KR100758118B1

KR100758118B1 - 생체시계에 의해 조절되는 벼 개화시기조절 유전자 및 이를이용한 식물의 개화시기 조절 방법

Info

Publication number: KR100758118B1
Application number: KR1020050122223A
Authority: KR
Inventors: 김정국; 윤충효; 이정환; 신봉수
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2005-12-13
Filing date: 2005-12-13
Publication date: 2007-09-11
Also published as: KR20070087804A

Abstract

본 발명은 벼 (Oryza sativa)에서 분리한 식물의 생체시계에 의해 조절되는 개화시기 (출수기) 조절 유전자인 벼 COL 유전자(OsB), 상기 유전자 염기서열에 의해 암호화되는 단백질 (OsB)을 제공한다. 또한 본 발명은 OsB 유전자를 식물체에 과다 발현시키거나 안티센스(antisense) 기술로 발현을 저하시킴으로써 식물의 개화시기를 조절하는 방법에 관한 것이다. 따라서 본 발명에서 분리된 OsB 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 개화시기조절 단백질은 식물체의 개화시기를 조절함으로써 식물체의 생산성 증대 및 타 식물체에서 개화시기 및 생체시계 조절 유전자의 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있다.

개화시기 조절, 생체시계 조절, 유전자, OsB, 벼

Description

생체시계에 의해 조절되는 벼 개화시기조절 유전자 및 이를 이용한 식물의 개화시기 조절 방법{circadian-regulated rice flowering time gene, and method for manipulating flowering time of plants using the same}

도 1a 및 도 1b는 본 발명에 의한 벼 COL (OsB) 유전자의 cDNA 염기서열(서열번호 1) 및 벼 OsB 단백질의 아미노산 서열(서열번호 2)을 보여주는 도면.

도 2a 및 도 2b는 본 발명에 의한 벼 COL (OsN) 유전자의 cDNA 염기서열(서열번호 3) 및 벼 OsN 단백질의 아미노산 서열(서열번호 4)을 보여주는 도면.

도 3a 및 도 3b는 본 발명에 의한 벼 COL (OsP) 유전자의 cDNA 염기서열(서열번호 5) 및 벼 OsP 단백질의 아미노산 서열(서열번호 6)을 보여주는 도면.

도 4a는 본 발명에 의한 벼 COL (OsB) 단백질의 아미노산 서열을 애기장대 CO, COL1, COL2 단백질의 아미노산 서열과 비교한 도면.

도 4b는 본 발명에 의한 벼 COL (OsN과 OsP) 단백질들의 아미노산 서열을 애기장대 COL10, COL14 단백질의 아미노산 서열과 비교한 도면.

도 4c는 본 발명에 의한 벼 COL (OsB, OsN, OsP) 단백질들과 애기장대 COL 단백질들 간의 도메인 구조를 비교한 도면.

도 5는 장일조건에서 본 발명에 의한 OsB(S12569) 유전자의 일주기 발현양상을 보여주는 도면.

◆: OsGI, □: Hd1, ▲: OsB (S12569)

도 6은 장일조건에서 본 발명에 의한 OsN(S3574)과 OsP(C60910) 유전자들의 일주기 발현양상을 보여주는 도면.

◆: OsN (S3574), ■: OsP (C60910), △: Hd1

도 7은 본 발명에 의한 OsB(S12569), OsN(S3574), OsP(C60910) 유전자들의 시간적, 공간적 발현양상을 보여주는 노던 분석 결과 도면.

레인 1번부터 8번까지는 벼의 유수(panicle)부분으로 어린 시기부터 성숙한 시기까지이고, 9, 10번은 벼의 잎이고 11, 12번은 벼의 뿌리임.

도 8a 및 도 8b는 본 발명에 의한 OsB(S12569)의 순방향 유전자가 도입된 형질전환 벼에서의 서던(Southern) 분석을 보여주는 도면.

화살표(삼각형의 화살표 머리를 의미함)는 낙동벼 자체가 갖고 있는 OsB 유전자 (약 6kb와 1.5kb 위치)

도 9는 본 발명에 의한 OsB(S12569)의 역방향 유전자가 도입된 형질전환 벼에서의 서던(Southern) 분석을 보여주는 도면.

화살표는 낙동벼 자체가 갖고 있는 OsB 유전자 (약 6kb와 1.5kb 위치)

도 10a는 본 발명에 의한 OsB(S12569)의 순방향 유전자가 도입된 형질전환 벼 T₀세대에서의 노던(Northern) 분석 결과를 보여주는 도면.

도 10b는 본 발명에 의한 OsB(S12569)의 역방향 유전자가 도입된 형질전환 벼 T₀세대에서의 노던(Northern) 분석 결과를 보여주는 도면.

도 11은 본 발명에 의한 OsB(S12569) 유전자가 순방향과 역방향으로 도입된 형질전환 벼 T₀세대에서의 출수기를 보여주는 그래프.

도 12는 본 발명에 의한 OsB의 순방향과 역방향 유전자가 도입된 형질전환 벼 T₁세대에서의 노던(Northern) 분석 결과를 보여주는 도면.

1: 낙동벼, 2-11: OsB 유전자-순방향 형질전환 T₁ 세대, 12-19: OsB 유전자-역방향 형질전환 T₁ 세대, 이 중에서 1, 8, 9, 19 라인은 BASTA-저항성 계통(BASTA-aensitive line).

본 발명은 벼 (Oryza sativa)에서 분리한 식물의 생체시계에 의해 조절되는 개화시기 (=출수기) 조절 유전자인 벼 COL 유전자(OsB), 상기 유전자 염기서열에 의해 암호화되는 단백질 (OsB)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 OsB 유전자를 식물체에 과다 발현시키거나 안티센스(antisense) 기술로 발현을 저하시킴으로써 식물의 개화시기를 조절하는 방법에 관한 것이다.

식물의 생활사는 영양생장기와 생식 생장기로 나누어지며, 개화는 생식 생장기의 특징 중의 하나이다. 영양생장기에서 생식생장기로의 전환은 정단 분열조직이 잎 대신에 꽃을 형성하는 화기 분열조직으로 변하는 분명한 상전이 과정이다. 대부분의 식물에서 이러한 변화는 빛, 춘화처리와 같은 환경적 요인과 식물의 발달 단 계에 의해 조절되어진다. 그 중에서 광주기에 관련된 유전자들은 특히 빛신호에 의해 영향을 받는다.

애기장대는 쌍자엽 식물의 모델로서 장일조건에서 개화가 촉진되는 식물이다. 빛 신호는 광수용체에 의해 인지되어 GI와 ELF3를 통해 CCA1, LHY, TOC1 같은 생체시계 유전자들에 영향을 준다. 이러한 유전자들은 피드백고리(feedback loop) 기작을 통한 상호작용을 통해 생체시계를 유발하고, 이에 의해 영향을 받는 유전자들에 의해 잎 운동, 광합성 능력, 세포생장 등의 많은 식물의 생리적 현상들이 조절되어진다.

또한, 개화시기를 조절하는 CO, CRY2, GI, FT 같은 광주기 경로에 있는 유전자들의 일주기 발현양상에 영향을 준다. 예를 들어, 빛 신호를 생체시계 유전자들에 전달하는 입력(input) 경로에 있는 GI 유전자 발현은 해가 뜨는 새벽에서 8-10 시간 후에 증가하며, 이 유전자가 불활성화된 돌연변이체에서는 이러한 주기가 짧아지고 개화도 느려지게 된다. CO는 생체시계에 의해 조절되어지는 광주기 경로에 있는 하위 유전자이다 (CO는 GI와 CRY2의 하위이며, FT의 상위). CO 유전자의 발현은 장일조건의 오후 4시와 새벽에 특히 강하고, 오후 8시에 감소가 된다. 단일조건에서는 장일조건에 비해 CO 유전자의 발현폭이 좁아지게 된다. CO는 N-말단에 두 개의 징크핑거를 가지고, C-말단 부위에 CCT 도메인으로 구성된 단백질이다. CCT 도메인은 CO, COL, TOC1 단백질에서 발견되며, 애기장대에서는 16개의 COL 유전자가 알려져 있다. 그 중에서 COL1과 COL2의 발현이 일주기 양상을 보이는 것으로 알려져 있다. 그러나, CO 유전자의 과다발현이 개화시기를 촉진시키는 반면에, 이 두 유전자들의 과다발현은 개화시기에 영향을 주지 않고 단지 일주기만 감소되었다.

한편, 벼는 단일 조건에서 개화가 촉진되는 단자엽 식물로서 이들의 개화시기 (출수기)는 광주기와 영양 생장기의 기간에 의해 영향을 받으며, 이러한 요인들은 벼가 다양한 경작지에서 생장하는데 관여하는 중요한 농업적 형질이다. 그 중에서 광주기는 벼의 개화시기 및 생체시계를 조절함으로써 중요하게 생장에 영향을 미쳐 직접적으로 생산성에 영향을 미친다. 또한, 최근에 벼의 전체게놈에 대한 염기서열이 완료되고, 비교 유전체학에 대한 연구가 진행되면서 벼는 중요한 단자엽 모델식물로써 주목을 받고 있다.

애기장대의 광주기 경로에 관련된 여러 유전자들이 벼에서 보존되어 있지만, 기능은 특이적이다. 벼에서 애기장대의 GI, CO, FT의 유사 유전자인 OsGI, Hd1, Hd3a의 일주기 발현양상은 애기장대와 마찬가지로 존재하지만 단일조건에서 Hd3a의 발현은 Hd1의 발현과 반대의 양상을 보인다. 이 결과는 Hd1을 과다 발현시킨 형질전환 벼에서도 입증이 되었다. 애기장대에서 COL1과 COL2의 발현뿐만 아니라 CCT 도메인이 없는 일부 CO 유사 유전자의 발현도 CO의 발현과 유사함이 보고 되어있다.

그러나, 벼에서 COL 유전자의 일주기 발현양상과 개화시기 조절의 기능에 대해서는 아직까지 보고가 된 바가 없다. 따라서 벼에서 개화시기 및 생체시계 조절 유전자 및 그 기능에 대한 연구는 계속 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점 및 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명자들은 단일 식물의 모델인 벼로부터 COL 유전자들을 분리하여 생체시계에 의해 조절됨을 확인하였고, 또한 그 중 한 유전자를 이용하여 식물체의 개화시기를 조절할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명자들은 애기장대 COL 유사 유전자들 (OsB, OsN, OsP)을 벼에서 찾았으며 그 기능을 분석하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 벼에서 분리된 신규한 생체시계에 의해 조절되는 개화시기 조절 유전자 및 이 유전자 염기서열에 의해 코딩되는 개화시기 조절 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 박테리아 및 벼를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 이용하여 식물체의 개화시기 조절 방법및 다른 생체시계 조절유전자를 발견하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 신규한 식물의 개화시기 조절 단백질(OsB)을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자(OsB)를 제공한다.

또한, 본 발명은 또한 상기 OsB 유전자를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해 형질전환된 박테리아 및 벼를 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 OsB 유전자를 이용하여 식물체에서의 개화시기를 조 절하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 및 단백질을 이용하여 식물의 개화시기 조절및 생체시계 조절 유전자 또는 단백질을 탐색하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 구성에 대해 상세히 설명한다. 본 명세서에서 본 발명에 의한 벼 COL 유전자들의 영문표기와 관련하여 이탤릭체는 유전자를 보통글씨체는 단백질을 나타낸다.

1) 벼 COL 유전자들의 동정

벼에서 애기장대 CO와 유사한 유전자를 찾기 위하여 벼 게놈 테이터베이스를 검색하여 징크핑거를 가진 세 개의 cDNA 염기서열 [OsB(GenBank accession number: AB001887), OsN(GenBank accession number: AB001888), OsP(GenBank accession number:AB001882)] 을 찾았고, 한국 벼 품종인 일품벼에서 이 유전자들을 PCR을 통해 얻었다. 염기서열을 분석한 결과, 동일한 서열을 가지고 있었으며 이를 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3을 각각 부여하였다 (도 1a 및 도 1b, 도 2a 및 도 2b, 도 3a 와 3b).

본 발명에 의한 COL 단백질과 애기장대 유사단백질간의 도메인 구조를 분석한 결과, OsB(S12569)는 애기장대 CO, COL1, COL2 그룹에 속하였고, OsN(S3574)과 OsP(C60910)는 애기장대 COL9 그룹에 속하였다 (도 4c). OsB(S12569)는 애기장대 COL2와 아미노산 서열을 비교시 53%의 유사성을 보였지만, B-box와 CCT 도메인에서는 각각 73%와 91%의 높은 상동성을 보였다 (도 4a). OsB(S12569)는 두개의 B-box 와 한 개의 CCT 도메인을 가진 애기장대 COL2와의 높은 유사성에도 불구하고 애기장대의 다른 COL6, 7, 8, 16처럼 한 개의 B-box와 한 개의 CCT 도메인만을 가지고 있었다. 그러나, OsB(S12569)는 같은 단백질 구조를 가진 COL6, 7, 8, 16과는 아미노산 상동성에서 덜 유사하였고, 애기장대의 COL6, 7, 8, 16의 아미노산 서열을 가지고 벼 게놈 데이터베이스 검색시에도 OsB(S12569)는 높은 상동성 값을 가지지 못했다. 또한, OsB는 CO, COL1, COL2처럼 B box와 CCT 도메인 사이의 지역과 C-말단 부위에 존재하는 네 개의 짧은 보존 부위를 가지고 있었으며, 이 부위는 COL6, 7, 8, 16에서는 발견할 수가 없었다. 한편, OsN(S3574)과 OsP(C60910)의 아미노산 서열은 애기장대의 COL10과 COL14와 유사하였다 (도 4b).

2) 벼 COL 유전자들의 일주기 양상 분석

본 발명에 의한 OsB(S12569)의 일주기 양상을 정확히 분석하기 위하여 1일 동안 단일 조건 (10시간-명/14시간-암)에서 키우다 2일간 계속적인 광을 준 조건에서 3시간 간격으로 벼 조직을 취하여 전체 RNA를 분리한 후에 양적 발현(semi-quantitative) RT-PCR을 수행하였다. 대조구로 OsGI와 Hd1을 사용하였다. OsGI는 빛이 있는 동안에 강한 발현을 보였고, Hd1은 빛이 뜨기 전에 강한 발현을 보였다. 계속적인 광 조건에서도 변하지 않는 일주기 양상을 보였다 (도 5). OsB의 일주기 양상은 OsGI와 Hd1과 반대의 양상을 보였다. OsB(S12569) 유전자의 경우도 단일 조건에서 보인 일주기 양상을 계속적으로 보였지만, 계속적인 광 조건에서 약간 발현 폭이 넓어지는 양상을 보였다. 반면에 OsN(S3574)과 OsP(C60910) 유전자는 같은 조건에서 Hd1과 유사한 일주기 양상을 계속적으로 유지하였다 (도 6). 따라서, 애기장대의 COL 유전자들과 마찬가지로 벼 COL 유전자들의 발현도 생체시계의 조절을 받는 것이 확인되었다.

3) 벼 COL 유전자들의 시간적, 공간적 발현양상

벼 COL 유전자들의 시간적, 공간적 발현양상을 조사하기 위하여 여러 조직에서 전체 RNA를 분리하여 양적 발현(semi-quantitative) RT-PCR을 수행하였다 (도 7). OsN(S3574)과 OsP(C60910) 유전자는 OsGI와 마찬가지로 어린 시기의 발달 동안의 여러 조직이나 화기의 발달 과정 모두에서 강하게 발현을 보였다. 반면에, OsB(S12569) 유전자는 Hd1과 유사하게 화기 발달의 초기 과정에 강하게 발현되고 후기 발달 단계에서는 감소되었다.

4) 순방향과 역방향(antisense)의 OsB 유전자를 과다 발현시킨 형질전환 벼의 제조

벼 COL 유전자들의 일주기 양상과 발현양상을 조사한 결과, OsB 유전자가 Hd1과 반대 양상을 보이므로, OsB 유전자가 Hd1처럼 벼의 개화시기를 조절할 수 있는지 알아보기 위하여 순방향과 역방향의 OsB 유전자를 과다 발현시킨 형질전환 벼를 제조하였다.

형질전환 T₀세대에서 OsB 유전자에 대한 순방향과 역방향 형질전환벡터를 가졌는지 여부를 조사하기 위하여 각각의 형질전환 벼에서 서던(Southern) 분석을 수행하였다. 순방향 OsB 유전자를 가진 형질전환 벼에서는 약 4 kb 위치에서 도입된 OsB 유전자 밴드를 확인하였다 (도 8a 및 도 8b). 밴드의 강도와 단편의 크기를 고 려할 때 7번과 8번은 단일 유전자가 삽입되었으며, 9번, 10번, 11번은 다수의 유전자가 도입된 것으로 확인되었다. 역방향 OsB 유전자를 가진 벼에서도 1번, 3번, 4번, 5번에서 약 4 kb 위치에서 도입된 OsB 유전자 밴드를 확인할 수 있었다 (도 9).

실질적으로 형질전환된 OsB 유전자가 발현되는 지 여부를 조사하기 위하여 전체 RNA를 분리하여 노던(Northern) 분석을 수행하였다 (도 10a 및 도 10b). 그 결과, 순방향과 역방향의 OsB 유전자를 가진 형질전환 벼의 다수의 라인에서 OsB 유전자가 안정적으로 발현이 되고 있음을 확인할 수 있었다.

온실 (장일조건)에서 자라고 있는 형질전환 T₀세대의 출수기를 조사해보았을 시 순방향 OsB 유전자가 도입된 형질전환 벼의 경우는 낙동벼에 비해 출수기가 20일 정도 더 늦어졌으며, 역방향 OsB 유전자가 도입된 형질전환 벼의 경우도 낙동벼와 비교시 약 1주일 늦어졌다 (도 11). Hd1 단백질은 단일조건에서는 출수기를 빨라지게 하나 장일 조건에서 느려지게 하기 때문에 hd1 돌연변이(mutant) 벼의 경우는 장일조건하에서 출수기가 빨라진다는 보고와 비교해보았을 시 OsB유전자는 Hd1유전자와는 반대 기능을 한다고 할 것이다. 또한, 형질전환 벼 T₁세대에서 도입된 본 발명에 의한 OsB 순방향 유전자 및 역방향 유전자가 안정적으로 발현이 되는지를 노던 분석으로 확인하였다 (도 12). 자연조건 (장일조건과 유사)하에서 농촌진흥청 GMO벼 전용포장에서 T₁세대의 형질전환벼들의 출수기를 조사한 결과 온실에서와 유사한 결과를 얻었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 벼에서 분리한 COL 단백질들은 일주기 양상을 보이는 생체시계에 의해 조절되는 단백질인 것이 확인되었다. 특히 OsB 유전자는 Hd1 유전자와는 반대로 개화시기를 조절하는 것이 확인되었다. 따라서 본 발명의 유전자들을 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써, 식물의 개화 및 생체시계를 조절하여 작물생산량을 증대시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 OsB 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자들은 식물의 개화시기 및 생체시계 조절 유전자의 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 유전자들과 결합하는 물질, 상기 유전자들의 발현 억제 또는 활성화하는 물질을 탐색함으로써 식물의 개화 및 생체시계 관련성을 탐색하는 용도로 사용될 수 있다. 구체적으로 일반적으로 사용되는 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블럿 분석, 서던 블럿 분석, 효소 면역반응(ELISA) 및 2-D 겔 분석 등을 포함하는 다양한 방법으로 분석을 수행할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1. 벼 개화시기 및 생체시계 유전자들의 동정]

벼 개화시기 및 생체시계 조절 유전자들을 벼 게놈 데이터베이스의 검색을 통해 동정하였으며, 그 유전자들은 다음과 같다; OsGI (GenBank accession number: AB012107), Hd1 (GenBank accession number: AB041838), OsB (GenBank accession number: AB001887), OsN (GenBank accession number: AB001888), OsP (GenBank accession number:AB001882), rice-MADS like gene (GenBank accession number: AB003328). 이 유전자들의 다중서열 정렬(multiple amino acid sequence alignment)은 Neighbor 프로그램을 이용하여 실시하였다.

그 결과, 도 1a 및 도 1b는 본 발명에 의한 벼 COL (OsB) 유전자의 cDNA 염기서열(서열번호 1) 및 벼 OsB 단백질의 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타내고, 도 2a 및 도 2b는 본 발명에 의한 벼 COL (OsN) 유전자의 cDNA 염기서열(서열번호 3) 및 벼 OsN 단백질의 아미노산 서열(서열번호 4)을 나타내고, 도 3a 및 도 3b는 본 발명에 의한 벼 COL (OsP) 유전자의 cDNA 염기서열(서열번호 5) 및 벼 OsP 단백질의 아미노산 서열(서열번호 6)을 나타냈다. 또한, 도 4a에는 본 발명에 의한 벼 COL (OsB) 단백질의 아미노산 서열을 애기장대 CO, COL1, COL2 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 도시하고, 도 4b에는 본 발명에 의한 벼 COL (OsN과 OsP) 단백질들의 아미노산 서열을 애기장대 COL10, COL14 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 도시하고, 도 4c에는 본 발명에 의한 벼 COL (OsB, OsN, OsP) 단백질들과 애기장대 COL 단백질들 간의 도메인 구조를 비교하여 도시하였다.

[실시예 2. 양적 발현(Semi-quantitative) RT-PCR 분석]

전체 RNA를 TRI 시약 (Moleular Research Center, USA)을 이용하여 여러 벼 조직으로 추출하였다. 분리한 1 μg RNA로부터 M-MLV 역전사효소(Invitrogen, USA)를 사용하여 cDNA를 합성한 후에 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로즈겔 (agarose gel)에 전기영동한 후 나이론막(nylon membrane, Amersham, UK)에 흡착시켜 이를 동위원소로 표지한(labeling) 탐침을 이용하여 혼성화(hybridization)하였다. PCR 조건은 94도 30초, 53-57도 30초, 72도 1분의 프로그램을 27회 반복한 후 72도에서 7분간 반응을 계속하였다.

여러 유전자들을 증폭하기 위해서 사용된 프라이머들은 다음과 같다. OsGI, 5'-CTGTGATGAGGAAGTAGCTCGTTA-3'(서열번호 7)과 5'-AAATAGTAATCTGGACGCAAGGTC-3'(서열번호 8) 프라이머들; Hd1, 5'-TTCTCCTCTCCAAAGATTCC-3'(서열번호 9)과 5'-CATACGCCTTTCTTGTTTCA-3'(서열번호 10) 프라이머들; OsB, 5'-ACTACGACGATGACGACGC-3'(서열번호 11)과 5'-CCTCGTCTTCCTCTTCTCCC-3'(서열번호 12) 프라이머들; OsN, 5'-CAGCAGTCCGTTGTCTTGAA-3'(서열번호 13)과 5'-TTGCTACATTCTGGCTGCAC-3'(서열번호 14) 프라이머들; OsP, 5'-CGGCGATCATCAGTTACCTT-3'(서열번호 15)과 5'-GAGCTTTGCGGGACTCATAC-3'(서열번호 16) 프라이머들; rice MADS-like gene, 5'-GTGGTTGGTTGGTTCATCG-3'(서열번호 17)과 5'-ATCCAGCTTATTCCTGGCCT-3' (서열번호 18) 프라이머들; RAc1, 5'-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3'(서열번호 19)과 5'-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3'(서열번호 20) 프라이머들.

그 결과는 도 5 내지 도 6에 도시하였다.

[실시예 3. OsB 유전자의 순방향과 역방향의 형질전환 벡터 구축]

OsB 유전자에 대한 순방향과 역방향의 벡터를 구축하기 위하여 pGEM-T 이지벡터(easy vector)에 클로닝(cloning) 되어있는 OsB 유전자의 시작 코돈과 종결코돈에서 프라이머(primer)를 제작하여 PCR로 증폭한 후 다시 pGEM-T 이지벡터(easy vector)에 클로닝하였다.

삽입단편을 염기서열분석으로 확인한 후 순방향(sense)와 역방향(antisense)으로 들어간 클론을 찾아 제한효소 NotI을 사용하여 구조유전자부위를 절단하여 바이너리벡터(binary vector)인 pMJU 플라스미드(plasmid)의 NotI 위치에 연결(ligation)한 후 대장균 DH5α에 형질전환(transformation) 하였다.

pMJU-OsB 플라스미드(plasmid)를 대장균에 삽입한 후 항생제 스펙티노마이신이 33 ug/L로 함유된 LB 아가(agar) 배지에서 선발된 콜로니(colony)를 액체배양 하여 플라스미드(plasmid) DNA를 분리하고 제한효소 NotI으로 삽입단편을 확인하였다.

OsB 유전자가 클로닝된 바이너리벡터(binary vector, pMJU-OsB)는 쓰리패어렌탈 메이팅(triparental mating) 방법으로 아그로박테리움(Agrobacterium LBA4404)에 도입하였고 항생제 선발배지에서 도입여부를 확인하였다. PCR 및 염기서열분석으로 구축된 벡터를 확인하였다.

[실시예 4. OsB 유전자를 과다발현시킨 형질전환 벼의 구축]

벼 캘러스 유기 및 증식의 경우는 벼 종자의 살균은 껍질을 벗긴 낙동벼 종자를 70 % 에탄올에서 5분간 표면살균 후 2 % 락스 (유한락스, 4 % 유효염소함유) 용액에서 15분씩 2번 살균한 다음 멸균수로 5분씩 5회 반복하여 실시하였다.

이렇게 살균된 종자는 2 mg/L 농도의 2.4-D가 함유된 2N6 배지에 치상하여 26℃에서 약 4주간 암 배양하여 캘러스를 증식하였다. 캘러스가 유기된 후 즉 4주간 암 배양하여 증식된 캘러스 중 생육이 좋은 배발생 캘러스(embryogenic callus) 를 선발하여 2N6 배지에서 2일간 배양하여 준비하였다.

형질전환벡터를 함유한 아그로박테리움(agrobacterium) 균은 항생제가 포함된 AB 아가(agar) 배지에서 2일간 배양 후 AAM 액체배지 (100 uM acetosyringone 함유)에 희석하여 1.5 - 2.0 OD가 되도록 조절하였다. 약 500개의 선발된 배발생 캘러스와 25 ml 정도의 아그로박테리움 현탁액을 페트리 디쉬(petri dish)에 혼합하여 25℃에서 15분간 배양한 후 여분의 균 배양액을 제거하고 2N6-acetosyringine (250 mg/L) 배지에 치상하여 2 일간 공동배양(co-culture) 하였다.

공동배양(Co-culture) 후 250 mg/L 농도의 세포탁심(cefotaxime)이 함유된 멸균수로 calli 표면에 자란 아그로박테리움을 세척하고 2N6-CP 선발배지 (250 mg/L cefotaxime, 2.5 mg/L PPT)에 치상하여 암 배양하였다. 2N6-CP 배지에서 3주간의 선발과정을 거친 캘러스를 새로운 2N6-CP 배지에 계대하여 3주간 배양하였고 식물체의 재분화는 MSR-CP 배지(250 mg/L cefotaxime, 2.5 mg/L PPT)에서 유도하였다. 재분화된 형질전환벼는 MS0-PPT (2.5 mg/L PPT) 배지에서 순화시킨 후 온실에서 증식하였다.

[실시예 5. 서던(Southern) 분석과 노던(Northern) 분석]

게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하여 15 μg을 EcoRV로 잘랐다. 1.2% 아가로즈겔(agarose gel)에서 전기영동한 후, 나일론막(nylon membrane, Amersham, UK)에 흡착시켰다. RNA는 약 10 μg을 포름알데히드(formaldehyde)가 포함된 1.2% 아가로즈겔에서 전기영동한 후 역시 나일론막에 흡착시켰다.

이들은 동위원소 표지 전장 cDNA 프로브(dCTP-radiolabeled full length cDNA probe)를 이용하여 67℃에서 혼성화(hybridization) 시켰고, x-ray 필름을 이용하여 검출(detection) 하였다. 그 결과는 도 8a 내지 도 10b에 나타내었다.

[실시예 6. 형질전환 벼의 출수기 조사]

온실에서 자라고 있는 재분화 식물체에 대해 Basta 제초제 (0.5%)를 살포하여 저항성을 보이는 지 여부를 조사하여 저항성 개체에서 종자를 받았다. 각 계통별로 충실한 종자를 선별하여 종자소독 후, 파종하여 온실에서 계속 키운 후에 출수기를 조사하였다. 만생종인 낙동벼도 함께 파종하여 형질전환 벼의 출수기를 비교 분석하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 벼에 분리한 COL 단백질(OsB, OsN, OsP)은 일주기 양상을 보이는 생체시계에 조절받는 단백질임을 확인하였다. 특히, 본 발명에 의한 OsB 유전자는 생체시계에 조절받는 개화시기 조절유전자인 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 유전자를 이용하여 식물체의 개화시기를 조절함으로써 식물체의 생산성 증대 및 타 식물체에서 개화시기 및 생체시계 조절 유전자의 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 유전자를 포함하는 재조합벡터로 식물체를 형질전환시킴으로써 벼의 개화시기를 지연시키는 방법.
삭제
삭제