JP2000116381A - 組換えグループ１ダニアレルゲンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、ダニ由来のアレルゲン、さらに具体
的には組換えグループ１アレルゲンの製造方法を提供す
る。 【解決手段】プロ配列を含むグループ１ダニアレルゲン
をコードする遺伝子を組換え技術により大腸菌（Escher
ichia coli）で発現させ、得られたプロ体を特定のｐＨ
と塩濃度で再生と精製を行い、プロ配列を除去すること
を特徴とする活性型組換えグループ１ダニアレルゲンの
製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なアレルゲン
製造方法に係わり、さらに詳細にはダニ由来のアレルゲ
ン、さらに具体的には組換えグループ１アレルゲンの製
造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、アレルギー性疾患が増加してお
り、社会的に問題になっている。その代表的なものとし
て、花粉症、アトピー性皮膚炎およびアトピー性喘息を
挙げることができる。このうち、特に、アトピー性喘息
は、室内塵によって発症することが多い。室内塵の中に
は、ダニの虫体および排泄物、カビの胞子、ペットの体
毛などが含まれる。このような室内塵の成分中でダニ由
来のタンパク質が最も重要なアレルギー原因物質（アレ
ルゲン）である。アレルギーを引き起こすダニの種類と
しては、コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae
（以下「Der f」と略す））とヤケヒョウヒダニ（Derma
tophagodes pteronyssinus（以下「Der p]と略す））が
知られている。ダニアレルゲンのうちで主要なものは、
排泄物中に多く含まれる、分子量約25キロダルトン（以
下、「KDa」と略す）のグループ１と、虫体中に多く含
まれる、分子量約14KDaのグループ２と呼ばれるもので
ある。グループ１アレルゲンはシステインプロテアーゼ
ファミリーに属するプロテアーゼであり、虫体内ではま
ず８０アミノ酸残基から成るプロ配列を持つ不活性型の
前駆体として産生され、プロ配列が切断されることによ
り、プロテアーゼ活性を持つ活性型となる。グループ
１、グループ２アレルゲンは、それぞれ由来するダニの
種類によってDerｆ 1、Der p 1、Der f 2、Der p 2と称
されている。これらのアレルゲンをコードする遺伝子は
cDNAとしてすでにクローニングされており（Dilworth,
R. J., et al.: Clinical and Experimental Allergy,
21, 25-32, 1991、Chua, K. Y., et al.: J.Exp.Med. 1
67, 175-182, 1988、Yuuki, T., et al.: Jpn. J. Alle
rgol., 39, 557-561, 1990、Chua, K.Y., et al.: Int.
Arch. Allergy Appl. Immunol., 91, 118-123, 199
0）、その結果から、Der f 1とDer p 1、Der f 2とDer
p 2にはそれぞれ高い相同性があることが明らかとなっ
ている。この２つのグループのアレルゲンに対し、アト
ピー性喘息患者、アトピー性皮膚炎患者の過半数が反応
することが報告されている（Heymann, P.W., et al.:
J. Allergy Clin. Immunol., 83, 1055-1067,1989)。

【０００３】したがって、これらグループ１、グループ
２アレルゲンは、診断試薬あるいは研究試薬として高い
需要がある。さらに、最近、原因アレルゲンを体内に投
与することによりそのアレルゲンに対する反応を抑止す
る減感作療法の有効性が認められつつあるが、これらの
アレルゲンを用いて減感作治療を行うことにより、ダニ
アレルゲンに起因するアトピー性喘息を効果的に治療で
きる可能性がある。いずれの場合も、とりわけ減感作療
法に用いる場合には、純度の高い、高品質のアレルゲン
が大量に必要である。そこで、これらのアレルゲンの純
品を大量にかつ安価に製造する方法の確立が望まれてき
た。グループ１、グループ２アレルゲンは、それぞれ、
ダニ排泄物および虫体からの単離に成功している（Yasu
eda, H. etal.: Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.,
88, 402-407, 1989）が、精製には手間がかかるうえ、
収率が非常に低く、大量に調製することは実質的に不可
能であった。そこで、遺伝子組換えの手法を用いてこれ
らのアレルゲンを製造する試みがなされており、グルー
プ２アレルゲンに関しては、大腸菌を用いた製造方法が
確立されている（Iwamoto. N, et al, Int. Arch. Alle
rgy Immunol., 109, 356-361, 1996)。グループ１アレ
ルゲンに関しては、バキュロウイルス系を使用して昆虫
細胞においてDer f 1を発現させることに成功している
（Shoji, H. etal.: Biosci. Biotech. Biochem., 60
(4), 621-625, 1996）。しかし、用いる培地等が高価で
あり、コスト面で実用的ではない。さらに、虫体由来の
天然のDerf 1と異なる糖鎖を有するため、この部分が新
たな抗原性を持つ可能性があり、減感作に使用するには
適していない。天然のグループ１アレルゲンと全く同じ
糖鎖を持つ組換えアレルゲンを製造するには、ダニの細
胞で製造する必要があるがそのような系は全く未開発で
あった。

【０００４】一方、糖鎖を結合させなくするため、遺伝
子操作によりアミノ酸配列を変え糖鎖結合部位を消失さ
せることも可能であるが、アミノ酸配列のうえから天然
アレルゲンとは異なってしまい、タンパク質としての性
質に影響を与える恐れがあった。したがって天然のグル
ープ１アレルゲンと全く同じアミノ酸配列を持ち、糖鎖
以外はタンパク質として天然グループ１アレルゲンと同
じ組換えグループ１アレルゲンを製造する方法の確立が
必要であった。大腸菌は糖鎖付加能力がなく、取り扱い
も容易で短期間で安価に培養できるので、グループ１組
換えアレルゲンを発現させる宿主として最も好ましい。
しかし、大腸菌においては、Der f 1のプレプロ体をグ
ルタチオントランスフェラーゼ分子（以下、「GST」と
略す）との融合タンパク質として発現させた例、Der p
1を同じくGSTとの融合タンパク質として発現させた例が
あるのみである（公表特許公報 平6-500993、公表特許
公報 平3-501920）。したがって、これまで、天然アレ
ルゲンと同等の活性を保持した、成熟型の組換えグルー
プ１アレルゲンを得た成功例はなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記現状より、大腸菌
を宿主として用い、糖鎖を持たない成熟型グループ１ア
レルゲンを効率よく製造する方法の確立が望まれてい
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究した結果、大腸菌において封入体
として発現させた組換えグループ１アレルゲンのプロ体
を特定のpHと塩濃度で２回のゲルろ過に供し、精製と再
生を同時に行った後、プロ配列を除去することにより、
活性型グループ１アレルゲンを効率よく製造することが
可能であることをを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、グループ１アレルゲンのう
ち、Der f 1の製造方法について述べるが、Der f 1とDe
r p 1のアミノ酸配列の相同性は80％と非常に高く、全
体的な立体構造、タンパク質としての機能は保存されて
いることから、本方法はDer p 1に応用することが可能
である。

【０００８】大腸菌において、異種タンパク質を発現さ
せるためには、大腸菌で効率よく働く任意の転写プロモ
ーターの支配下に当該遺伝子を導入する必要がある。大
腸菌用の発現ベクターは、既に多数開示されており、任
意のものが使用できるが、一例として、強力な転写プロ
モーターであるT7プロモーターを利用した、pGEMEX（登
録商標）-1ベクター(Promega社)を用いた場合について
述べる。また、Der f 1遺伝子には多型が存在すること
が知られているが、そのうち任意の遺伝子を導入するこ
とが可能である。プロDer f 1をコードするcDNAをpGEME
X（登録商標）-1のT7プロモーターの下流に挿入した。
作製したプラスミドを用いて、lacプロモーター支配下
にT7 RNA polymerase遺伝子をコードする大腸菌BL21株
を形質転換した。形質転換株を培養し、IPTG (isopropy
l-β-D-thiogalactopyranoside)を添加することによ
り、プロDer f 1の発現を誘導した。発現産物は、不溶
性の封入体として菌体内に蓄積された。封入体は、菌体
を任意の方法で破砕後、遠心分離した沈殿として回収す
ることができる。菌体を超音波破砕後、遠心分離して、
封入体を回収した。回収した封入体は、適当な変性剤を
添加することにより、可溶化が可能であるが、この条件
により後の再生効率が左右されるため、最適な変性条件
で行わねばならない。この場合、8M 尿素、１％ジチオ
スレイトール（以下、DTTと略す。）を添加して、封入
体を可溶化するのが最適であった。可逆的に変性したタ
ンパク質は、適切な条件で変性剤を除くことにより、再
生が可能である。しかし、再生のしやすさとその条件
は、個々のタンパク質によって全く異なり、共通したル
ールは存在しない。したがって、そのタンパク質ごとに
適した再生条件を見いださねばならない。

【０００９】変性剤を除去する最も一般的な方法は、透
析あるいは希釈であるが、Der f 1の場合、これらの方
法により現実的な収率で活性型を得ることは不可能であ
った。様々な再生条件を検討した結果、封入体として発
現させた組換えプロDer f 1を8M 尿素、1% DTTを用いて
可溶化後、特定のpHと塩濃度で２回のゲルろ過を行い、
精製と再生を同時に行うことにより、最終的に活性型グ
ループ１アレルゲンを効率よく製造することが可能であ
ることが明らかとなった。

【００１０】以下に、その再生手順の詳細について述べ
る。まず、可溶化したプロDer f 1を20mMトリス塩酸緩
衝液pH8.6にて平衡化した、適当な分画範囲をもつゲル
ろ過カラムに供する。一例として、SephacrylS-200カラ
ム(Pharmacia社製）を用いた場合について述べる。この
ゲルろ過の溶出パターンを図２-aに示す。図中に示した
フラクション（以下、「fr」と略す）A、BがプロDer f
1に相当するが、その後の操作で再生可能なのはBのみで
あり、Aは凝集体を形成していると考えられる。frBの保
持時間は分子量から予想されるより長いが、カラムに試
料を添加した直後は尿素による変性状態で見かけの分子
量が大きいためと考えられる。fr AとBの割合は、塩濃
度によって大きく変わり、fr Bの割合を大きくするに
は、塩濃度が100mM NaCl未満が好ましく、さらには0mM
NaClが好ましい。塩濃度が高いとAのピークのみしか溶
出しない（図2-b（20mMトリス塩酸緩衝液pH8.6、100mM
NaCl））。

【００１１】次に、fr BをpH6.8から8.2、好ましくはｐ
H7.0から7.6、さらに好ましくはpH7.4の適当な緩衝液、
例えばリン酸緩衝塩溶液（8g NaCl, 0.2g KCl, 0.2g KH
₂PO₄,2.9g Na₂HPO₄.12H₂O/ 1L H₂O, pH7.4 ;以下「PB
S」と略す）に対して透析後、PBSにて平衡化した、適当
な分画範囲を持つゲルろ過カラムに供する。一例とし
て、Sephacryl S-200カラム（Pharmacia社製）を用いた
場合について述べる。２度目のゲルろ過の溶出パターン
を図３に示す。図中のfr C、D、Eに含まれるのはすべて
プロDer f 1であるが、最終的にプロ配列を除去して活
性を保持した成熟型が得られるのはfr Dのみである。fr
Cはモノマーではあるがプロ配列を除去して活性を保持
した成熟型を得ることはできない。 Eは凝集体を形成し
ていると考えられる。frDの割合はpHと塩濃度によって
大きく異なり、frDの割合が最大になるのが、図３-c、d
のpH7.4の条件であった。PBS透析と２度目のゲルろ過
は、どちらも必要であり、どちらか一方のみでは、最終
的に活性を保持した成熟型を得ることができなかった。

【００１２】このように、適当なpHと塩濃度におけるゲ
ルろ過を組み合わせることにより、最終的に活性を保持
した成熟型が得られるようなプロ体を再生することが可
能であった。fr Dをさらに、100mM 酢酸緩衝液pH4.0に
対して4℃透析した。この過程で、プロ配列が除去さ
れ、成熟型のDer f 1を得ることができる。なお、プロ
配列を持たない成熟型Der f 1を封入体として発現させ
た場合、様々な可溶化、再生条件を試みたが、活性型を
得ることは不可能であり、再生にはプロ配列が必要であ
ると考えられた。得られた成熟型Der f 1は、SDS-PAGE
に供した際にシングルバンドであり、十分に精製されて
いた。さらに、非還元条件下のSDS-PAGEでの移動度が天
然Der f1と一致することから、分子内に３組存在すると
予想されるジスルフィド結合が正しく形成されていると
推定された。実際に、プロテアーゼ活性及びダニアレル
ギー患者末梢血中の免疫グロブリンE（以下、「IgE」と
略す）との結合活性を測定したところ、本方法で得られ
た組換え成熟型Der f 1は、これらの活性を保持してい
た。

【００１３】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ 組換えプロDer f 1発現用プラスミドの構築 発現ベクターpGEMEX（登録商標）-1(Promega社）をXba
I消化し、T7プロモーター下流のNde Iを含むXba I断片
を取り除いた後、自己閉環した。このベクターをNde I
消化し、filling in反応を行い、f1 ori近傍のNde Iを
潰した後、自己閉環した。このベクターを再度Xba I消
化し、先のXba I断片を戻すことにより、T7プロモータ
ー下流にユニークなNde I切断部位を持つベクターを構
築した。この改変pGEMEX（登録商標）-1をNde IとBamH
Iで消化し、合成オリゴヌクレオチド5'-TATGACAAGCGCTA
TCGATG-3'と5'-GATCCATCGATAGCGCTTGTCA-3'をアニーリ
ングさせたアダプターを挿入した。作製したプラスミド
をAor51H IとBamH Iで消化し、Der f 1 cDNAをクローニ
ングしたpUC118（pUC118::prepro Der f 1)からAor51HI
とBamH Iで切り出した断片を挿入した（pGEMEX（登録商
標）-１::mature Der f1）。pUC118::prepro Der f 1を
鋳型として用いて、プライマー5'-CCCATATGCGTCCAGCTTC
AATCAAACT-3'と5'-AATACTCGCAAGAGTAGTTG-3'を用いてPC
R法により増幅後、塩基配列を確認した。この断片をNde
IとAor51H Iで消化後、pGEMEX（登録商標）-１::matur
e Der f 1をNde IとAor51H Iで消化したものに挿入した
（pGEMEX（登録商標）-１::pro Der f 1）（図１）。pG
EMEX（登録商標）-１::pro Derf 1に含まれるpro Der f
1遺伝子のうち、アミノ酸をコードする部分の塩基配列
を配列表１に示す。表中の４塩基目から２４３塩基目ま
でがプロ配列をコードする部分である。

【００１４】実施例２ 組換えプロDer f 1の大腸菌に
おける封入体としての発現 作製した発現プラスミドを用いて大腸菌BL21株を形質転
換した。形質転換した大腸菌を30℃で一晩前培養後、50
μｇ/mLのアンピシリンを添加したLB培地に100分の１量
植菌し、30℃で振とう培養した。OD₆₀₀＝0.4-0.5に達し
たところで、IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranos
ide)を最終濃度0.1ｍＭとなるように添加し、さらに30
℃で3〜6時間振とう培養して、プロDer f 1の発現を誘
導した。培養液を遠心分離して得られた菌体をTEP（100
mMトリス塩酸緩衝液pH8.5, 10mM EDTA, 1mM PMSF)で洗
浄後、TEPに懸濁し、-80℃で凍結した。融解後、超音波
処理により、菌体を破砕し、15000g、15分間遠心した。
遠心分離した沈殿をTEPで洗浄し、封入体を得た。

【００１５】実施例３ 組換えプロDer f 1封入体の可
溶化 プロDer f 1封入体に、尿素を最終濃度8M、DTT（dithio
threitol)を最終濃度1%となるように添加したTEPを加
え、室温で1-2時間ゆるやかに振とうした。 実施例４ 組換えプロDer f 1の再生（精製と巻き戻
し） 可溶化したプロDer f 1を20mM トリス塩酸緩衝液pH8.6
にて平衡化したSephacryl S-200 16/60カラム（Pharmac
ia社）に供し、１回目のゲルろ過を行った。0mMおよび1
00mMNaClを含む緩衝液を用いた場合の溶出パターンを図
２に示した。後の操作で活性型として得られるのはfr B
のみで、100mM NaClを含む緩衝液を用いた場合は、frB
に相当するフラクションは溶出しなかった。次いで、fr
BをpH7.4リン酸緩衝塩溶液（8g NaCl, 0.2g KCl, 0.2g
KH₂PO₄, 2.9g Na₂HPO₄.12H₂O/ 1LH₂O, pH7.4 ;以下「PB
S」と略す）に対して透析後、PBSにて平衡化したSephac
ryl S-200 16/60カラム（Pharmacia社）に供し、２回目
のゲルろ過を行った。この時の溶出パターンを図３−ｃ
に示す。条件検討の例として、０％あるいは0.8％のNaC
lを含む、pHが6.8、7.4、8.2の緩衝液を用いた場合の溶
出パターンを図３に示した。図中のfr C、D、Eに含まれ
るのはすべてプロDer f 1であるが、最終的にプロ配列
を除去して活性を保持した成熟型が得られるのはfr Dの
みである。 frDの割合はpHと塩濃度によって大きく異な
り、frDの割合が最大になるのが、図３-c、dのpH7.4の
条件であった。図３に示したfr Dを以下の操作に用い
た。fr B、fr BをPBS透析したもの及びfr DのSDS-PAGE
のパターンを図４、５に示す。fr BをPBSに対して透析
することにより、プロDer f 1のバンドより低分子側に
バンドが現れるが、N末のアミノ酸配列を決定した結
果、プロ配列の22番目のValから始まるものであること
が明らかになった。透析操作により構造変化が起きて、
プロ配列の最初の21アミノ酸残基から成る領域が切断さ
れたと考えられる。この方法により、大腸菌の培養液1m
Lあたり、30-100μgのプロDer f 1が正しく再生され
た。

【００１６】実施例５ 酸性処理によるプロ配列の除去 図３のfrDを100mM 酢酸緩衝液 pH4.0に対して、4℃で一
晩透析を行い、プロ配列を除去し、成熟型Der f 1を得
た。この後、PBSに置換して以下の測定に用いた。２度
目のゲルろ過により得られたfr Dを酢酸緩衝液に対して
透析することにより、図４に示すように、SDS-PAGEにお
けるバンドの位置が成熟型Der f 1の分子量に相当する
低分子量側に移動した。このバンドについて、PVDF膜に
ブロッティング後、473Aプロテインシーケンサ(Applied
Biosystems社）を用いてN末端アミノ酸配列の確認を行
った。その結果、成熟型Der f 1とプロ配列の最後の２
残基が余分についたものとの混合物であることが明らか
となった。

【００１７】透析の際の経時変化を追うと、プロ配列の
最初から始まるものより、N末の２１アミノ酸残基から
成る領域が切断されたもののほうが、速く成熟型になる
ことが確認された。しかし、この領域を欠く変異体を封
入体として発現させた場合、最終的に活性型を得ること
が不可能であったことから、この領域は再生には必要で
あると考えらる。得られた成熟型Der f 1と天然Der f 1
を還元条件及び非還元条件でSDS-PAGEに供した結果を図
５に示す。還元条件下においても非還元条件下において
も、組換え成熟型Der f 1と天然Der f 1は、同じ移動度
を示した。このことから、組換え成熟型Der f 1におい
て、分子内に３組存在すると予想されるS-S結合が正し
く形成され、天然Der f 1と同じ構造をとっている可能
性が高いと考えられた。

【００１８】実施例６ プロテアーゼ活性の測定 組換えプロDer f 1、組換え成熟型Der f 1及び天然Der
f 1それぞれ 1.6μgを0.01Ｍのシステインを添加した10
mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）20mLに溶解した状態
で37℃10分間静置した。次に、最終濃度0.1mMとなるよ
うに80mLの10mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）に溶解
した３種の合成基質N-Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA（Sigma
社）、 Boc-Val-Leu-Lys-MCA（Peptide社）、Suc-Ala-P
ro-Ala-MCA（Peptide社）を添加して、37℃で30分間静
置した。10%酢酸を3mL添加して反応を停止し、基質の消
化により生じる遊離MCAの蛍光強度（excitation 380n
m、emission 460nm）を測定した。各合成基質を用いて
プロテアーゼ活性を測定した結果を図６に示す。どの基
質を用いた場合にも、組換えプロDer f 1はプロテアー
ゼ活性を持たず、組換え成熟型Der f 1と天然Der f 1に
はプロテアーゼ活性が確認された。このことから、組換
えDer f 1のプロ配列を除去することにより、プロテア
ーゼ活性を持つようになることが明らかとなった。ま
た、組換え成熟型Der f 1も天然Der f 1も、 N-Suc-Leu
-Leu-Val-Tyr-MCA 、Boc-Val-Leu-Lys-MCA に対しては
強い活性を示し、 Suc-Ala-Pro-Ala-MCAに対しては弱い
活性を示したことから、組換え成熟型Der f 1は天然Der
f 1と同様の基質特異性を持つと考えられる。

【００１９】実施例７ IgE結合活性の測定 ９６穴マイクロタイタープレートに、PBSに溶解した10
μg/mLの天然Der f 1を添加し、４℃で一晩静置した。P
BSで２回洗浄後、PBSに溶解した３% BSAを添加し、室温
で２時間静置した。PBST（0.05% Tween 20を添加したPB
S）で洗浄後、PBSTに溶解した３% BSAで２倍希釈したダ
ニアレルギー患者血清25μLと様々な濃度の組換え成熟
型Der f 1あるいは天然Der f 1を25μL添加し、４℃で
一晩静置した。PBSTで３回洗浄後、３%BSAを添加したPB
STで1000倍希釈した、ビオチン標識抗ヒトIgE抗体（Vec
tor社）を添加し、室温で２時間静置した。PBSTで３回
洗浄後、３%BSAを添加したPBSTで1000倍希釈したアビジ
ン標識西洋ワサビパーオキシダーゼを添加し、室温で２
時間静置した。PBSTで３回洗浄後、6×10^-5%の過酸化水
素及び0.4mg/mlのo-phenylenediamine dihydrochloride
(Sigma社）を添加した0.1Mクエン酸緩衝液(pH5.0)を加
えた。2N硫酸を加えて反応を停止させた後、492nmの吸
光度を測定した。競合ELISAの結果を図７に示す。組換
え成熟型Der f 1は天然Der f 1と同等に患者血清中のIg
Eと天然Der f 1の結合を阻害した。

【００２０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Asahi Breweries, Ltd.，Torii Pharmaceutical Co.,Ltd. <120> The production method of recombinant group 1 mite allergens.（組換えグル−プ１ダニアレルゲンの製造法） <130> 98T8-09 <160> 2 <210> 1 <211> 915 <212> DNA <213> Dermatophagoides farinae <220> <221> CDS, mat peptide <222> (1)…(912), (244)…(912) <400> 1 atg cgt cca gct tca atc aaa act ttt gaa gaa ttc 36 Met Arg Pro Ala Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Phe -80 -75 -70 aaa aaa gcc ttc aac aaa aac tat gcc acc gtt gaa 72 Lys Lys Ala Phe Asn Lys Asn Tyr Ala Thr Val Glu -65 -60 gag gaa gaa gtt gcc cgt aaa aac ttt ttg gaa tca 108 Glu Glu Glu Val Ala Arg Lys Asn Phe Leu Glu Ser -55 -50 ttg aaa tat gtt gaa gct aac aaa ggt gcc atc aac 144 Leu Lys Tyr Val Glu Ala Asn Lys Gly Ala Ile Asn -45 -40 -35 cat ttg tcc gat ttg tca ttg gat gaa ttc aaa aac 180 His Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn -30 -25 cgt tat ttg atg agt gct gaa gct ttt gaa caa ctc 216 Arg Tyr Leu Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu Gln Leu -20 -15 -10 aaa act caa ttc gat ttg aat gcc gaa aca agc gct 252 Lys Thr Gln Phe Asp Leu Asn Ala Glu Thr Ser Ala -5 -1 1 tgc cgt atc aat tcg gtt aac gtt cca tcg gaa ttg 288 Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu 5 10 15 gat tta cga tca ctg cga act gtc act cca atc cgt 324 Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg 20 25 atg caa gga ggc tgt ggt tca tgt tgg gct ttc tct 360 Met Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser 30 35 ggt gtc gcc gca act gaa tca gct tat ttg gcc tac 396 Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr 40 45 50 cgt aac acg tct ttg gat ctt tct gaa cag gaa ctc 432 Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu 55 60 gtc gat tgc gca tct caa cac gga tgt cac ggc gat 468 Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp 65 70 75 aca ata cca aga ggc atc gaa tac atc caa caa aat 504 Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Gln Asn 80 85 ggt gtc gtt gaa gaa aga agc tat cca tac gtt gca 540 Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala 90 95 cga gaa caa caa tgc cga cga cca aat tcg caa cat 576 Arg Glu Gln Gln Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His 100 105 110 tac ggt atc tca aac tac tgc caa att tat cca cca 612 Tyr
Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro 115 120 gat gtg aaa caa atc cgt gaa gct ttg act caa aca 648 Asp Val Lys Gln Ile Arg Glu Ala Leu Thr Gln Thr 125 130 135 cac aca gct att gcc gtc att att ggc att aaa gat 684 His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile Lys Asp 140 145 ttg aga gct ttt caa cat tat gat gga cga aca atc 720 Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile 150 155 att caa cat gac aat ggt tat caa cca aac tat cat 756 Ile Gln His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His 160 165 170 gcc gtc aac att gtc ggt tac gga agt aca caa ggc 792 Ala Val Asn Ile Val Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Gly 175 180 gtc gat tat tgg atc gta cga aac agt tgg gat act 828 Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr 185 190 195 acc tgg ggt gat agc gga tac gga tat ttc caa gcc 864 Thr Trp Gly Asp Gly Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln Ala 200 205 gga aac aac ctc atg atg atc gaa caa tat cca tat 900 Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr 210 215 gtt gta atc atg tga 915 Val Val Ile Met 220 <210> 2 <211> 304 <212> PRT <213> Dermatophagoides farinae <220> <221> PROPEP <222> (-81)…(-1) <400> 2 Met Arg Pro Ala Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Phe -80 -75 -70 Lys Lys Ala Phe Asn Lys Asn Tyr Ala Thr Val Glu -65 -60 Glu Glu Glu Val Ala Arg Lys Asn Phe Leu Glu Ser -55 -50 Leu Lys Tyr Val Glu Ala Asn Lys Gly Ala Ile Asn -45 -40 -35 His Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn -30 -25 Arg Tyr Leu Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu Gln Leu -20 -15 -10 Lys Thr Gln Phe Asp Leu Asn Ala Glu Thr Ser Ala -5 -1 1 Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu 5 10 15 Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg 20 25 Met Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser 30 35 Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr 40 4 50 Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu 55 60 Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp 65 70 75 Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Gln Asn 80 85 Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala 90 95 Arg Glu Gln Gln Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His 100 105 110 Tyr Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro 115 120 Asp Val Lys Gln Ile Arg Glu Ala Leu Thr Gln Thr 125 130 135 His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile Lys Asp 140 145 Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile 150 155 Ile Gln His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His 160 165 170 Ala Val Asn Ile Val Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Gly 175 180 Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr 185 190 195 Thr Trp Gly Asp Gly Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln Ala 200 205 Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr 210 215 Val Val Ile Met 220

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１における組換えプロDerｆ１発現用プ
ラスミドの構築の概略図。

【図２】実施例４におけるプロDer f １の溶出パターン
を示す図。

【図３】実施例４における条件を変えたプロDer f １の
溶出パターンを示す図。

【図４】実施例４におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを
示す図。

【図５】実施例４におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを
示す図。

【図６】実施例６における組換え成熟型Der f 1のプロ
テアーゼ活性を示す図。

【図７】実施例７における組換え成熟型Der f 1のIgE結
合活性を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 安原 貴臣 茨城県北相馬郡守谷町緑１−１−21 アサ ヒビール株式会社研究開発センター基盤研 究所内 (72)発明者 結城 敏文 茨城県北相馬郡守谷町緑１−１−21 アサ ヒビール株式会社研究開発センター基盤研 究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA31 CA04 DA06 EA04 4B064 AG31 CA10 CA19 CB30 CC24 CE06 DA01 DA13 4H045 AA20 BA10 CA50 DA86 EA20 EA50 FA15 FA67 FA72 FA74 GA01 GA10 GA22

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グループ１ダニアレルゲンの製造方法に
   おいて、グループ１ダニアレルゲンをコードする遺伝子
   を組換え技術により大腸菌（Escherichia coli）で発現
   させることを特徴とする組換えグループ１ダニアレルゲ
   ンの製造方法。
2. 【請求項２】 グループ１ダニアレルゲンをコードする
   遺伝子がプロ配列をコードする領域を含むことを特徴と
   する請求項１記載の製造方法。
3. 【請求項３】 大腸菌において封入体として発現させた
   グループ１ダニアレルゲンプロ体を可溶化・再生後、プ
   ロ配列を除去することにより成熟体を得ることを特徴と
   する請求項２記載の製造方法。
4. 【請求項４】 特定のｐＨと塩濃度の緩衝液を用いてゲ
   ルろ過を行うことにより、プロ体の再生と精製を同時に
   行うことを特徴とする請求項３記載の製造方法。
5. 【請求項５】 2回以上ゲルろ過を行うことを特徴とす
   る請求項４記載の製造方法。
6. 【請求項６】 1回目のゲルろ過を塩濃度が１００ｍＭ
   ＮａＣｌ未満の緩衝液を用いて行い、2回目のゲルろ過
   をｐＨが６．８〜８．２の緩衝液を用いて行うことを特
   徴とする請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 成熟体がシステインプロテアーゼ活性を
   有することを特徴とする請求項１、３または４記載の製
   造方法。
8. 【請求項８】 成熟体がダニアレルギー患者由来の免疫
   グロブリンEとの結合活性を有することを特徴とする請
   求項１、３または４記載の製造方法。
9. 【請求項９】 グループ１ダニアレルゲンをコードする
   遺伝子の由来するダニがコナヒョウヒダニ（Dermatopha
   goides farinae）であることを特徴とする請求項１、
   ２、３、４、７または８記載の製造方法。