MXPA01007194A - Hibridos de nicotiana interespecificos y su progenie. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a semillas y plantas hibridas interespecificas novedosas de Nicotiana excelsior x N. benfhamiana, y a un metodo para producir hibridos interespecificos de Nicotiana que tengan propiedades mejoradas para biomasa y la produccion de proteinas recombinantes usando un sistema de vectores virales.

Description

HIBRIDOS INTERESPECIFICOS DE NICOTIANA. Y SU PROGENIE REFERENCIA RECIPROCA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud serie No. 09/232,170, presentada en enero 15 de 1999, la cual a su vez es una continuación en parte de la solicitud serie No. 09/008,186, presentada en enero 6 de 1998, cada una incorporada en la presente como referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La presente invención se refiere a semillas y plantas híbridas interespecíficas novedosas de Nicotiana excelsior x N. benthamiana, y a un método para producir híbridos interespecíficos de Nicotiana que tengan propiedades mejoradas para biomasa y la producción de proteínas recombinantes usando un sistema de vectores virales. La diferencia entre híbridos íntraespecíficos e interespecíficos se puede visualizar mediante el comportamiento mendeliano de híbridos íntraespecíficos y el comportamiento esencialmente no mendeliano de híbridos interespecíficos. Esta diferencia resulta de la homología completa de cromosomas en los híbridos entre plantas de la misma especie (intraespecífica) y la homología parcial o no cromosómica que caracteriza a los híbridos entre plantas de diferentes especies (interespecífica). El área intermedia o gris entre los extremos entre híbridos interespecíficos, se observa en el comportamiento de aquellos que implican especies estrechamente emparentadas. Dichas especies tendrán el mismo número de cromosomas, y el grado de homología de los cromosomas puede ser muy alto. Los híbridos de este tipo producen semilla cuando son autopolinizados, y muestran evidencia de patrones de segregación mendeliana para algunos rasgos. Los estudios otológicos de meiosis en algunos híbridos Fi pueden mostrar evidencia de irregularidades cromosómicas que reflejan las diferencias cromosómicas que marcan a los progenitores como especies diferentes. Un híbrido entre especies distantemente emparentadas, puede mostrar apareamiento reducido entre cromosomas de los genomas diferentes. La meiosis en dichos híbridos puede exhibir el comportamiento típico de los cromosomas característico de los haploides monogenómicos. La mayoría de las combinaciones de híbridos Fi interespecíficos en el género Nicotiana, pertenece a esta última categoría. Sus contrapartes con cromosomas duplicados se denominan anfidiploides, o simplemente alopoliploides, cuando un progenitor del híbrido puede ser por sí mismo una combinación de diferentes genomas ancestrales. N. tabacum representa un ejemplo típico. La dificultad relativa para producir híbridos Fi interespecíficos, aumenta en proporción a la disminución de las relaciones taxonómicas entre sus progenitores. Aunque algunos híbridos Fi son estables cuando se convierten en poliploides fértiles, incluso los híbridos entre progenitores distantemente emparentados muestran cierto grado de homología de cromosomas. Existen ventajas para mantener materiales de abastecimiento de semillas de alopoliploides mediante autopolinización, particularmente si el híbrido es difícil de obtener mediante polinización cruzada convencional. La introgresión e hibridación interespecífica en poblaciones naturales de plantas y animales es una fuente conocida de variación genética y adaptación. El término introgresión o transferencia introgresiva de rasgos genéticos, se usa en un sentido más estrecho con proyectos de reproducción a corto plazo. El propósito de la hibridación interespecífica experimental, es usualmente la transferencia introgresiva de un rasgo de una especie (el progenitor no recurrente) en el genoma de otra (el progenitor recurrente). El rasgo se debe expresar con fidelidad fenotípica razonable como un dominante o dominante parcial en el híbrido Fi y todas las generaciones de retrocruza subsecuentes, cuando los cromosomas no recurrentes se pierden al azar; de otra manera, no se podría realizar la transferencia interespecífica propuesta. Los genes introducidos de una especie se pueden volver inestables cuando se translocan en el germoplasma de otra especie. El apareamiento de cromosomas entre los genomas introducidos en un híbrido interespecífico puede ser extenso o mínimo, aunque el híbrido Fi es usualmente estéril. La fertilidad se puede restaurar tratando la semilla germinante del híbrido en colchicina acuosa a 0.4% durante aproximadamente 4 horas para inducir ia duplicación de los cromosomas. También puede ser efectiva la inmersión de las semillas en colchicina a 0.1% durante 24 horas.

Después, la semillas se enjuagan en agua destilada estéril, y se siembran sobre la superficie de suelo pasteurízado en cajas de preparación de vidrio o plástico. Después, las plántulas se transplantan a macetas de suelo en el invernadero, y las plantas maduras que muestren buen desarrollo del polen son sometidas a autopolinización o retrocruza con el progenitor recurrente. Tres alternativas convencionales a la hibridación interespecífica con el propósito de transferir e incorporar germoplasma introducido en líneas diploides estables son (a) diploide x diploide, duplicando entonces para producir el alopoliploide y retrocruzando para producir el sesquidiploide, (b) autotetraploide x autotetraploide para producir directamente el alopoliploide, y (c) autotetraploide x diploide para producir directamente el sesquidiploide como se describe en el Boletín Técnico 1586 del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, 1979. La transferencia de genes mediada por vectores de Agrobacteríum tumefaciens, se ha vuelto usual en el tabaco (DeBlock et al., 1987; Grierson et al., 1990; Hilder, et al., 1990; Lindbo y Dougherty, 1992). El uso comercial de la transformación genética en agricultura depende de la incorporación de genes introducidos en germoplasma de alto rendimiento. Los fitomejoradores pueden desear combinar varios genes introducidos en una sola fuente de germoplasma élite. Para lograr este propósito, es deseable la construcción de cromosomas diseñados o artificiales. Se han producido cromosomas diseñados o artificiales en levaduras. En plantas, el escenario para la construcción de cromosomas diseñados se puede encontrar en una línea de reproducción que posea el complemento completo de cromosomas de su propia especie, más un cromosoma adicional de una especie emparentada; véase Campbell, et al., Construction of a designer chromosome in tabacco, TheorAppl Genet (1994) 87: 837-842. Los cromosomas adicionales son con frecuencia meióticamente estables como homocigotos, y puesto que la recombinación entre cromosomas adicionales y el resto del genoma de la planta es rara (Gerstel 1945), se puede preservar la integridad de un paquete de ligamiento de genes introducidos. La colocación de este paquete de ligamiento en un cromosoma adicional, reducirá también al máximo la perturbación del resto del genoma de la planta. La estructura genética del germoplasma de alto rendimiento se puede perturbar mediante mutagénesis por inserción, o la perturbación de bloques de ligamiento benéficos. La mutagénesis por inserción, causada por la integración de genes introducidos en secuencias de codificación de la planta, puede ocurrir con frecuencia. Konez, et al. (1989) calcularon que por lo menos 30% de todas las inserciones de ADN T ocurren en regiones transcritas de los genomas de Arabídopsis y Nicotiana. Se forman bloques de ligamiento benéficos mediante interapareamiento y recombinación, seguidos de selección. Los rasgos deseados para una planta pueden no estar presentes en el germoplasma de la especie de interés. En tal caso, la reproducción tradicional dentro de la especie puede no dar lugar a resultados aceptables.

La introducción de un rasgo deseado de una especie en una especie emparentada mediante hibridación interespecífica, va seguida de introgresión en el progenitor recurrente. Métodos para la expresión de genes en plantas se han descrito en las patentes de E.U.A. Nos. 5,316,931; 5,589,367; 5,811,653 y 5,866,785. las cuales se incorporan en la presente como referencia. Ciertas especies tienen una biomasa aceptable o una expresión aceptable de una secuencia insertada en el vector viral de una planta, pero ninguna especie común tiene altos niveles de biomasa y altos niveles de rendimiento de vectores virales. Existe por lo tanto la necesidad de un método que permita desarrollar, en una especie, las características de biomasa incrementada y rendimiento mejorado de vectores virales.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención está dirigida a un método para cruzar dos diferentes especies de Nicotiana para producir un híbrido interespecífico que dé como resultado una biomasa incrementada y susceptibilidad mejorada del hospedero a un vector viral. De conformidad con esta invención, se han producido híbridos interespecíficos de Nicotiana que se caracterizan por tener una biomasa mayor que la que se obtiene usualmente del tabaco con construcciones de fusión de CP y un rendimiento de viriones mayor de 1.0 mg de viriones/gramos de peso fresco. En una modalidad de la invención, se provee un híbrido interespecífico novedoso de Nicotiana. Esta invención se refiere así a las semillas del híbrido interespecífico de Nicotiana, a las plantas del híbrido interespecífico de Nicotiana, y a métodos para producir una planta híbrida interespecrfica de Nicotiana producida cruzando el híbrido interespecífico de Nicotiana consigo mismo u otra línea híbrida interespecífica de Nicotiana. De esta manera, cualquiera de dichos métodos que use el híbrido interespecífico de Nicotiana, forma parte de esta invención: autopolinización, retrocruzas, producción de híbridos, cruzas con poblaciones, y similares. Todas las plantas producidas usando un híbrido interespecífico de Nicotiana como progenitor, están dentro del alcance de esta invención. En forma ventajosa, el híbrido interespecífico de Nicotiana se podría usar en cruzas con otros híbridos interespecíficos de Nicotiana diferentes para producir semillas y plantas híbridas interespecíficas de Nicotiana de la primera generación (Fi) con características superiores. En otro aspecto, la presente invención provee plantas convertidas en un solo gen de híbridos interespecíficos de Nicotiana. El gen transferido individual puede ser de preferencia un alelo dominante o recesivo. De preferencia, el gen transferido individual conferirá rasgos tales como resistencia a herbicidas, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades bacterianas, fungosas o virales, fertilidad masculina, androesterílidad, calidad nutricional mejorada y uso industrial. El gen individual puede ser un gen de Nicotiana que ocurra naturalmente, o un transgen introducido mediante técnicas de ingeniería genética. En otro aspecto, la presente invención provee células regenerables para su uso en cultivo de tejidos de un híbrido interespecífico de Nicotiana. El cultivo de tejidos será de preferencia capaz de regenerar plantas que tengan las características fisiológicas y morfológicas del híbrido interespecífico de Nicotiana anterior, y de regenerar plantas que tengan sustancialmente el mismo genotipo que el híbrido interespecífico de Nicotiana anterior. De preferencia, las células regenerables en dicho cultivo de tejidos serán embriones, protoplastos, células meristemáticas, callos, polen, hojas, anteras, raíces, ápices de la raíz, flores, semillas, vainas o tallos. Todavía más, la presente invención provee plantas de Nicotiana regeneradas a partir del cultivo de tejidos de la invención.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Para facilitar el entendimiento de varios de los términos que se usan en la especificación y las reivindicaciones, se proveen las siguientes definiciones: Vector viral Geneware Como se usa en la presente, vector viral Geneware™ se refiere a un sistema para la expresión de genes en plantas, tal como se describe en las patentes de E.UA Nos. 5,316,931 ; 5,589.367; 5,811 ,653 y 5,866,785, incorporadas en la presente como referencia.

Biomasa Como se usa en la presente, el término "biomasa" significa el peso fresco total en gramos de tejido de la planta que se cosecha arriba del suelo. Los términos "peso fresco" y "biomasa" se usan recíprocamente en la presente.

Rendimiento de vinones Como se usa en la presente, el término "rendimiento de vinones" significa el rendimiento total del virus medido en miligramos de vinones por gramos de peso fresco.

Hospedero Como se usa en la presente, un "hospedero" significa una célula, tejido u organismo capaz de sustentar la replicación de un vector o ácido nucleico viral de la planta, y que es capaz de ser infectado por un virus que contiene al vector viral o ácido nucleico viral de la planta.

Infección Como se usa en la presente, una "infección" significa la capacidad de un virus para transferir su ácido nucleico a un hospedero, o introducir ácido nucleico viral en un hospedero, en donde el ácido nucleico viral es replicado, las proteínas virales son sintetizadas, y las nuevas partículas virales son ensambladas. En este contexto, los términos "transmisible" e "infeccioso" se usan recíprocamente en la presente.

Rasgo fenotípico Como se usa en la presente, "rasgo fenotípico" es una propiedad observable que resulta de la expresión de un gen o genes.

Tejido vegetal Como se usa en la presente, "tejido vegetal" es cualquier tejido de una planta en plantación o en cultivo. Este término se usa para incluir una planta completa, célula vegetal, órgano de la planta, protoplasto, cultivo de células, o cualquier grupo de células vegetales organizadas en una unidad estructural y funcional.

Acido nucleico viral recombinante de la planta Como se usa en la presente, "ácido nucleico viral recombinante de la planta" significa que ha sido modificado para contener secuencias de ácido nucleico no nativas.

Virus recombinate de la planta Como se usa en la presente, "virus recombinante de la planta" es un virus de la planta que contiene al ácido nucleico viral recombinante de la planta.

Vector Como se usa en la presente, "vector" es una molécula de ácido nucleico auto-replicante que transfiere un segmento de ácido nucleico entre células.

Virus Como se usa en la presente, "virus" es un agente infeccioso formado de un ácido nucleico encapsidado en proteína. Un virus puede ser un virus mono-, di-, tri- o multi-partita.

Retrocruza Como se usa en la presente, la "retrocruza" es un procedimiento en el cual el fitomejorador cruza repetidamente la progenie híbrida de vuelta con alguno de los progenitores, por ejemplo, una primera generación F<i híbrida con uno de los genotipos párenteles (progenitores) del híbrido F-i.

Esencialmente todas las características fisiológicas v morfológicas Como se usa en la presente, una planta que tiene esencialmente todas las características fisiológicas morfológicas, significa una planta que tiene las características fisiológicas y morfológicas, excepto las características derivadas del gen convertido.

Gen individual convertido (por conversión) Como se usa en la presente, una planta con un "gen individual convertido (por conversión)" se refiere a plantas que son desarrolladas, en donde esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas de una variedad se recuperan, además del gen individual transferido en una variedad, mediante la técnica de retrocruza o mediante ingeniería genética.

Tricomas Como se usa en la presente, "tricomas" significa los pelos glandulares sobre la superficie del tallo, hoja, cáliz o corola de la planta, u otras superficies de los tejidos de la planta.

Lámina foliar Como se usa en la presente, "lámina foliar" significa la superficie de la hoja carente de tejido vascular de naturaleza primaría, secundaría o terciaría.

GFP-GJ Como se usa en la presente, "GFP-GJ" significa un extracto crudo de la planta que contiene proteína verde fluorescente.

GFP-DH5. ¾ Como se usa en la presente, "GFP-pH5, ?" significa un extracto crudo de la planta que se trató con calor y a un pH de 5, y que contiene proteína verde fluorescente que es enriquecida por su presencia.

CP-GJ Como se usa en la presente, "CP-GJ" significa un extracto crudo de la planta que contiene proteína de la cubierta viral.

CP-DH5. ? Como se usa en la presente, "CP-pH5, ?" significa un extracto crudo de la planta que se trató con calor y a un pH de 5, y que contiene proteína de cubierta que es enriquecida por su presencia.

Las especies vegetales hospederas varían en su capacidad para sustentar la expresión de una secuencia insertada en un vector viral de la planta. Por ejemplo, algunas especies (tales como Nicotiana benthamiana) sustentan la expresión de un promotor subgenómico doble de vector tobamovira! a una alta actividad específica, pero tienen relativamente poca biomasa. Otras especies (tales como N. tabacum), tienen alta biomasa y/u otras propiedades deseables para crecimiento en el campo, pero tienen una actividad específica relativamente baja de la proteína expresada. Mediante el uso del método de la presente invención, después de la duplicación de los cromosomas para restaurar la fertilidad, el híbrido primario puede tener propiedades adecuadas, o puede ser deseable hacer retrocruzas con cualquier progenitor, seleccionando en cada generación las propiedades deseadas del progenitor no recurrente (por ejemplo, introgresión de la biomasa superior de N. tabacum en N. benthamiana, o introgresión del rendimiento superior de los vectores virales de N. benthamiana en N. tabacum). Un vector viral que exprese la proteína verde fluorescente (GFP), es un ejemplo de una herramienta útil para seleccionar el nivel de expresión sistémico en plantas híbridas candidatas. El vector viral Geneware™ se refiere a un sistema para expresar genes en plantas, tal como se describe en las patentes de E.UA Nos. 5,316,931 ; 5,589,367; 5,811.653 y 5,866,785, las cuales se incorporan en la presente como referencia.

EJEMPLOS Se proveen los siguientes ejemplos para ilustrar mejor la presente invención, y no se pretende que limiten la misma más allá de las limitaciones descritas en las reivindicaciones anexas.

EJEMPLO 1 Procedimientos para hacer cruzas interespectficas de Nicotiana Cuando se hagan cruzas interespecíficas, es importante contar con: 1 ) plantas sanas, 2) emasculación cuidadosa, 3) ausencia de contaminación por polen introducido, 4) un nivel razonable de fertilidad cruzada entre las plantas progenitoras, y 5) registro de las cruzas. Se usa un par de fórceps finos de punta curva para separar la corola y emascular la flor. En el caso de que N. tabacum y muchas otras especies, las anteras son removidas poco antes de que la corola se despliegue. Varias excepciones se aplican a esta regla general. En el caso de N. repanda, las anteras están adnadas al estigma, las paredes de la antera usualmente se degradan, y los contenidos de la antera se adhieren al estigma antes de que la flor madure. Las anteras en las últimas flores de N. nudicauHs que se forman, pueden sufrir dehiscencia antes de que la corola se despliegue y ocurra la autopolinización. Las flores de estas especies son emasculadas varios días antes de que se realicen las polinizaciones cruzadas.

Por lo regular, las polinizaciones se hacen inmediatamente después de la emasculación, hasta 18 a 24 horas después de la emasculación antes de aplicar el polen. La superficie brillante y pegajosa del estigma es tocada con una antera que recién ha sufrido dehiscencia, o se puede aplicar polen con ayuda de un pequeño pincel (de tamaño 6/128 a 10/128). La polinización con pincel ayuda a que se forme semilla en algunas especies autofértiles, por lo que se requieren polinizaciones fraternas para producir semilla de especies autoestériles. El pincel que se usa para transferir polen es insertado entre individuos fraternos y pasado de arriba abajo, en una maceta. Se prefieren los pinceles económicos con mango de plástico sobre aquellos pinceles con mango de madera, ya que la actividad de los microorganismos hará que el mango se pudra. Si no se puede obtener polen de una planta deseada de plantas vivas, se debe usar polen que se colectó en una primera instancia, y se debe almacenar congelado en cápsulas de gelatina. Gwynn ha encontrado que polen congelado de N. tabacum puede permanecer viable hasta durante 7 años. Si se tiene la sospecha que una planta progenitora aloja un virus mecánicamente transmitido, los instrumentos se esterilizan en etanol a 70%. Después de que se haya realizado una polinización, un tramo de un popote, ligeramente más largo que el pistilo, se coloca sobre el estigma, y se ondula mediante plegamiento para evitar su contaminación por polen de la misma planta o polen introducido. El uso de popotes es quizá innecesario si las plantas están bien espaciadas en el banco del invernadero, las flores maduras son removidas, y los insectos o los movimientos excesivos de aire presentan un problema. Además, bajo la mayoría de las circunstancias, el estigma totalmente cubierto con el polen deseado, ofrece protección suficiente ante la contaminación. Usualmente, la fecundación es afectada dentro de 1 a 2 días. Deben marcarse las cruzas individuales con una pequeña etiqueta ensartada. Debe humedecerse el cordón antes de enrollarlo alrededor del pedicelo; de otra manera, la flor se puede desprender cuando el cordón es apretado. Si se planea un número de cruzas idénticas, se puede ahorrar tiempo marcando las etiquetas antes de realizar la polinización. Por lo general, la semilla de la mayoría de las especies de Nicotiana madurará alrededor de 28 días después de la polinización. Se pueden obtener en primera instancia plántulas de N. tabacum raspando las semillas en desarrollo de los carpelos alrededor de 18 días después de la polinización, y tratándolas en hipoclorito de sodio a 0.5 por ciento (Clorox y agua, 1:9) durante aproximadamente 10 minutos. Una o dos cápsulas de N. tabacum contendrán semilla suficiente para mantener una línea de reproducción, pero el rendimiento de semillas por cápsula de otras especies puede ser considerablemente menor. Algunas especies de Nicotiana son esencialmente neutras durante el día, mientras que otras requieren condiciones especiales de temperatura y duración del día para iniciar la floración. Por lo tanto, cuando se planeen hibridaciones específicas, deben considerarse los requisitos de duración del día de las especies involucradas, a menos que se tenga la posibilidad de congelar el polen para su uso en un tiempo posterior. Ciertas cruzas pueden requerir una multitud de polinizaciones individuales con la esperanza de obtener una semilla individual entre muchas cápsulas maduras, por ejemplo, la cruza de N. rustica diploide x N. tabacum. Las hibridaciones difíciles pueden producir una escasez de semilla mermada de un tamaño menor que el promedio. Aunque la mayoría de las semillas de este tipo es con frecuencia estéril, es posible inducir que algunas de ellas germinen si se siembran en suelo en placas de preparación de plástico o vidrio cubiertas. Cuando las semillas son de número limitado, no se deberá tratar a las plántulas con colchicina. La selección de las plantas más vigorosas es mejor para propagación asexual. Después, los ápices de crecimiento del material clonal deberán ser tratados con colchicina acuosa a 0.5 por ciento tres veces al día durante 3 días, para inducir la duplicación de los cromosomas. La caída prematura de la flor se puede evitar mediante el uso de ácido indolacético a 0.5 por ciento en lanolina. Este ácido se aplicará sumergiendo una aguja en la preparación, y raspando el pedicelo en su punto de fijación. Este tratamiento hará que la flor permanezca en la planta, sin importar el desarrollo del embrión y, por lo tanto, no ofrece garantía alguna de una hibridación exitosa. Por otra parte, la singamia sirve para prevenir la abscisión.

EJEMPLO 2 Selección de líneas párenteles foroaenitorasi para híbridos de N. excelsior/N. benthamiana 5 Se colectaron siete números de acceso de N. excelsior. Todos los números de acceso tenían características similares, pero se determinó que únicamente TW46 y TW47 eran hospederos adecuados para el vector viral Geneware™. Se identificó que TW46 era un hospedero ineficaz para ciertos genes de inserción en el vector viral Geneware™. Puesto que se observó r ^ 10 necrosis sistémica en TW46, se seleccionó a TW47. Un grupo de más de 100 hospederos TW47 de N. excelsior fue inoculado para dar un estudio estadísticamente válido del rendimiento del vector viral Geneware™ en N. excelsior. Casi todas las plantas mostraron una expresión de GFP sistémica de buena a excelente. Una preparación viral de 200 gramos de plantas 15 enteras infectadas, dio un rendimiento final de 2 mg de viriones/gramo de peso fresco. Inesperadamente, esta cifra fue 5 a 10 veces mayor que el , rendimiento de viríones que se obtuvo típicamente de tabaco con construcciones de fusión de CP. En vista del mayor rendimiento de viríones para N. excelsior cuando se extendió al campo, el rendimiento por acre sería 20 similar al tabaco, pero la cantidad de tejido (desperdicio) en la corriente de bioprocesamiento, se redujo ampliamente. Resultados típicos para N. benthamiana, son 0.9 mg de viriones/gramo de peso fresco.

Se seleccionaron varios números de acceso de N. benthamiana para biomasa, y como hospedero para expresión sistémica a partir del vector viral Geneware™ subgenómico doble. Uno de los números de acceso que tuvo mejor rendimiento fue TW16.

EJEMPLO 3 Un híbrido interespecífico primario entre TW47 de N. excelsior y TW16 de N. benthamiana, mostró muy buena expresión sistémica de GFP con el vector viral Geneware™. Se llevó a cabo la regeneración de la nervadura media para estimular la duplicación de los cromosomas y la recuperación de la fertilidad (véase la referencia Campbell et al., Theor Appl Genet 87 (1994) 837-842; Kasperbauer y Collins, Crop Sci 12 (1972) 98-101 ). TW47 y TW16 se obtuvieron de la colección de germoplasma de tabaco del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, en Oxford, NC. Vanos regenerantes produjeron semilla, indicando duplicación de cromosomas y fertilidad recuperada. El nombre de trabajo para la especie híbrida es N. excelsiana. La semilla se hizo germinar, y las plantas resultantes se evaluaron para biomasa y expresión sistémica del vector viral Geneware™. La expresión sistémica de GFP estuvo próxima al nivel de N. benthamiana. La biomasa y el hábito de crecimiento fueron similares a los de N. excelsior. Se cultivaron plantas en Kentucky para una prueba agronómica. Las plantas sobrevivieron bien en el campo (mejor que N. benthamiana), y mostraron cierta resistencia al moho azul. La biomasa fue intermedia entre los valores de los progenitores. El híbrido primario con duplicación de cromosomas entre N. excelsior y N. benthamiana (N. excelsiana), parece ser una línea estable de reproducción verdadera. Tiene buena biomasa y excelentes propiedades para el vector viral Geneware™, y mostró un buen rendimiento en una prueba realizada en Kentucky. En el cuadro 1 siguiente se muestran las observaciones fenotípicas para varios rasgos de dos líneas de cada uno de los progenitores TW16 de Nicotiana benthamiana; TW47 de Nicotiana excelsior y el híbrido 7.b de Nicotiana excelsiana Oí O Oí CUADRO 1 Observ. iciones fenotípicas Fecha de siembra: 310/91 í; fecha de colecta de datos: 4/22/99 Nlcotíana benthamiana Nfcotiana excelsior Nioofíana excelsiana Rasgos TW16 #1 TW18 #2 TW47 #1 TW47 #2 7.b#1 7 b #2 Primera flor abierta 4/23/99 422/99 Gemación Gemación Gemación Gemación AHura (a la parte superior 20 cm 26 cm 27 cm 20 cm 34 cm 26 cm del tallo) Hoja más larga (longitud) 18 cm 19.5 cm 17-20 cm 19.5 cm 21 cm 19 cm Hoja más larga (ancho) 13 cm 13.5 cm 10-12 cm 10 cm 14 cm 13 cm Forma de la hoja Redonda Redonda Oblonga Oblonga Oval Oval Angulo de la hoja 90· 90° 90· 90a 90° 90° Verde Verde Verde Verde Color de la hoja Verde oscuro Verde oscuro intermedio intermedio intermedio intermedio Número Número Tricomas moderado, moderado, Pocos, largos Pocos, largos Pocos, largos Pocos, largos pequeños pequeños Hoja del pecíolo No No Sí, 70-80 mm Sí, 40 mm Sí, 20 mm Sí, 1 mm Continua Continua Longitud del pecíolo 5 cm 6 cm ß cm 5 cm con/lámina foliar con/lámina foliar Lámina foliar 13 x 13 cm 13.5 x 13.5 cm 20 x 12 cm 19.5 x 10 cm 15 x 14 cm 14 x 13 cm Longitud internodular 10 mm 15 mm 15 mm 15 mm 22 mm 21 mm Diámetro del pedicelo 7 mm 7 mm 7 mm 8 mm 7 mm 7 mm Sí, escasamente Sí, 2 nódulos SI, en cada Sí, en cada Sí, 2 nódulos Aún no Ramificación a partir de 5 nodulo follar nodulo foliar observada comenzando a comenzando a nódulos foliares extenderse extenderse Forma de la flor Nb Nb Color de la flor Blanco Blanco Una flor/nodulo Una flor/nódulo Hábito de la cabezuela follar sobre el foliar sobre el de la flor tallo principal tallo principal o n n CUADRO 2 Observaciones fenotf picas Fecha de siembra: 3/10/99; fecha de colecta de datos: 4/26/99 Nlcotiana benthamiana NfcoOana excete/or Nlcotiana axcelsiana Características TW16#1 TW16«2 TW47#1 TW47#2 7.b#1 7.b#2 SI, meristemos SI, meristemos Yemas del 4/25/99 Yemas del 4/25/99 Yemas del 4/25/99 secundarios secundarios producidas en las producidas en las Gemación; Primera flor abierta comenzando a comenzando a ramas más producidas en s apertura estándar gemar gemar superiores las ramas más ramas má superiores superiores iniciada el 4/28/99 Altura (a la parte superior 24 cm 31 cm 40 cm del tallo) 31 cm 49 cm 40 cm Hoja mas larga (longitud) 21 cm 21 cm 21 cm 21 cm 23 cm 22 cm Hoja mas larga (ancho) 15 cm 15 cm 14 cm 11.5 cm 15.5 cm 13.7 cm Forma de la hoja Redonda Redonda Oblonga Oblonga Oval Oval Angulo de la hoja 90' 90* 90" <90" 90" 90" Color de la hoja Verde intermedio Verde intermedio Verde oscuro- intermedio Verde Intermedio Verde intermedio Verde intermedio Número moderado, Número moderado, Tricomas pequeros pequeños Pocos, largos Pocos, largos Pocos, largos Pocos, largos Hoja del peciolo No No SI, 9.5 cm Sí, cm SI, 20 mm SI, 18 mm Longitud del peciolo 5 cm 6cm N/A N/A 7 cm 5.5 cm Lámina foliar 16 x 1Scm 1S x 15cm 21 14 cm 2 x 11.5cm 16 x 15.5 cm 16.5 x 13.7 cm Longitud intemodular 1.6 cm (10 nodulos) 2 cm (10 nodulos) 3.2 cm (5 nodulos) 2.9 cm (5 (10 nodulos) 3 cm (8 nodulos) 2.4 cm nodulos) Diámetro del pedicelo 7 mm 8 mm 8 mm 7 mm 8 mm 8 mm Sf, casi todos los 31, casi todos los SI, 5 están Sf, 5 están SI, 9 están Ramificación Si, 6 están nodulos follares nodulos follares extendiéndose extendiéndose extendiéndose extendiéndose Forma de la flor Nb Nb Larga Larga Media N/A Color de la flor Blanco Blanco Blanco Blanco Blanco N/A 1/ nodulo a partir 1/ nodulo a partir 1/ nodulo a partir 1/ nodulo a partir Hábito de la cabezuela de 1/nódulo a partir del del pedicelo del pedicelo del pedicelo del pedicelo N/A la flor pedicelo principal principal principal principal principal CUADRO 3 EJEMPLO 4 Progenie de la retrocruza del híbrido interesuecíftco TW47 x TW16 Se llevaron a cabo retrocruzas con cada tipo parental (progenitor) para evaluar las características de los sesquidiploides. La retrocruza con N. excelsior fue la única que germinó. Se parecía mucho a N. excelsior, y dio un patrón similar de expresión de GFP respecto de N. excelsior. Se llevó a cabo una retrocruza adicional para generar la primera generación de degradación, y las plantas resultantes actualmente están siendo evaluadas.

EJEMPLO 5 Se continuó la selección en el campo de varías especies de Nicotiana en 1999. El propósito de este estudio fue evaluar las diferencias de biomasa entre las especies, evaluar las diferencias de las características de crecimiento entre las especies, y evaluar las diferencias de presión por insectos y enfermedades entre las especies. Se sembraron nueve especies diferentes de Nicotiana en el invernadero en abril 14. Cada especie se sembró en tres bandejas de 72 celdas, y se colocó en un lecho de flotación especialmente construido. Se usaron medios de crecimiento Burley Gold para los transplantes. Las bandejas fueron llenadas manualmente, y se hicieron huecos en ellas usando el plantador Golf Ball. Se usó semilla nueva para ocho de las especies, y las semillas de benthamiana transformadas a pellas se usaron para los transplantes de la cepa de laboratorio de benthamiana. Se usó el sembrador manual GROmore para sembrar la semilla nueva, y la semilla transformada a pellas se sembró manualmente. Cada bandeja fue marcada con un marcador para identificar cada especie. Las bandejas de la cepa de laboratorio de benthamiana transformada a pellas fueron saturadas con agua durante tres días después de la emergencia de las plántulas, para disolver el recubrimiento de arcilla de las pellas y facilitar la emergencia de los cotiledones. El cuadro 4 describe las especies transplantadas en este estudio.

CUADRO 4 r ^ 10 Los transplantes se trataron, mediante el agua de saturación, con el fungicida Ridomil. Un insecticida, orteno, y un fungicida aplicado foliarmente, ditano, se aplicaron también a los transplantes. A 21 DPT, se aplicó fertilizante al agua de saturación. Se mantuvo un nivel de fertilidad de 7 15 en el medidor DiSST-4 a lo largo de la producción de transplantes. Los transplantes fueron transportados al ARP para transplante r , en mayo 20, 37 DPS. Las plantas fueron transplantadas en lechos de plástico cubiertos de color negro, usando un transplantador mecánico a una densidad de cuatro plantas por .305 metros del lecho. Las plantas fueron transplantadas 20 en dos hileras sobre el lecho con una configuración de plantas desplazadas. El agua de transplante contenía 1.89 litros de fertilizante de inicio 7-14-7 y 0.22 kg de orteno por 567.75 litros de agua. Cada especie fue replicada tres veces, y cada replicación consistió de 3.05 metros de lecho.

Durante el transplante, varías diferencias fueron evidentes en la calidad del transplante. TW 16 produjo un transplante ligeramente larguirucho, el cual se marchitó poco después del transplante. Los transplantes de TW 17 " fueron más pequeños que los otros transplantes de benthamiana. Sin 5 embargo, los transplantes de TW 17 tenían un tallo más denso y parecían ser mucho más robustos que los otros transplantes de benthamiana. Las plantas de la cepa de laboratorio de benthamiana, fueron mucho más pequeñas y menos consistentes en tamaño debido a problemas de germinación durante la fase de producción de transplantes. Estos problemas se debieron quizá al 10 hecho de que estas semillas fueron transformadas a pellas. Algunos de los transplantes de obliqua eran ya alargados al tiempo de realizar el transplante. Los transplantes de más alta calidad fueron las plántulas de excelsiana. Estas plántulas tenían un color verde muy oscuro, tenían un tallo denso, y parecían manejar la tensión del transplante mucho mejor que las otras plántulas en esta 15 parcela. Todas las réplicas de las parcelas fueron tratadas cada 7-10 días con orteno y ditano ai régimen de una cucharada de té/3.785 litros. La humedad del suelo se monitoreó usando bloques de yeso que se enterraron aproximadamente 10.16 cm - 12.7 cm en los lechos. No fue necesario 20 practicar riego para esta parcela debido a la precipitación oportuna. En junio 29, 43 DPT, cuatro plantas de cada réplica fueron muestreadas para determinar su peso fresco. El cuadro 5 ilustra los resultados de cada réplica.

CUADRO 5 Varías réplicas murieron debido a la pudríción de la raíz inducida por el exceso de agua en torno al lecho elevado. Este exceso de agua se debió a la precipitación excesiva y el drenaje deficiente de la parcela.

El cuadro 6 resume los pesos de las réplicas. El cuadro 6 siguiente es el promedio de todas las réplicas de cada especie.

CUADRO 6 TW 17 mostró un rendimiento bueno comparativamente con benthamiana en la parcela. TW 17 era una planta muy vigorosa con resistencia excelente y altos niveles de biomasa. Se deben hacer más estudios para determinar la conveniencia de esta planta como un hospedero de vectores virales. Asimismo, excelsiana resultó ser una planta superior en esta parcela. Esta planta mostró altos niveles de biomasa, con peso y tamaño de la hoja significativos. Esta invención está dirigida también a métodos para producir una planta de Nicotiana cruzando una primera planta progenitora de Nicotiana con una segunda planta progenitora de Nicotiana, en donde la primera o segunda planta de Nicotiana es la planta de Nicotiana de la línea híbrida interespecífica de Nicotiana. Además, la primera y segunda plantas progenitoras de Nicotiana pueden ser de la variedad cultivada TW47 x TW16. Por lo tanto, cualquiera de los métodos que utilice esta variedad, forma parte de esta invención: autopolinización, retrocruzas, reproducción de híbridos y cruzas con poblaciones. Cualquier planta producida usando esta variedad cultivada como progenitor, está dentro del alcance de esta invención. Como se usa en la presente, el término "planta" incluye células vegetales, protoplastos vegetales o cultivos de tejidos de los cuales se pueden regenerar plantas de Nicotiana, así como callos, masas vegetales y células vegetales que estén intactas en plantas o partes de plantas, tales como polen, flores, embriones, óvulos, semillas, vainas, hojas, tallos, raíces, anteras, y similares. De esta manera, otro aspecto de esta invención es proveer células que después de diferenciarse, produzcan una variedad cultivada que tenga esencialmente todas las características fisiológicas y morfológicas del híbrido interespecífico de Nicotiana. Se conoce en la técnica el cultivo para expresar genes estructurales y células cultivadas deseadas. Como se sabe también en la técnica, las células de Nicotiana son transformables y regenerables, de modo que se pueden obtener plantas completas que contengan y expresen genes deseados bajo control regulador. Descripciones generales de vectores de expresión en plantas, y genes reporteros y protocolos de transformación, se pueden encontrar en Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation, en Methods in Plant Molecular Biobgy & Biotechnology", en Glich, et al., (eds. pp. 89-119, CRC Press, 1993). Además, vectores de expresión de GUS y cassettes de genes, de GUS están disponibles de Clone Tech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, mientras que vectores de expresión de luciferasa y cassettes de genes de luciferasa, están disponibles de Pro Mega Corp.

(Madison, Wisconsin). Métodos generales para el cultivo de tejidos vegetales se proveen, por ejemplo, en Maki, et al., "Procedures for Introducing Foreign ADN into Plants", en Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glich, et al., (Eds., pp. 67-88 CRC Press, 1993), y en Phillips, et al., "Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation", en Corn & Com Improvement, 3a. edición; Sprague, et al., (Eds. pp. 345-387), American Society of Agronomy Inc., 988. Métodos para introducir vectores de expresión en tejidos vegetales incluyen la infección directa o co-cultivo de células vegetales con Agrobacterium tumefaciens, Horsch et al., Science, 227:1229 (1985). Descripciones de sistemas de vectores de Agrobacterium y métodos para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium, se proveen en Gruber, et al., citado anteriormente. Métodos útiles incluyen, pero no están limitados a, vectores de expresión introducidos en tejidos vegetales usando métodos de transferencia directa de genes, tales como suministro mediado por microproyectiles, inyección de ADN, electroporación, y similares. Más preferiblemente, se introducen vectores de expresión en tejidos vegetales usando el suministro mediado por microproyectiles con el dispositivo biolistico de transformación mediada por Agrobacterium. Se pretende que las plantas transformantes obtenidas con el protoplasma de la invención, estén dentro del alcance de la misma. La presente invención contempla una planta de Nicotiana regenerada a partir de un cultivo de tejidos de una variedad de planta híbrida de la presente invención. Como es bien sabido en la técnica, se puede usar el cultivo de tejidos de Nicotiana para la regeneración in vitro de la planta de Nicotiana. El cultivo de tejidos de varios tejidos de Nicotiana y la regeneración de plantas del mismo, en bien conocido y está ampliamente publicado. Por ejemplo, se puede hacer referencia a Weissbach y Weissbach (eds.), Meth. Enzymol. 118 (1986); y Zaitlin et al. (eds.), Biotechnology in Plant Science (1985). Cuando el término planta de Nicotiana se usa en el contexto de la presente invención, incluye también cualquier conversión de genes individuales de esa variedad. El término planta convertida en genes individuales, como se usa en la presente, se refiere a aquellas plantas de Nicotiana que se obtienen mediante una técnica de fitomejoramiento denominada retrocruza, en donde se recuperan esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas de una variedad, además del gen individual transferido en la variedad mediante la técnica de retrocruza. Se pueden usar métodos de retrocruza de la presente invención para mejorar o introducir una característica en la variedad. El término retrocruza, como se usa en la presente, se refiere a la cruza repetida de la progenie de un híbrido de vuelta con el progenitor recurrente. La planta parental de Nicotiana que contribuye el gen para la característica deseada, se denomina el progenitor no recurrente o donador. Esta terminología se refiere al hecho de que el progenitor no recurrente se usa una vez en el protocolo de retrocruza, y por lo tanto no es recurrente. La planta parental de Nicotiana a la cual el gen o los genes de la planta no recurrente son transferidos, se conoce como el progenitor recurrente, ya que se usa para varios ciclos en el protocolo de retrocruza (Poehlman & Sleper, 1994; Fehr, 1987). En un protocolo de retrocruza típico, la variedad original de interés (progenitor recurrente) es cruzada con una segunda variedad (progenitor no recurrente) que posee el gen individual de interés que va a ser transferido. La progenie resultante de esta cruza es cruzada entonces de nuevo con el progenitor recurrente, y el procedimiento se repite hasta que se obtenga una planta de Nicotiana en donde esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas del progenitor recurrente se recuperan en la planta convertida, además del gen transferido individual del progenitor no recurrente. La selección de un progenitor recurrente adecuado es un paso importante para un procedimiento exitoso de retrocruza. El propósito de un protocolo de retrocruza es alterar o sustituir una característica o rasgo individual en la variedad original. Para lograr esto, un gen individual de la variedad recurrente es modificado o sustituido con el gen deseado del progenitor no recurrente, mientras retiene esencialmente el resto de la genética deseada y, por lo tanto, la constitución fisiológica y morfológica deseada de la variedad original. La elección del progenitor no recurrente particular dependerá del propósito de la retrocruza, y uno de los propósitos principales es agregar algún rasgo comercialmente deseable y agronómicamente Importante a la planta. El protocolo de retrocruza exacto dependerá de la característica o el rasgo que esté siendo alterado, para determinar un protocolo de prueba apropiado. Aunque los métodos de retrocruza se simplifican cuando la característica que está siendo transferida es un alelo dominante, se puede transferir también un alelo recesivo. En este caso, puede ser necesario introducir una prueba de progenie para determinar si la característica deseada ha sido transferida con éxito. Se han identificado muchos rasgos de genes individuales que no se seleccionan regularmente en el desarrollo de una nueva variedad, pero que se pueden mejorar mediante técnicas de retrocruza. Los rasgos de genes individuales pueden o no ser transgénicos, y algunos ejemplos de ellos incluyen, pero no están limitados a, androesterílidad, resistencia a herbicidas, resistencia a enfermedades bacterianas, fungosas o virales, resistencia a insectos, fertilidad masculina, calidad nutricional mejorada, uso industrial, estabilidad de rendimiento y mejora de rendimiento. Por lo general, estos genes se heredan a través del núcleo.

Información del depósito Se ha hecho un depósito de la semilla de Nicotiana de esta invención, con la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. El depósito se hizo en julio 12, 1999, y tiene el número de acceso de ATCC . Aunque la presente invención se ha descrito con cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y entendimiento, será obvio que pueden ponerse en práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención, lo cual es limitado únicamente por el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 5 1- Un método para producir híbridos interespecíficos de Nicotiana, caracterizado porque comprende: a. seleccionar una primera línea parental para un alto nivel de biomasa en una especie; b. seleccionar una segunda línea parental para nivel incrementado de proteína sistémica a partir de la expresión de un vector viral en otra especie; c. cruzar un primer r 10 progenitor de alta biomasa con un segundo progenitor de alto nivel de expresión para producir una cruza interespecífica; d. usar colchicina o regeneración de la nervadura media para estimular la duplicación de los cromosomas y la fertilidad, y e. cosechar la semilla resultante. 2. - La semilla híbrida producida a partir del método que se 15 reclama en la reivindicación 1. 3. - La semilla híbrida producida a partir del método que se r s reclama en la reivindicación 1, caracterizada además porque dicha primer línea parental es TW16 y dicha segunda línea parental es TW47, y la cual se ha depositado con el número de acceso de ATCC . 20 4.- El método de conformidad con la reivindicación 1. caracterizado porque dicha primera línea parental es TW16. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha segunda línea parental es TW47. 6. - Una planta de Nicotiana, o sus partes, producidas haciendo crecer la semilla que se reclama en la reivindicación 2. 7. - Polen de la planta que se reclama en la reivindicación 6. 8. - Un óvulo de la planta que se reclama en la reivindicación 6. 5 9.- Una planta de Nicotiana caracterizada porque tiene esencialmente todas las características fisiológicas y morfológicas de la planta de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 6, o sus partes. 10.- Cultivo de tejidos de la semilla que se reclama en la reivindicación 2. r 10 1.- Una planta de Nicotiana regenerada a partir del cultivo de tejidos que se reclama en la reivindicación 10. 12. - Cultivo de tejidos de células regenerables de la planta, o sus partes, de conformidad con la reivindicación 6. 13. - El cultivo de tejidos de conformidad con la reivindicación 12, 15 caracterizado además porque las células regenerables son embriones, células meristemáticas, polen, hojas, anteras, raíces, ápices de la raíz, flor, semillas, tallos, o protoplastos o callos derivados del mismo. 14. - Una planta de Nicotiana regenerada a partir del cultivo de tejidos que se reclama en la reivindicación 13. 20 15.- Un método para producir progenie de retrocruza a partir de híbridos interespecíficos de Nicotiana, caracterizado porque comprende: a. seleccionar un progenitor de un híbrido interespecífico como progenitor recurrente, con base en el nivel de expresión de proteína sistémica a partir de un vector viral; b. retrocruzar dicho híbrido interespecífico con el "progenitor a" recurrente, y un rendimiento de viríones una o más veces; c. seleccionar progenie de la retrocruza para biomasa mayor que el peso fresco en gramos del "progenitor a", y un rendimiento de viríones mayor de 1.0 miligramos de viriones/g de peso fresco; y d. cosechar las semillas resultantes. 16. - La semilla híbrida producida a partir del método que se reclama en la reivindicación 15. 7. - Una planta de Nicotiana, o sus partes, producidas haciendo crecer la semilla que se reclama en la reivindicación 16. 18. - Polen de la planta que se reclama en la reivindicación 17. 19. - Un óvulo de la planta que se reclama en la reivindicación 17. 20. - Una planta de Nicotiana que tiene esencialmente todas las características fisiológicas y morfológicas de la planta de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 17, o sus partes. 21. - Un cultivo de tejidos de la semilla que se reclama en la reivindicación 16. 22. - Una planta de Nicotiana regenerada a partir del cultivo de tejidos que se reclama en la reivindicación 21. 23. - El cultivo de tejidos de células regenerables de la planta, o sus partes, que se reclama en la reivindicación 17. 24. - El cultivo de tejidos de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque las células regenerables son embriones, células merístemáticas, polen, hojas, anteras, raíces, ápices de la raíz, flor, semillas, tallos, o protoplastos o callos derivados del mismo. 25. - Una planta de Nicotiana regenerada a partir del cultivo de tejidos de conformidad con la reivindicación 24. 26. - Una semilla híbrida interespecífica de Nicotiana designada como , en donde una muestra de dicha semilla ha sido depositada bajo el número de acceso de ATCC . 27. - Una planta, o sus partes, producidas haciendo crecer la semilla que se reclama en con la reivindicación 26. 28. - Polen de la planta que se reclama en la reivindicación 27. 29. - El óvulo de la planta que se reclama en la reivindicación 27. 30. - Una planta de Nicotiana que tiene esencialmente todas las características fisiológicas y morfológicas de la planta de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 27, o sus partes. 31. - El cultivo de tejidos de la semilla que se reclama en la reivindicación 26. 32. - Una planta de Nicotiana regenerada a partir del cultivo de tejidos que se reclama en la reivindicación 31. 33. - Un cultivo de tejidos de células regenerables de la planta, o sus partes, que se reclama en la reivindicación 27. 34. - El cultivo de tejidos de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque las células regenerables son embriones, células merístemáticas, polen, hojas, anteras, raíces, ápices de la raíz, flor, semillas, tallos, o protoplastos o callos derivados del mismo. 35.- Una planta de Nicotiana regenerada a partir del cultivo de tejidos que se reclama en la reivindicación 34. 36.- Un método para producir una semilla de Nicotiana, caracterizado porque comprende cruzar una primera planta progenitora de Nicotiana con una segunda planta progenitora de Nicotiana y cosechar la semilla híbrida resultante de Nicotiana, en donde dicha primera o segunda planta progenitora de Nicotiana es la planta de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 27. 37. - Una semilla híbrida de Nicotiana producida mediante el método que se reclama en la reivindicación 36. 38. - Una planta híbrida de Nicotiana, o sus partes, producidas haciendo crecer dicha semilla híbrida de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 37. 39 - La semilla de Nicotiana producida a partir de dicha planta híbrida de Nicotiana como se reclama en la reivindicación 38. 40.- La planta de Nicotiana, o sus partes, producidas a partir de la semilla de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 39. 41.- La planta de Nicotiana de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque comprende la conversión de un gen individual. 42. - La conversión del gen individual de la planta de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 41, caracterizada porque el gen es un gen transgénico. 43. - La conversión del gen individual de la planta de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 41, caracterizada además porque el gen es un alelo dominante. 44. - La conversión del gen individual de la planta de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 41, caracterizada además porque el gen es un alelo recesivo. 45. - La conversión del gen individual de la planta de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 41, caracterizada además porque el gen confiere resistencia a herbicidas. 46. - La conversión del gen individual de la planta de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 41 , caracterizada además porque el gen confiere resistencia a insectos. 47. - La conversión del gen individual de la planta de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 41 , caracterizada además porque el gen confiere resistencia a enfermedades bacterianas, fungosas o virales. 48. - La conversión del gen individual de la planta de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 41, caracterizada además porque el gen confiere androesterilidad. 49.- La conversión del gen individual de la planta de Nicotiana que se reclama en la reivindicación 41 , caracterizada además porque el gen confiere calidad nutrícional mejorada.