JP2000116260A - 環境ストレス耐性植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 環境ストレス耐性植物 【解決手段】 ストレス応答性プロモーターの下流に以
下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするDNAが連結さ
れた遺伝子を含むトランスジェニック植物の提供。 (a) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
若しくは配列番号10で表されるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質 (b) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
若しくは配列番号10で表されるアミノ酸配列において少
なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつストレス応答性エレメン
ト下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、乾燥ストレス応答
性エレメント(DRE；dehydration responsive element)
に結合しDRE下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質
をコードするDNAを、ストレス応答性プロモーター下流
に連結した遺伝子が導入されたトランスジェニック植物
に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物は、自然界において、乾燥、高温、
低温又は塩などの様々な環境ストレスに曝されて生息し
ている。植物は、動物のように移動によってストレスか
ら身を守る行動をとることができないため、進化の過程
で、様々なストレス耐性機構を獲得してきた。例えば、
低温耐性植物(シロイヌナズナ、ホウレンソウ、レタ
ス、エンドウ、オオムギ、テンサイなど)は、低温感受
性植物(トウモロコシ、イネ、カボチャ、キュウリ、バ
ナナ、トマトなど)よりも、生体膜脂質中の不飽和脂肪
酸の含有割合が低く、そのため、低温に曝されても、生
体膜脂質の相転移が起こりにくく、低温障害が生じにく
い。

【０００３】これまで、人為的に環境ストレス耐性植物
を作出する場合、乾燥、低温又は塩耐性な系統の選抜や
交配などの手法が用いられてきたが、選抜法には多くの
時間が必要であり、一方、交配法は限られた種間にしか
用いることができないため、高い環境ストレス耐性を有
する植物の作出は困難であった。

【０００４】近年のバイオテクノロジーの進歩に伴い、
植物に異種生物由来の特定の遺伝子を導入するトランス
ジェニック技術などの手法を用いて、乾燥、低温、塩な
どに耐性の植物の作出が試みられている。これまでに、
環境ストレス耐性植物の作出に用いられた遺伝子として
は、浸透圧調節物質(マンニトール、プロリン、グリシ
ンベタインなど)の合成酵素遺伝子や細胞膜脂質の修飾
酵素遺伝子などが挙げられる。具体的には、マンニトー
ル合成酵素遺伝子としては大腸菌由来マンニトール 1-
リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子[Science 259:508-510(1
993)]、プロリン合成酵素遺伝子としては豆由来Δ¹-プ
ロリン-5-カルボキシレートシンテターゼ遺伝子[Plant
Physiol. 108:1387-1394 (1995)]、グリシンベタイン合
成酵素遺伝子としては細菌由来コリンデヒドロゲナーゼ
遺伝子[Plant J. 12:1334-1342(1997)]、細胞膜脂質修
飾遺伝子としてはシロイヌナズナ由来ω-3脂肪酸不飽和
化酵素遺伝子[Plant Physiol. 105:601-605(1994)]やラ
ン藻のΔ9不飽和化酵素遺伝子[Nature Biotech. 14:100
3-1006(1996)]が用いられている。しかし、これらの遺
伝子の導入植物は、ストレス耐性度が不安定であった
り、耐性レベルが低い等の問題から実用化に至ったもの
は存在しない。

【０００５】さらに、乾燥、低温、又は塩ストレス耐性
の獲得には、複数の遺伝子が働き、その結果、植物はス
トレス耐性になることが報告されている[Plant Physio
l., 115:327-334(1997)]。そこで、ストレス耐性の獲得
に関与する複数の遺伝子の発現を同時に活性化すること
ができる転写因子をコードする遺伝子が植物に導入さ
れ、ストレス耐性度の高い植物が作出されている[The P
lant Cell, 10:1-17(1998)]。しかし、このように複数
の遺伝子の発現を誘導する遺伝子を導入した場合、複数
の遺伝子が同時期に活性化されるため、宿主植物のエネ
ルギーは、該遺伝子産物の生成や、該遺伝子産物に起因
する細胞内代謝に向けられ、宿主植物は、成長が遅れた
り矮化してしまうことが多い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ストレス応
答性プロモーターの下流に、ストレス応答性エレメント
に結合し該エレメント下流の遺伝子の転写を制御するタ
ンパク質をコードするDNAが連結された遺伝子を含む、
環境ストレス(乾燥ストレス、低温ストレス、塩ストレ
スなど)に対する耐性が向上し且つ矮化の起こらないト
ランスジェニック植物を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、乾燥、低
温又は塩ストレス耐性の獲得に働く遺伝子を制御する新
規な転写因子の遺伝子をクローニングし、植物にストレ
ス応答性プロモーターの下流に連結した該遺伝子を導入
することにより、乾燥、低温又は塩ストレス耐性が著し
く向上し且つ矮化の起こらない植物を作出することに成
功し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、ストレス応答性プロ
モーターの下流に以下の(a)又は(b)のタンパク質をコー
ドするDNAが連結された遺伝子を含むトランスジェニッ
ク植物である。 (a) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
若しくは配列番号10で表されるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質 (b) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
若しくは配列番号10で表されるアミノ酸配列において少
なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつストレス応答性エレメン
ト下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質

【０００９】さらに、本発明は、ストレス応答性プロモ
ーターの下流に以下の(c)又は(d)のDNAが連結された遺
伝子を含むトランスジェニック植物である。 (c) 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７
若しくは配列番号９で表される塩基配列からなるDNA (d) 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７
若しくは配列番号９で表される塩基配列からなるDNAと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつス
トレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を制御する
タンパク質をコードするDNA ストレスとしては、乾燥ストレス、低温ストレス又は塩
ストレスが挙げられる。

【００１０】さらに、ストレス応答性プロモーターとし
ては、rd29A遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモー
ター、rd17遺伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモータ
ー、DREB1A遺伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモー
ター、cor15a遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモー
ター及びkin1遺伝子プロモーターからなる群から選択さ
れる少なくとも１つが挙げられる。以下、本発明を詳細
に説明する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のトランスジェニック植物
は、ストレス応答性プロモーターの下流に乾燥ストレス
応答性エレメント(DRE；dehydration responsive eleme
nt)に結合しDRE下流の遺伝子の転写を活性化する機能を
有する転写因子をコードするDNA(DREB遺伝子という)が
連結された遺伝子を導入することにより作出した、環境
ストレス耐性のトランスジェニック植物である。

【００１２】本発明において用いられるDREB遺伝子は、
以下のようにしてクローニングすることができる。な
お、DREB遺伝子のうち、DRE結合タンパク質1A遺伝子をD
REB1A遺伝子、DRE結合タンパク質1B遺伝子をDREB1B遺伝
子、DRE結合タンパク質1C遺伝子をDREB1C遺伝子、DRE結
合タンパク質2A遺伝子をDREB2A遺伝子、DRE結合タンパ
ク質2B遺伝子をDREB2B遺伝子という。

【００１３】1. DREB遺伝子のクローニング (1) シロイヌナズのmRNA及びcDNAライブラリーの調製 mRNAの供給源としては、シロイヌナズナの葉、茎、根、
花など植物体の一部又は植物体全体が挙げられる。ま
た、シロイヌナズナの種子をGM培地、MS培地、#3培地な
どの固体培地に播種し、無菌条件下で生育させた植物体
も用いることができる。DREB1A遺伝子のシロイヌナズナ
植物体中のmRNAレベルは、植物体を低温ストレス(例え
ば、10〜-4℃)に曝露することにより増大し、DREB2A遺
伝子のmRNAレベルは、植物体を塩ストレス(例えば、150
〜250mM NaCl)や乾燥ストレス(例えば、脱水状態にす
る)に曝露することにより増大するため、シロイヌナズ
ナをこれらのストレスに曝露させた植物体を用いてもよ
い。

【００１４】mRNAの調製は、例えば、GM培地で生育させ
たシロイヌナズナの植物体を、上記乾燥ストレス、低温
ストレス又は塩ストレスに曝露後、液体窒素で凍結す
る。その後は、通常行われる手法により行うことができ
る。例えば、凍結した植物体を乳鉢などで摩砕後、得ら
れた摩砕物から、グリオキザール法、グアニジンチオシ
アネート-塩化セシウム法、塩化リチウム-尿素法、プロ
テイナーゼK-デオキシリボヌクレアーゼ法などにより粗
RNA画分を抽出調製する。次いで、この粗RNA画分から、
オリゴdT-セルロースやセファロース2Bを担体とするポ
リ U-セファロースなどを用いたアフィニティーカラム
法、あるいはバッチ法によりポリ(A)⁺RNA(mRNA)を得る
ことができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法などによ
りmRNAをさらに分画してもよい。

【００１５】このようにして得られたmRNAを鋳型とし
て、市販のキット(例えば、ZAP-cDNASynthesis Kit(STR
ATAGENE社製))を用い、オリゴdT₂₀及び逆転写酵素によ
って一本鎖cDNAを合成した後、該一本鎖cDNAから二本鎖
cDNAを合成する。次いで、得られた二本鎖cDNAにEcoRI-
NotI-BamHIアダプターなどの適切なアダプターを付加
後、転写活性化ドメイン(例えばGAL4活性化ドメインな
ど)を含むプラスミド(例えばpAD-GAL4プラスミド(Strat
agene社製)など)の転写活性化ドメインの下流に連結す
ることにより、cDNAライブラリーを作製することができ
る。

【００１６】(2) DREB遺伝子のクローニング用宿主 DREB遺伝子をクローニングする方法としては、酵母を用
いるワンハイブリッドスクリーニング法を挙げることが
できる。該スクリーニング法によるスクリーニングは、
市販のキット(例えばMATCHMAKERワンハイブリッドシス
テム(Clontech社製))を用いて行うことができる。

【００１７】上記キットを用いて、DREB遺伝子をクロー
ニングする場合、DREB遺伝子がコードするタンパク質(D
REBタンパク質という)が結合するDREを含むDNA断片をキ
ットに添付のプラスミドpHISi-1及びpLacZiに連結し、
得られたプラスミドをキットに添付の酵母(Saccharomay
ces cerevisiae YM4271)に形質転換したクローニング用
宿主酵母を作製することが必要である。

【００１８】クローニング用宿主酵母は、HIS3最小プロ
モーターと呼ばれるプロモーターの作用でリーキー(lea
ky)に発現されるHIS3タンパク質の作用によりヒスチジ
ンを生合成することができるため、通常はヒスチジン非
存在下でも生育可能である。しかし、ここでHIS3タンパ
ク質をコードする遺伝子の発現に用いられているプロモ
ーターは最低限の転写水準しか維持することのできない
最小プロモーターであるため、細胞内に生成されるタン
パク質は非常に微量である。従って、HIS3タンパク質の
競合阻害剤である3-AT(3-アミノトリアゾール)存在下で
前記宿主酵母を培養した場合、細胞内のHIS3タンパク質
の機能は、濃度依存的に3-ATによって阻害され、ある濃
度以上の3-AT存在下では、細胞内のHIS3タンパク質は機
能することができなくなり、前記宿主酵母はヒスチジン
非存在下で生育不能となる。同様に、lacZ遺伝子も、CY
C1最小プロモーターと呼ばれる最小プロモーターの下流
に存在し、細胞内に生成されるβ-ガラクトシダーゼは
非常に微量である。従って、前記宿主酵母をX-gal含有
プレートに播種した場合、出現したコロニーは、コロニ
ー全体が青色になるほどのX-gal分解能は有さない。

【００１９】しかし、前記宿主酵母中において、HIS3遺
伝子上流のDRE及びlacZ遺伝子上流のDREに結合し、HIS3
遺伝子及びlacZ遺伝子の転写を活性化する転写因子が発
現されると、該宿主酵母は十分量の3-AT存在下でも生育
可能となり、かつX-galは分解されコロニーは青色とな
る。ここで、乾燥ストレス応答性エレメント(DRE；dehy
dration responsive element)は、乾燥ストレスや低温
ストレスに曝露された場合に発現される遺伝子の上流に
存在する９bpの保存的な配列5'-TACCGACAT-3'からなる
シス作動性のDNA領域をいう。

【００２０】DREを含むDNA断片は、乾燥ストレス耐性遺
伝子の１つであるrd29A遺伝子[Kazuko Yamaguchi-Shino
zaki and Kazuo Shinozaki：The Plant Cell 6：251-2
64(1994)]のプロモーター領域(rd29A遺伝子の翻訳開始
点から-215〜-145の領域)を、ポリメラーゼ連鎖反応(PC
Rともいう)を行い、増幅することにより得ることができ
る。ここでPCRに用いることができる鋳型DNAとしては、
シロイヌナズナのゲノムDNAが挙げられる。またセンス
プライマーとしては、5'-AAGCTTAAGCTTACATCAGTTTGAAAG
AAA-3'(配列番号11)、アンチセンスプライマーとして
は、5'-AAGCTTAAGCTTGCTTTTTGGAACTCATGTC-3'(配列番号
12)を用いることができる。但し、本発明においてはこ
れらのプライマーに限定されるものではない。

【００２１】(3) DREB1A遺伝子及びDREB2A遺伝子のクロ
ーニング DREB1A遺伝子及びDREB2A遺伝子は、上記(1)において得
られたcDNAライブラリーを、上記(2)において得られた
宿主に、酢酸リチウム法などにより形質転換し、該形質
転換体をX-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-
ガラクトシド)及び3-AT(3-アミノトリアゾール)を含有
するLB培地プレートなどに播種・培養後、該プレート上
に出現した青色のコロニーからプラスミドを単離するこ
とにより得ることができる。

【００２２】すなわち、DREB1A遺伝子又はDREB2A遺伝子
を含むポジティブクローンは、GAL4活性化ドメイン(GAL
4 AD)をコードするDNA領域とDRE結合タンパク質をコー
ドする領域との融合遺伝子を保有し、アルコールデヒド
ロゲナーゼプロモーターの制御下で、DRE結合タンパク
質とGAL4転写活性化ドメインとの融合タンパク質(ハイ
ブリッドタンパク質)を発現する。次いで、発現された
融合タンパク質は、DRE結合タンパク質部分を介して、
レポーター遺伝子上流のDREに結合し、次いでGAL4活性
化ドメインがlacZ遺伝子及びHIS3遺伝子の転写を活性化
する。それにより、ポジティブクローンは、著量のHIS3
タンパク質及びβ-ガラクトシダーゼを生成する。従っ
て、ポジティブクローンは、生成されたHIS3タンパク質
の作用により3-AT存在下でもヒスチジンを生合成するこ
とができるため3-AT存在下で生育可能となるとともに、
生成されたβ-ガラクトシダーゼの作用による培地中のX
-galの分解によりコロニーは青色を呈する。

【００２３】次いで、このような青色コロニーからシン
グルセルアイソレーションを行った後、単離された細胞
を培養し、得られる培養細胞からプラスミドDNAを精製
することにより、DREB1A遺伝子及びDREB2A遺伝子を得る
ことができる。

【００２４】(4) DREB1Aタンパク質又はDREB2Aタンパク
質のホモローグ 生物は、１つの遺伝子から進化したと考えられる塩基配
列の類似した遺伝子を有していることがある。そのよう
な遺伝子がコードするタンパク質は、互いにホモローグ
といわれ、既に塩基配列が判明している遺伝子の一部を
プローブとして、遺伝子ライブラリーの中からクローニ
ングすることができる。従って、シロイヌナズナのcDNA
ライブラリーの中から、上記(3)において得られたDREB1
AcDNA又はDREB2AcDNAをプローブとしてそれらのホモロ
ーグをコードする遺伝子をクローニングすることができ
る。

【００２５】(5) 塩基配列の決定 上記(3)及び(4)において得られたプラスミドよりcDNA部
分を制限酵素で切断し、pSK(Stratagene社製)などの適
切なプラスミドに連結してサブクローニングした後、全
塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム-ギ
ルバートの化学修飾法、又はM13ファージを用いるジデ
オキシヌクレオチド鎖終結法などの公知手法により行う
ことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばPE
RKIN-ELMER社製373A DNAシークエンサーなど）を用いて
配列決定が行われる。

【００２６】配列番号１にはDREB1A遺伝子の塩基配列
を、配列番号２には該遺伝子のコードするタンパク質の
アミノ酸配列を示す。配列番号３にはDREB2A遺伝子の塩
基配列を、配列番号４には該遺伝子のコードするタンパ
ク質のアミノ酸配列を示す。配列番号５にはDREB1B遺伝
子の塩基配列を、配列番号６には該遺伝子のコードする
タンパク質のアミノ酸配列を示す。配列番号７にはDREB
1C遺伝子の塩基配列を、配列番号８には該遺伝子のコー
ドするタンパク質のアミノ酸配列を示す。配列番号９に
はDREB2B遺伝子の塩基配列を、配列番号10には該遺伝子
のコードするタンパク質のアミノ酸配列を示す。また、
前記アミノ酸配列からなるタンパク質がDREに結合しDRE
下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する有する限
り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ
酸に欠失、置換、付加などの変異が生じたタンパク質を
コードする変異型遺伝子も本発明に用いることができ
る。

【００２７】例えば、配列番号２、４、６、８又は10で
表されるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１
〜20個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠
失してもよく、配列番号２、４、８又は10で表わされる
アミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜20個程
度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加しても
よく、あるいは、配列番号２、４、８又は10で表わされ
るアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜160
個程度、さらに好ましくは１〜40個のアミノ酸が他のア
ミノ酸に置換したタンパク質をコードする遺伝子も、当
該タンパク質がDREに結合しDRE下流の遺伝子の転写を活
性化する機能を有する有する限り、本発明に用いること
ができる。

【００２８】また、上記遺伝子とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズすることができるDNAも、当該DNA
がコードするタンパク質がDREに結合しDRE下流の遺伝子
の転写を活性化する機能を有する限り、本発明に用いる
ことができる。ストリンジェントな条件とは、例えば、
ホルムアミド濃度が30〜50％、好ましくは50％であり、
温度が37〜50℃、好ましくは42℃での条件をいう。

【００２９】なお、変異型遺伝子は、Kunkel法や Gappe
d duplex法などの公知の手法又はこれに準ずる方法によ
り、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導
入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G
(TAKARA社製）など)を用いて、あるいは、TAKARA社のLA
PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて作
製することができる。

【００３０】一旦DREB遺伝子の塩基配列が確定される
と、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のcDNAな
いしゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩
基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイ
ズさせることにより、DREB遺伝子を得ることができる。

【００３１】なお、DREB1A又はDREB2A遺伝子を含む組換
えベクターは、大腸菌K-12株に導入され、DREB1A遺伝子
を含む大腸菌は、識別表示DREB1A、寄託番号FERM P-169
36として、DREB2A遺伝子を含む大腸菌は、識別表示DREB
2A、寄託番号FERM P-16937として、工業技術院生命工学
工業技術研究所(茨城県つくば市東１丁目１番３号)に、
平成10年８月11日付けで寄託されている。

【００３２】２．DREB遺伝子がコードするタンパク質の
DRE結合能及び転写活性化能の測定 (1) DREB遺伝子がコードするタンパク質のDRE結合能の
解析 DREB遺伝子がコードするタンパク質(以下DREBタンパク
質という)がコードするタンパク質のDREへの結合能は、
該タンパク質とGSTとの融合タンパク質を用い、ゲルシ
フトアッセイ［Urao,T et al.：The Plant Cell 5:1529
-1539(1993)］を行うことにより確かめることができ
る。ここで、DREB1Aタンパク質とGSTとの融合タンパク
質は以下のようにして得ることができる。すなわち、ま
ずDREB1A遺伝子をグルタチオン-S-トランスフェラーゼ
(GST)遺伝子をコードするプラスミド(例えば、pGEX-4T-
1ベクター(Pharmacia社製)など)中のGSTコード領域の下
流にフレームを合わせて連結する。得られたプラスミド
を大腸菌に形質転換後、誘導条件下で大腸菌培養し、得
られた大腸菌細胞を超音波破砕機などで破砕する。次に
破砕液から遠心により細胞破片を除去後、上清をグルタ
チオン-セファロースなどの担体を用いるアフィニティ
ークロマトグラフィーによって精製し、前記融合タンパ
ク質を得ることができる。

【００３３】ゲルシフトアッセイは、DNAとタンパク質
との相互作用を調べる方法である。すなわち、³²Pなど
で標識したDREを含むDNA断片と前記融合タンパク質とを
混合してインキュベーションした後、該混合物を電気泳
動し、ゲルを乾燥する。次に、オートラジオグラムをと
り、DNA断片とタンパク質との結合に起因する遅れて泳
動されたバンドを検出する。本発明において、DREB1Aタ
ンパク質又はDREB2Aタンパク質がDRE配列に特異的に結
合していることは、DRE配列に変異を加えたDNA断片を用
いた場合に、前記のバンドが検出されないことを明らか
にすることにより確認することができる。

【００３４】(2) DREB遺伝子がコードするタンパク質
の転写活性化能の解析 DREB遺伝子がコードするタンパク質の転写活性化能は、
シロイヌナズナのプロトプラストの系を用いるトランス
アクチベーション実験法を用いることにより解析するこ
とができる。例えば、DREB1A cDNAをCaMV35Sプロモータ
ーを含むpBI221プラスミド(Clonetech社製)に連結し、
エフェクタープラスミドを構築する。一方、上記１の
(2)において得られるDREを含む71塩基のDNA領域を３カ
セット結合したDNA断片を、β-グルクロニダーゼ(GUS)
遺伝子上流のTATAプロモーターのさらに上流に連結し、
レポータープラスミドを構築する。次いでこの２種のプ
ラスミドをシロイヌナズナのプロトプラストに導入した
後、GUS活性を測定する。ここでDREB1Aタンパク質を同
時に発現させることにより、GUS活性の上昇が見られれ
れば、プロトプラスト内で発現したDREB1Aタンパク質
が、DREの配列を介して転写を活性化していることがわ
かる。

【００３５】本発明において、プロトプラストの調製及
び該プロトプラストへのプラスミドDNAの導入は、Abel
らの方法[Abel,S. et al.：Plant J. 5:421-427(1994)]
により行うことができる。また、実験ごとのプラスミド
DNAの導入効率の差による実験誤差を最小限にするた
め、上記２種のプラスミドとともに、CAMV35Sプロモー
ター下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結したプラスミド
をプロトプラストに導入し、ルスフェラーゼ活性に対す
るβ-グルクロニダーゼ活性を測定し、得られた測定値
を転写活性化能の値とすることができる。β-グルクロ
ニダーゼ活性は、Jeffersonらの方法[Jefferson,R.A. e
t al.：EMBO J. 83：8447-8451(1986)]により、ルシフ
ェラーゼ活性はPicaGeneルシフェラーゼアッセイキット
(Toyo-Ink社製)を用いることにより測定することができ
る。

【００３６】３．トランスジェニック植物の作製 遺伝子工学的手法を用いて、上記１．において得られた
遺伝子を植物宿主に導入することによリ、環境ストレ
ス、特に、低温ストレス(凍結ストレスも含む)、乾燥ス
トレス、塩ストレスなどに対して抵抗性を有するトラン
スジェニック植物を作製することができる。遺伝子の植
物宿主への導入方法としては、アグロバクテリウム感染
法などの間接導入法や、パーティクルガン法、ポリエチ
レングリコール法、リポソーム法、マイクロインジェク
ション法などの直接導入法などが挙げられる。アグロバ
クテリウム感染法を用いる場合、以下のようにしてトラ
ンスジェニック植物を作製ことができる。

【００３７】(1) 植物導入用組換えベクターの作製及び
アグロバクテリウムの形質転換 植物導入用組換えベクターは、前記１．において得られ
たDREB1A遺伝子、DREB1B遺伝子、DREB1C遺伝子、DREB2A
遺伝子、又はDREB2B遺伝子を含むDNAを適当な制限酵素
で切断後、必要に応じて適切なリンカーを連結し、植物
細胞用のクローニングベクターに挿入することにより得
ることができる。クローニング用ベクターとしては、pB
I2113Not、pBI2113、pBI101、pBI121、pGA482、pGAH、p
BIG等のバイナリーベクター系のプラスミドやpLGV23Ne
o、pNCAT、pMON200などの中間ベクター系のプラスミド
を用いることができる。

【００３８】バイナリーベクター系プラスミドを用いる
場合、上記のバイナリーベクターの境界配列(LB,RB)間
に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌
中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグ
ロバクテリウム・チュメファシエンスC58、LBA4404、EH
A101、C58C1Rif^R、EHA105等に、凍結融解法、エレクト
ロポレーション法等により導入し、該アグロバクテリウ
ムを植物の形質導入用に用いる。

【００３９】上記の方法以外にも、本発明においては、
三者接合法[Nucleic Acids Research, 12：8711(1984)]
によってDREB遺伝子を含む植物感染用アグロバクテリウ
ムを調製することができる。すなわち、目的遺伝子を含
むプラスミドを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド
(例えばpRK2013など)を保有する大腸菌、及びアグロバ
クテリウムを混合培養し、リファンピシリン及びカナマ
イシンを含む培地上で培養することにより植物感染用の
接合体アグロバクテリウムを得ることができる。

【００４０】DREB遺伝子は、転写を活性化するタンパク
質をコードする遺伝子であるため、該遺伝子を導入した
植物は、発現されたDREBタンパク質の作用で種々の遺伝
子が活性化され、それに伴うエネルギー消費の増大や代
謝の活性化により植物自身の生育が抑制される場合があ
る。これを防止するため、ストレス負荷時にのみDREB遺
伝子が発現されるように、DREB遺伝子をストレス応答性
プロモーターをDREB遺伝子上流に連結することが考えら
れる。例えば、そのようなプロモーターとしては、例え
ば以下のものが挙げられる。

【００４１】rd29A遺伝子プロモーター[Yamaguchi-Shin
ozaki,K. et al.：The Plant Cell,6:251-264 (199
4)]。 rd29B遺伝子プロモーター[Yamaguchi-Shinozaki,K. et
al.：The Plant Cell,6:251-264 (1994)]。 rd17遺伝子プロモーター[Iwasaki,T. et al.：Plant Ph
ysiol.,115:1287(1997)]。 rd22遺伝子プロモーター[Iwasaki,T. et al.：Mol. Ge
n. Genet.,247:391-398(1995)]。 DREB1A遺伝子プロモ
ーター[Shinwari,Z.K. et al.：Biochem. Biophys. Re
s. Com. 250:161-170(1998)]。

【００４２】cor6.6遺伝子プロモーター[Wang, H. et a
l.：Plant Mol. Biol. 28:619-634(1995)]。 cor15a遺伝子プロモーター[Baker, S.S. et al.：Plant
Mol. Biol. 24:701-713(1994)]。 erd1遺伝子プロモーター[Nakashima K. et al.：Plant
J. 12:851-861(1997)]。 kin1遺伝子プロモーター[Wang,H．et al.：Plant Mol.
Biol.28:605-617(1995)]。

【００４３】但し、ストレス応答性であり、且つ植物体
内で機能することが知られている限り、上記プロモータ
ーに限定されるものではない。なお、これらのプロモー
ターは、該プロモーターを含むDNAの塩基配列に基づい
て設計したプライマーを用いて、ゲノムDNAを鋳型とし
て、PCRによる増幅反応によって得ることができる。

【００４４】また、必要に応じて転写終結を指令するタ
ーミネーターをDREB遺伝子の下流に連結することもでき
る。ターミネーターとしては、カリフラワーモザイクウ
イルス由来やノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターな
どが挙げられる。但し、植物体内で機能することが知ら
れているターミネーターであればこれに限定されるもの
ではない。

【００４５】また、必要に応じてプロモーター配列とDR
EB遺伝子の間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持つ
イントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデヒ
ドロゲナーゼ(Adh1)のイントロン[Genes＆ Development
1:1183-1200(1987)]を導入することができる。

【００４６】さらに、効率的に目的の形質転換細胞を選
択するために、有効な選択マーカー遺伝子をDREB遺伝子
と併用することが好ましい。その際に使用する選択マー
カーとしては、カナマイシン耐性遺伝子(NPTII)、抗生
物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与する
ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(htp)遺伝
子及びビアラホス(bialaphos)に対する抵抗性を付与す
るホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(ba
r)遺伝子等から選ばれる１つ以上の遺伝子を使用するこ
とができる。DREB遺伝子及び選択マーカー遺伝子は、単
一のベクターに一緒に組み込んでも良いし、それぞれ別
個のベクターに組み込んだ２種類の組換えDNAを用いて
もよい。

【００４７】(2) 植物宿主へのDREB遺伝子の導入 本発明において、植物宿主とは、植物培養細胞、栽培植
物の植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、
根茎、種子等)、又は植物組織(例えば表皮、師部、柔組
織、木部、維管束等)のいずれをも意味するものであ
る。植物宿主として用いることができる植物としては、
シロイヌナズナ、タバコ、イネ、トウモロコシなどが挙
げられる。DREB遺伝子は、採取した植物切片にDREB遺伝
子を含むベクターをアグロバクテリウム感染法、パーテ
ィクルガン法、又はポリエチレングリコール法などで、
上記植物宿主に導入することができる。あるいはプロト
プラストにエレクトロポレーション法によりDREB遺伝子
を含むベクターを導入することもできる。

【００４８】アグロバクテリウム感染法により遺伝子を
導入する場合、目的の遺伝子を含むプラスミドを保有す
るアグロバクテリウムを植物宿主に感染させる工程が必
要である。この工程は、バキュームインフィルトレーシ
ョン法[CR Acad. Sci. Paris, Life Science, 316 :119
4(1993)]により行うことができる。すなわち、シロイヌ
ナズナをバーミキュライトとパーライトを等量ずつ合わ
せた土で生育させたシロイヌナズナに、DREB遺伝子を含
むプラスミドを含むアグロバクテリウムの培養液に直接
シロイヌナズナを浸し、これをデシケーターに入れバキ
ュームポンプで65〜70mmHgになるまで吸引後、5〜10分
間、室温に放置する。鉢をトレーに移しラップで覆い湿
度を保つ。翌日ラップを取り、植物をそのまま生育させ
種子を収穫する。

【００４９】次いで、目的遺伝子保有個体を選択するた
めに、様々な株由来の種子を適切な抗生物質を加えたMS
寒天培地に播種する。この培地で生育したシロイヌナズ
ナを鉢に移し、生育させることにより、本発明に用いる
遺伝子が導入されたトランスジェニック植物の種子を得
ることができる。

【００５０】一般に、植物に導入した遺伝子は、宿主植
物のゲノム中に組み込まれるが、その場合、導入される
ゲノム上での位置が異なることにより導入遺伝子の発現
が異なるポジションイフェクトと呼ばれる現象が見られ
る。導入遺伝子がより強く発現している形質転換体は、
導入遺伝子のDNA断片をプローブとして用いるノーザン
法により宿主植物中に発現しているmRNAレベルを検定す
ることによって選抜することができる。

【００５１】本発明に用いる遺伝子を導入したトランス
ジェニック植物及びその次世代に目的の遺伝子が組み込
まれていることの確認は、これらの細胞及び組織から常
法に従ってDNAを抽出し、公知のPCR法又はサザン分析を
用いて導入した遺伝子を検出することにより行うことが
できる。

【００５２】(3) DREB遺伝子の植物組織での発現レベル
及び発現部位の分析 DREB遺伝子を導入したトランスジェニック植物における
該遺伝子の発現レベル及び発現部位の分析は、これらの
細胞及び組織から常法に従ってRNAを抽出し、公知のRT-
PCR法又はノーザン分析を用いてDREB遺伝子のmRNAを検
出することにより行うことができる。また、DREBタンパ
ク質を、該タンパク質に対する抗体を用いたウエスタン
分析等によって直接分析することもできる。

【００５３】(4) DREB遺伝子が導入されたトランスジェ
ニック植物体内における各種遺伝子のmRNAレベルの変化 DREB遺伝子が導入されたトランスジェニック植物体内に
おいて、DREBタンパク質の作用により、発現レベルが変
化したと考えられる遺伝子はノーザン分析によって同定
することができる。ノーザン分析においては、DREB遺伝
子が導入されたトランスジェニック植物と導入されてい
ない植物とを用いて、標的遺伝子と考えられる遺伝子の
mRNAレベルを常法に従って、比較することによって検定
することができる。

【００５４】例えば、GM寒天培地などで育てた植物に、
所定期間（例えば１〜２週間）の乾燥及び／又は低温ス
トレスを与える。乾燥ストレスの負荷は、寒天培地から
植物体を、抜き取り濾紙上で10分〜24時間乾燥させるこ
とにより与えることができる。一方、低温ストレスの負
荷は、15〜-4℃に10分〜24時間保持することにより与え
ることができる。ストレスを与えないコントロール植物
と乾燥及び低温ストレスを与えた植物から全RNAを調製
して電気泳動を行い、ノーザン分析又はＲＴ−ＰＣＲに
よって発現している遺伝子を検定する。

【００５５】（５） トランスジェニック植物の環境ス
トレスに対する耐性の評価 DREB遺伝子を導入したトランスジェニック植物の環境ス
トレスに対する耐性は、バーミキュライト、パーライト
などを含む土を入れた植木鉢にトランスジェニック植物
を植え、乾燥・低温・凍結などの各種ストレスを負荷し
た場合の生存を調べることによって評価することができ
る。例えば、乾燥ストレスに対する耐性は、2〜4週間、
水を与えずその生存を調べることにより、また凍結スト
レスに対する耐性は、-6〜-10℃に、5〜10日間置いた
後、5〜10日間、20〜25℃で生育させその生存率を調べ
ることにより評価することができる。

【００５６】

【実施例】以下に、本発明を実施例を示して具体的に説
明するが、本発明に用いる範囲はこれらに限定されるも
のではない。 〔実施例１〕DREB1A遺伝子及びDREB2A遺伝子のクローニ
ング (1) シロイヌナズナ植物体の栽培 LEHLE SEEDSから入手したシロイヌナズナの種子を滅菌
液(1％次亜塩素酸ナトリウム、0.02％Triton X-100)に1
5分間浸漬することにより滅菌し、次いで滅菌水により
水洗後、GM寒天培地(１リットル当り：ムラシゲ・スク
ーグ培地用混合塩類(日本製薬社製)4.6g、MES 0.5g、スク
ロース30g、寒天８g、pH 5.7)に、40〜120粒播種した。そ
して約1000lux、16時間明期、８時間暗期の光条件下に
おいて、22℃で栽培することにより植物体を得た。

【００５７】(2) ポリ(A)⁺RNAの調製 上記(1)において得た植物体を、４℃で24時間の低温処
理を行った後、グリオキザール法により全RNAを調製し
た。すなわち、液体窒素により凍結したシロイヌナズナ
の植物体３ｇを、100mlの5.5M GTC溶液(5.5Mグアニジン
チオシアネート、25mMクエン酸ナトリウム、0.5％N-ラ
ウロイルサルコシン酸ナトリウム)に懸濁し、ホモジェ
ナイザーで素早く細胞を可溶化させた。このホモジェネ
ートを、18-Gの注射針を取り付けた注射筒を用いて10回
以上出し入れすることによりDNAを細断した後、４℃、1
2,000×gで15分間遠心し、細胞破片を沈殿させて除去し
た。

【００５８】得られた上清をオートクレーブ済の遠心管
に入れた17mlのCsTFA溶液(セシウムトリフルオロアセテ
ート(Pharmacia社製)、0.25M EDTA、滅菌水を混合してD
=1.51に調整したもの)上に重層後、Beckmann SW28ロー
ター中15℃、25,000×rpmで24時間超遠心しRNAを沈殿さ
せた。次いで得られたRNAを、600μl の4M GTC溶液(上
記5.5M GTC溶液を滅菌水で希釈してGTC濃度が4Mとなる
ようにしたもの)に溶解しエタノール沈殿を行うことに
より目的の全RNAを得た。

【００５９】上記全RNAを、２mlのTE/NaCl(TEと1M NaCl
を1:1の割合で混合したもの)に溶解し、既にTE/NaClで
平衡化しておいたオリゴdTセルロースカラム(Collabora
tiveresearch社製オリゴdTセルロース(type３)をBio-Ra
d社製エコノカラム(直径0.6cm)に高さ1.5cmとなるよう
に詰めたもの)に通し、通過した溶液をもう一度カラム
に通した。次いで、約８mlのTE/NaClでカラムを洗浄
後、TEを加えてポリ(A)⁺RNAを溶出・精製した。得られ
たRNAの量は、UV分光器により測定した。

【００６０】(3) cDNAライブラリーの合成 上記(2)により得られたポリ(A)⁺RNA ５μgを用いて、cD
NA合成キット (Stratagene社製)により二本鎖cDNAを合
成後、該二本鎖cDNAをpAD-GAL4プラスミド(Stratagene
社製)に連結しcDNAライブラリーを合成した。すなわ
ち、まず、キットに添付のプロトコルに従い、以下の反
応溶液中で一本鎖cDNAを合成した。

【００６１】

【００６２】上記溶液に、逆転写酵素1.5μl(50単位/μ
l)を添加して、37℃で、１時間インキュベートすること
により一本鎖cDNAを合成した。次に、得られた一本鎖cD
NAの反応液に、以下の試薬を順に加えた。

【００６３】

【００６４】上記反応液を、16℃で2.5時間インキュベ
ートすることにより二本鎖cDNAを合成した。合成した二
本鎖cDNAを、Pfu DNAポリメラーゼ５単位を用い72℃で3
0分間インキュベートすることにより末端を平滑した。
次いで、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール
沈殿を行った後、得られたペレットに９μlのEcoRI-Not
I-BamHIアダプター(TAKARA社製)、１μlの10×リガーゼ
緩衝液、１μlのATP、１μlのT4 DNAリガーゼ(４単位/
μl)を加え、４℃で２日間インキュベートすることによ
り、二本鎖cDNAにアダプターを付加した。次いで、両端
にEcoRI制限酵素部位を有するcDNAを、クローニングベ
クターであるpAD-GAL4プラスミド(Stratagene社製)のGA
L4の活性化ドメインの下流のEcoRI部位に、T4DNAリガー
ゼを用いて連結することによりcDNAライブラリーを合成
した。

【００６５】(4) ゲノムDNAの調製 上記(1)において得られた植物体から、Molecular Cloni
ng[Maniatis, T. et al., Molecular Cloning:a Labora
tory Manual,187-198,Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor,NY(1982)]に記載の方法に
従って、ゲノムDNAを調製した。すなわち、シロイヌナ
ズナ植物体50ｇに2,000mlの破砕用緩衝液(0.35Mスクロ
ース、1M Tris-HCl(pH8.0)、５mM MgCl₂、50mM KCl)を
加えて、ワーリングブレンダーで１分間の粉砕を３回行
うことによりホモジナイズした。

【００６６】摩砕液を濾過することにより、細胞残渣を
除去し、濾液を遠心管に分注し、スイングローターで3,
000×ｇ、４℃で10分間低速遠心した。遠心後、上清を
捨て沈殿を氷冷した30mlの破砕用緩衝液に懸濁ししてか
ら再度低速遠心した。緑色の沈殿が白くなるまで同じ操
作を３回繰り返した。

【００６７】得られた白い沈殿を氷冷した10mlのTEに懸
濁した後、10mlの溶解液(0.2M Tris-HCl(pH8.0)、50mM
EDTA、２％N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウム)を加
えた。0.1mlのプロティナーゼＫ(10mg/ml)を加え細胞核
を消化後、得られた消化液を、フェノール処理及びエタ
ノール沈殿させた。次いで沈殿により得られるDNA繊維
を3,000×g、５分間の遠心により回収し、これを１mlの
TEに溶解してゲノムDNAを得た。

【００６８】(5) 酵母ワンハイブリッドスクリーニング
に用いる酵母宿主の構築 本発明に用いる転写因子をコードする遺伝子をクローニ
ングするために、HIS3レポーター遺伝子又はlacZレポー
ター遺伝子の上流に、DREモチーフを含むDNA領域をそれ
ぞれ４カセット連結した２種類のプラスミドを含む、DR
E結合タンパク質遺伝子クローニング用宿主を構築した
(図１)。すなわち、まず、本発明に用いる転写因子が結
合するDRE配列を含む、rd29A遺伝子プロモーター領域(r
d29A遺伝子の翻訳開始点から-215〜-145の領域)をPCR法
により増幅した。すなわち、センスプライマーとして、
5'-AAGCTTAAGCTTACATCAGTTTGAAAGAAA-3'(配列番号11)
を、アンチセンスプライマーとして、5'-AAGCTTAAGCTTG
CTTTTTGGAACTCATGTC-3'(配列番号12)を合成した。ここ
で、これらのプライマーには、増幅後、PCR断片を容易
にベクターに連結することができるように、5'末端にHi
ndIII切断部位を導入した。なお、これらの合成プライ
マーは、全自動DNA合成機(Perkin-Elmer社製)を使用し
て化学合成した。これらのプライマーを用い、上記(3)
において調製したゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。
PCRの反応液の組成は以下の通りである。

【００６９】

【００７０】上記反応液を、よく混合後、ミネラルオイ
ルを50μl重層した。PCRは、98℃で15秒間の熱変性、65
℃で2秒間のアニーリング、74℃で30秒間の伸長反応の
条件を１サイクルとして、25サイクル行った。反応終了
後、クロロホルム50μｌを加え混合し、４℃、15,000rp
mで15分間遠心し、上層を新しいマイクロチューブに回
収した。そこにエタノール100μlを加えよく混合後、４
℃、15,000rpmで15分間遠心しPCR産物をペレット化し
た。

【００７１】得られたPCR産物をHindIIIで切断後ベクタ
ーｐSKのHindIII部位に連結し、この組換えプラスミド
を大腸菌に形質転換した。形質転換体よりプラスミドDN
Aを調製し、塩基配列を決定することにより、４回同じ
方向にDNA断片が結合されたものを選抜した。

【００７２】これをEcoRIとHincIIで切リ出した後、得
られたDNA断片を酵母の発現ベクターであるpHISi-1(Clo
ntech社製) のHIS3最小プロモーター上流のEcoRI-MluI
部位に連結した。また、同様に、DREを４カセット含むD
NA断片をpSKからEcoRIとHincIIで切り出し、酵母の発現
ベクターpLacZi (Clontech社製) のlacZ最小プロモータ
ーの上流のEcoRI-SalI部位に連結した。得られた２種の
プラスミドをSaccharomyces cerevisiae YM4271(MATa,
ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, leu2-3, 11
2, trp1-903) (Clontech社製) に形質転換することによ
り、酵母ワンハイブリッドスクリーニングに用いる酵母
宿主を得た（図１）。

【００７３】(6) DREB1A遺伝子及びDREB2A遺伝子のクロ
ーニング 上記(3)において調製したcDNAライブラリーを用いて1.2
× 10⁶の酵母の形質変換体をスクリーニングした。そ
の結果、２種のポジティブクローンを得た。得られたcD
NAをpAD-GAL4プラスミドからEcoRIを用いて切り出し、p
SKプラスミドのEcoRI部位に結合して、組換えプラスミ
ドpSKDREB1A及びpSKDREB2Aを得た。

【００７４】(7) 塩基配列の決定 このプラスミドpSKDREB1A及びpSKDREB2Aを用いて、得ら
れたcDNAの全塩基配列を決定した。プラスミドpSKDREB1
A及びpSKDREB2Aは、培養した大腸菌細胞中から自動プラ
スミド調製機(KURABO社製Model PI-100)によって調製し
た。塩基配列決定のための反応は、反応用ロボッド(Per
kin Elmer社製CATALYST 800)を用いて行った。塩基配列
決定は、自動塩基配列決定機(Perkin Elmer社製Model 3
73A)を用いて行った。その結果、プラスミドpSKDREB1A
中のcDNAは、933 bpの塩基から構成されており(配列番
号１)、該塩基配列中には216アミノ酸残基からなる推定
分子量約24.2キロダルトンのタンパク質(配列番号２)を
コードする唯一のオープンリーディングフレームの存在
することがわかった。一方プラスミドpSKDREB2A のcDNA
は、1437bpの塩基から構成されており(配列番号３)、該
塩基配列中には335アミノ酸残基からなる推定分子量約3
7.7キロダルトンのタンパク質(配列番号４)をコードす
る唯一のオープンリーディングフレームの存在すること
がわかった。

【００７５】(8) DREB1Aタンパク質又はDREB2Aタンパク
質のホモローグをコードする遺伝子の単離 上記(6)において得られたDREB1A遺伝子又はDREB2A遺伝
子がコードするタンパク質のホモローグをコードする遺
伝子を単離した。すなわち、上記(5)において得られたD
REB1A遺伝子を含む二本鎖cDNA断片又はDREB2A遺伝子を
含む二本鎖cDNA断片をプローブとして、Molecular Clon
ing[Sambrook, J et al., Molecular Cloning:a Labora
tory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 10 Skyline Drive Plainview,NY(1989)]に記載
の方法に従い、シロイヌナズナのλgt11ｃDNAライブラ
リーから、ホモローグをコードする遺伝子を単離した。
DREB1Aタンパク質のホモローグをコードする遺伝子とし
て、DREB1B遺伝子及びDREB1C遺伝子を、DREB2Aタンパク
質のホモローグをコードする遺伝子としてDREB2B遺伝子
を得た。塩基配列決定したところ、DREB1B遺伝子(配列
番号５)はCBF1と呼ばれる遺伝子[Stockinger,E.J. et a
l. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1035-1040(1997)]
と同一であったが、DREB1C遺伝子(配列番号７)、DREB2B
遺伝子(配列番号９)は新規であった。

【００７６】オープンリーディングフレームの解析から
DREB1C遺伝子がコードする遺伝子産物は216アミノ酸残
基よりなる分子量約24.3キロダルトンのタンパク質(配
列番号８)であり、DREB2B遺伝子がコードする遺伝子産
物は330アミノ酸残基よりなる分子量約37.1キロダルト
ンのタンパク質(配列番号10)であった。

【００７７】〔実施例２〕DREB1Aタンパク質及びDREB2A
タンパク質のDREへの結合能の解析 DREB1Aタンパク質及びDREB2Aタンパク質のDREへの結合
能を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)と該タ
ンパク質との融合タンパク質を大腸菌を用いて調製し、
ゲルシフトアッセイにより調べた。DREB1AcDNAの塩基配
列の119番目から547番目の 429塩基のDNA断片又はDREB2
AcDNAの塩基配列の167番目から666番目の500塩基のDNA
断片をPCRによって増幅後、該増幅断片をプラスミドpGE
X-4T-1（ファルマシア）のEcoRI-SalI部位に結合した。
これを大腸菌JM109に導入したのち、大腸菌を200 mlの
２x YT培地（Molecular Cloning (1982) Cold Spring H
arvor Laboratory Press)で培養して、これにプラスミ
ドpGEX-4T-1中のプロモーターを活性化させる1 mMのイ
ソプロピルβ-D-チオガラクトシドを加え、DREB1Aタン
パク質とGSTとの融合タンパク質の合成を誘導した。

【００７８】タンパク質を行った大腸菌を、13 ml の緩
衝液（10 mM Tris-HCl, 0.1 mM DTT, 0.1mM phenylmeth
ylsulfonyl fluoride)に懸濁した後、１％ Triton X-10
0と1mMEDTAを加え、細胞を超音波で破壊した。得られた
細胞破砕物を、22,000×gで20分間遠心し、グルタチオ
ン-セファロース (Pharmacia製)を担体とするアフィニ
ティークロマトグラフィーによってDREB1Aタンパク質又
はDREB2Aタンパク質とGSTとの融合タンパク質を精製し
た。次に、融合タンパク質を、PCRによって調製したDRE
配列を含む71塩基のDNA断片プローブとともに(³²Pで放
射能標識したもの)室温で20分間インキュベートした。
これを0.25xTris-borate-EDTAを含む６％アクリルアミ
ドを用いて、100Vで２時間の電気泳動を行った。電気泳
動後のゲルについてのオートラジオグラムの結果を図２
に示した。この図からも明らかなように、融合タンパク
質をDRE配列を含む71塩基のDNA断片プローブ(配列番号1
8)とともにインキュベートしたものは、遅れて泳動する
バンドが検出された。また、DRE配列に変異を加えたDNA
断片(配列番号19、配列番号20、配列番号21)をプローブ
として用いた場合はこのバンドは検出されず、一方DRE
配列の外に変異を加えたDNA断片(配列番号22、配列番号
23)をプローブとして用いた場合には、バンドが検出さ
れた。このことから、DREB1Aタンパク質又はDREB2Aタン
パク質がDRE配列に特異的に結合していることわかっ
た。

【００７９】〔実施例３〕DREB1Aタンパク質及びDREB2A
タンパク質のDRE下流遺伝子の転写活性化能の解析 DREB1Aタンパク質及びDREB2Aタンパク質が、植物細胞内
におけるDRE依存的な転写をトランスに活性化し得るか
どうかを調べるため、シロイヌナズナの葉から調製した
プロトプラストの系を用いて、トランスアクチベーショ
ン実験を行った。すなわち、まず、DREB1A又はDREB2Aの
cDNAをCaMV35Sプロモーターを含むpBI221プラスミドに
連結することによりエフェクタープラスミドを構築し
た。レポータープラスミドを得るため、DREの配列を含
む71塩基の配列を三個結合したDNA断片をrd29A遺伝子の
最小限のTATAプロモーターとβ-グルクロニダーゼ(GUS)
遺伝子に結合した。この２種のエフェクタープラスミド
とレポータープラスミドとをシロイヌナズナのプロトプ
ラストに導入したのち、GUS活性を測定した。DREB1Aタ
ンパク質又はDREB2Aタンパク質を同時に発現させるとGU
S活性の上昇が見られ、DREB1Aタンパク質はDREの配列を
介して転写を活性化している転写因子であることが示さ
れた(図３)。

【００８０】〔実施例４〕CaMV35Sプロモーターの下流
にDREB1A遺伝子をコードするDNAを連結した遺伝子を含
むトランスジェニック植物の作製 (1) 植物プラスミドの構築 上記のようにして得られたpSKDREB1A(10μg)を、10mM T
risHCl(pH7.5)/10mM MgCl₂/1mMジチオスレイトール/100
mM NaCl中、EcoRV(20ユニット)とSmaI (20ユニット)
を用いて37℃で2時間切断し、DREB1A遺伝子を含む約0.9
kbのDNA断片を得た。一方、プロモーターDNAを持つプラ
スミドpBI2113Not(10 μg)を、10 mM TrisHCl (pH7.5)/
10mM MgCl₂/1mMジチオスレイトール(DTT)/100 mM NaCl
中、SmaIを用いて37℃で2時間切断した。DREB1A遺伝子
を含む0.9kbの前記DNA断片とpBI2113Notとを、66 mM T
risHCl (pH7.6)/6.6 mM MgCl₂/10 mM DTT/0.1 mM ATP
中、T4DNAリガーゼ(2ユニット) を用いて、15℃で16時
間反応させることにより連結し、得られた連結物を大腸
菌JM109に形質転換した。得られた形質転換体を培養
後、該培養物からプラスミドpBI35S:DREB1Aを精製した
(図４)。次に塩基配列の決定を行いDREB1A遺伝子がセン
ス方向に結合したものを選抜した。ここで、pBI2113Not
プラスミドは、pBI2113プラスミド[Plant Cell Physiol
ogy 37:49-59(1996)]をSmaIとSacIで切断して、GUS 遺
伝子のコード領域を取り除き、これにSmaI-NotI-SacIポ
リリンカーを結合することにより調製した。

【００８１】(2) 植物プラスミドpBI35S:DREB1Aを含む
接合体アグロバクテリウムの調製 上記(1)において得られた植物プラスミドpBI35S:DREB1A
を持つ大腸菌DH5a、ヘルパープラスミドpRK2013を持つ
大腸菌HB101及びアグロバクテリウムC58をLB培地を用い
て28℃でLB寒天培地上で24時間混合培養した。生育した
コロニーを1 mlのLB培地にかきとり懸濁した。この懸濁
液 10mlをリファンピシリン100μg/ml,及びカナマイシ
ン20μg/mlを含むLB寒天培地に塗り、28℃で２日間培養
して、接合体アグロバクテリウムC58 (pBI35S:DREB1A)
を得た。

【００８２】(3) アグロバクテリウム感染法によるシロ
イヌナズナへの遺伝子導入 この接合体をリファンピシリン100μg/ml, 及びカナマ
イシン20μg/mlを含むLB培地 (10 ml)中28℃で２４時間
培養した。さらに、この培養液を500 mlのLB培地に加え
て２４時間培養した。この培養液を遠心して培地を除
き、さらに 250 mlのLB培地に懸濁した。

【００８３】一方、バーミキュライトとパーライトとを
等量ずつ合わせた土を入れた９cmの植木鉢で４から５本
のシロイヌナズナを６週間育てた。プラスミドpBI35S:D
REB1Aを含むアグロバクテリウムのLB培養液に直接上記
のシロイヌナズナを浸して、これをデシケーターに入れ
バキュームポンプで650mmHgになるまで吸引後、そのま
ま10分放置した。鉢をトレーに移しラップで覆い湿度を
保った。翌日ラップを取り、植物をそのまま生育させ種
子を得た。種子は次亜塩素酸ナトリウム水溶液で滅菌
後、選択用のMS培地にバンコマイシン100μg/ml、カナ
マイシン30μg/mlを加えた寒天培地に蒔いた。この培地
で生育したシロイヌナズナを鉢に移し形質転換植物体の
種子を得た。

【００８４】(4) 導入遺伝子と導入遺伝子がコードする
転写因子が発現を変化させた遺伝子の同定 形質転換体の導入遺伝子DREB1Aと導入遺伝子が発現を変
化させたと考えられる遺伝子のmRNAレベルをノーザン分
析により調べた。すなわち、DREB１A遺伝子、rd29A遺伝
子、kin1遺伝子、cor6.6遺伝子、cor6.6遺伝子、cor15a
遺伝子、rd17遺伝子、erd10遺伝子、P5CS遺伝子、erd1
遺伝子、rd22遺伝子、rd29B遺伝子の部分断片をプロー
ブとして。ノーザン分析にはシロイヌナズナの形質転換
体の他に形質転換していない植物を用いて遺伝子の発現
を比較することで検定した。2 gの３週間GM寒天培地で
育てた植物に乾燥及び低温ストレスを与えた。乾燥スト
レスについては寒天培地から抜き取り濾紙上で５時間乾
燥させた。低温ストレスについては植物体を４℃に５時
間保温した。ストレスを与えないコントロールの植物と
上記乾燥と低温ストレスを与えた植物から全RNAを調製
して、電気泳動を行いノーザン法で発現している遺伝子
を検定した。一般に、形質転換体においては遺伝子は同
様にゲノムに導入されるが、その導入場所が異なること
から、導入遺伝子の発現が異なるポジションイフェクト
と呼ばれる現象が見られる。プローブとして導入遺伝子
のDNA断片を用い、ノーザン法で検定することより導入
遺伝子が強く発現している形質転換体を選抜した。ま
た、プローブとして上記のストレス耐性に関与している
可能性のある遺伝子のDNA断片を用い、DREB1A遺伝子を
導入することでmRNAレベルの変化した遺伝子を同定した
(図５)。

【００８５】(5) 乾燥・凍結ストレスに対する耐性の発
現 ３週間バーミキュライトとパーライトを等量ずつ合わせ
た土を入れた９cmの植木鉢で育てたシロイヌナズナの形
質転換体を用いて乾燥・凍結耐性に関して検討した。形
質転換体とコントロールとしてDREB1A遺伝子を含まない
pBI121を形質転換したシロイヌナズナを用いて乾燥スト
レスに対する耐性、凍結ストレスに対する耐性を検討し
た。乾燥ストレスに対する耐性の検討では２週間水を止
めその生存を調べた。また凍結耐性では−６℃に２日間
置いた後５日間22℃で生育させその生存率を調べた。

【００８６】その結果、コントールではすべての植物が
枯れてしまったが、DREB1A遺伝子を導入したトランスジ
ェニック植物では高い生存率を示した(図６)。しかし、
これらのトランスジェニック植物においては成長の抑制
及び矮化が見られた。

【００８７】〔実施例５〕rd29A遺伝子プロモーターの
下流にDREB1A遺伝子をコードするDNAを連結した遺伝子
を含むトランスジェニック植物の作製 (1) rd29A遺伝子プロモーターを含むpBI29APNotベクタ
ーの構築 両端にHindIII部位を結合したrd29Aプロモーター領域(r
d29A遺伝子の翻訳開始点から-861〜+63の領域)を以下の
プライマーを用い、実施例２の(4)と同条件でPCR法にて
作出した(配列番号17)。用いたプライマーの塩基配列は
5'-AAGCTTAAGCTTGCCATAGATGCAATTCAATC-3' (配列番号1
3)と5'-AAGCTTAAGCTTTTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAA-3'(配
列番号14)であった。PCRで得られたDNA断片はHindIIIで
切断後、植物のバイナリーベクターであるpBI101 (Clon
tech, Palo Alto, CA, USA)のHindIII部位に結合した。
pBI101はβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子がコードされ
ているのでこれをSmaIとSacIで切断してSmaI-NotI-SacI
ポリリンカーで結合した。これを大腸菌DH5aに導入して
プラスミドpBI29APNotを調製した。

【００８８】(2) rd29A遺伝子プロモーターを用いた植
物プラスミドpBI29AP:DREB1Aの構築 DREB1A遺伝子は、実施例１において得られたpSKDREB1A
を鋳型として、PCR法により増幅した。すなわち、セン
スプライマーとして、5'-GGATCCGGATCCATGAACTCATTTTCT
GCT-3' (配列番号15)を、アンチセンスプライマーとし
て、5'-GGATCCGGATCCTTAATAACTCCATAACGATA- 3'(配列番
号16)を合成した。ここで、これらのプライマーには、
増幅後、PCR断片を容易にベクターに連結することがで
きるように、5'末端にBamHI切断部位を導入した。このP
CR産物を１％アガロースゲル電気泳動に供試し、900〜1
000bp付近の大きさのPCR産物をゲルから切り出した。こ
のゲル断片を新しいマイクロチューブに移した後、67℃
に10分間保持することによりゲルを溶解した。得られた
ゲル溶解物に等容量のTEを加えよく混合した後、フェノ
ール抽出した。さらに得られた抽出物を1,600×ｇで３
分間遠心後、水層を再びフェノール抽出、フェノール／
クロロホルム抽出し、水層に冷エタノールを加えエタノ
ール沈殿しPCR産物を得た。

【００８９】得られたPCR産物10μgを、30μlのTEに溶
解し、これをBamHI(20ユニット)で切断した。70℃で1時
間加温して、BamHIを失活させた後、フェノール抽出、
エタノール沈殿によりDREB１A遺伝子を含むDNA断片を回
収した。次いで、このDNA断片を、ベクターpBI29APNot
のBamHI部位に連結し、この組換えプラスミドを大腸菌
(DH5α株)に形質転換後、形質転換体をカナマイシン耐
性により選択し、得られた形質転換体をLB培地で培養
後、抽出精製することにより植物プラスミドpBI29AP:DR
EB1Aを得た(図７)。

【００９０】(4) 植物プラスミドpBI29AP:DREB1Aを含む
接合体アグロバクテリウムの調製 上記(3)において得られた組換えプラスミドpBI29AP:DRE
B1Aを用いて、実施例５(2)と同様の手順により植物プラ
スミドpBI29AP:DREB1Aを含む接合体アグロバクテリウム
を調製した。 (5) アグロバクテリウム感染法によるシロイヌナズナへ
の遺伝子導入 上記(4)において得られた接合体アグロバクテリウムを
用いて、実施例５(3)と同様の手順により植物プラスミ
ドpBI29AP:DREB1Aをシロイヌナズナに導入した。

【００９１】(6) 形質転換体の成長及び乾燥・凍結・塩
ストレス耐性の観察 上記(5)において得られたrd29A遺伝子プロモーター下流
にDREB1A遺伝子を連結したプラスミドを導入したシロイ
ヌナズナのトランスジェニック植物体、実施例５におい
て得られたCaMV35S遺伝子プロモーター下流にDREB1A遺
伝子を連結したプラスミドを導入した得られたシロイヌ
ナズナのトランスジェニック植物体、及びコントロール
として形質転換していない植物体を同一条件下で栽培
し、成長及び乾燥・凍結・塩ストレス負荷後の生存率を
調べた。すなわち、バーミキュライト及びパーライトを
等量ずつ合わせた土を入れた９cmの植木鉢に各植物体を
植え露地栽培した。図８は栽培を始めてから35日目(図
８Ａ及び図９Ａ)と65日目(図８Ｂ及び図９Ｂ)の成長を
示す植物体の写真である。PBI35S:DREB1Aを導入したト
ランスジェニック植物では株によって成長の度合いに差
が見られるが、成長に大きな阻害が見られた(図８Ａ及
び図８Ｂ)。これに対してpBI29AP:DREB1Aを導入したト
ランスジェニック植物ではほとんど成長に阻害が見られ
なかった(図９Ａ及び図９Ｂ)。

【００９２】次に、ストレスに対する耐性度を調べた。
すなわち、乾燥ストレスに対する耐性の検討では２週間
水を与えなかった場合の生存、凍結ストレスに対する耐
性では−６℃に２日間置いた後５日間22℃で生育させた
場合の生存、塩ストレスに対する耐性は600mM NaClに２
時間浸した後、鉢に移し３週間生育させた場合の生存を
調べた。その結果、図10及び表１〜３のように、乾燥又
は凍結ストレスを与えたコントロールの植物はすべて枯
れた。塩ストレスを与えたコントロールの植物も生存す
るものはわずかであった。pBI35S:DREB1Aを導入したト
ランスジェニック植物では株によってその生存率に差が
見られ、導入したDREB1A遺伝子の発現が強い植物ほど耐
性度が高かった。これに対してpBI29AP:DREB1Aを導入し
た形質転換体では43種を解析したが耐性度はほとんど同
様であり、pBI35S:DREB1Aを導入した形質転換体よりも
高い生存率を示した。このように、本発明により作出し
た植物は、高いレベルの乾燥・凍結・塩耐性を有し且つ
良好な成長を示すことがわかった。

【００９３】

【００９４】

【００９５】

【００９６】

【発明の効果】本発明により、ストレス応答性プロモー
ターの下流に、ストレス応答性エレメントに結合し該エ
レメント下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコ
ードするDNAが連結された遺伝子を含む、環境ストレス
(乾燥ストレス、低温ストレス、塩ストレスなど)に対す
る耐性が向上し且つ矮化の起こらないトランスジェニッ
ク植物が提供される。

【００９７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Nobuyoshi Maeno, Director General, Japan International Research Center for Agricultural Sciences ；Bio-oriented Technology Research Advancement Institution <120> Environmental Stress-resistant Plant <160> 23 <210> 1 <211> 933 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (119)..(766) <400> 1 cctgaactag aacagaaaga gagagaaact attatttcag caaaccatac caacaaaaaa 60 gacagagatc ttttagttac cttatccagt ttcttgaaac agagtactct tctgatca 118 atg aac tca ttt tct gct ttt tct gaa atg ttt ggc tcc gat tac gag 166 Met Asn Ser Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly Ser Asp Tyr Glu 1 5 10 15 tct tcg gtt tcc tca ggc ggt gat tat att ccg acg ctt gcg agc agc 214 Ser Ser Val Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Pro Thr Leu Ala Ser Ser 20 25 30 tgc ccc aag aaa ccg gcg ggt cgt aag aag ttt cgt gag act cgt cac 262 Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His 35 40 45 cca ata tac aga gga gtt cgt cgg aga aac tcc ggt aag tgg gtt tgt 310 Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Cys 50 55 60 gag gtt aga gaa cca aac aag aaa aca agg att tgg ctc gga aca ttt 358 Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe 65 70 75 80 caa acc gct gag atg gca gct cga gct cac gac gtt gcc gct tta gcc 406 Gln Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala 85 90 95 ctt cgt ggc cga tca gcc tgt ctc aat ttc gct gac tcg gct tgg aga 454 Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg 100 105 110 ctc cga atc ccg gaa tca act tgc gct aag gac atc caa aag gcg gcg 502 Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala 115 120 125 gct gaa gct gcg ttg gcg ttt cag gat gag atg tgt gat gcg acg acg 550 Ala Glu Ala Ala Leu Ala Phe Gln Asp Glu Met Cys Asp Ala Thr Thr 130 135 140 gat cat ggc ttc gac atg gag gag acg ttg gtg gag gct att tac acg 598 Asp His Gly Phe Asp Met Glu Glu Thr Leu Val Glu Ala Ile Tyr Thr 145 150 155 160 gcg gaa cag agc gaa aat gcg ttt tat atg cac gat gag gcg atg ttt 646 Ala Glu Gln Ser Glu Asn Ala Phe Tyr Met His Asp Glu Ala Met Phe 165 170 175 gag atg ccg agt ttg ttg gct aat atg gca gaa ggg atg ctt ttg ccg 694 Glu Met Pro Ser Leu Leu Ala Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu Pro 180 185 190 ctt ccg tcc gta cag tgg aat cat aat cat gaa gtc gac ggc gat gat 742 Leu Pro Ser Val Gln Trp Asn His Asn His Glu Val Asp Gly Asp Asp 195 200 205 gac gac gta tcg tta tgg agt tat taaaactcag attattattt ccatttttag 796 Asp Asp Val Ser Leu Trp Ser Tyr 210 215 tacgatactt tttattttat tattattttt agatcctttt ttagaatgga atcttcatta 856 tgtttgtaaa actgagaaac gagtgtaaat taaattgatt cagtttcagt ataaaaaaaa 916 aaaaaaaaaa aaaaaaa 933 <210> 2 <211> 216 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Asn Ser Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly Ser Asp Tyr Glu 1 5 10 15 Ser Ser Val Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Pro Thr Leu Ala Ser Ser 20 25 30 Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His 35 40 45 Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Cys 50 55 60 Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe 65 70 75 80 Gln Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala 85 90 95 Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg 100 105 110 Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala 115 120 125 Ala Glu Ala Ala Leu Ala Phe Gln Asp Glu Met Cys Asp Ala Thr Thr 130 135 140 Asp His Gly Phe Asp Met Glu Glu Thr Leu Val Glu Ala Ile Tyr Thr 145 150 155 160 Ala Glu Gln Ser Glu Asn Ala Phe Tyr Met His Asp Glu Ala Met Phe 165 170 175 Glu Met Pro Ser Leu Leu Ala Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu Pro 180 185 190 Leu Pro Ser Val Gln Trp Asn His Asn His Glu Val Asp Gly Asp Asp 195 200 205 Asp Asp Val Ser Leu Trp Ser Tyr 210 215 <210> 3 <211> 1437 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (167)..(1171) <400> 3 gctgtctgat aaaaagaaga ggaaaactcg aaaaagctac acacaagaag aagaagaaaa 60 gatacgagca agaagactaa acacgaaagc gatttatcaa ctcgaaggaa gagactttga 120 ttttcaaatt tcgtccccta tagattgtgt tgtttctggg aaggag atg gca gtt 175 Met Ala Val 1 tat gat cag agt gga gat aga aac aga aca caa att gat aca tcg agg 223 Tyr Asp Gln Ser Gly Asp Arg Asn Arg Thr Gln Ile Asp Thr Ser Arg 5 10 15 aaa agg aaa tct aga agt aga ggt gac ggt act act gtg gct gag aga 271 Lys Arg Lys Ser Arg Ser Arg Gly Asp Gly Thr Thr Val Ala Glu Arg 20 25 30 35 tta aag aga tgg aaa gag tat aac gag acc gta gaa gaa gtt tct acc 319 Leu Lys Arg Trp Lys Glu Tyr Asn Glu Thr Val Glu Glu Val Ser Thr 40 45 50 aag aag agg aaa gta cct gcg aaa ggg tcg aag aag ggt tgt atg aaa 367 Lys Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Lys 55 60 65 ggt aaa gga gga cca gag aat agc cga tgt agt ttc aga gga gtt agg 415 Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Arg Cys Ser Phe Arg Gly Val Arg 70 75 80 caa agg att tgg ggt aaa tgg gtt gct gag atc aga gag cct aat cga 463 Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg 85 90 95 ggt agc agg ctt tgg ctt ggt act ttc cct act gct caa gaa gct gct 511 Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Gln Glu Ala Ala 100 105 110 115 tct gct tat gat gag gct gct aaa gct atg tat ggt cct ttg gct cgt 559 Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Ala Met Tyr Gly Pro Leu Ala Arg 120 125 130 ctt aat ttc cct cgg tct gat gcg tct gag gtt acg agt acc tca agt 607 Leu Asn Phe Pro Arg Ser Asp Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Ser Ser 135 140 145 cag tct gag gtg tgt act gtt gag act cct ggt tgt gtt cat gtg aaa 655 Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Thr Pro Gly Cys Val His Val Lys 150 155 160 aca gag gat cca gat tgt gaa tct aaa ccc ttc tcc ggt gga gtg gag 703 Thr Glu Asp Pro Asp Cys Glu Ser Lys Pro Phe Ser Gly Gly Val Glu 165 170 175 ccg atg tat tgt ctg gag aat ggt gcg gaa gag atg aag aga ggt gtt 751 Pro Met Tyr Cys Leu Glu Asn Gly Ala Glu Glu Met Lys Arg Gly Val 180 185 190 195 aaa gcg gat aag cat tgg ctg agc gag ttt gaa cat aac tat tgg agt 799 Lys Ala Asp Lys His Trp Leu Ser Glu Phe Glu His Asn Tyr Trp Ser 200 205 210 gat att ctg aaa gag aaa gag aaa cag aag gag caa ggg att gta gaa 847 Asp Ile Leu Lys Glu Lys Glu Lys Gln Lys Glu Gln Gly Ile Val Glu 215 220 225 acc tgt cag caa caa cag cag gat tcg cta tct gtt gca gac tat ggt 895 Thr Cys Gln Gln Gln Gln Gln Asp Ser Leu Ser Val Ala Asp Tyr Gly 230 235 240 tgg ccc aat gat gtg gat cag agt cac ttg gat tct tca gac atg ttt 943 Trp Pro Asn Asp Val Asp Gln Ser His Leu Asp Ser Ser Asp Met Phe 245 250 255 gat gtc gat gag ctt cta cgt gac cta aat ggc gac gat gtg ttt gca 991 Asp Val Asp Glu Leu Leu Arg Asp Leu Asn Gly Asp Asp Val Phe Ala 260 265 270 275 ggc tta aat cag gac cgg tac ccg ggg aac agt gtt gcc aac ggt tca 1039 Gly Leu Asn Gln Asp Arg Tyr Pro Gly Asn Ser Val Ala Asn Gly Ser 280 285 290 tac agg ccc gag agt caa caa agt ggt ttt gat ccg cta caa agc ctc 1087 Tyr Arg Pro Glu Ser Gln Gln Ser Gly Phe Asp Pro Leu Gln Ser Leu 295 300 305 aac tac gga ata cct ccg ttt cag ctc gag gga aag gat ggt aat gga 1135 Asn Tyr Gly Ile Pro Pro Phe Gln Leu Glu Gly Lys Asp Gly Asn Gly 310 315 320 ttc ttc gac gac ttg agt tac ttg gat ctg gag aac taaacaaaac 1181 Phe Phe Asp Asp Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Glu Asn 325 330 335 aatatgaagc tttttggatt tgatatttgc cttaatccca caacgactgt tgattctcta 1241 tccgagtttt agtgatatag agaactacag aacacgtttt ttcttgttat aaaggtgaac 1301 tgtatatatc gaaacagtga tatgacaata gagaagacaa ctatagtttg ttagtctgct 1361 tctcttaagt tgttctttag atatgtttta tgttttgtaa caacaggaat gaataataca 1421 cacttgtaaa aaaaaa 1437 <210> 4 <211> 335 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 Met Ala Val Tyr Asp Gln Ser Gly Asp Arg Asn Arg Thr Gln Ile Asp 1 5 10 15 Thr Ser Arg Lys Arg Lys Ser Arg Ser Arg Gly Asp Gly Thr Thr Val 20 25 30 Ala Glu Arg Leu Lys Arg Trp Lys Glu Tyr Asn Glu Thr Val Glu Glu 35 40 45 Val Ser Thr Lys Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly 50 55 60 Cys Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Arg Cys Ser Phe Arg 65 70 75 80 Gly Val Arg Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu 85 90 95 Pro Asn Arg Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Gln 100 105 110 Glu Ala Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Ala Met Tyr Gly Pro 115 120 125 Leu Ala Arg Leu Asn Phe Pro Arg Ser Asp Ala Ser Glu Val Thr Ser 130 135 140 Thr Ser Ser Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Thr Pro Gly Cys Val 145 150 155 160 His Val Lys Thr Glu Asp Pro Asp Cys Glu Ser Lys Pro Phe Ser Gly 165 170 175 Gly Val Glu Pro Met Tyr Cys Leu Glu Asn Gly Ala Glu Glu Met Lys 180 185 190 Arg Gly Val Lys Ala Asp Lys His Trp Leu Ser Glu Phe Glu His Asn 195 200 205 Tyr Trp Ser Asp Ile Leu Lys Glu Lys Glu Lys Gln Lys Glu Gln Gly 210 215 220 Ile Val Glu Thr Cys Gln Gln Gln Gln Gln Asp Ser Leu Ser Val Ala 225 230 235 240 Asp Tyr Gly Trp Pro Asn Asp Val Asp Gln Ser His Leu Asp Ser Ser 245 250 255 Asp Met Phe Asp Val Asp Glu Leu Leu Arg Asp Leu Asn Gly Asp Asp 260 265 270 Val Phe Ala Gly Leu Asn Gln Asp Arg Tyr Pro Gly Asn Ser Val Ala 275 280 285 Asn Gly Ser Tyr Arg Pro Glu Ser Gln Gln Ser Gly Phe Asp Pro Leu 290 295 300 Gln Ser Leu Asn Tyr Gly Ile Pro Pro Phe Gln Leu Glu Gly Lys Asp 305 310 315 320 Gly Asn Gly Phe Phe Asp Asp Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Glu Asn 325 330 335 <210> 5 <211> 937 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (164)..(802) <400> 5 cttgaaaaag aatctacctg aaaagaaaaa aaagagagag agatataaat agctttacca 60 agacagatat actatctttt attaatccaa aaagactgag aactctagta actacgtact 120 acttaaacct tatccagttt cttgaaacag agtactctga tca atg aac tca ttt 175 Met Asn Ser Phe 1 tca gct ttt tct gaa atg ttt ggc tcc gat tac gag cct caa ggc gga 223 Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Pro Gln Gly Gly 5 10 15 20 gat tat tgt ccg acg ttg gcc acg agt tgt ccg aag aaa ccg gcg ggc 271 Asp Tyr Cys Pro Thr Leu Ala Thr Ser Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly 25 30 35 cgt aag aag ttt cgt gag act cgt cac cca att tac aga gga gtt cgt 319 Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg 40 45 50 caa aga aac tcc ggt aag tgg gtt tct gaa gtg aga gag cca aac aag 367 Gln Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Ser Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys 55 60 65 aaa acc agg att tgg ctc ggg act ttc caa acc gct gag atg gca gct 415 Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Gln Thr Ala Glu Met Ala Ala 70 75 80 cgt gct cac gac gtc gct gca tta gcc ctc cgt ggc cga tca gca tgt 463 Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys 85 90 95 100 ctc aac ttc gct gac tcg gct tgg cgg cta cga atc ccg gag tca aca 511 Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr 105 110 115 tgc gcc aag gat atc caa aaa gcg gct gct gaa gcg gcg ttg gct ttt 559 Cys Ala Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Leu Ala Phe 120 125 130 caa gat gag acg tgt gat acg acg acc acg aat cat ggc ctg gac atg 607 Gln Asp Glu Thr Cys Asp Thr Thr Thr Thr Asn His Gly Leu Asp Met 135 140 145 gag gag acg atg gtg gaa gct att tat aca ccg gaa cag agc gaa ggt 655 Glu Glu Thr Met Val Glu Ala Ile Tyr Thr Pro Glu Gln Ser Glu Gly 150 155 160 gcg ttt tat atg gat gag gag aca atg ttt ggg atg ccg act ttg ttg 703 Ala Phe Tyr Met Asp Glu Glu Thr Met Phe Gly Met Pro Thr Leu Leu 165 170 175 180 gat aat atg gct gaa ggc atg ctt tta ccg ccg ccg tct gtt caa tgg 751 Asp Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu Pro Pro Pro Ser Val Gln Trp 185 190 195 aat cat aat tat gac ggc gaa gga gat ggt gac gtg tcg ctt tgg agt 799 Asn His Asn Tyr Asp Gly Glu Gly Asp Gly Asp Val Ser Leu Trp Ser 200 205 210 tac taatattcga tagtcgtttc catttttgta ctatagtttg aaaatattct 852 Tyr agttcctttt tttagaatgg ttccttcatt ttattttatt ttattgttgt agaaacgagt 912 ggaaaataat tcaatacaaa aaaaa 937 <210> 6 <211> 213 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 6 Met Asn Ser Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly Ser Asp Tyr Glu 1 5 10 15 Pro Gln Gly Gly Asp Tyr Cys Pro Thr Leu Ala Thr Ser Cys Pro Lys 20 25 30 Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Ile Tyr 35 40 45 Arg Gly Val Arg Gln Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Ser Glu Val Arg 50 55 60 Glu Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Gln Thr Ala 65 70 75 80 Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Leu Arg Gly 85 90 95 Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Leu Arg Ile 100 105 110 Pro Glu Ser Thr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala Ala Glu Ala 115 120 125 Ala Leu Ala Phe Gln Asp Glu Thr Cys Asp Thr Thr Thr Thr Asn His 130 135 140 Gly Leu Asp Met Glu Glu Thr Met Val Glu Ala Ile Tyr Thr Pro Glu 145 150 155 160 Gln Ser Glu Gly Ala Phe Tyr Met Asp Glu Glu Thr Met Phe Gly Met 165 170 175 Pro Thr Leu Leu Asp Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu Pro Pro Pro 180 185 190 Ser Val Gln Trp Asn His Asn Tyr Asp Gly Glu Gly Asp Gly Asp Val 195 200 205 Ser Leu Trp Ser Tyr 210 <210> 7 <211> 944 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (135)..(782) <400> 7 cctgaattag aaaagaaaga tagatagaga aataaatatt ttatcatacc atacaaaaaa 60 agacagagat cttctactta ctctactctc ataaacctta tccagtttct tgaaacagag 120 tactcttctg atca atg aac tca ttt tct gcc ttt tct gaa atg ttt ggc 170 Met Asn Ser Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly 1 5 10 tcc gat tac gag tct ccg gtt tcc tca ggc ggt gat tac agt ccg aag 218 Ser Asp Tyr Glu Ser Pro Val Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ser Pro Lys 15 20 25 ctt gcc acg agc tgc ccc aag aaa cca gcg gga agg aag aag ttt cgt 266 Leu Ala Thr Ser Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg 30 35 40 gag act cgt cac cca att tac aga gga gtt cgt caa aga aac tcc ggt 314 Glu Thr Arg His Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Asn Ser Gly 45 50 55 60 aag tgg gtg tgt gag ttg aga gag cca aac aag aaa acg agg att tgg 362 Lys Trp Val Cys Glu Leu Arg Glu Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp 65 70 75 ctc ggg act ttc caa acc gct gag atg gca gct cgt gct cac gac gtc 410 Leu Gly Thr Phe Gln Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val 80 85 90 gcc gcc ata gct ctc cgt ggc aga tct gcc tgt ctc aat ttc gct gac 458 Ala Ala Ile Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp 95 100 105 tcg gct tgg cgg cta cga atc ccg gaa tca acc tgt gcc aag gaa atc 506 Ser Ala Trp Arg Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr Cys Ala Lys Glu Ile 110 115 120 caa aag gcg gcg gct gaa gcc gcg ttg aat ttt caa gat gag atg tgt 554 Gln Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Leu Asn Phe Gln Asp Glu Met Cys 125 130 135 140 cat atg acg acg gat gct cat ggt ctt gac atg gag gag acc ttg gtg 602 His Met Thr Thr Asp Ala His Gly Leu Asp Met Glu Glu Thr Leu Val 145 150 155 gag gct att tat acg ccg gaa cag agc caa gat gcg ttt tat atg gat 650 Glu Ala Ile Tyr Thr Pro Glu Gln Ser Gln Asp Ala Phe Tyr Met Asp 160 165 170 gaa gag gcg atg ttg ggg atg tct agt ttg ttg gat aac atg gcc gaa 698 Glu Glu Ala Met Leu Gly Met Ser Ser Leu Leu Asp Asn Met Ala Glu 175 180 185 ggg atg ctt tta ccg tcg ccg tcg gtt caa tgg aac tat aat ttt gat 746 Gly Met Leu Leu Pro Ser Pro Ser Val Gln Trp Asn Tyr Asn Phe Asp 190 195 200 gtc gag gga gat gat gac gtg tcc tta tgg agc tat taaaattcga 792 Val Glu Gly Asp Asp Asp Val Ser Leu Trp Ser Tyr 205 210 215 tttttatttc catttttggt attatagctt tttatacatt tgatcctttt ttagaatgga 852 tcttcttctt tttttggttg tgagaaacga atgtaaatgg taaaagttgt tgtcaaatgc 912 aaatgttttt gagtgcagaa tatataatct tt 944 <210> 8 <211> 216 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 8 Met Asn Ser Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Phe Gly Ser Asp Tyr Glu 1 5 10 15 Ser Pro Val Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ser Pro Lys Leu Ala Thr Ser 20 25 30 Cys Pro Lys Lys Pro Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His 35 40 45 Pro Ile Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Cys 50 55 60 Glu Leu Arg Glu Pro Asn Lys Lys Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe 65 70 75 80 Gln Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Ile Ala 85 90 95 Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg 100 105 110 Leu Arg Ile Pro Glu Ser Thr Cys Ala Lys Glu Ile Gln Lys Ala Ala 115 120 125 Ala Glu Ala Ala Leu Asn Phe Gln Asp Glu Met Cys His Met Thr Thr 130 135 140 Asp Ala His Gly Leu Asp Met Glu Glu Thr Leu Val Glu Ala Ile Tyr 145 150 155 160 Thr Pro Glu Gln Ser Gln Asp Ala Phe Tyr Met Asp Glu Glu Ala Met 165 170 175 Leu Gly Met Ser Ser Leu Leu Asp Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu 180 185 190 Pro Ser Pro Ser Val Gln Trp Asn Tyr Asn Phe Asp Val Glu Gly Asp 195 200 205 Asp Asp Val Ser Leu Trp Ser Tyr 210 215 <210> 9 <211> 1513 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (183)..(1172) <400> 9 gagacgctag aaagaacgcg aaagcttgcg aagaagattt gcttttgatc gacttaacac 60 gaacaacaaa caacatctgc gtgataaaga agagattttt gcctaaataa agaagagatt 120 cgactctaat cctggagtta tcattcacga tagattctta gattgcgact ataaagaaga 180 ag atg gct gta tat gaa caa acc gga acc gag cag ccg aag aaa agg 227 Met Ala Val Tyr Glu Gln Thr Gly Thr Glu Gln Pro Lys Lys Arg 1 5 10 15 aaa tct agg gct cga gca ggt ggt tta acg gtg gct gat agg cta aag 275 Lys Ser Arg Ala Arg Ala Gly Gly Leu Thr Val Ala Asp Arg Leu Lys 20 25 30 aag tgg aaa gag tac aac gag att gtt gaa gct tcg gct gtt aaa gaa 323 Lys Trp Lys Glu Tyr Asn Glu Ile Val Glu Ala Ser Ala Val Lys Glu 35 40 45 gga gag aaa ccg aaa cgc aaa gtt cct gcg aaa ggg tcg aag aaa ggt 371 Gly Glu Lys Pro Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly 50 55 60 tgt atg aag ggt aaa gga gga cca gat aat tct cac tgt agt ttt aga 419 Cys Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Asp Asn Ser His Cys Ser Phe Arg 65 70 75 gga gtt aga caa agg att tgg ggt aaa tgg gtt gca gag att cga gaa 467 Gly Val Arg Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu 80 85 90 95 ccg aaa ata gga act aga ctt tgg ctt ggt act ttt cct acc gcg gaa 515 Pro Lys Ile Gly Thr Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu 100 105 110 aaa gct gct tcc gct tat gat gaa gcg gct acc gct atg tac ggt tca 563 Lys Ala Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Thr Ala Met Tyr Gly Ser 115 120 125 ttg gct cgt ctt aac ttc cct cag tct gtt ggg tct gag ttt act agt 611 Leu Ala Arg Leu Asn Phe Pro Gln Ser Val Gly Ser Glu Phe Thr Ser 130 135 140 acg tct agt caa tct gag gtg tgt acg gtt gaa aat aag gcg gtt gtt 659 Thr Ser Ser Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Asn Lys Ala Val Val 145 150 155 tgt ggt gat gtt tgt gtg aag cat gaa gat act gat tgt gaa tct aat 707 Cys Gly Asp Val Cys Val Lys His Glu Asp Thr Asp Cys Glu Ser Asn 160 165 170 175 cca ttt agt cag att tta gat gtt aga gaa gag tct tgt gga acc agg 755 Pro Phe Ser Gln Ile Leu Asp Val Arg Glu Glu Ser Cys Gly Thr Arg 180 185 190 ccg gac agt tgc acg gtt gga cat caa gat atg aat tct tcg ctg aat 803 Pro Asp Ser Cys Thr Val Gly His Gln Asp Met Asn Ser Ser Leu Asn 195 200 205 tac gat ttg ctg tta gag ttt gag cag cag tat tgg ggc caa gtt ttg 851 Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Phe Glu Gln Gln Tyr Trp Gly Gln Val Leu 210 215 220 cag gag aaa gag aaa ccg aag cag gaa gaa gag gag ata cag caa cag 899 Gln Glu Lys Glu Lys Pro Lys Gln Glu Glu Glu Glu Ile Gln Gln Gln 225 230 235 caa cag gaa cag caa cag caa cag ctg caa ccg gat ttg ctt act gtt 947 Gln Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Pro Asp Leu Leu Thr Val 240 245 250 255 gca gat tac ggt tgg cct tgg tct aat gat att gta aat gat cag act 995 Ala Asp Tyr Gly Trp Pro Trp Ser Asn Asp Ile Val Asn Asp Gln Thr 260 265 270 tct tgg gat cct aat gag tgc ttt gat att aat gaa ctc ctt gga gat 1043 Ser Trp Asp Pro Asn Glu Cys Phe Asp Ile Asn Glu Leu Leu Gly Asp 275 280 285 ttg aat gaa cct ggt ccc cat cag agc caa gac caa aac cac gta aat 1091 Leu Asn Glu Pro Gly Pro His Gln Ser Gln Asp Gln Asn His Val Asn 290 295 300 tct ggt agt tat gat ttg cat ccg ctt cat ctc gag cca cac gat ggt 1139 Ser Gly Ser Tyr Asp Leu His Pro Leu His Leu Glu Pro His Asp Gly 305 310 315 cac gag ttc aat ggt ttg agt tct ctg gat att tgagagttct gaggcaatgg 1192 His Glu Phe Asn Gly Leu Ser Ser Leu Asp Ile 320 325 330 tcctacaaga ctacaacata atctttggat tgatcatagg agaaacaaga aataggtgtt 1252 aatgatctga ttcacaatga aaaaatattt aataactcta tagtttttgt tctttccttg 1312 gatcatgaac tgttgcttct catctattga gttaatatag cgaatagcag agtttctctc 1372 tttcttctct ttgtagaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaayh sakmabgcar 1432 srcsdvsnaa nntrnatnar sarchcntrr agrctrascn csrcaswash tskbabarak 1492 aantamaysa kmasrngnga c 1513 <210> 10 <211> 330 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 10 Met Ala Val Tyr Glu Gln Thr Gly Thr Glu Gln Pro Lys Lys Arg Lys 1 5 10 15 Ser Arg Ala Arg Ala Gly Gly Leu Thr Val Ala Asp Arg Leu Lys Lys 20 25 30 Trp Lys Glu Tyr Asn Glu Ile Val Glu Ala Ser Ala Val Lys Glu Gly 35 40 45 Glu Lys Pro Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys 50 55 60 Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Asp Asn Ser His Cys Ser Phe Arg Gly 65 70 75 80 Val Arg Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro 85 90 95 Lys Ile Gly Thr Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu Lys 100 105 110 Ala Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Thr Ala Met Tyr Gly Ser Leu 115 120 125 Ala Arg Leu Asn Phe Pro Gln Ser Val Gly Ser Glu Phe Thr Ser Thr 130 135 140 Ser Ser Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Asn Lys Ala Val Val Cys 145 150 155 160 Gly Asp Val Cys Val Lys His Glu Asp Thr Asp Cys Glu Ser Asn Pro 165 170 175 Phe Ser Gln Ile Leu Asp Val Arg Glu Glu Ser Cys Gly Thr Arg Pro 180 185 190 Asp Ser Cys Thr Val Gly His Gln Asp Met Asn Ser Ser Leu Asn Tyr 195 200 205 Asp Leu Leu Leu Glu Phe Glu Gln Gln Tyr Trp Gly Gln Val Leu Gln 210 215 220 Glu Lys Glu Lys Pro Lys Gln Glu Glu Glu Glu Ile Gln Gln Gln Gln 225 230 235 240 Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Pro Asp Leu Leu Thr Val Ala 245 250 255 Asp Tyr Gly Trp Pro Trp Ser Asn Asp Ile Val Asn Asp Gln Thr Ser 260 265 270 Trp Asp Pro Asn Glu Cys Phe Asp Ile Asn Glu Leu Leu Gly Asp Leu 275 280 285 Asn Glu Pro Gly Pro His Gln Ser Gln Asp Gln Asn His Val Asn Ser 290 295 300 Gly Ser Tyr Asp Leu His Pro Leu His Leu Glu Pro His Asp Gly His 305 310 315 320 Glu Phe Asn Gly Leu Ser Ser Leu Asp Ile 325 330 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on the promoter region of rd29A gene and having HindIII site. <400> 11 aagcttaagc ttacatcagt ttgaaagaaa 30 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on the promoter region of rd29A gene and having HindIII site. <400> 12 aagcttaagc ttgctttttg gaactcatgt c 31 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on DREB1A gene and having BamHI site. <400> 13 aagcttaagc ttgccataga tgcaattcaa tc 32 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on DREB1A gene and having BamHI site. <400> 14 aagcttaagc ttttccaaag atttttttct ttccaa 36 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on the promoter region of rd29A gene and having HindIII site. <400> 15 ggatccggat ccatgaactc attttctgct 30 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on the promoter region of rd29A gene and having HindIII site. <400> 16 ggatccggat ccttaataac tccataacga ta 32 <210> 17 <211> 941 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 17 gccatagatg caattcaatc aaactgaaat ttctgcaaga atctcaaaca cggagatctc 60 aaagtttgaa agaaaattta tttcttcgac tcaaaacaaa cttacgaaat ttaggtagaa 120 cttatataca ttatattgta attttttgta acaaaatgtt tttattatta ttatagaatt 180 ttactggtta aattaaaaat gaatagaaaa ggtgaattaa gaggagagag gaggtaaaca 240 ttttcttcta ttttttcata ttttcaggat aaattattgt aaaagtttac aagatttcca 300 tttgactagt gtaaatgagg aatattctct agtaagatca ttatttcatc tacttctttt 360 atcttctacc agtagaggaa taaacaatat ttagctcctt tgtaaataca aattaatttt 420 ccttcttgac atcattcaat tttaatttta cgtataaaat aaaagatcat acctattaga 480 acgattaagg agaaatacaa ttcgaatgag aaggatgtgc cgtttgttat aataaacagc 540 cacacgacgt aaacgtaaaa tgaccacatg atgggccaat agacatggac cgactactaa 600 taatagtaag ttacatttta ggatggaata aatatcatac cgacatcagt tttgaaagaa 660 aagggaaaaa aagaaaaaat aaataaaaga tatactaccg acatgagttc caaaaagcaa 720 aaaaaaagat caagccgaca cagacacgcg tagagagcaa aatgactttg acgtcacacc 780 acgaaaacag acgcttcata cgtgtccctt tatctctctc agtctctcta taaacttagt 840 gagaccctcc tctgttttac tcacaaatat gcaaactaga aaacaatcat caggaataaa 900 gggtttgatt acttctattg gaaagaaaaa aatctttgga a 941 <210> 18 <211> 71 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 18 cagtttgaaa gaaaagggaa aaaaagaaaa aataaataaa agatatacta ccgacatgag 60 ttccaaaaag c 71 <210> 19 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide having a partially mutated sequence within the DRE region. <400> 19 cagtttgaaa gaaaagggaa aaaaagaaaa aataaataaa agatatattt tcgacatgag 60 ttccaaaaag c 71 <210> 20 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide having a partially mutated sequence within the DRE region. <400> 20 cagtttgaaa gaaaagggaa aaaaagaaaa aataaataaa agatatacta cttttatgag 60 ttccaaaaag c 71 <210> 21 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide having a partially mutated sequence within the DRE region. <400> 21 cagtttgaaa gaaaagggaa aaaaagaaaa aataaataaa agatatacta ccgacaaaag 60 ttccaaaaag c 71 <210> 22 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide having a partially mutated sequence outside the DRE region. <400> 22 cagtttgaaa gaaaagggaa aaaaagaaaa aataaataaa agatatacta ccgacatgat 60 caacaaaaag c 71 <210> 23 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide having a partially mutated sequence outside the DRE region. <400> 23 cagtttgaaa gaaaagggaa aaaaagaaaa aataaataaa agatatacta ccgacatgag 60 ttcggttaag c 71

【００９８】

【配列表フリーテキスト】

【００９９】

【配列番号11】 rd29A遺伝子のプロモーター領域に基
づいて設計した、HindIII部位を有するオリゴヌクレオ
チド。

【０１００】

【配列番号12】 rd29A遺伝子のプロモーター領域に基
づいて設計した、HindIII部位を有するオリゴヌクレオ
チド。

【０１０１】

【配列番号13】 DREB1A遺伝子のプロモーター領域に
基づいて設計した、BamHI部位を有するオリゴヌクレオ
チド。

【０１０２】

【配列番号14】 DREB1A遺伝子のプロモーター領域に
基づいて設計した、BamHI部位を有するオリゴヌクレオ
チド。

【０１０３】

【配列番号15】 rd29A遺伝子のプロモーター領域に基
づいて設計した、HindIII部位を有するオリゴヌクレオ
チド。

【０１０４】

【配列番号16】 rd29A遺伝子のプロモーター領域に基
づいて設計した、HindIII部位を有するオリゴヌクレオ
チド。

【０１０５】

【配列番号19】 DRE領域内の配列を一部変異させたオ
リゴヌクレオチド。

【０１０６】

【配列番号20】 DRE領域内の配列を一部変異させたオ
リゴヌクレオチド。

【０１０７】

【配列番号21】 DRE領域内の配列を一部変異させたオ
リゴヌクレオチド。

【０１０８】

【配列番号22】 DRE領域外の配列を一部変異させたオ
リゴヌクレオチド。

【０１０９】

【配列番号23】 DRE領域外の配列を一部変異させたオ
リゴヌクレオチド。

【図面の簡単な説明】

【図１】DREB遺伝子のスクリーニング方法の原理を示す
図である。

【図２】DREB1Aタンパク質及びDREB2Aタンパク質のDRE
への結合特性に関するゲルシフトアッセイに用いたプロ
ーブの構造及び該アッセイの結果を示す電気泳動写真で
ある。

【図３】DREB1Aタンパク質及びDREB2Aタンパク質の転写
活性化能を示す図である。

【図４】CAMV35Sプロモーターを含む植物導入用組換え
プラスミドの構造を示す図である。

【図５】DREB1A遺伝子導入植物におけるストレス負荷時
の各遺伝子の転写レベルを示す電気泳動写真である。

【図６】DREB1A遺伝子導入植物の凍結ストレス又は乾燥
ストレスを与えた場合の植物の生育を示した写真である
(生物の形態)。

【図７】rd29A遺伝子プロモーターを含む植物導入用組
換えプラスミドの構造を示す図である。

【図８】pBI35S:DREB1Aを導入したトランスジェニック
植物の生育を示す写真である(生物の形態)。

【図９】pBI29AP:DREB1Aを導入したトランスジェニック
植物の生育を示す写真である(生物の形態)。

【図10】ストレス負荷後のトランスジェニック植物の生
存を示す写真である(生物の形態)。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１１年１０月１２日（１９９９．１０．
１２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項１】ストレス応答性プロモーターに、転写因子
をコードする遺伝子が連結されたDNAが導入されたトラ
ンスジェニック植物であって、当該転写因子が、当該ス
トレス応答性プロモーターに結合し、且つ、当該転写因
子をコードする遺伝子の転写を活性化することができる
ものであるトランスジェニック植物。

【請求項２】ストレス応答性プロモーターが乾燥ストレ
ス応答性エレメントを含むプロモーターである請求項１
に記載のトランスジェニック植物。

【請求項３】ストレス応答性プロモーターがrd29A遺伝
子プロモーターである請求項１に記載のトランスジェニ
ック植物。

【請求項４】転写因子がDREB1タンパク質である請求項
１に記載のトランスジェニック植物。

【請求項５】ストレス応答性プロモーターに、転写因子
をコードする遺伝子が連結されたDNAを導入することを
特徴とするトランスジェニック植物の作成方法であっ
て、当該転写因子が、当該ストレス応答性プロモーター
に結合し、且つ、当該転写因子をコードする遺伝子の転
写を活性化することができるものであるトランスジェニ
ック植物の作成方法。

【請求項６】ストレス応答性プロモーターが乾燥ストレ
ス応答性エレメントを含むプロモーターである請求項５
に記載のトランスジェニック植物の作成方法。

【請求項７】ストレス応答性プロモーターがrd29A遺伝
子プロモーターである請求項５に記載のトランスジェニ
ック植物の作成方法。

【請求項８】転写因子がDREB1タンパク質である請求項

【書類名】 受託番号変更届

【整理番号】 Ｐ９８−０３９２

【提出日】 平成１１年２月２２日（１９９
９．２．２２）

【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１６９３６

【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−６６５４

【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１６９３７

【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−６６５５

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD04 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD13 CD17 CD21 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 EA04 FA01 FA02 FA10 GA11 HA01 4H045 AA10 AA30 BA10 CA30 EA05 EA60 FA72 FA74

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ストレス応答性プロモーターの下流に以
   下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするDNAが連結さ
   れた遺伝子を含むトランスジェニック植物。 (a) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
   若しくは配列番号10で表されるアミノ酸配列からなるタ
   ンパク質 (b) 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８
   若しくは配列番号10で表されるアミノ酸配列において少
   なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
   たアミノ酸配列からなり、かつストレス応答性エレメン
   ト下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質
2. 【請求項２】 ストレス応答性プロモーターの下流に以
   下の(c)又は(d)のDNAが連結された遺伝子を含むトラン
   スジェニック植物。 (c) 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７
   若しくは配列番号９で表される塩基配列からなるDNA (d) 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７
   若しくは配列番号９で表される塩基配列からなるDNAと
   ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつス
   トレス応答性エレメント下流の遺伝子の転写を制御する
   タンパク質をコードするDNA
3. 【請求項３】 ストレスが乾燥ストレス、低温ストレス
   又は塩ストレスである請求項１又は２記載のトランスジ
   ェニック植物。
4. 【請求項４】 ストレス応答性プロモーターが、rd29A
   遺伝子プロモーター、rd29B遺伝子プロモーター、rd17遺
   伝子プロモーター、rd22遺伝子プロモーター、DREB1A遺
   伝子プロモーター、cor6.6遺伝子プロモーター、cor15a
   遺伝子プロモーター、erd1遺伝子プロモーター及びkin1
   遺伝子プロモーターからなる群から選択される少なくと
   も１つである請求項１〜３のいずれか１項に記載のトラ
   ンスジェニック植物。