WO2006134903A1 - 花及び／又は果実のサイズが大型化された植物の作出方法 - Google Patents

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Norio Murata
Eung-Jun Park
Tony H. H. Chen
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    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to a plant in which the size of reproductive organs such as flowers and fruits is increased and a method for producing the same, and more particularly to a plant in which the size of flowers and fruits is increased and a method for producing the same.
  • Non-Patent Document 1 Certain aspects of flower growth, such as verification of floral organ identification, have been well studied (Non-Patent Document 1), but how flower patterns and sizes are regulated. Isn't much researched.
  • Arabidopsis thaliana the AINTEGU MENTA (ANT) gene is known to be involved in the regulation of organ growth during flower organ growth. That is, by ectopic expression of ANT under the constitutive 35S promoter, Arabidopsis flowers and shoots grow in larger organs (Non-patent Documents 2 and 3).
  • Non-patent literature 2 In this genetically modified Arabidopsis, the increase in the size of the sepals depends on the increase in cell division, and the increase in the sizes of petals, stamens and heart skin mainly depends on the enlargement of the cells.
  • Non-patent literature 3 In ANT-overexpressing Arabidopsis transgenics, the increased size of the shoot organ is due to longer cell cycle gene expression time and organ growth, and AN does more than just cell cycle progression. This suggests that it also affects cell enlargement (Non-patent Document 3).
  • Non-Patent Document 4 In the genus Tomato, the difference in fruit size is extremely large, ranging from 1—2g to lOOOg (Non-Patent Document 4), but many major quantitative trait loci (QTLs) that regulate fruit size and fruit shape. 3 ⁇ 4 Frequently used (fruit weighty locule—numDer, annoyed ⁇ ovate sun, fs8.1, etc., several sitting positions have been found to be important in transforming fruit size and shape. (Non-Patent Document 5) The four main QTLs, fwl.1, fw2.2, fw3.1, and fw4.1, are probably forces S that have an effect on fruit size, except for fw3.1.
  • Non-Patent Document 6 Non-Patent Document 6
  • fw2.2 one of the QTLs that regulate the size
  • Reference 7 Ultimately, the total amount of fruit is affected by changes in the shape and structure of the ovary inside the flower. The two positions of the annoyed and locule-number are the fruit size by changing the number of pericardium inside the flower.
  • Non-patent document 4 The ovate mutation changes the tomato fruit from a round shape to a pear shape (non-patent document 8)
  • the sun locus maintains the left-right symmetry of the fruit.
  • the ovate locus causes asymmetric elongation such that the end of the stem of the fruit is exaggerated from the end of the flower (Non-Patent Document 9).
  • Fs8.1 is related to the appearance and function of a rugged, slightly elongated body and functions during the early flowering period (Non-patent Document 10).
  • glycine betin (GB) by cyanobacteria and cruciferous plants by transformation with the codA gene for choline oxidase, and this is accumulated in these plants and regenerated. It was shown that salt tolerance and / or osmotic pressure resistance was achieved at various stages of plant growth including the season (Non-patent Document 11, Patent Document 1).
  • Patent Document 1 International Publication W096Z29857
  • Non-Patent Document 1 H. Ma. Genes Dev. 8, 745 (1994).
  • Non-Patent Document 2 ⁇ A. Krizek, Dev. Genet. 25, 224 (1999).
  • Non-Patent Document 3 Y. Mizukanri, R. L. Fischer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 942 (2 002).
  • Non-Patent Document 4 Z. Lippman, S. D. Tanksley, Genetics 158, 413 (2001).
  • Non-Patent Document 5 SD Tanksley, Plant Cell 16, S181 (2004).
  • Non-Patent Document 6 ⁇ van der Knaap, SD Tanksley, Theor. Appl. Genet. 107, 139 (200 3).
  • Non-Patent Document 7 A. Frary et al., Science 289, 85 (2000).
  • Non-Patent Document 8 J. Liu, J. Van Eck, B. Cong, S.D.Tanksley, Pro Natl. Acad. Sci. U. S.A. 99, 13302 (2002).
  • Patent Document 9 E. van der Knaap, S. D. Tanksley, Theor. Appl. Genet. 103, 353 (200 1).
  • Non-Patent Document 10 H. -M. Ku, G. Grandillo, S. D. Tanksley, Theor. Appl. Genet. 101, 8 73 (2000).
  • Non-Patent Document 11 E.-J. Park et al., Plant J 40, 474 (2004).
  • An object of the present invention is to provide a crop having an enlarged flower and fruit size and a method for domestication and genetic improvement thereof.
  • the present inventor has identified that the gene encoding choline oxidase (codA gene) is a major gene involved in increasing the size of flowers and fruits, and has carried out gene recombination to express this gene.
  • codA gene choline oxidase
  • tomatoes the inventors have found that the number of cells and the cell size have mainly increased, and that flowers and fruits have been significantly enlarged, and the present invention has been completed.
  • the present inventors further elucidated that transformation with the codA gene significantly increases the size of flowers and fruits without an apparent morphological change in the vegetative tissue. It was clarified that the change in expression is related to the increase in flower and fruit size.
  • the present invention relates to a plant having an enlarged flower and / or fruit size comprising transforming a plant with a recombinant vector containing a gene encoding choline oxidase. This is the production method.
  • the present invention is a plant in which the size of the flower and / or fruit produced by the above method is increased, or a progeny thereof having the same properties, or a part of these plants. “Part” means cut flowers, fruits, and other parts cut from these plants.
  • a gene derived from the Gram-positive soil fungus Alsulacter can be used as the gene encoding the choline oxidase of the present invention.
  • those derived from Arthrobacter globiformis are preferably derived from Pascens, and particularly those derived from Arthrobacter globiformis.
  • the codA gene which encodes the chondoxidase of Globusforumus, has a 1638 bp open reading frame, encodes 546 amino acids, and consists of nucleotide sequences 362 to 1999 of SEQ ID NO: 2.
  • a gene encoding such choline oxidase can be transformed into a plant by incorporating it into an appropriate vector. Furthermore, genes can be expressed in plants by introducing appropriate promoters and sequences related to expression into these vectors.
  • Even a base sequence encoding a protein having choline oxidase activity can be used as the gene of the present invention.
  • Cholineoxidase activity refers to the function of oxidizing choline to betaine in a single-step oxidation reaction (Ikuta, S. et. Al, J. Biochem. 82: 1741-1749, 1977).
  • the range of plants in which the size of reproductive organs such as flowers and fruits can be increased by the method of the present invention includes all crops and horticultural plants, such as roses, chrysanthemums, carnations, Goldfish grass, cyclamen, orchid, turkey, freesia, gerbera, gladiolus, casmiso, kalanchoe, lily, pelargonium, zeranium, petunia, treaure, tulip, rice, barley, wheat, rapeseed, potato, tomato, poplar, banana , Eucalyptus, Sweet Potato, Tides, Alf Alpha, Nore Ipin, Corn, Cauliflower, and other forces S, but are not limited to these.
  • a vector incorporating a gene encoding cholineoxidase, a transformation method, and a method for selecting a transformed plant can be appropriately selected according to the type of plant to be transformed.
  • a gene transfer method using protoplasts or a gene transfer method using a part of a tissue can be used.
  • tissue fragments Ti plasmid derived from Agrobacterium can be used. Infecting a plant tissue fragment with protoplasts containing a protoplast containing a gene encoding choline oxidase, select it using drug resistance, such as kanamycin, and then differentiate the stem and leaves into recombinant plants. You can get a body.
  • a gene introduction method a method in which particles such as gold having DNA adsorbed on the surface thereof are physically introduced into plant cells with a high-pressure gas such as helium (the so-called particle gun method) is used. be able to.
  • Example 1 Plasmid pBluescript (Skt) (Stratagene) carrying the codA gene (SEQ ID NO: 2) was digested with BstEII (position 40 from the translation start point) and Smal (downstream of the stop codon) restriction enzymes. In front of the codA gene, a cDNA encoding a transit peptide of a small subunit of tobacco lupisco was ligated. This DNA fragment was inserted into the beta'dalcronidase gene position of the binary plasmid pB1221. From this construct.
  • a fragment containing the cauliflower mosaic virus 35SRNA promoter, the cDNA encoding the transit peptide of the small subunit of Lupisco, the codA gene, and the terminator of the nopaline synthase gene was excised with Hindlll and EcoRl. This fragment was inserted into the Hindlll and EcoRl sites of the binary vector plasmid pCAMBIA (CAMBIA, Canberra, Australia). This plasmid pCG or odA was inserted into Agrobacterium tumefaciens EHA101 by freezing and thawing. Using the plasmid containing the codA gene, tomato (Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker) was transformed by the agrobacterium method. The obtained transformant is called cdA-genetically modified tomato.
  • WT wild tomatoes
  • co dA codA-genetically modified tomatoes
  • the greenhouse conditions were 25 ° C and irradiation time (400-500 ⁇ molm 2 s— for 16 hours.
  • Flora series, hydroponic nutrients Flora Series, General hydroponics, Sebastopol, CA, USA
  • PH was maintained at 5.7-5.9 All flowers were marked at the flowering stage and weighed freshly on the third to fifth days after the flowering period.
  • Ten fruits were harvested when they were ripe, and the freshly picked weight, number of seeds and number of locules for each fruit were measured.
  • WT and codA transgenic tomatoes There is a significant difference between WT and codA transgenic tomatoes (p O. 001).
  • One significant difference between WT and codA tomatoes was the number of flowers per inflorescence—codA transgenic tomatoes had about 30% fewer flowers per inflorescence than WT tomatoes.
  • Fig. 2 shows the tomato fruit transformed with the codA gene.
  • Mature transgenic tomatoes were significantly larger in size, averaging 54% heavier than WT tomatoes.
  • the average fruit weight of genetically modified tomatoes is equivalent to the upper limit of deviation 60% heavier than that of WT tomatoes, 25% of individual genetically modified fruits are about twice as heavy as the average fruit weight of WT It was.
  • an increase in tomato fruit size means that there is less competition for photosynthetic compounds between fruits in a single inflorescence. It may have been caused by a large number of fruits as a result of fewer fruits. Compared to genetically modified tomatoes, WT has more fruit for any inflorescence, so competition under limited nutrients and photosynthetic products is likely to increase and reduce size . Under locally limited photosynthesis products, tomatoes have been reported to drop a small number of growing fruits, leaving a few rich fruit, not many half-filled fruits. ( ⁇ C. Nesbitt, SD Tanksley, Plant Physiol. 127, 575 (2001)). Therefore, it is necessary to know whether an increase in the fruit size of the transgenic tomato is a direct result of the introduction of the codA gene, or simply because the number of fruits per inflorescence has decreased.
  • the present inventor conducted a flower removal experiment in order to investigate the possibility that the fruit load per inflorescence affects the fruit size.
  • 5 pairs of WT and transgenic tomatoes were tweaked, leaving 5 inflorescences per tomato, leaving 3 fruits per inflorescence and cutting the fruits, leaving a total of 15 fruits per tomato.
  • Table 2 shows the fruit weight and size after flower removal. In the table, 1st indicates the first inflorescence of the three fruits, and 2nd and 3rd indicate the second and third inflorescence, respectively.
  • Plant organ size is generally determined by both cell number and cell size.
  • codA tomato regulates the prolongation of growth period with cell division and post-division cell enlargement during the fruit growth period
  • the present inventor examined the percutaneous organs 2 to 3 days before the flowering period. The histological analysis was performed by photographing the cross section of each of the above and the longitudinal section of the petal organ with an optical microscope. Figure 3 shows the photograph.
  • the cell size increased, and the number of cells per unit area decreased significantly (p ⁇ ). 01).
  • the percentage of cells with larger petals (> 25 ⁇ m in length) in transgenic tomatoes was higher (13.4%) than that in WT tomatoes (13.4%), while medium (12%).
  • codA percutane 2 to 3 days before the flowering stage is significantly larger than the percutaneous skin of WT tomato, and is often composed of many child chambers that have two layers (FIGS. 3C to F). Furthermore, the pericarp outer wall of most genetically modified percutaneous skin was thicker than that of WT percutaneous skin.
  • codA reproductive organs including petals and heart tissue
  • FIG. 1 is a diagram showing petals and ovary of tomato transformed with codA gene. “WT” ⁇ wild-type tomatoes into which coda gene has not been introduced, and “codA” represents tomatoes into which codA gene has been introduced. The unit of the measure on the right is cm.
  • FIG. 2 is a diagram showing tomato fruits transformed with the codA gene.
  • the unit of the measure on the right is cm.
  • FIG. 3 is a view showing a longitudinal section of a petal organ and a transverse section of a percutaneous organ two to three days before the flowering period.
  • A, C and E are those of WT
  • B, D and F are those of codA.
  • the scales of the WT and codA photos are the same.
  • a and B show the longitudinal section of the petal organ
  • C and D show the transverse section of the percutaneous organ. Enlarged pictures of boxes C and D are shown in E and F, respectively.

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Abstract

　【課題】　花及び果実のサイズが大型化された作物及びその栽培化及び遺伝学的改良方法を提供する。 　【解決手段】　コリンオキシダーゼをコードする遺伝子（ｃｏｄＡ遺伝子）が、花及び果実のサイズの大型化にかかわる主要な遺伝子であることを特定し、この遺伝子を発現する遺伝子組換えトマトにおいて、グリシンベタインが蓄積され、主に細胞数と細胞サイズが増加し、花と果実が顕著に大型化したことを見出した。本発明は、コリンオキシダーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターで植物を形質転換することからなる花及び／又は果実のサイズが大型化された植物の作出方法であり、この方法によって作出された花及び／又は果実のサイズが大型化された植物若しくはこれと同じ性質を有するその子孫又はこれら植物の一部である。 　

Description

明 細 書
花及び Z又は果実のサイズが大型化された植物の作出方法
技術分野
[0001] この発明は、花や果実等の生殖器官のサイズが大型化された植物及びその作出 方法に関し、より詳細には、花及び果実のサイズが大型化された植物及びその作出 方法に関する。
背景技術
[0002] 自然界において、植物器官の固有のサイズは、種内では際だった均一性を示すば 力りでなぐ近縁の種間では明白な差異を示す。器官サイズを大型化させることは、 長い間、作物の栽培化及び遺伝的改良における第一目標であつたが、植物の固有 な器官サイズを調節する生育機構については、ごく最近になるまで研究されてこなか つた。しかも、最も特徴が調べられた植物の器官サイズを調節する遺伝子は葉、根及 びシュート（苗条）の頂端分裂組織の生育に関係しており、花及び果実のような生殖 器官のサイズを調節する生育機構及び分子的機構については、注意が余り払われ てこなかった。
[0003] 花器官同定の立証のような、花生育のある種の側面については、良く研究されてき たが（非特許文献 1)、花のパターン及びサイズがどの様に調節されているかについ ては、余り研究されてなレ、。シロイヌナズナにおいて、花器官生育過程で、 AINTEGU MENTA (ANT)遺伝子が器官生長の調節に関わってレ、ることが知られてレ、る。即ち 、構成的 35Sプロモーターの下での ANTの異処的発現により、シロイヌナズナの花 とシュートは、より大きな器官に生育する（非特許文献 2、 3)。この遺伝子組換えシロ ィヌナズナにおいて、萼片のサイズの大型化は細胞分裂の増加に依るもので、花弁 、雄ずい及び心皮のサイズの大型化は、主に、細胞の大型化に依っている（非特許 文献 2)。 ANT—過剰発現のシロイヌナズナ遺伝子組換え体においては、シュート器 官の大型化は、細胞周期遺伝子の発現時間の長期化と器官の生長によるもので、 A NTは単に細胞周期進行以上のことを行い細胞大型化にも作用することを示唆して いる (非特許文献 3)。 [0004] トマト属において、果実サイズの差異は極端に大きく 1— 2gから lOOOgに及ぶが（ 非特許文献 4)、果実サイズ、果実の形状を調節する多くの主要量的形質遺伝子座（ QTL) ¾頻繁 (こ使われており、 fruit weighty locule— numDer、 fascinated^ ovate sun、 fs8.1等レ、くつかの座位が、果実サイズと果実形状を形質転換する上で重要であるこ とが見いだされている（非特許文献 5)。 4種の主要 QTL、即ち fwl. 1、 fw2. 2、 fw3 . 1、及び fw4. 1は、恐らく fw3. 1を除き、果実サイズに作用を有する力 S、果実の形 状には作用を有しない様である（非特許文献 6)。今日まで、サイズを調節する QTL の一つである fw2. 2のみがクローン化されて分子レベルで研究されており、この座 位の対立遺伝子の自然変異のみで果実サイズが 30%ほど変化することが分かって いる（非特許文献 7)。最終的に果実の総量は花内部の子房の形、構造の変化により 影響を受ける。 fascinated及び locule-numberの 2座位は、花内部の心皮の数を変える ことで果実サイズを決定づけると報告されてレ、る（非特許文献 4)。 ovate変異はトマト 果実を丸形から梨型へ変化させる（非特許文献 8)。 sun座位は、果実が左右の対称 性を維持するように両縦方向の一様な伸長を引き起こすに対し、 ovate座位は果実 の茎末端 (へた)が花末端より誇張される様な、非対称的な伸長をもたらす (非特許 文献 9)。他の座位、 fs8. 1、はずんぐりした、僅かに伸長した外観と機能に関わり、 花初期生育期間に機能する (非特許文献 10)。
[0005] なお、本発明者はコリンォキシダーゼに対する codA遺伝子による形質転換でラン 藻やアブラナ科の植物がグリシンべティン (GB)を合成するようになり、これがこれら の植物体内で蓄積され、生殖期を含め植物生育の様々な段階で、耐塩性及び/又 は耐浸透圧性となることを示した (非特許文献 11、特許文献 1)。
[0006] 特許文献 1 :国際公開 W096Z29857
非特許文献 1 : H. Ma. Genes Dev. 8, 745 (1994).
非特許文献 2 : Β· A. Krizek, Dev. Genet. 25, 224 (1999).
非特許文献 3 : Y. Mizukanri, R. L. Fischer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 942 (2 002).
非特許文献 4 : Z. Lippman, S. D. Tanksley, Genetics 158， 413 (2001).
非特許文献 5 : S. D. Tanksley, Plant Cell 16， S181 (2004). 非特許文献 6 : Ε· van der Knaap, S. D. Tanksley, Theor. Appl. Genet. 107, 139 (200 3).
非特許文献 7 : A. Frary et al., Science 289， 85 (2000).
非特許文献 8 : J. Liu, J. Van Eck, B. Cong, S.D. Tanksley, Pro Natl. Acad. Sci. U. S.A. 99， 13302 (2002).
特許文献 9 : E. van der Knaap, S. D. Tanksley, Theor. Appl. Genet.103， 353 (200 1).
非特許文献 10 : H. -M. Ku, G. Grandillo, S. D. Tanksley, Theor. Appl. Genet.101， 8 73 (2000).
非特許文献 11 : E. -J. Park et al., Plant J 40, 474 (2004).
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、花及び果実のサイズが大型化された作物及びその栽培化及び遺伝学 的改良方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者は、コリンォキシダーゼをコードする遺伝子（codA遺伝子）が、花及び果 実のサイズの大型化にかかわる主要な遺伝子であることを特定し、この遺伝子を発現 する遺伝子組換えトマトにおいて、主に細胞数と細胞サイズが増加し、花と果実が顕 著に大型化したことを見出し、本発明を完成するに至った。
また、本発明者は、その後の研究により、花と果実の大型化は導入した codA遺伝 子発現の多面的作用に依るものであり、この遺伝子はこれらの形質の更なる改良に 有用であることを明らかにした。
本発明者は、更に、 codA遺伝子による形質転換は、栄養組織には明白な形態変 化を伴わずに、花及び果実サイズを著しく大型化させることを解明し、 codA遺伝子 導入による一連の遺伝子の発現変化が花及び果実サイズの大型化に関わっている こと解明した。
[0009] 即ち、本発明は、コリンォキシダーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクター で植物を形質転換することからなる花及び/又は果実のサイズが大型化された植物 の作出方法である。
また、本発明は、上記の方法によって作出された花及び/又は果実のサイズが大 型化された植物若しくはこれと同じ性質を有するその子孫又はこれら植物の一部で ある。 「一部」とは、これら植物の切花、果実、その他これら植物から切り取られた部分 をいう。
発明の効果
[0010] codA遺伝子でトマトを形質転換することにより、野生型 (WT)トマトと比べて、花と 果実のサイズが大型化し、その他の特徴ある形質として、花序あたりの花数が低下し 、結実率が下がり、また子室数が増加した。花除去実験により、遺伝子組換えトマトの 果実サイズの増加は codA遺伝子の多面的作用に依って引き起こされることを実証し た。花弁及び心皮器官の組織学的解析の結果から、遺伝子組換えトマト生殖器官の サイズの全体としての増加は細胞サイズ及び細胞数の増加により引き起こされたとい える。トマト cDNAミクロアレイ解析の結果から、野生型の花の遺伝子と比較して遺伝 子組換えの花の多くの遺伝子が差異的に調節されていた。半定量的 RT— PCRの 結果から、 codA遺伝子組換えトマトの生殖器官の大型化は、 fw2. 2を含む細胞分 裂に関与する転写物の制御により与えられたものといえる。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明のコリンォキシダーゼをコードする遺伝子は、グラム陽性の土壌菌ァルスロ パクター属由来のものを使用できる。例えば、ァルスロバクタ一'グロビフオルムス (Art hrobacter globiformis)ゃァルスロバクタ一'パセンス (pascens)由来のものが好ましく、 特にアルスロバクタ一'グロビフオルムス由来のものが好ましい。
ァルスロバクタ^ ~ ·グロビフオルムスのコリンォキシダーゼをコードする codA遺伝子 は、 1638bpのオープンリーディングフレームをもち、 546アミノ酸をコードし、配列番号 2の塩基配列 362〜1999番目から成る。
このようなコリンォキシダーゼをコードする遺伝子はこれを適当なベクターに組み込 むことにより、植物を形質転換することができる。さらに、これらのベクターに適当なプ 口モーターや形質発現にかかわる配列を導入することにより植物中において遺伝子 を発現させることができる。 配列表の配列番号 1で表されるアミノ酸配列力 成るタンパク質又は該アミノ酸配列 において 1若しくは数個のアミノ酸 (例えば、全アミノ酸の 5%以下）が欠失、置換若し くは付加されたアミノ酸配列から成り、コリンォキシダーゼ活性を有するタンパク質を コードする塩基配列であっても本発明の遺伝子として使用できる。
コリンォキシダーゼ活性は、 1段階の酸化反応でコリンをべタインに酸化する機能を いう (Ikuta, S. et. al , J. Biochem.82: 1741-1749, 1977)。
[0012] 本癸明の方法により花及び果実のような生殖器官のサイズが大型化されうる植物の 範囲は極めて広ぐ全ての農作物及び園芸植物が含まれ、例えば、バラ、キク、カー ネーシヨン、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキヨウ、フリージア、ガーベラ、グラジオ ラス、カスミソゥ、カランコェ、ユリ、ペラルゴ二ゥム、ゼラニゥム、ペチュニア、トレユア、 チューリップ、イネ、ォォムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ 、サツマィモ、タイズ、アルフアルファ、ノレ一ピン、トウモロコシ、カリフラワーなどが挙 げられる力 S、これらに限定されるものではない。
[0013] コリンォキシダーゼをコードする遺伝子を組み込むベクター、形質転換方法並びに 形質転換植物体の選択方法は形質転換すべき植物の種類に応じて適宜選択するこ とができる。
形質転換植物の作出には、プロトプラストを経由する遺伝子導入法、あるいは組織 の一部を用いる遺伝子導入法を利用できる。組織片を用いる遺伝子導入では、ァグ ロバクテリウム (Agrobacterium)由来の Tiプラスミドを利用することができる。コリンォキ シダーゼをコードする遺伝子を組み込んだプロトプラストをもつァグロバタテリゥムを力 ノレス化した植物組織片に感染させ、カナマイシンなどの薬剤耐性を利用して選択し、 次いで茎葉を分化させて組換え植物体を得ることができる。遺伝子の導入方法には 、ヘリウムなどの高圧ガスで、 DNAを表面に吸着させた金などの粒子を植物の細胞 に物理的に導入する方法（いわゆる適伝予銃法 (Particle Gun法）を用いることができ る。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものでは ない。
実施例 1 [0014] codA遺伝子 (配列番号 2)をもつプラスミド pBluescript(Skt)(Stratagene社)を、 BstEII( 翻訳開始点から— 40の位置)と Smal (ストップコドンの下流)制限酵素で消化した。この codA遺伝子の前にタバコのルピスコの小サブユニットのトランジットペプチドをコード する cDNAを結合させた。この DNAフラグメントをバイナリープラスミド pB1221のベータ 'ダルクロニダーゼ遺伝子の位置に揷入した。このコンストラクトから。カリフラワーモザ イクヴィールスの 35SRNAプロモーター、ルピスコの小サブユニットのトランジットぺプ チドをコードする cDNA、 codA遺伝子、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネータ一を含 むフラグメントを、 Hindlllと EcoRlで切り出した。このフラグメントをバイナリーベクター プラスミド pCAMBIA(CAMBIA，Canberra，Australia)の Hindlllと EcoRlのサイトに揷入し た。このプラスミド pCGん odAを Agrobacterium tumefaciens EHA101に凍結'融解法で 揷入した。この codA遺伝子を含むプラスミドを用いて、トマト（Lycopersicon esculentu m cv. Moneymaker)をァグロバタテリゥム法で形質転換した。得られた形質転換体を c odA—遺伝子組換えトマトとよぶ。
[0015] 各 5組の野生種トマト（以下「WT」で表す。）と codA—遺伝子組換えトマト（以下「co dA」で表す。）を温室中で水栽培した。温室の条件は、 25°Cで照射時間（400-500 μ molm— 2s— を 16時間とした。水栽培の栄養分であるフローラシリーズ（Flora Series, G eneral hydroponics, Sebastopol, CA， USA)を隔週で与え、 pHを 5.7-5.9に保持した。 全ての花は開花期に印を付し、開花期後 3〜5日目に花の摘みたての重量を測定し た。各植物の最初の 10個の果実を熟した時点で収穫し、果実毎の摘みたての重量、 種子の数及び子室 (locule)の数を測定した。
[0016] その結果、下記のような事実が判明した。
(l) codA遺伝子による形質転換は大型化した花及び果実をもたらす。
表現型による観察結果を表 1に示し、トマトの花弁と子房を図 1に示す。
[表 1] WT codA 花序あたりの花数 8.7 ± 0.7 6.1 ± 0.6 摘みたての花の重量 (mg) 96 ± 15 194 ± 22 花弁の長さ (mm) 10.1 ± 1.5 17.3 ± 1.8 結実率 (％；) 68 ± 9 42 ± 7
摘みたての赤果実あたりの重量 (g) 93士 11 143 ± 14
果実あたりの子室の数 2.7士 0.3 6.5 ± 0.9 果実あたりの種子の数 120 ± 18 45 ± 8
[0017] WT及び codA遺伝子組換えトマトの間には有意な差異がある（p O. 001)。 WT及 び codAトマトの間の有意な差異の一つは、花序あたりの花数であり— codA遺伝子 組換えトマトの花序あたりの花数は、 WTトマトより約 30%少なかった。開花後 3ないし 5日後、遺伝子組換えトマトの各花は WTの花より約 2倍の重量であり、花弁サイズも また WTのものより約 1. 7倍大き力 た（図 1A)。また開花以前において子房サイズも 大型化していた（図 1B)。花弁セグメント数は、 WTと codAトマトの間に有意な差異が なかった（ρ=0· 25)。
また、データは示さないが、遺伝子組換えした花において、心皮及び柱頭裂片の 数は増加してレ、た。実際 30以上の GB蓄積性の codA遺伝子組換えトマト株を作り出 したが、それ等全ての株は花及び果実サイズが大型化するよう変化した表現形質を 有していた。
[0018] codA遺伝子により形質転換したトマトの果実を図 2に示す。成熟した遺伝子組換え トマトのサイズは有意に大型化しており、 WTトマトのサイズより平均 54%重かった。 遺伝子組換えトマトの果実重量の平均値は、 WTトマトの値より 60%重ぐ偏差の上 限値に相当する、個々の遺伝子組換え果実の 25%は WTの平均果実重量より約 2 倍重かった。
人工授粉なしで、花序あたりの結実率は、 WTトマトが 68%であるのに対し、遺伝子 組換えトマトは 42%に減少していた。この結果によると、花序あたりの花の数も少ない ことを考慮すると、遺伝子組換えトマトの全果実数は更に低いことになる。しかし、本 発明者は無限型トマト品種を用いたので、トマトあたりの花序総数の測定をしなかつ た。
[0019] 受精後各心皮は果実の子室に生長する。しかし、いくつかの品種は、多くの子室を 持つ果実をつくり、屡々、より大きくたっぷりした果実をつくる。多重子室型の心皮は c odA花芽のごく初期段階で観察され、その後、 WT果実が 2〜3個の子室を持つのに 対し、遺伝子組換え果実は 6〜7個の子室を有する（表 1、図 3C及び D)。 fascinated 及び locule-numberの 2つの座位が花の心皮数を変えることによって果実サイズを変 えること（非特許文献 4)、特に、 fascinated突然変異株では、心皮の数が増すばかり でなぐ心皮が非合着となり、あるいは、萼片，花弁，雄ずいのような他の花器官数も 増加することが報告されているが（非特許文献 5)、 fascinated突然変異株に見られる これらの形質は、 codA遺伝子組換えトマトの花には見られなかった（図 1)。
[0020] (2)トマト果実の大型化は codA遺伝子導入の多面的な作用で引き起こされる。
codA遺伝子組換えトマトでは花序あたりの花数が少ないこと及び、結実率が少な レ、ことを考慮すると、トマト果実サイズの大型化が、単一花序につく果実間で光合成 物に対する競合が少ないことによって引き起こされたもので、果実数がより少ない結 果として大きな果実になった可能性がある。遺伝子組換えトマトと比較し、 WTはどの 花序に対してもより多くの果実を持つので、限られた栄養物、光合成生産物の下で 競合が激しくなり、サイズが小さくなるのであると考えられる。局所的に限られた光合 成産物の下で、トマトは生育過程にある少数の果実を落下させることによって、多数 の半詰まりの果実ではなぐ数少ない充実した果実が残されるということが報告されて いる（Τ· C. Nesbitt, S. D. Tanksley, Plant Physiol. 127, 575 (2001))。従って、遺伝 子組換えトマトの果実サイズが増加するとレ、うこと力 codA遺伝子導入の直接的な 結果なのか、単に花序あたりの果実数が減少した為であるのか知る必要がある。
[0021] 本発明者は、花序あたりの果実負荷が果実サイズに影響するという可能性を調べる 為に、花除去実験を行った。この実験において、 5対の WT及び遺伝子組換えトマト に手を加え、トマトあたり 5花序残し、各花序あたり 3個の果実を残して果実を切り取り 、全部でトマトあたり 15個の果実を残した。花除去後の果実重量とサイズを表 2に示 す。 表中の 1stは 3個の果実のうちで最初に花序に付いた果実を示し、 2ndと 3rdはそ れぞれ 2番目と 3番目に花序に付いた果実を示す。
[表 2]
WT codA
1st 2nd 3rd 1st 2nd 3rd 果実重量（g/個） 85.8 ± 11.8 78.7 ± 10.3 72.2 ± 8.5 185.7 ± 32.5 101.6 ± 1 9 86.7 ± 10.7 果実の幅 (cm) 5.1 ± 0.6 4.9 ± 0.4 4.5 ± 0.2 6.9 ± 0.5 5.8 ± 0.2 5.1 ± 0.3 果実の高さ（cm) 4.2 0,2 4,1 ± 0,2 4,0 ± U 5.6 ± 0.4 4.8 ± 0.3 4.2 ± 0.2
[0022] 全てのトマトの花数を等しくしても、野生型トマト (WT)と遺伝子組換えトマト (codA) 間の果実サイズの差異は減らなかった。それ以上に、花除去によって、花除去しない 場合に比べ、 WTと遺伝子組換えトマト間の果実サイズの差異は強調され、特に、最 初に花序に付いた成熟果実では差異が大きかった。遺伝子組換え果実は WT果実 より長さと高さの両方で有意に大きかった。
しかし、果実の長さ Z直径（全体では平均 1. 2)は WTと遺伝子組換えトマトの間で 有意な差がなかった。大部分の場合、遺伝子組換えトマト花序の最初に成熟した果 実は、成熟した残りの 2個の果実よりも有意に大きかった。同様の傾向が WTトマトの 果実に対しても認められた。しかし、同じ花序位置では、遺伝子組換え果実は WT果 実より有意に大きかった。表 2に示す結果から、遺伝子組換えトマトの大型化した果 実サイズは codA遺伝子の多面的な作用によって引き起こされたものであって、花序 あたりの果実数の減少の結果として起こるシンク ソース機構に依るものではないと いえる。
[0023] (3)遺伝子組換え花弁及び心皮組織の大型化は細胞サイズと細胞数の増加に由来 する。
植物の器官サイズは細胞数と細胞サイズの両者により一般的に決定される。 codA トマトが細胞分裂を伴う生長期の長期化、及び果実生育期間における分裂後の細胞 大型化をどのように調整するか調べる為に、本発明者は開花期 2 _ 3日前の心皮器 官の横断面と花弁器官の縦断面を光学顕微鏡により撮影することにより組織学的解 析を行った。その写真を図 3に示す。 遺伝子組換えトマトの花弁組織（図 3A及び 3B)に於いて、細胞サイズは大型化し た力 単位面積あたりの細胞数は有意に減少した (p^). 01)。遺伝子組換えトマトの 花弁の大型化した細胞（>25 μ m長）の割合は、 WTトマトの値 (8. 4%)よりずつと高 かった（13. 4%)、他方、中型（12〜25 μ πι)及び小型（く 12 z m)の細胞の割合に ついては、 WT及び遺伝子組換えトマトの間で有意な差異（中型及び小型の細胞に ついてそれぞれ、 p = 0. 22及び p = 0. 44)が見られなかった。
[0024] 開花期 2— 3日前の codA心皮は、 WTトマトの心皮より顕著に大型であり、しばしば 2層になった多くの子室から構成されている（図 3C〜F)。更に、大部分の遺伝子組 換え心皮の果皮外壁は、 WT心皮のものより厚かった。 codA遺伝子組換えトマトは、 WTトマトが果皮外壁において有するより、単位面積あたり少ない細胞数を有するが（ pく 0. 01)、果皮内壁については WTと有意な差異が無かった（p = 0. 25)。しかし、 c odA遺伝子組換えトマトは果皮外壁においては、 WTと比較し有意に増加した細胞 層（pく 0. 01)を有する。
以上から、花弁及び心皮組織を含め codA生殖器官の大型化は、細胞サイズ及び 細胞数の調節に依って起こると結論づけられる。
図面の簡単な説明
[0025] [図 l]codA遺伝子により形質転換したトマトの花弁と子房を示す図である。「WT」《c odA遺伝子を導入していない野生型トマトを示し、「codA」は、 codA遺伝子を導入し たトマトを示す。図右のメジャーの単位は cmである。
[図 2]codA遺伝子により形質転換したトマトの果実を示す図である。図右のメジャー の単位は cmである。
[図 3]開花期 2— 3日前の花弁器官の縦断面と心皮器官の横断面を示す図である。 A , C及び Eは WT、 B, D及び Fは codAのものを示す。 WTと codAの写真の縮尺は同 じである。 Aと Bは花弁器官の縦断面を示し、 Cと Dは心皮器官の横断面を示す。 Cと Dのボックスの拡大写真をぞれぞれ Eと Fに示す。

Claims

請求の範囲
[1] コリンォキシダーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターで植物を形質転換 することからなる花及び Z又は果実のサイズが大型化された植物の作出方法。
[2] 前記コリンォキシダーゼをコードする遺伝子が土壌菌ァルスロバクタ一由来のもので ある請求項 1に記載の方法。
[3] 前記コリンォキシダーゼ力 S、配列番号 1で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質又 は該アミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された アミノ酸配列から成り、コリンォキシダーゼ活性を有するタンパク質である請求項 1又 は 2に記載の方法。
[4] 前記コリンォキシダーゼをコードする遺伝子が配列番号 2の塩基配列 362〜1999番 目から成る請求項 3に記載の方法。
[5] 請求項:!〜 4のいずれか一項に記載の方法によって作出された花及び/又は果実 のサイズが大型化された植物若しくはこれと同じ性質を有するその子孫又はこれら植 物の一部。
[6] 前記植物力 Sトマトである請求項 5に記載の花及び/又は果実のサイズが大型化され た植物若しくはこれと同じ性質を有するその子孫又はこれら植物の一部。
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