ
の開発方法ならびにその菌を用いたムレ臭低下納豆の生
産に関する。さらに詳しくは、短鎖分岐脂肪酸（short
branched chain fatty acids）生産酵素遺伝子であるロ
イシンデヒドロゲナーゼ（leucine dehydrogenase, EC
1.4.1.9）遺伝子および／または分岐ケト酸デヒドロゲ
ナーゼ（branched chain α−keto acid dehydrogenas
e, EC 1.2.1.25）遺伝子の機能を低下または欠損させ、
それらの酵素活性を低下または失活させることによる短
鎖分岐脂肪酸生産能を低下または消失させたムレ臭低下
納豆菌の開発方法とその菌ならびにその菌を用いて生産
されたムレ臭が低下したまたはムレ臭がない納豆の生産
に関する。さらに本発明は、納豆中の短鎖分岐脂肪酸の
より好ましい含有量についても検討し、ムレ臭が低下し
たまたはムレ臭のない納豆を提供し、さらに短鎖分岐脂
肪酸の含有量がより好ましくは１００ｍｇ／１００ｇ納
豆以下である納豆を提供することにも関する。
質である短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−
メチル酪酸）の生産能が低下または消失した納豆菌とそ
の開発方法ならびにその菌を用いたムレ臭低下納豆の生
産に関する。さらに詳しくは、短鎖分岐脂肪酸（short
branched chain fatty acids）生産酵素遺伝子であるロ
イシンデヒドロゲナーゼ（leucine dehydrogenase, EC
1.4.1.9）遺伝子および／または分岐ケト酸デヒドロゲ
ナーゼ（branched chain α−keto acid dehydrogenas
e, EC 1.2.1.25）遺伝子の機能を低下または欠損させ、
それらの酵素活性を低下または失活させることによる短
鎖分岐脂肪酸生産能を低下または消失させたムレ臭低下
納豆菌の開発方法とその菌ならびにその菌を用いて生産
されたムレ臭が低下したまたはムレ臭がない納豆の生産
に関する。さらに本発明は、納豆中の短鎖分岐脂肪酸の
より好ましい含有量についても検討し、ムレ臭が低下し
たまたはムレ臭のない納豆を提供し、さらに短鎖分岐脂
肪酸の含有量がより好ましくは１００ｍｇ／１００ｇ納
豆以下である納豆を提供することにも関する。
【０００３】
【従来の技術】納豆は、大豆を原料に納豆菌による発酵
を行って生産され、納豆菌がつくる粘質物と共に、その
臭いに特徴のある食品である。納豆中には、ピラジン
類、アセトイン、ジアセチル、酢酸、プロピオン酸、短
鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪
酸）、アンモニアなどを中心とした種々の揮発性成分が
含有されていることが知られているが（日本食品工業学
会誌、３１巻、ｐ．５８７−５９５（１９８４））、こ
れらの内のピラジン類、ジアセチルなどは、納豆好きの
消費者に好まれるいわゆる納豆臭の主成分であるといわ
れている。
を行って生産され、納豆菌がつくる粘質物と共に、その
臭いに特徴のある食品である。納豆中には、ピラジン
類、アセトイン、ジアセチル、酢酸、プロピオン酸、短
鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪
酸）、アンモニアなどを中心とした種々の揮発性成分が
含有されていることが知られているが（日本食品工業学
会誌、３１巻、ｐ．５８７−５９５（１９８４））、こ
れらの内のピラジン類、ジアセチルなどは、納豆好きの
消費者に好まれるいわゆる納豆臭の主成分であるといわ
れている。
【０００４】その一方で、いわゆるアンモニア臭やムレ
臭は代表的な不快臭であるといわれており、なるべくこ
れらの不快臭の原因となる物質の含量の低い納豆を開発
することができれば、納豆の品質を向上させることがで
きると期待できる。
臭は代表的な不快臭であるといわれており、なるべくこ
れらの不快臭の原因となる物質の含量の低い納豆を開発
することができれば、納豆の品質を向上させることがで
きると期待できる。
【０００５】このような観点から、不快臭の一つである
アンモニア臭を抑制する方法としては、特開昭６４−８
６８５４、特開平１−１９１６５５、特開平４−１７３
０６９、特開平６−２６９２８１、特開平８−１５４６
１６、特開平８−２７５７７２などに開示の如く、発酵
中や保存中にアンモニアをあまり生産しないように改良
した納豆菌を開発し、その納豆菌を使用して納豆を生産
しようとする試みが多くなされてきている。これらの殆
どは、納豆菌が本来保有するプロテアーゼ活性を低下さ
せた納豆菌を開発し、このようなプロテアーゼ活性低下
納豆菌を用いて納豆を生産する方法であった。このよう
な方法により、アンモンニアの生産がある程度抑えら
れ、アンモニア臭が低下した納豆を製造できることが期
待されている。
アンモニア臭を抑制する方法としては、特開昭６４−８
６８５４、特開平１−１９１６５５、特開平４−１７３
０６９、特開平６−２６９２８１、特開平８−１５４６
１６、特開平８−２７５７７２などに開示の如く、発酵
中や保存中にアンモニアをあまり生産しないように改良
した納豆菌を開発し、その納豆菌を使用して納豆を生産
しようとする試みが多くなされてきている。これらの殆
どは、納豆菌が本来保有するプロテアーゼ活性を低下さ
せた納豆菌を開発し、このようなプロテアーゼ活性低下
納豆菌を用いて納豆を生産する方法であった。このよう
な方法により、アンモンニアの生産がある程度抑えら
れ、アンモニア臭が低下した納豆を製造できることが期
待されている。
【０００６】しかし、納豆のもう一方の代表的不快臭で
あるムレ臭を抑えることについては、これまでに全く検
討されていなかった。むしろムレ臭の原因物質を特定す
ることも出来ておらず、従ってムレ臭を抑制する方法の
開発も大幅に遅れているのが現状であって、ムレ臭低下
納豆の製造方法の開発が望まれていた。
あるムレ臭を抑えることについては、これまでに全く検
討されていなかった。むしろムレ臭の原因物質を特定す
ることも出来ておらず、従ってムレ臭を抑制する方法の
開発も大幅に遅れているのが現状であって、ムレ臭低下
納豆の製造方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、納豆の有用
性、特に嗜好食品としてのみでなく健康保健食品として
の面からの有用性にも鑑み、更なる摂取量の増加を図る
目的でなされたものであり、その際において、従来未解
決のまま残されていたムレ臭の消失という技術課題を解
決する目的でなされたものである。
性、特に嗜好食品としてのみでなく健康保健食品として
の面からの有用性にも鑑み、更なる摂取量の増加を図る
目的でなされたものであり、その際において、従来未解
決のまま残されていたムレ臭の消失という技術課題を解
決する目的でなされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため、先ずはじめに、納豆におけるムレ臭の
原因物質を特定すべく各方面から鋭意検討を重ねた結
果、短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチ
ル酪酸）であることをはじめてつきとめた。そして、分
岐アミノ酸を出発物質とする短鎖分岐脂肪酸の生合成経
路について、図１のような仮説を設定した。そしてこの
仮説にしたがってロイシンデヒドロゲナーゼ／分岐ケト
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させることにより、短
鎖分岐脂肪酸の少なくともひとつを生産できないように
育種した短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌を開発するのには
じめて成功し、その納豆菌を用いて納豆を製造したとこ
ろ、上記仮説どおり、ムレ臭が著しく低下した納豆であ
ることがはじめて確認できた。
を達成するため、先ずはじめに、納豆におけるムレ臭の
原因物質を特定すべく各方面から鋭意検討を重ねた結
果、短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチ
ル酪酸）であることをはじめてつきとめた。そして、分
岐アミノ酸を出発物質とする短鎖分岐脂肪酸の生合成経
路について、図１のような仮説を設定した。そしてこの
仮説にしたがってロイシンデヒドロゲナーゼ／分岐ケト
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させることにより、短
鎖分岐脂肪酸の少なくともひとつを生産できないように
育種した短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌を開発するのには
じめて成功し、その納豆菌を用いて納豆を製造したとこ
ろ、上記仮説どおり、ムレ臭が著しく低下した納豆であ
ることがはじめて確認できた。
【０００９】その結果、ムレ臭の原因物質が短鎖分岐脂
肪酸、すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸
であることをつきとめることができ、同時に上記仮説の
正しいことが確認された。そして、納豆菌においてロイ
シンデヒドロゲナーゼおよび／または分岐ケト酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子の機能を低下または欠損する手法も確
立して、ムレ臭の生産能が低下または消失した納豆菌と
いう従来未知の新規納豆菌を創製するのにはじめて成功
し、そして更に、このようにして開発した新規納豆菌を
用いることにより、ムレ臭の低下ないし消失した納豆と
いう新規食品の製造が可能であることも確認し、遂に本
発明の完成に至ったものである。さらに本発明者らは、
納豆中の短鎖分岐脂肪酸のより好ましい含有量について
も検討し、ムレ臭が低下したまたはムレ臭のない納豆で
あれば良く、さらに短鎖分岐脂肪酸の含有量がより好ま
しくは１００ｍｇ／１００ｇ納豆以下であれば良いこと
を確認して、本発明を完成させることができた。
肪酸、すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸
であることをつきとめることができ、同時に上記仮説の
正しいことが確認された。そして、納豆菌においてロイ
シンデヒドロゲナーゼおよび／または分岐ケト酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子の機能を低下または欠損する手法も確
立して、ムレ臭の生産能が低下または消失した納豆菌と
いう従来未知の新規納豆菌を創製するのにはじめて成功
し、そして更に、このようにして開発した新規納豆菌を
用いることにより、ムレ臭の低下ないし消失した納豆と
いう新規食品の製造が可能であることも確認し、遂に本
発明の完成に至ったものである。さらに本発明者らは、
納豆中の短鎖分岐脂肪酸のより好ましい含有量について
も検討し、ムレ臭が低下したまたはムレ臭のない納豆で
あれば良く、さらに短鎖分岐脂肪酸の含有量がより好ま
しくは１００ｍｇ／１００ｇ納豆以下であれば良いこと
を確認して、本発明を完成させることができた。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明で育種改良に用いるもとの納豆菌には特に
制限はないが、通常納豆工業で使用されている発酵能力
に優れた納豆菌や、自然界から分離取得された納豆菌、
市販の納豆から分離した納豆菌、およびさらに改良を重
ねた優れた納豆菌を用いるのが望ましい。
する。本発明で育種改良に用いるもとの納豆菌には特に
制限はないが、通常納豆工業で使用されている発酵能力
に優れた納豆菌や、自然界から分離取得された納豆菌、
市販の納豆から分離した納豆菌、およびさらに改良を重
ねた優れた納豆菌を用いるのが望ましい。
【００１１】納豆菌は、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓに分類されているが、粘質物（糸引物質）
などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆
発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチン
を要求するとされるなどの特性を有していることなどか
ら、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏに分類されたり、枯
草菌の変種としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ｖａｒ．ｎａｔｔｏあるいはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ）などと分類する文献もあ
る。納豆菌としては、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔ
ｔｏ ＩＦＯ ３００９、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ ＩＦＯ ３３３５、同ＩＦＯ３３３６、同Ｉ
ＦＯ ３９３６、同ＩＦＯ １３１６９などがあるほ
か、上記した各種納豆菌が広く使用される。
ｂｔｉｌｉｓに分類されているが、粘質物（糸引物質）
などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆
発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチン
を要求するとされるなどの特性を有していることなどか
ら、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏに分類されたり、枯
草菌の変種としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ｖａｒ．ｎａｔｔｏあるいはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ）などと分類する文献もあ
る。納豆菌としては、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔ
ｔｏ ＩＦＯ ３００９、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ ＩＦＯ ３３３５、同ＩＦＯ３３３６、同Ｉ
ＦＯ ３９３６、同ＩＦＯ １３１６９などがあるほ
か、上記した各種納豆菌が広く使用される。
【００１２】具体的には、市販納豆から分離したＯ−２
株、市販の納豆菌高橋３号菌（Ｔ3株、東京農業大学菌
株保存室）、宮城野納豆菌（宮城野納豆製造所）等、各
種の納豆菌が適宜使用できる。
株、市販の納豆菌高橋３号菌（Ｔ3株、東京農業大学菌
株保存室）、宮城野納豆菌（宮城野納豆製造所）等、各
種の納豆菌が適宜使用できる。
【００１３】本発明では、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺
伝子および／または分岐ケト酸デヒドロゲナーゼの遺伝
子を欠損させ、これらの酵素活性を失活させた納豆菌を
育種することにより短鎖分岐脂肪酸すなわちイソ酪酸、
イソ吉草酸、２−メチル酪酸を生産しない納豆菌を取得
するのである。育種の方法のひとつとしては、スタール
らがＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて開発
した相同組換え能を利用した遺伝子失活法（J. Bacteri
ol., Vol.158, p.411-418(1984)）を納豆菌用に改変し
た方法が用いられる。
伝子および／または分岐ケト酸デヒドロゲナーゼの遺伝
子を欠損させ、これらの酵素活性を失活させた納豆菌を
育種することにより短鎖分岐脂肪酸すなわちイソ酪酸、
イソ吉草酸、２−メチル酪酸を生産しない納豆菌を取得
するのである。育種の方法のひとつとしては、スタール
らがＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて開発
した相同組換え能を利用した遺伝子失活法（J. Bacteri
ol., Vol.158, p.411-418(1984)）を納豆菌用に改変し
た方法が用いられる。
【００１４】本方法が納豆菌においても有効であること
は本発明者らにより初めて立証されたことである。本方
法の利点は狙いを定めた遺伝子だけを特異的に欠損させ
ることが可能であり、そのため納豆菌などの工業的に利
用される微生物においては、他の優れた特性は壊さず
に、欠点となっている性質に関与する遺伝子だけに変異
を起こさせて改良することができることである。また本
方法は、最終的には、育種のための遺伝子破壊などの目
的で納豆菌に導入した異種遺伝子を完全に除去すること
ができる方法であるため、異種蛋白質が発現されること
は全くなく、育種された菌は遺伝子組換え菌とはならな
いなどの、特に食品として利用する場合に重要な長所を
有している。
は本発明者らにより初めて立証されたことである。本方
法の利点は狙いを定めた遺伝子だけを特異的に欠損させ
ることが可能であり、そのため納豆菌などの工業的に利
用される微生物においては、他の優れた特性は壊さず
に、欠点となっている性質に関与する遺伝子だけに変異
を起こさせて改良することができることである。また本
方法は、最終的には、育種のための遺伝子破壊などの目
的で納豆菌に導入した異種遺伝子を完全に除去すること
ができる方法であるため、異種蛋白質が発現されること
は全くなく、育種された菌は遺伝子組換え菌とはならな
いなどの、特に食品として利用する場合に重要な長所を
有している。
【００１５】また、このような遺伝子組換え法を納豆菌
で利用するには、納豆菌への遺伝子導入のための形質転
換系が必要であるが、本発明者らは、形質転換能の向上
した納豆菌を取得することにより、納豆菌の実用的なレ
ベルの形質転換系を開発することも可能としており、こ
の形質転換系を利用してプラスミドベクターを納豆菌に
効率良く導入し、目的の遺伝子欠損株を育種することが
出来たのである。また、納豆菌の遺伝子組換え系の一つ
としては、Appl. Environ. Microbiol.,Vol.63., p.408
7-4089(1997)に記載のファージベクターを利用した形質
導入法（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）が既に開発されて
おり、本発明ではこの方法も利用される。
で利用するには、納豆菌への遺伝子導入のための形質転
換系が必要であるが、本発明者らは、形質転換能の向上
した納豆菌を取得することにより、納豆菌の実用的なレ
ベルの形質転換系を開発することも可能としており、こ
の形質転換系を利用してプラスミドベクターを納豆菌に
効率良く導入し、目的の遺伝子欠損株を育種することが
出来たのである。また、納豆菌の遺伝子組換え系の一つ
としては、Appl. Environ. Microbiol.,Vol.63., p.408
7-4089(1997)に記載のファージベクターを利用した形質
導入法（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）が既に開発されて
おり、本発明ではこの方法も利用される。
【００１６】なお、上記のような遺伝子組換え技術以外
によっても、すなわち、既に目的遺伝子の機能が低下ま
たは欠損している納豆菌を自然界から選抜するいわゆる
スクリーニング法や、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や
エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等による薬剤変異法
や、γ線や紫外線等を用いる方法などによってこれらの
遺伝子を変異させて機能を低下または欠損させるなど
の、従来から実施されているような他の方法によっても
育種が可能である。このような通常の変異手段によれ
ば、ロイシンデヒドロゲナーゼ及び／または分岐ケト酸
デヒドロゲナーゼの酵素活性が完全に失活した納豆菌以
外にも、これらの酵素活性が中間程度に低下した納豆菌
も取得することができる。このような納豆菌を用いて納
豆を生産する場合は、ムレ臭原因物質である短鎖分岐脂
肪酸の含有量が中間程度に低下した納豆が製造可能とな
る。本発明においては、このようにして得た短鎖分岐脂
肪酸すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸の
生産能が低下ないし消失した納豆菌を使用する。
によっても、すなわち、既に目的遺伝子の機能が低下ま
たは欠損している納豆菌を自然界から選抜するいわゆる
スクリーニング法や、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や
エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等による薬剤変異法
や、γ線や紫外線等を用いる方法などによってこれらの
遺伝子を変異させて機能を低下または欠損させるなど
の、従来から実施されているような他の方法によっても
育種が可能である。このような通常の変異手段によれ
ば、ロイシンデヒドロゲナーゼ及び／または分岐ケト酸
デヒドロゲナーゼの酵素活性が完全に失活した納豆菌以
外にも、これらの酵素活性が中間程度に低下した納豆菌
も取得することができる。このような納豆菌を用いて納
豆を生産する場合は、ムレ臭原因物質である短鎖分岐脂
肪酸の含有量が中間程度に低下した納豆が製造可能とな
る。本発明においては、このようにして得た短鎖分岐脂
肪酸すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸の
生産能が低下ないし消失した納豆菌を使用する。
【００１７】このようにして開発された短鎖分岐脂肪酸
非生産納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実施され
ている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。このよ
うにして短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌を用いて生産した
納豆と、従来から利用されている通常の納豆菌を用いた
納豆とを比較すると、短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌で製
造した納豆は、短鎖分岐脂肪酸をほとんど含有しておら
ず、いわゆるムレ臭がほとんどないことが確認される。
また、短鎖分岐脂肪酸の生産能が低下または消失した上
記の納豆菌を通常の納豆菌と適当な比率で混合して使用
して納豆の発酵をさせることによっても、納豆のムレ臭
原因物質である短鎖分岐脂肪酸の含有量が通常の納豆よ
りも低下しており、かつ任意の含有量の納豆を製造する
ことができる。
非生産納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実施され
ている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。このよ
うにして短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌を用いて生産した
納豆と、従来から利用されている通常の納豆菌を用いた
納豆とを比較すると、短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌で製
造した納豆は、短鎖分岐脂肪酸をほとんど含有しておら
ず、いわゆるムレ臭がほとんどないことが確認される。
また、短鎖分岐脂肪酸の生産能が低下または消失した上
記の納豆菌を通常の納豆菌と適当な比率で混合して使用
して納豆の発酵をさせることによっても、納豆のムレ臭
原因物質である短鎖分岐脂肪酸の含有量が通常の納豆よ
りも低下しており、かつ任意の含有量の納豆を製造する
ことができる。
【００１８】ここに開発された短鎖分岐脂肪酸非生産納
豆菌は、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子及び／または
分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損しており、こ
れらの酵素活性がほとんど消失した納豆菌である。この
ような納豆菌を用いて生産された納豆は、短鎖分岐脂肪
酸すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸をほ
とんど含有しておらず、そしてムレ臭が低下した納豆で
あることが確認されたことから、納豆のムレ臭の原因物
質がイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸などの短鎖
分岐脂肪酸であることが明白となり、ここに、これらの
短鎖分岐脂肪酸は納豆菌においては、図１に示すような
代謝経路により生産されることが初めて確認されたので
ある。
豆菌は、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子及び／または
分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損しており、こ
れらの酵素活性がほとんど消失した納豆菌である。この
ような納豆菌を用いて生産された納豆は、短鎖分岐脂肪
酸すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸をほ
とんど含有しておらず、そしてムレ臭が低下した納豆で
あることが確認されたことから、納豆のムレ臭の原因物
質がイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸などの短鎖
分岐脂肪酸であることが明白となり、ここに、これらの
短鎖分岐脂肪酸は納豆菌においては、図１に示すような
代謝経路により生産されることが初めて確認されたので
ある。
【００１９】したがって、ムレ臭が低下ないし消失した
納豆を生産する目的で短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ
吉草酸、２−メチル酪酸の少なくともひとつ）の生産能
が低下または消失した納豆菌を開発するには、図１に示
すような代謝経路に係わる酵素群の内の一つもしくはそ
れ以上の酵素の活性を失活させれば良いことが示された
ことになる。そして本発明に係る納豆菌を育種するに
は、遺伝子組み換えの手法によるだけでなく、通常行わ
れている変異手段によればよく、あるいは、自然界から
分離してもよい。これらの短鎖分岐脂肪酸の生産能が低
下または消失した納豆菌を用いて納豆を製造する方法以
外にも、通常の納豆菌を用いた納豆の製造における発酵
条件を種々工夫するなどして短鎖分岐脂肪酸の生産を抑
制したり、さらに通常の納豆の発酵が終了した後に、納
豆を吸引−吸着などの物理的手段などによって処理する
などの方法によっても、納豆中のムレ臭原因物質である
短鎖分岐脂肪酸の含有量を低下または消失させて、ムレ
臭が低下したまたはムレ臭がない納豆を製造することが
可能である。さらに、納豆中の短鎖分岐脂肪酸の含有量
は、より好ましくは１００ｍｇ／１００ｇ納豆以下であ
れば良く、上記の短鎖分岐脂肪酸の生産能が低下または
消失した納豆菌を用いて、あるいは発酵条件の改良や納
豆を物理的手段などによって処理することなどによって
製造することが可能となる。
納豆を生産する目的で短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ
吉草酸、２−メチル酪酸の少なくともひとつ）の生産能
が低下または消失した納豆菌を開発するには、図１に示
すような代謝経路に係わる酵素群の内の一つもしくはそ
れ以上の酵素の活性を失活させれば良いことが示された
ことになる。そして本発明に係る納豆菌を育種するに
は、遺伝子組み換えの手法によるだけでなく、通常行わ
れている変異手段によればよく、あるいは、自然界から
分離してもよい。これらの短鎖分岐脂肪酸の生産能が低
下または消失した納豆菌を用いて納豆を製造する方法以
外にも、通常の納豆菌を用いた納豆の製造における発酵
条件を種々工夫するなどして短鎖分岐脂肪酸の生産を抑
制したり、さらに通常の納豆の発酵が終了した後に、納
豆を吸引−吸着などの物理的手段などによって処理する
などの方法によっても、納豆中のムレ臭原因物質である
短鎖分岐脂肪酸の含有量を低下または消失させて、ムレ
臭が低下したまたはムレ臭がない納豆を製造することが
可能である。さらに、納豆中の短鎖分岐脂肪酸の含有量
は、より好ましくは１００ｍｇ／１００ｇ納豆以下であ
れば良く、上記の短鎖分岐脂肪酸の生産能が低下または
消失した納豆菌を用いて、あるいは発酵条件の改良や納
豆を物理的手段などによって処理することなどによって
製造することが可能となる。
【００２０】
【実施例】以下、本発明の実施例を示す。
【００２１】
【実施例１】使用菌株等 納豆菌Ｏ−２株は、市販納豆から常法により分離した納
豆菌である。納豆菌ｒ２２株はＯ−２株の形質転換能を
高めた変異株であり、後述の如く、Ｏ−２株をニトロソ
グアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することに
より取得した。大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ、枯草
菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫおよび大腸菌ベクターｐ
ＨＳＧ３９９は宝酒造株式会社より購入した。培地は、
納豆試験法（光琳）ｐ．８５−９７（１９９０）記載の
肉汁培地、胞子形成培地、ＮＰ再生培地等を用いた。た
だし、必要な場合は、テトラサイクリン（２μｇ／ｍ
ｌ）や短鎖分岐脂肪酸（イソ吉草酸、２−メチル酪酸、
イソ酪酸、各０．１ｍＭ）を添加した。
豆菌である。納豆菌ｒ２２株はＯ−２株の形質転換能を
高めた変異株であり、後述の如く、Ｏ−２株をニトロソ
グアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することに
より取得した。大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ、枯草
菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫおよび大腸菌ベクターｐ
ＨＳＧ３９９は宝酒造株式会社より購入した。培地は、
納豆試験法（光琳）ｐ．８５−９７（１９９０）記載の
肉汁培地、胞子形成培地、ＮＰ再生培地等を用いた。た
だし、必要な場合は、テトラサイクリン（２μｇ／ｍ
ｌ）や短鎖分岐脂肪酸（イソ吉草酸、２−メチル酪酸、
イソ酪酸、各０．１ｍＭ）を添加した。
【００２２】納豆菌ｒ２２株は、以下の方法で取得し
た。すなわち、市販納豆分離菌Ｏ−２株を、常法に準
じ、ＮＴＧ変異処理（ＮＴＧ濃度１６０μｇ／ｍｌ、３
０℃・１ｈｒ、生存率７．３％）した。その結果得られ
た変異処理菌（５×１０6個）を、Mol. Gen. Genet., V
ol.168, p.111(1979）に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓの方法に準じたプロトプラスト法により枯
草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫで形質転換した。この
場合、形質転換後のプロトプラストの再生培地はＮＰ再
生培地を用い、テトラサイクリン耐性を指標として数十
株の形質転換株を得た。これらの株は親株Ｏ−２株に比
較して形質転換能が向上していることが期待されたが、
これらの株にはベクターｐＨＹ３００ＰＬＫが導入され
ており、このことが形質転換に利用する際に障害となる
のでベクターｐＨＹ３００ＰＬＫを除去する必要があっ
た。
た。すなわち、市販納豆分離菌Ｏ−２株を、常法に準
じ、ＮＴＧ変異処理（ＮＴＧ濃度１６０μｇ／ｍｌ、３
０℃・１ｈｒ、生存率７．３％）した。その結果得られ
た変異処理菌（５×１０6個）を、Mol. Gen. Genet., V
ol.168, p.111(1979）に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓの方法に準じたプロトプラスト法により枯
草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫで形質転換した。この
場合、形質転換後のプロトプラストの再生培地はＮＰ再
生培地を用い、テトラサイクリン耐性を指標として数十
株の形質転換株を得た。これらの株は親株Ｏ−２株に比
較して形質転換能が向上していることが期待されたが、
これらの株にはベクターｐＨＹ３００ＰＬＫが導入され
ており、このことが形質転換に利用する際に障害となる
のでベクターｐＨＹ３００ＰＬＫを除去する必要があっ
た。
【００２３】ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの除去は、納
豆菌Ｏ−２株が胞子を形成する際にベクターｐＨＹ３０
０ＰＬＫが欠落しやすい性質を本発明実施の中で見出
し、利用することにした。そこで、これらの形質転換株
の内３０株を選択し、胞子形成培地で培養して胞子を形
成させた。その後、それぞれの形質転換株から得られた
胞子各１６個を培養後、ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの
保持の有無を調べた結果、３０株中の２１株についてベ
クターｐＨＹ３００ＰＬＫの除去に成功したことが確認
できた。
豆菌Ｏ−２株が胞子を形成する際にベクターｐＨＹ３０
０ＰＬＫが欠落しやすい性質を本発明実施の中で見出
し、利用することにした。そこで、これらの形質転換株
の内３０株を選択し、胞子形成培地で培養して胞子を形
成させた。その後、それぞれの形質転換株から得られた
胞子各１６個を培養後、ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫの
保持の有無を調べた結果、３０株中の２１株についてベ
クターｐＨＹ３００ＰＬＫの除去に成功したことが確認
できた。
【００２４】さらに得られた２１株のベクター除去株に
ついて、プロトプラストを作成し、ベクターｐＨＹ３０
０ＰＬＫで再度形質転換し、親株Ｏ−２よりも形質転換
能が向上しているかを比較し、１５株で形質転換能が向
上していることを確認した。さらに、これら１５株につ
いて常法による納豆製造試験を行い、発酵能や品質評価
を比較検討した結果、外観上納豆となったものを製造で
きる株は４株だけであった。さらにこれら４株中２株は
納豆の香りで硫黄臭などの不快臭の強い品質の悪いもの
しか製造できず、また１株は糸引きが極端に悪くなった
ものであった。残る１株（ｒ２２株と命名）のみが９名
のパネラーによる評価の結果、親株Ｏ−２株を用いて製
造した納豆よりは少し品質が劣るものの、納豆として許
容される範囲の品質のものを製造できた。
ついて、プロトプラストを作成し、ベクターｐＨＹ３０
０ＰＬＫで再度形質転換し、親株Ｏ−２よりも形質転換
能が向上しているかを比較し、１５株で形質転換能が向
上していることを確認した。さらに、これら１５株につ
いて常法による納豆製造試験を行い、発酵能や品質評価
を比較検討した結果、外観上納豆となったものを製造で
きる株は４株だけであった。さらにこれら４株中２株は
納豆の香りで硫黄臭などの不快臭の強い品質の悪いもの
しか製造できず、また１株は糸引きが極端に悪くなった
ものであった。残る１株（ｒ２２株と命名）のみが９名
のパネラーによる評価の結果、親株Ｏ−２株を用いて製
造した納豆よりは少し品質が劣るものの、納豆として許
容される範囲の品質のものを製造できた。
【００２５】ｒ２２株で製造した納豆を親株Ｏ−２株で
製造した納豆と比較した品質評価結果を表１に、またｒ
２２株の形質転換能を親株Ｏ−２株と比較した結果を表
２に示した。なお、表１において、評価点は、対照（Ｏ
−２株で製造）を３とした５段階評価の結果で示した。
但し、総合評価は、対照（Ｏ−２株で製造）を０とした
±５段階評価の結果で示した。
製造した納豆と比較した品質評価結果を表１に、またｒ
２２株の形質転換能を親株Ｏ−２株と比較した結果を表
２に示した。なお、表１において、評価点は、対照（Ｏ
−２株で製造）を３とした５段階評価の結果で示した。
但し、総合評価は、対照（Ｏ−２株で製造）を０とした
±５段階評価の結果で示した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】 ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損
株の分離 ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株は、ロイシンデ
ヒドロゲナーゼ遺伝子（ｙｑｉＴ）内部の約０．２４ｋ
ｂのＥｃｏＲＶ断片を以下の方法で脱落させることによ
り分離した。
株の分離 ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株は、ロイシンデ
ヒドロゲナーゼ遺伝子（ｙｑｉＴ）内部の約０．２４ｋ
ｂのＥｃｏＲＶ断片を以下の方法で脱落させることによ
り分離した。
【００２９】ｉ）ベクター構築（図２、図３） Jpn. J. Genet. Vol.61, p.515-528に記載された、ｐＨ
Ｙ３００ＰＬＫの塩基配列を基に、５′−ＡＡＡＡＧＡ
ＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧ−３′、およ
び、５′−ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡ
ＡＴＧＴＧＧＴ−３′の２種のオリゴＤＮＡを調製し、
ｐＨＹ３００ＰＬＫを鋳型に用い、常法どおりＰＣＲを
行い、ｐＨＹ３００ＰＬＫ上のテトラサイクリン耐性遺
伝子全長を増幅すると共に両末端に、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉの認識サイトを導入した。得られたＤＮＡ断片を制限
酵素ＥｃｏＲＩで切断後、プラスミドｐＨＳＧ３９９の
ＥｃｏＲＩサイトに導入し、プラスミドｐＨＳＧ３９９
Ｔを得た。（図３）
Ｙ３００ＰＬＫの塩基配列を基に、５′−ＡＡＡＡＧＡ
ＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧ−３′、およ
び、５′−ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡ
ＡＴＧＴＧＧＴ−３′の２種のオリゴＤＮＡを調製し、
ｐＨＹ３００ＰＬＫを鋳型に用い、常法どおりＰＣＲを
行い、ｐＨＹ３００ＰＬＫ上のテトラサイクリン耐性遺
伝子全長を増幅すると共に両末端に、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉの認識サイトを導入した。得られたＤＮＡ断片を制限
酵素ＥｃｏＲＩで切断後、プラスミドｐＨＳＧ３９９の
ＥｃｏＲＩサイトに導入し、プラスミドｐＨＳＧ３９９
Ｔを得た。（図３）
【００３０】アミノ酸配列のデータベースＳＷＩＳＳ−
ＰＬＯＴに登録されている（登録番号Ｐ５４５３１）Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのロイシンデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子の塩基配列を基に、５′−ＧＣＣＧＧＡ
ＴＣＣＡＴＧＧＡＡＣＴＴＴＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴ−
３′、および、５′−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＧ
ＴＣＴＧＣＴＴＡＡＴＡＣＡＣ−３′の２種のオリゴＤ
ＮＡを合成し、Ｏ−２株の全ＤＮＡを鋳型に、通常の条
件でＰＣＲを行い、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の
オープンリーディングフレーム全長（１０９５塩基）を
増幅すると共に、両端に制限酵素ＢａｍＨＩの認識サイ
トを導入した。得られた断片をｐＨＳＧ３９９のＢａｍ
ＨＩサイトに導入し、ｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴを得た。
（図２）
ＰＬＯＴに登録されている（登録番号Ｐ５４５３１）Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのロイシンデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子の塩基配列を基に、５′−ＧＣＣＧＧＡ
ＴＣＣＡＴＧＧＡＡＣＴＴＴＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴ−
３′、および、５′−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＧ
ＴＣＴＧＣＴＴＡＡＴＡＣＡＣ−３′の２種のオリゴＤ
ＮＡを合成し、Ｏ−２株の全ＤＮＡを鋳型に、通常の条
件でＰＣＲを行い、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の
オープンリーディングフレーム全長（１０９５塩基）を
増幅すると共に、両端に制限酵素ＢａｍＨＩの認識サイ
トを導入した。得られた断片をｐＨＳＧ３９９のＢａｍ
ＨＩサイトに導入し、ｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴを得た。
（図２）
【００３１】ｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＶで切断後、アガロース電気泳動した。２本生じるバ
ンドのうち、長いほうのバンド（約３．１ｋｂ）をアガ
ロースから回収し、セルフライゲーションし、大腸菌を
形質転換することによりｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴ上のロ
イシンデヒドロゲナーゼ遺伝子のほぼ中央部に存在する
約０．２４ｋｂのＥｃｏＲＶ断片を脱落させたプラスミ
ドｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶを得た。（図
２）
ＲＶで切断後、アガロース電気泳動した。２本生じるバ
ンドのうち、長いほうのバンド（約３．１ｋｂ）をアガ
ロースから回収し、セルフライゲーションし、大腸菌を
形質転換することによりｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴ上のロ
イシンデヒドロゲナーゼ遺伝子のほぼ中央部に存在する
約０．２４ｋｂのＥｃｏＲＶ断片を脱落させたプラスミ
ドｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶを得た。（図
２）
【００３２】ｐＨＳＧ３９９ｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶをＢ
ａｍＨＩで切断し、電気泳動後、約０．８６ｋｂの断片
を回収し（この断片は、中央部の０．２４ｋｂＥｃｏＲ
Ｖ断片が脱落したロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子）、
ｐＨＳＧ３９９ＴのＢａｍＨＩサイトに導入した。得ら
れたプラスミドはｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲ
Ｖと命名し、以下の実験に供した。（図３）
ａｍＨＩで切断し、電気泳動後、約０．８６ｋｂの断片
を回収し（この断片は、中央部の０．２４ｋｂＥｃｏＲ
Ｖ断片が脱落したロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子）、
ｐＨＳＧ３９９ＴのＢａｍＨＩサイトに導入した。得ら
れたプラスミドはｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲ
Ｖと命名し、以下の実験に供した。（図３）
【００３３】ii）形質転換（図４、図５） プラスミドｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶを大
腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳを宿主にして調製した。
本大腸菌はｒｅｃＡ+株であるので、ｐＨＳＧ３９９Ｔ
ｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶの２量体が得られる。得られた２
量体を用いて、納豆菌ｒ２２株を常法どおりプロトプラ
スト法により形質転換した。形質転換体の選択は、テト
ラサイクリン耐性を指標に行った。得られた形質転換体
では、染色体上のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子とｐ
ＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶ上のロイシンデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の間で１回又はそれ以上の回数の相
同組換えが起こり、ｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏ
ＲＶが染色体上のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子に組
み込まれている。
腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳを宿主にして調製した。
本大腸菌はｒｅｃＡ+株であるので、ｐＨＳＧ３９９Ｔ
ｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶの２量体が得られる。得られた２
量体を用いて、納豆菌ｒ２２株を常法どおりプロトプラ
スト法により形質転換した。形質転換体の選択は、テト
ラサイクリン耐性を指標に行った。得られた形質転換体
では、染色体上のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子とｐ
ＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏＲＶ上のロイシンデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の間で１回又はそれ以上の回数の相
同組換えが起こり、ｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏ
ＲＶが染色体上のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子に組
み込まれている。
【００３４】複数の形質転換株より全ＤＮＡを調製し、
ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の増幅に使用した合成
ＤＮＡを用いＰＣＲを行った。増幅された断片のパター
ンをアガロースゲル電気泳動により解析し、各形質転換
株で何回組換えが起こっているか確認した。そして、２
回組換えが起こっている株を選択し、ｙｑｉＴ７株と命
名した。（図５）
ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の増幅に使用した合成
ＤＮＡを用いＰＣＲを行った。増幅された断片のパター
ンをアガロースゲル電気泳動により解析し、各形質転換
株で何回組換えが起こっているか確認した。そして、２
回組換えが起こっている株を選択し、ｙｑｉＴ７株と命
名した。（図５）
【００３５】iii）形質導入（図５） 上記の形質転換に用いたｒ２２株よりも、親株であるＯ
−２株の方が、品質のよい納豆を生産する能力があるた
め、ｙｑｉＴ７上に挿入されたｐＨＳＧ３９９Ｔｙｑｉ
ＴΔＥｃｏＲＶをAppl. Environ. Microbiol., Vol.63,
p.4087-4089(1997）記載の、納豆菌ファージφＢＮ１
００を用いた形質導入法（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）
により、Ｏ−２株に導入した。得られた形質導入株をｙ
ｑｉＴｔ１株と命名した。
−２株の方が、品質のよい納豆を生産する能力があるた
め、ｙｑｉＴ７上に挿入されたｐＨＳＧ３９９Ｔｙｑｉ
ＴΔＥｃｏＲＶをAppl. Environ. Microbiol., Vol.63,
p.4087-4089(1997）記載の、納豆菌ファージφＢＮ１
００を用いた形質導入法（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）
により、Ｏ−２株に導入した。得られた形質導入株をｙ
ｑｉＴｔ１株と命名した。
【００３６】iv）脱落株の選択（図５） ｙｑｉＴｔ１株上のｐＨＳＧ３９９ＴｙｑｉＴΔＥｃｏ
ＲＶ挿入は、染色体上で相同組換えが起こると脱落す
る。そして、脱落した株では、結果として、ロイシンデ
ヒドロゲナーゼ遺伝子上の０．２４ｋｂＥｃｏＲＶ断片
が脱落し、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠損株が
取得できる。この相同組換えによる脱落株は、テトラサ
イクリンを含まない栄養培地上中で、約１０世代液体培
養する事により、約０．１％の確率で得られる。得られ
た株をＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｂ２（以
下、Ｂ２株）と命名し、以下の実験に供した。本菌株
は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６０５として、工業技術院生命
工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託し
た。
ＲＶ挿入は、染色体上で相同組換えが起こると脱落す
る。そして、脱落した株では、結果として、ロイシンデ
ヒドロゲナーゼ遺伝子上の０．２４ｋｂＥｃｏＲＶ断片
が脱落し、ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠損株が
取得できる。この相同組換えによる脱落株は、テトラサ
イクリンを含まない栄養培地上中で、約１０世代液体培
養する事により、約０．１％の確率で得られる。得られ
た株をＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｂ２（以
下、Ｂ２株）と命名し、以下の実験に供した。本菌株
は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６０５として、工業技術院生命
工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託し
た。
【００３７】ｖ）ロイシンデヒドロゲナーゼの酵素活性 納豆菌Ｏ−２株およびＢ２株を１００ｍｌの肉汁培地
（各０．１ｍＭのイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪
酸を含む）入りの坂口フラスコ中で３７℃、振とう培養
した。定常期初期（ＯＤ６６０が約１）まで菌が生育し
た時点で、集菌し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２、０．００２％β−メルカプトエタノールを含む）に
懸濁後、フレンチプレスにて、菌体を破砕した。菌体破
砕液を３．５ｋｒｐｍ、１５分遠心分離し、上清を粗酵
素液として用いた。
（各０．１ｍＭのイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪
酸を含む）入りの坂口フラスコ中で３７℃、振とう培養
した。定常期初期（ＯＤ６６０が約１）まで菌が生育し
た時点で、集菌し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２、０．００２％β−メルカプトエタノールを含む）に
懸濁後、フレンチプレスにて、菌体を破砕した。菌体破
砕液を３．５ｋｒｐｍ、１５分遠心分離し、上清を粗酵
素液として用いた。
【００３８】酵素活性は、J. Ferment. Bioeng., Vol.6
9, p.199-203(1990)に記載の方法に従って測定した。表
３に結果を示す。
9, p.199-203(1990)に記載の方法に従って測定した。表
３に結果を示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】Ｏ−２株では、活性が検出されたのに対
し、Ｂ２株では、活性が検出されず、Ｂ２株がロイシン
デヒドロゲナーゼ失活株となっている事が確認された。
し、Ｂ２株では、活性が検出されず、Ｂ２株がロイシン
デヒドロゲナーゼ失活株となっている事が確認された。
【００４１】vi）短鎖分岐脂肪酸要求性の確認 ロイシンデヒドロゲナーゼが失活すると、分岐アミノ酸
（ロイシン、イソロイシン、バリン）から、分岐脂肪酸
の合成ができなくなるため、最少培地上での生育に短鎖
分岐脂肪酸を要求するようになる（J. Biol. Chem., Vo
l.246, 5264-5272(1971))。
（ロイシン、イソロイシン、バリン）から、分岐脂肪酸
の合成ができなくなるため、最少培地上での生育に短鎖
分岐脂肪酸を要求するようになる（J. Biol. Chem., Vo
l.246, 5264-5272(1971))。
【００４２】Ｏ−２株およびＢ２株について、短鎖分岐
脂肪酸を生育に要求するかどうかを、短鎖分岐脂肪酸
（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸、各０．１ｍ
Ｍ）を含む最少培地および含まない最少培地上で確認し
た。尚、Ｏ−２株は、グルタミン酸を生育に要求するた
め、最少培地には１０ｍｇ／ｌのグルタミン酸ナトリウ
ムを添加した。Ｏ−２株は短鎖分岐脂肪酸の有無に関係
なく生育したのに対し、Ｂ２株は、イソ酪酸、イソ吉草
酸、２−メチル酪酸の３種の短鎖分岐脂肪酸のうち、い
ずれか１つ以上を添加した培地でのみ生育した。本結果
により、Ｂ２株が、短鎖分岐脂肪酸合成能を失った短鎖
分岐脂肪酸要求株であることが確認された。
脂肪酸を生育に要求するかどうかを、短鎖分岐脂肪酸
（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸、各０．１ｍ
Ｍ）を含む最少培地および含まない最少培地上で確認し
た。尚、Ｏ−２株は、グルタミン酸を生育に要求するた
め、最少培地には１０ｍｇ／ｌのグルタミン酸ナトリウ
ムを添加した。Ｏ−２株は短鎖分岐脂肪酸の有無に関係
なく生育したのに対し、Ｂ２株は、イソ酪酸、イソ吉草
酸、２−メチル酪酸の３種の短鎖分岐脂肪酸のうち、い
ずれか１つ以上を添加した培地でのみ生育した。本結果
により、Ｂ２株が、短鎖分岐脂肪酸合成能を失った短鎖
分岐脂肪酸要求株であることが確認された。
【００４３】vii）納豆製造（官能検査、短鎖分岐脂肪
酸分析） Ｂ２株を用い、常法に従って納豆を製造し、納豆中の短
鎖分岐脂肪酸含量の測定を以下のごとく行った。対照と
しては、市販の宮城野納豆菌を用いた。
酸分析） Ｂ２株を用い、常法に従って納豆を製造し、納豆中の短
鎖分岐脂肪酸含量の測定を以下のごとく行った。対照と
しては、市販の宮城野納豆菌を用いた。
【００４４】試作した納豆検体約２０ｇをブレンダーで
粉砕した。粉砕した納豆約２ｇに４倍量の蒸留水を加
え、納豆を良く分散させた後、４℃で、約２時間放置
し、短鎖分岐脂肪酸を溶出させた。１．５ｍｌのテスト
チューブに移し、４℃で、１５０００ｒｐｍ、１０分遠
心し、上清を回収した。得られた上清液を０．２０μｍ
のセルロースアセテートフィルターで濾過し、ＨＰＬＣ
による短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メ
チル酪酸）の分析に供した。なお、イソ吉草酸と２−メ
チル酪酸は、ピークが重なるため、両物質の総和をイソ
吉草酸として計算した。結果を表４に記す。
粉砕した。粉砕した納豆約２ｇに４倍量の蒸留水を加
え、納豆を良く分散させた後、４℃で、約２時間放置
し、短鎖分岐脂肪酸を溶出させた。１．５ｍｌのテスト
チューブに移し、４℃で、１５０００ｒｐｍ、１０分遠
心し、上清を回収した。得られた上清液を０．２０μｍ
のセルロースアセテートフィルターで濾過し、ＨＰＬＣ
による短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メ
チル酪酸）の分析に供した。なお、イソ吉草酸と２−メ
チル酪酸は、ピークが重なるため、両物質の総和をイソ
吉草酸として計算した。結果を表４に記す。
【００４５】
【表４】
【００４６】Ｂ２株を用いて製造した納豆には、短鎖分
岐脂肪酸はほとんど含まれていなかった。Ｂ２株を用い
て製造した納豆の品質は、専門のパネラーによる官能検
査の結果、外観、糸引きの強さ、味、ともに、宮城野納
豆菌を用いて作成した対照と同等のものであった。香り
に関しては、独特のムレ臭が抑えられていた。
岐脂肪酸はほとんど含まれていなかった。Ｂ２株を用い
て製造した納豆の品質は、専門のパネラーによる官能検
査の結果、外観、糸引きの強さ、味、ともに、宮城野納
豆菌を用いて作成した対照と同等のものであった。香り
に関しては、独特のムレ臭が抑えられていた。
【００４７】
【実施例２】使用菌株等 納豆菌Ｏ−２株は、ｒ２２株、大腸菌ＢＭＨ７１−１８
ｍｕｔＳ、枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ、大腸菌
ベクターｐＨＳＧ３９９及び培地などは実施例１と同様
に実施した。
ｍｕｔＳ、枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ、大腸菌
ベクターｐＨＳＧ３９９及び培地などは実施例１と同様
に実施した。
【００４８】 分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子欠
損株の分離 分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株は、分岐ケト
酸デヒドロゲナーゼオペロン上のＥ２サブユニット遺伝
子（ｏｄｂ２）内部の約０．５３ｋｂのＣｆｒ１０Ｉ断
片を以下の方法で脱落させることにより分離した。
損株の分離 分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株は、分岐ケト
酸デヒドロゲナーゼオペロン上のＥ２サブユニット遺伝
子（ｏｄｂ２）内部の約０．５３ｋｂのＣｆｒ１０Ｉ断
片を以下の方法で脱落させることにより分離した。
【００４９】ｉ）ベクター構築（図６） Eur. J. Biochem., Vol.213, p.1091-1099(1993)に報告
されているＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの分岐
ケト酸デヒドロゲナーゼオペロン上のＥ２サブユニット
遺伝子（ｏｄｂ２）の塩基配列を基に、５′−ＧＣＣＧ
ＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＡＣ
−３′、および、５′−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴ
ＡＡＡＣＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＴ−３′の２種のオリゴ
ＤＮＡを合成し、Ｏ−２株の全ＤＮＡを鋳型に、通常の
条件でＰＣＲを行い、分岐ケト酸デヒドロゲナーゼのＥ
２サブユニットのオープンリーディングフレーム全長
（１２７５塩基）を増幅すると共に、両端に制限酵素Ｂ
ａｍＨＩの認識サイトを導入した。得られた断片をｐＨ
ＳＧ３９９のＢａｍＨＩサイトに導入し、ｐＨＳＧ３９
９ｏｄｂ２を得た。
されているＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの分岐
ケト酸デヒドロゲナーゼオペロン上のＥ２サブユニット
遺伝子（ｏｄｂ２）の塩基配列を基に、５′−ＧＣＣＧ
ＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＡＣ
−３′、および、５′−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴ
ＡＡＡＣＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＴ−３′の２種のオリゴ
ＤＮＡを合成し、Ｏ−２株の全ＤＮＡを鋳型に、通常の
条件でＰＣＲを行い、分岐ケト酸デヒドロゲナーゼのＥ
２サブユニットのオープンリーディングフレーム全長
（１２７５塩基）を増幅すると共に、両端に制限酵素Ｂ
ａｍＨＩの認識サイトを導入した。得られた断片をｐＨ
ＳＧ３９９のＢａｍＨＩサイトに導入し、ｐＨＳＧ３９
９ｏｄｂ２を得た。
【００５０】ｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２を制限酵素Ｃｆｒ
１０Ｉで切断後、アガロース電気泳動した。２本生じる
バンドのうち、長いほうのバンド（約３．０ｋｂ）をア
ガロースから回収し、セルフライゲーションし、大腸菌
を形質転換することによりｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２上の
Ｅ２サブユニット遺伝子のほぼ中央部に存在する約０．
５３ｋｂのＣｆｒ１０Ｉ断片を脱落させたプラスミドｐ
ＨＳＧ３９９ｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉを得た。
１０Ｉで切断後、アガロース電気泳動した。２本生じる
バンドのうち、長いほうのバンド（約３．０ｋｂ）をア
ガロースから回収し、セルフライゲーションし、大腸菌
を形質転換することによりｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２上の
Ｅ２サブユニット遺伝子のほぼ中央部に存在する約０．
５３ｋｂのＣｆｒ１０Ｉ断片を脱落させたプラスミドｐ
ＨＳＧ３９９ｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉを得た。
【００５１】ｐＨＳＧ３９９ｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉを
ＢａｍＨＩで切断し、電気泳動後、約０．７４ｋｂの断
片を回収し（この断片は、中央部の０．５３ｋｂのＣｆ
ｒ１０Ｉ断片が脱落したＥ２サブユニット遺伝子）、ｐ
ＨＳＧ３９９ＴのＢａｍＨＩサイトに導入した。得られ
たプラスミドはｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０
Ｉと命名し、以下の実験に供した。（図７）
ＢａｍＨＩで切断し、電気泳動後、約０．７４ｋｂの断
片を回収し（この断片は、中央部の０．５３ｋｂのＣｆ
ｒ１０Ｉ断片が脱落したＥ２サブユニット遺伝子）、ｐ
ＨＳＧ３９９ＴのＢａｍＨＩサイトに導入した。得られ
たプラスミドはｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０
Ｉと命名し、以下の実験に供した。（図７）
【００５２】ii）形質転換（図８） プラスミドｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉを
大腸菌ＪＭ１０９を宿主にして調製した。得られたプラ
スミドを用いて、納豆菌ｒ２２株を常法どおりプロトプ
ラスト法により形質転換した。形質転換体の選択は、テ
トラサイクリン耐性を指標に行った。得られた形質転換
体では、染色体上のＥ２サブユニット遺伝子とｐＨＳＧ
３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉ上のＥ２サブユニット
遺伝子の間で１回相同組換えが起こり、ｐＨＳＧ３９９
Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉが染色体上のＥ２サブユニッ
ト遺伝子に組み込まれている。
大腸菌ＪＭ１０９を宿主にして調製した。得られたプラ
スミドを用いて、納豆菌ｒ２２株を常法どおりプロトプ
ラスト法により形質転換した。形質転換体の選択は、テ
トラサイクリン耐性を指標に行った。得られた形質転換
体では、染色体上のＥ２サブユニット遺伝子とｐＨＳＧ
３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉ上のＥ２サブユニット
遺伝子の間で１回相同組換えが起こり、ｐＨＳＧ３９９
Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０Ｉが染色体上のＥ２サブユニッ
ト遺伝子に組み込まれている。
【００５３】複数の形質転換株より全ＤＮＡを調製し、
Ｅ２サブユニット遺伝子の増幅に使用した合成ＤＮＡお
よび、市販のＭ１３用プライマーＭ４、ＲＶを用いＰＣ
Ｒを行った。増幅された断片のパターンをアガロースゲ
ル電気泳動により解析することにより、Ｅ２サブユニッ
ト遺伝子上のＣｆｒ１０Ｉサイトの上流（５′末端側）
で組換えが起こっているのか、下流（３′末端側）で組
換えが起こっているのか確認した。Ｅ２サブユニット遺
伝子のＣｆｒ１０Ｉサイトの下流で組換えが起こってい
る株１株を選択し、ｏｄｂ２−１株と命名した。
Ｅ２サブユニット遺伝子の増幅に使用した合成ＤＮＡお
よび、市販のＭ１３用プライマーＭ４、ＲＶを用いＰＣ
Ｒを行った。増幅された断片のパターンをアガロースゲ
ル電気泳動により解析することにより、Ｅ２サブユニッ
ト遺伝子上のＣｆｒ１０Ｉサイトの上流（５′末端側）
で組換えが起こっているのか、下流（３′末端側）で組
換えが起こっているのか確認した。Ｅ２サブユニット遺
伝子のＣｆｒ１０Ｉサイトの下流で組換えが起こってい
る株１株を選択し、ｏｄｂ２−１株と命名した。
【００５４】iii）形質導入（図８） 上記の形質転換に用いたｒ２２株より、親株であるＯ−
２株の方が、品質のよい納豆を生産する能力があるた
め、ｏｄｂ２−１株の遺伝子上に挿入されたｐＨＳＧ３
９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０ＩをAppl. Environ. Micro
biol., Vol.63, p.4087-4089(1997）記載の納豆菌ファ
ージφＢＮ１００を用いた形質導入法（ｔｒａｎｓｄｕ
ｃｔｉｏｎ）により、Ｏ−２株に導入した。得られた形
質導入株をｏｄｂ２ｔ１株と命名した。
２株の方が、品質のよい納豆を生産する能力があるた
め、ｏｄｂ２−１株の遺伝子上に挿入されたｐＨＳＧ３
９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ１０ＩをAppl. Environ. Micro
biol., Vol.63, p.4087-4089(1997）記載の納豆菌ファ
ージφＢＮ１００を用いた形質導入法（ｔｒａｎｓｄｕ
ｃｔｉｏｎ）により、Ｏ−２株に導入した。得られた形
質導入株をｏｄｂ２ｔ１株と命名した。
【００５５】iv）脱落株の選択（図８） ｏｄｂ２ｔ１株上のｐＨＳＧ３９９Ｔｏｄｂ２ΔＣｆｒ
１０Ｉ挿入は、染色体上で重複しているＥ２サブユニッ
ト遺伝子の５′末端からＣｆｒ１０Ｉサイトの間で相同
組換えが起こると脱落する。そして、脱落した株では、
結果として、Ｅ２サブユニット遺伝子上の０．５３ｋｂ
のＣｆｒ１０Ｉ断片が脱落し、Ｅ２サブユニット遺伝子
の欠損株が取得できる。相同組換えによる脱落株は、テ
トラサイクリンを含まない栄養培地上中で、約１０世代
液体培養する事により、約０．１％の確率で得られる。
得られた株をＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｂ
５（以下、Ｂ５株）と命名し、以下の実験に供した。本
菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６０６として、工業技術院
生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託
した。
１０Ｉ挿入は、染色体上で重複しているＥ２サブユニッ
ト遺伝子の５′末端からＣｆｒ１０Ｉサイトの間で相同
組換えが起こると脱落する。そして、脱落した株では、
結果として、Ｅ２サブユニット遺伝子上の０．５３ｋｂ
のＣｆｒ１０Ｉ断片が脱落し、Ｅ２サブユニット遺伝子
の欠損株が取得できる。相同組換えによる脱落株は、テ
トラサイクリンを含まない栄養培地上中で、約１０世代
液体培養する事により、約０．１％の確率で得られる。
得られた株をＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｂ
５（以下、Ｂ５株）と命名し、以下の実験に供した。本
菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６０６として、工業技術院
生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託
した。
【００５６】ｖ）短鎖分岐脂肪酸要求性の確認 分岐ケト酸デヒドロゲナーゼが失損すると、分岐アミノ
酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）から、分岐脂肪
酸の合成ができなくなるため、最少培地上での生育に短
鎖分岐脂肪酸を要求するようになる（J. Biol. Chem.,
Vol.246, p.5264-5272(1971))。Ｏ−２株およびＢ５株
について、短鎖分岐脂肪酸を生育に要求するかどうか
を、短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチ
ル酪酸、各０．１ｍＭ）を含む最少培地および含まない
最少培地上で確認した。尚、Ｏ−２株は、グルタミン酸
を生育に要求するため、最少培地には１０ｍｇ／ｌのグ
ルタミン酸ナトリウムを添加した。
酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）から、分岐脂肪
酸の合成ができなくなるため、最少培地上での生育に短
鎖分岐脂肪酸を要求するようになる（J. Biol. Chem.,
Vol.246, p.5264-5272(1971))。Ｏ−２株およびＢ５株
について、短鎖分岐脂肪酸を生育に要求するかどうか
を、短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチ
ル酪酸、各０．１ｍＭ）を含む最少培地および含まない
最少培地上で確認した。尚、Ｏ−２株は、グルタミン酸
を生育に要求するため、最少培地には１０ｍｇ／ｌのグ
ルタミン酸ナトリウムを添加した。
【００５７】Ｏ−２株は、短鎖分岐脂肪酸の有無に関係
なく生育したのに対し、Ｂ５株は、イソ酪酸、イソ吉草
酸、２−メチル酪酸の３種の短鎖分岐脂肪酸のうち、い
ずれか１つ以上を添加した培地でのみ生育した。本結果
によりＢ５株が、短鎖分岐脂肪酸合成能を失った短鎖分
岐脂肪酸要求株であることが確認された。
なく生育したのに対し、Ｂ５株は、イソ酪酸、イソ吉草
酸、２−メチル酪酸の３種の短鎖分岐脂肪酸のうち、い
ずれか１つ以上を添加した培地でのみ生育した。本結果
によりＢ５株が、短鎖分岐脂肪酸合成能を失った短鎖分
岐脂肪酸要求株であることが確認された。
【００５８】vi）納豆製造（官能検査、短鎖分岐脂肪酸
分析） Ｂ５株を用い、常法に従って納豆を製造し、納豆中の短
鎖分岐脂肪酸含量の測定を以下のごとく行った。対照と
しては、市販の宮城野納豆菌を用いた。
分析） Ｂ５株を用い、常法に従って納豆を製造し、納豆中の短
鎖分岐脂肪酸含量の測定を以下のごとく行った。対照と
しては、市販の宮城野納豆菌を用いた。
【００５９】試作した納豆検体約２０ｇをブレンダーで
粉砕した。粉砕した納豆約２ｇに４倍量の蒸留水を加
え、納豆を良く分散させた後、４℃で、約２時間放置
し、短鎖分岐脂肪酸を溶出させた。１．５ｍｌのテスト
チューブに移し、４℃で、１５０００ｒｐｍ、１０分遠
心し、上清を回収した。得られた上清液を０．２０μｍ
のセルロースアセテートフィルターで濾過し、ＨＰＬＣ
による短鎖分岐脂肪酸（イソ吉草酸、２−メチル酪酸、
イソ酪酸）の分析に供した。
粉砕した。粉砕した納豆約２ｇに４倍量の蒸留水を加
え、納豆を良く分散させた後、４℃で、約２時間放置
し、短鎖分岐脂肪酸を溶出させた。１．５ｍｌのテスト
チューブに移し、４℃で、１５０００ｒｐｍ、１０分遠
心し、上清を回収した。得られた上清液を０．２０μｍ
のセルロースアセテートフィルターで濾過し、ＨＰＬＣ
による短鎖分岐脂肪酸（イソ吉草酸、２−メチル酪酸、
イソ酪酸）の分析に供した。
【００６０】なお、イソ吉草酸と２−メチル酪酸は、ピ
ークが重なるため、両物質の総和をイソ吉草酸をスタン
ダードとして計算した。結果を表５に記す。
ークが重なるため、両物質の総和をイソ吉草酸をスタン
ダードとして計算した。結果を表５に記す。
【００６１】
【表５】
【００６２】Ｂ５株を用いて製造した納豆には、短鎖分
岐脂肪酸はほとんど含まれていなかった。Ｂ５株を用い
て作製した納豆の品質は、専門のパネラーによる官能検
査の結果、外観、糸引きの強さ、味、ともに、宮城野納
豆菌を用いて作成した対照と同等のものであった。香り
に関しては、独特のムレ臭が抑えられていた。
岐脂肪酸はほとんど含まれていなかった。Ｂ５株を用い
て作製した納豆の品質は、専門のパネラーによる官能検
査の結果、外観、糸引きの強さ、味、ともに、宮城野納
豆菌を用いて作成した対照と同等のものであった。香り
に関しては、独特のムレ臭が抑えられていた。
【００６３】
【発明の効果】本発明により、納豆の不快臭のひとつで
あるムレ臭の原因物質である短鎖分岐脂肪酸の生産量の
非常に低い納豆菌を育種開発する方法が提供され、その
方法により開発された短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌を用
いて納豆を生産することにより短鎖分岐脂肪酸含量が非
常に低くムレ臭の著しく少ない納豆が製造可能となる。
あるムレ臭の原因物質である短鎖分岐脂肪酸の生産量の
非常に低い納豆菌を育種開発する方法が提供され、その
方法により開発された短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌を用
いて納豆を生産することにより短鎖分岐脂肪酸含量が非
常に低くムレ臭の著しく少ない納豆が製造可能となる。
【図１】納豆菌における短鎖分岐脂肪酸の合成経路を示
す。
す。
【図２】ロイシンデヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為
のベクター構築過程の概略（１）を示す。
のベクター構築過程の概略（１）を示す。
【図３】ロイシンデヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為
のベクター構築過程の概略（２）を示す。
のベクター構築過程の概略（２）を示す。
【図４】ロイシンデヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為
の脱落株の構築過程の概略（１）を示す。
の脱落株の構築過程の概略（１）を示す。
【図５】ロイシンデヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の為
の脱落株の構築過程の概略（２）を示す。
の脱落株の構築過程の概略（２）を示す。
【図６】分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の
為のベクター構築過程の概略（１）を示す。
為のベクター構築過程の概略（１）を示す。
【図７】分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の
為のベクター構築過程の概略（２）を示す。
為のベクター構築過程の概略（２）を示す。
【図８】分岐ケト酸デヒドロゲナーゼ欠損変異株取得の
為の脱落株構築過程の概略を示す。
為の脱落株構築過程の概略を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年４月１９日（１９９９．４．１
９）
９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【提出日】平成１２年２月１４日（２０００．２．１
４）
４）
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、納豆の不快臭のひ
とつであるムレ臭の低下ないし消失システムに関するも
のである。特に本発明は、納豆のムレ臭の原因物質が短
鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪
酸）であることをはじめて見出しただけでなく、その生
成メカニズムをはじめて解明してそれに関与する酵素に
着目し、該酵素活性を遺伝子操作などによって低下ない
し失活せしめることによりムレ臭の低下ないし消失を確
認し、これらの新規知見に基きはじめて完成されたもの
である。
とつであるムレ臭の低下ないし消失システムに関するも
のである。特に本発明は、納豆のムレ臭の原因物質が短
鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪
酸）であることをはじめて見出しただけでなく、その生
成メカニズムをはじめて解明してそれに関与する酵素に
着目し、該酵素活性を遺伝子操作などによって低下ない
し失活せしめることによりムレ臭の低下ないし消失を確
認し、これらの新規知見に基きはじめて完成されたもの
である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】すなわち、本発明は、納豆のムレ臭原因物
質である短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−
メチル酪酸）の生産能が低下または消失した納豆菌とそ
の開発方法ならびにその菌を用いたムレ臭低下納豆の生
産に関する。さらに詳しくは、短鎖分岐脂肪酸（short
branched chain fatty acids）生産酵素遺伝子であるロ
イシンデヒドロゲナーゼ（leucine dehydrogenase, EC
1.4.1.9）遺伝子および／または分岐ケト酸デヒドロゲ
ナーゼ（branched chain α−keto acid dehydrogenas
e, EC 1.2.1.25）遺伝子の機能を低下または欠損させ、
それらの酵素活性を低下または失活させることによる短
鎖分岐脂肪酸生産能を低下または消失させたムレ臭低下
納豆菌の開発方法とその菌ならびにその菌を用いて生産
されたムレ臭が低下したまたはムレ臭がない納豆の生産
に関する。
質である短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ吉草酸、２−
メチル酪酸）の生産能が低下または消失した納豆菌とそ
の開発方法ならびにその菌を用いたムレ臭低下納豆の生
産に関する。さらに詳しくは、短鎖分岐脂肪酸（short
branched chain fatty acids）生産酵素遺伝子であるロ
イシンデヒドロゲナーゼ（leucine dehydrogenase, EC
1.4.1.9）遺伝子および／または分岐ケト酸デヒドロゲ
ナーゼ（branched chain α−keto acid dehydrogenas
e, EC 1.2.1.25）遺伝子の機能を低下または欠損させ、
それらの酵素活性を低下または失活させることによる短
鎖分岐脂肪酸生産能を低下または消失させたムレ臭低下
納豆菌の開発方法とその菌ならびにその菌を用いて生産
されたムレ臭が低下したまたはムレ臭がない納豆の生産
に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】その結果、ムレ臭の原因物質が短鎖分岐脂
肪酸、すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸
であることをつきとめることができ、同時に上記仮説の
正しいことが確認された。そして、納豆菌においてロイ
シンデヒドロゲナーゼおよび／または分岐ケト酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子の機能を低下または欠損する手法も確
立して、ムレ臭の生産能が低下または消失した納豆菌と
いう従来未知の新規納豆菌を創製するのにはじめて成功
し、そして更に、このようにして開発した新規納豆菌を
用いることにより、ムレ臭の低下ないし消失した納豆と
いう新規食品の製造が可能であることも確認し、遂に本
発明の完成に至ったものである。
肪酸、すなわちイソ酪酸、イソ吉草酸、２−メチル酪酸
であることをつきとめることができ、同時に上記仮説の
正しいことが確認された。そして、納豆菌においてロイ
シンデヒドロゲナーゼおよび／または分岐ケト酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子の機能を低下または欠損する手法も確
立して、ムレ臭の生産能が低下または消失した納豆菌と
いう従来未知の新規納豆菌を創製するのにはじめて成功
し、そして更に、このようにして開発した新規納豆菌を
用いることにより、ムレ臭の低下ないし消失した納豆と
いう新規食品の製造が可能であることも確認し、遂に本
発明の完成に至ったものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】したがって、ムレ臭が低下ないし消失した
納豆を生産する目的で短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ
吉草酸、２−メチル酪酸の少なくともひとつ）の生産能
が低下または消失した納豆菌を開発するには、図１に示
すような代謝経路に係わる酵素群の内の一つもしくはそ
れ以上の酵素の活性を失活させれば良いことが示された
ことになる。そして本発明に係る納豆菌を育種するに
は、遺伝子組み換えの手法によるだけでなく、通常行わ
れている変異手段によればよく、あるいは、自然界から
分離してもよい。これらの短鎖分岐脂肪酸の生産能が低
下または消失した納豆菌を用いて納豆を製造する方法以
外にも、通常の納豆菌を用いた納豆の製造における発酵
条件を種々工夫するなどして短鎖分岐脂肪酸の生産を抑
制したり、さらに通常の納豆の発酵が終了した後に、納
豆を吸引−吸着などの物理的手段などによって処理する
などの方法によっても、納豆中のムレ臭原因物質である
短鎖分岐脂肪酸の含有量を低下または消失させて、ムレ
臭が低下したまたはムレ臭がない納豆を製造することが
可能である。
納豆を生産する目的で短鎖分岐脂肪酸（イソ酪酸、イソ
吉草酸、２−メチル酪酸の少なくともひとつ）の生産能
が低下または消失した納豆菌を開発するには、図１に示
すような代謝経路に係わる酵素群の内の一つもしくはそ
れ以上の酵素の活性を失活させれば良いことが示された
ことになる。そして本発明に係る納豆菌を育種するに
は、遺伝子組み換えの手法によるだけでなく、通常行わ
れている変異手段によればよく、あるいは、自然界から
分離してもよい。これらの短鎖分岐脂肪酸の生産能が低
下または消失した納豆菌を用いて納豆を製造する方法以
外にも、通常の納豆菌を用いた納豆の製造における発酵
条件を種々工夫するなどして短鎖分岐脂肪酸の生産を抑
制したり、さらに通常の納豆の発酵が終了した後に、納
豆を吸引−吸着などの物理的手段などによって処理する
などの方法によっても、納豆中のムレ臭原因物質である
短鎖分岐脂肪酸の含有量を低下または消失させて、ムレ
臭が低下したまたはムレ臭がない納豆を製造することが
可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｆターム(参考） 4B020 LB14 LC01 LP18 LY04 4B024 AA05 BA77 CA03 DA07 EA04 GA11 HA01 4B065 AA19X AA19Y AB01 AC20 BA02 CA42
Claims (8)
- 【請求項１】 ムレ臭が低下したまたはムレ臭のない納
豆を生産する納豆菌。 - 【請求項２】 短鎖分岐脂肪酸非生産納豆菌。
- 【請求項３】 ロイシンデヒドロゲナーゼおよび／また
は分岐ケト酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を低下ないし
失活せしめたことを特徴とする請求項１または２に記載
の納豆菌。 - 【請求項４】 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
Ｂ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６０５）またはＢａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｂ５（ＦＥＲＭＢＰ−６６０
６）。 - 【請求項５】 ロイシンデヒドロゲナーゼおよび／また
は分岐ケト酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を低下ないし
失活せしめることを特徴とする請求項１〜４のいずれか
１項に記載の納豆菌の育種方法。 - 【請求項６】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の納
豆菌を用いて生産された納豆。 - 【請求項７】 ムレ臭が低下したまたはムレ臭がないこ
とを特徴とする納豆。 - 【請求項８】 短鎖分岐脂肪酸の含有量が１００ｍｇ／
１００ｇ納豆以下であることを特徴とする請求項７に記
載の納豆。
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