JP2000139250A - 植物の世代短縮方法および植物体 - Google Patents

植物の世代短縮方法および植物体

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JP2000139250A
JP2000139250A JP10320219A JP32021998A JP2000139250A JP 2000139250 A JP2000139250 A JP 2000139250A JP 10320219 A JP10320219 A JP 10320219A JP 32021998 A JP32021998 A JP 32021998A JP 2000139250 A JP2000139250 A JP 2000139250A
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plant
gene
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shortening
generation
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Takashi Araki
崇 荒木
Takashi Kobayashi
恭士 小林
Kenichi Ogawa
健一 小川
Makoto Shirai
真 白井
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物の1世代を短縮すること。 【解決手段】 日長の制御を受ける遺伝子よりも下流で
機能する制御遺伝子を利用することにより植物の幼若期
間を短縮し花期を早め、種子の取得を早める。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は植物の幼若期を短縮
し、日長に関係なく花期を早める遺伝子の機能を利用し
た植物の世代短縮方法およびその方法で得られた植物体
に関するものである。
【0002】
【従来の技術】世代を短縮することを特徴とする技術は
これまでのところ開発されていないため、植物の育種改
良や遺伝子組換え体開発にはかなりの時間がかかった。
【0003】強制発現によって植物の花成時期を早めら
れる遺伝子が発表されている[Weigelら、Nature 377 49
5-500(1995)、][Simonら、Nature 384 59-62(1996)]
が、日長や温度等に影響されることから日長や温度等の
コントロールが必要となる。この場合植物によって異な
った花成の制御が必要になる。最近さらに短日植物シロ
イヌナズナにおいて遅咲き変異株の解析の結果新たな花
成制御遺伝子(FT遺伝子)が見出された(荒木ら1998
年度日本生理学会年会要旨集;荒木ら、1998年国際
アラビドプシスミーティング要旨集)が日長による制御
を直接受けるかどうかは明らかではなかった。
【0004】また遺伝子組換えによる遺伝子の強制発現
の場合、サイレンシングと呼ばれる現象が問題になるこ
とも多く、花期が早められたからと言っても何世代にも
渡って正常に形質が継代されることは難しかった。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、植物の遺伝子機能の解析や育種改良、日長
・温度等に関係なく遺伝子組換え作物の作出にかかる時
間を短縮することおよび花成を早めることまたは促すこ
と、何世代にも渡って形質を安定に継代させることであ
る。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明では、上記課題を
解決するために、まず日長の制御を直接受ける遺伝子よ
りも下流で制御される遺伝子を検索し、利用することに
よって日長に関係なく花期を早めることで日長に関係な
く発芽から種子取得までの期間を大幅に短縮することに
成功した。
【0007】すなわち本発明は、日長に関係なく植物の
花期を早める機能を有する遺伝子を用いて花期を早める
または花成を促すことを特徴とする植物の世代短縮方法
およびこの方法で得られる植物体に関する。
【0008】
【発明の実施の形態】本発明者らは鋭意検討を行った結
果、荒木らの発見した花成遺伝子(FT遺伝子)が日長の
影響を直接受ける遺伝子群よりも下流で制御を受けるこ
とを発見し、その遺伝子を強制的に発現することで日長
によらず花成が早められることを発見した。花の形等に
影響を及ぼすような花成遺伝子LFY遺伝子等とはことな
り、FT遺伝子を強制発現した植物は極端な早咲きにな
り、植物体は極端に小さくなるが花の形は野生型と比較
してもほぼ正常で種子形成にも殆ど影響が出ない。組換
え体植物の形質も安定で少なくとも4世代の種子をとる
ことが可能である。
【0009】以下、さらに詳細に本発明を説明する。本
発明で用いられる遺伝子工学的技術は、たとえば、J.,S
ambrook, E.,F.,Frisch,T.,Maniatis 著、モレキュラー
クローニング第 2版(Molecular Cloning 2nd edition
)、コールド スプリングハーバー ラボラトリー発
行(Cold Spring Harbor Laboratory press )、1989年
及び D.,M.,Glover 著、DNA クローニング(DNA Clonin
g )、IRL 発行、1985年などに記載されている通常の方
法である。
【0010】本発明を実施するに当たり本発明における
日長に関係なく植物の花期を早める機能を有する遺伝子
(以下、花成遺伝子)配列を植物で発現可能なプロモー
ターと連結せしめ、その配列を含有する植物組換え用ベ
クターを構築し、アグロバクテリウム等によりそのベク
ターを植物体に含有させる。
【0011】本花成遺伝子を発現させることにより花成
を促すことができる。
【0012】本発明における花成遺伝子とは、アブラナ
科の植物由来であるものが好ましく、さらに好ましく
は、シロイヌナズナ由来の遺伝子である。具体的には、
配列番号:1のアミノ酸配列をコードする塩基配列ある
いは配列番号:2または3で示される塩基配列である領
域(528bp)を含む塩基配列あるいは配列番号:2
または3で示される塩基配列とストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつ日長に関係なく植物の花期
を早める機能を有する蛋白質をコードする遺伝子配列な
どが挙げられる。
【0013】花成遺伝子を含有するベクターは必ずしも
染色体上に含有される必要はない。発現を促す場合配列
番号:2または3で示されるDNA配列に相当するRN
A配列を直接植物体に含有させるなどの方法で細胞内に
配列番号:2または3で示されるDNA配列をコードする
タンパク質または配列番号:2または3の塩基配列とハ
イブリダイズする塩基配列がコードするタンパク質が細
胞内に含有されるようにすればよい。
【0014】花成遺伝子が染色体上に組み込まれた場
合、その効果は優性遺伝しその効果を得るのに必ずしも
ホモ接合である必要はない。
【0015】植物で発現可能なプロモーターは、カリフ
ラワーモザイクウィルス35Sプロモーターなどの強制
発現用プロモーターの他にPRプロテインプロモーターや
HSPプロモーター、ステロイド誘導成プロモーター等の
誘導性プロモーターでもよい。強制発現用プロモーター
を用いた場合植物は極端な早咲きとなり、花の形や稔性
に殆ど影響を与えずに種子を取得でき世代を短縮でき
る。誘導性プロモーターを用いると通常花成が促されな
い日長でも花成時期を自ら決定することができる。
【0016】生育温度は野生型植物と同じでよく、特別
に設定する必要はない。
【0017】世代短縮を行う植物種は特に限定しない。
【0018】ターミネーターは必ずしも必要ないが本花
成遺伝子にNOSターミネーター等に連結してもよい。
【0019】数世代の植物体を短期間に取得した後、FT
遺伝子の機能がいらない場合は適当な掛け合わせによっ
てFT遺伝子を除けばよい。
【0020】本発明の方法が特に効果が大きいのは花を
つけるまでに何年もかかる樹木であり、育種改良は大幅
に時間短縮される。また花をつけにくいランなどの植物
に花成を促すことも大きな効果の一つである。
【0021】遺伝子導入の方法は特に限定しない。
【0022】配列番号:2または3とハイブリダイズす
る塩基配列を取得するには、花芽組織等のcDNAライブラ
リーやゲノミックライブラリー等のライブラリーを用い
て配列番号:2または3の遺伝子をプローブとしたコロ
ニーハイブリダイゼーション法によって行うことができ
るほか、プラークハイブリダイゼーション法や配列番
号:2または3の適当な部位をプライマーとしたPCR法
やRT-PCR法等によってもよい。またPCR産物をそのまま
組換え用ベクターに挿入して用いてもよい。
【0023】
【実施例】以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を
説明する。尚、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
【0024】実施例1 (導入ベクターの構築)既に取得したpBluescriptSK(-)
中の配列2のcDNAクローンをXbaI、XhoIの制限酵素を用
いて切り出し、XhoI末端をKlenow(宝酒造)によって平
滑化した。pCGN1547に図1のようなサイトをもつように
カリフラワーモザイクウィルス35S-プロモーターとNOS
ターミネーターを組み込んだpCGN35SNOSをXbaI、PstIで
切断後、T4ポリメラーゼによってPstI末端を平滑化し
た。ベクターとcDNAはXbaIと平滑末端で連結し図2のよ
うな導入用ベクターを構築した。このようにして得られ
た発現用ベクターをエレクトロポレーション装置(バイ
オラッド社製)を用いてアグロバクテリアに導入した。
【0025】(遺伝子の植物体への導入) (1)形質転換体を得るための植物の育種 鉢に培養土を入れ、表面を網戸用のメッシュで覆い、メ
ッシュの目の間にシロイヌナズナを播種し、22度、長
日条件(16時間明/8時間暗)で育てた。発芽後、適
当に間引きし、5本の植物を残した。3週間後植物が軸
台をはじめ、茎の高さが数cmになったところで摘心を行
った。摘心は、伸長をはじめた主軸全体を切る方法で行
い、ロゼット葉の葉腋の側枝を誘導するようにした。摘
心後、植物を数日から1週間おき、その間に、伸長して
きた側枝上の最初の花の開花・結実がはじまるのをまっ
た。
【0026】このような状態になった植物を形質転換養
殖物として用いた。
【0027】(2)アグロバクテリウム懸濁液の準備 感染を行う前日、カナマイシン100mg/lを含む2
00mlのLB培地に前培養した菌を摂取し、28度で
約1日培養した(OD600が1.2〜1.5まで)。室温で集菌
し、OD600が0.8になるように浸潤用懸濁培地(1/2×MS
塩、1/2×Gamborg B5ビタミン、1%ショ糖、0.5 g/l M
ES、44 nM ヘ゛ンシ゛ルアミノフ゜リン、0.02% SilwetL-77 )に懸濁
した。
【0028】(3)減圧浸潤による感染 浸潤操作を行う植物から、すでに開花・結実している花
を取り除いた。アグロバクテリウム懸濁液が培養土に吸
収されるのを軽減するため、鉢の養土に十分吸水させ
た。400 mlのビーカーに約150 mlのアグロバクテリウム
懸濁液を分取し、鉢を逆さにして植物体を懸濁液に浸
け、適当な支えを用いて固定した。鉢を入れたビーカー
をアスピレーターに入れ、減圧した。圧を40 mmHgに
調整し、15分間その状態で吸引した。徐々に減圧解除
した後、植物アグロバクテリウム懸濁液から取り出し
た。ペーパータオルの上で植物を軽く揺すり、植物上の
余分な懸濁液を落とした。さらに、鉢の角をもって少し
握り、用土中に染み込んだ懸濁液を除いた。適当なトレ
イに鉢を横倒しにして置き、トレイのそこに少量の水を
滴下して、透明な覆いを被せた。この状態で1日おい
た。覆いをはずし鉢をおこして水をやらずに数日間おい
た。手でもち用土が乾いてきたのが分かったら、数分で
完全に鉢に吸収される程度少量の水をトレイに入れた。
約2から4週間で種子の収穫を行う。最初のさやが熟し
はじめた時点で通気性の良い袋で袋かけし落ちてくる種
子を集めた。
【0029】(形質転換体のスクリーニングおよび形質
転換体の育種)クリーンベンチ内で準備した選択培地
(MS塩、Gamborg B5ビタミン、1%ショ糖、0.5 g/
l MES、1N KOHによってpH 5.7にあわせる。オートクレ
ーブ後200mgカナマイシン、100 mg/lカルベ
ニシリン、10mg/lベノミル)のシャーレの蓋を開
けて、培地表面を30分乾かした。約100μl(約2000
〜3000粒)の乾燥種子を、70%エタノール中に2分、
5%ブリーチ−1% SDS中に15分それぞれ置き、滅菌水で
水洗3〜5回し、表面滅菌を行った。表面滅菌後の種子
を約9mlの0.1%寒天水溶液(無菌)に懸濁した。
よく混合してファージをプレートにまく要領で培地表面
に種子の懸濁液を一様にひろげ、クリーンベンチ内で3
0分程乾かした。そののち、パラフィルムで封をし4℃
に数日放置した後23℃で発芽させた。カナマイシン耐
性植物体を新しい選択培地に移し、本葉が5〜6枚展開
するまで育てた。耐性植物を土にうつし2〜3日間、適
当な覆いをした。この段階でカナマイシン耐性形質を獲
得した植物はつぼみをつけていた。形質転換体に開花し
た花は野生株と比べても正常な形状を示していた。ここ
で得られた形質転換体は4世代を経ても正常に芽生えを
起こし、本葉が5〜6枚になったときに開花するという
形質を受け継いだ。1鞘の大きさも野生株と比べて大き
な違いはなかった。取得した種子を短日および長日条件
下で生育させた。その結果、日長に関係なく本葉が5〜
6枚程度になったときに開花するという形質に影響はな
かった。
【0030】
【発明の効果】本発明によれば、花をつけさせるのが困
難な植物に花を簡単につけさせたり植物の花期を日長に
関係なく早めたりできるばかりでなく、何世代にわたっ
て安定に形質を受け継がせることができることから世代
の短縮をも可能にする。世代の短縮は、純系植物を得た
り育種改良の速度をはやめたりすることに応用できると
期待される。とくに幼若期間が長い樹木に至ってはその
効果は大きいと期待される。
【0031】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 東レ株式会社 <120> 植物の世代短縮方法および植物体 <130> 51E14270 <160> 3 <210>1 <211>175 <212>PRT <213>Arabidopsis <400> Met Ser Ile Asn Ile Arg Asp Pro Leu Ile Val Ser Arg Val Val 1 5 10 15 Gly Asp Val Leu Asp Pro Phe Asn Arg Ser Ile Thr Leu Lys Val 20 25 30 Thr Tyr Gly Gln Arg Glu Val Thr Asn Gly Leu Asp Leu Arg Pro 35 40 45 Ser Gln Val Gln Asn Lys Pro Arg Val Glu Ile Gly Gly Glu Asp 50 55 60 Leu Arg Asn Phe Tyr Thr Leu Val Met Val Asp Pro Asp Val Pro 65 70 75 Ser Pro Ser Asn Pro His Leu Arg Glu Tyr Leu His Trp Leu Val 80 85 90 Thr Asp Ile Pro Ala Thr Thr Gly Thr Thr Phe Gly Asn Glu Ile 95 100 105 Val Cys Tyr Glu Asn Pro Ser Pro Thr Ala Gly Ile His Arg Val 110 115 120 Val Phe Ile Leu Phe Arg Gln Leu Gly Arg Gln Thr Val Tyr Ala 125 130 135 Pro Gly Trp Arg Gln Asn Phe Asn Thr Arg Glu Phe Ala Glu Ile 140 145 150 Tyr Asn Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala Val Phe Tyr Asn Cys Gln 155 160 165 Arg Glu Ser Gly Cys Gly Gly Arg Arg Leu 170 175 <210>2 <211>528 <212>DNA <213>Arabidopsis <222>1..528 <400> atgtctataa atataagaga ccctcttata gtaagcagag ttgttggaga cgttcttgat 60 ccgtttaata gatcaatcac tctaaaggtt acttatggcc aaagagaggt gactaatggc 120 ttggatctaa ggccttctca ggttcaaaac aagccaagag ttgagattgg tggagaagac 180 ctcaggaact tctatacttt ggttatggtg gatccagatg ttccaagtcc tagcaaccct 240 cacctccgag aatatctcca ttggttggtg actgatatcc ctgctacaac tggaacaacc 300 tttggcaatg agattgtgtg ttacgaaaat ccaagtccca ctgcaggaat tcatcgtgtc 360 gtgtttatat tgtttcgaca gcttggcagg caaacagtgt atgcaccagg gtggcgccag 420 aacttcaaca ctcgcgagtt tgctgagatc tacaatctcg gccttcccgt ggccgcagtt 480 ttctacaatt gtcagaggga gagtggctgc ggaggaagaa gactttag 528 <210>3 <211>528 <212>DNA <213>Arabidopsis <222>1..528 <400> atgtctttaa gtcgtagaga tcctctcgtg gtcggcagtg ttgttggaga tgttcttgat 60 cctttcacga ggttggtctc tcttaaggtc acttatggcc atagagaggt tactaatggc 120 ttggatctaa ggccttctca agttctgaac aaaccaatag tggagattgg aggagacgac 180 ttcagaaatt tctacacctt ggttatggtg gatcctgatg tgccgagtcc aagcaaccct 240 caccaacgag aatatctcca ctggttggtg actgatatac ctgccaccac tggaaatgcc 300 tttggcaatg aggtggtgtg ctacgagagt ccacgtcccc cctcgggaat tcatcgtatt 360 gtgttggtat tgttccggca actcggaaga caaacggttt atgcaccggg gtggcgccaa 420 cagttcaaca ctcgtgagtt tgctgagatc tacaatcttg gtcttcctgt ggctgcctct 480 tacttcaact gccagaggga gaatggctgt gggggaagaa gaacgtag 528
【図面の簡単な説明】
【図1】発現用ベクターの構造を示す図である。
【図2】形質転換植物植物作成のための導入遺伝子の構
築例を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12R 1:91) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) (72)発明者 白井 真 愛知県名古屋市港区大江町9番地の1 東 レ株式会社名古屋事業場内 Fターム(参考) 2B030 AA02 AB03 AD06 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 4B024 AA08 BA80 CA04 DA05 EA04 4B065 AA89X AA89Y AB01 AC20 BA01 CA24 CA53

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】日長に関係なく植物の花期を早める機能を
    有する遺伝子を用いて花期を早めるまたは花成を促すこ
    とを特徴とする植物の世代短縮方法。
  2. 【請求項2】日長に関係なく植物の花期を早める機能を
    有する遺伝子がアブラナ科の植物由来であることを特徴
    とする請求項1記載の植物の世代短縮方法。
  3. 【請求項3】アブラナ科の植物がシロイヌナズナである
    ことを特徴とする請求項2記載の植物の世代短縮方法。
  4. 【請求項4】日長に関係なく植物の花期を早める機能を
    有する遺伝子が配列番号:1で表される蛋白質をコード
    する遺伝子であることを特徴とする請求項1から3のい
    ずれか1項記載の植物の世代短縮方法。
  5. 【請求項5】日長に関係なく植物の花期を早める機能を
    有する遺伝子が、以下の(a)、(b)または(c)の
    DNAからなる遺伝子であることを特徴とする請求項1
    から4のいずれか1項記載の植物の世代短縮方法。 (a)配列番号:2で表される塩基配列からなるDNA (b)配列番号:3で表される塩基配列からなるDNA (c)配列番号:2または配列番号:3で表されるDN
    Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
    つ日長に関係なく植物の花期を早める機能を有する蛋白
    質をコードするDNA
  6. 【請求項6】請求項1から5のいずれか1項記載の植物
    の世代短縮方法によって得られた植物体。
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