JP2000102394A - 高められたアベルメメクチン生成のためのストレプトミセス・アベルミチリス調節遺伝子 - Google Patents

高められたアベルメメクチン生成のためのストレプトミセス・アベルミチリス調節遺伝子

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 駆虫効果のあるアベルメクチンをストレプト
ミセス アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）
から高収率で生成することに関する。 【解決手段】 ストレプトミセス アベルミチリス中の
ａｖｅＲ１遺伝子及びａｖｅＲ２遺伝子を不活性化する
ことによりアベルメクチンを高収率で生成することに関
する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アベルメクチン
（avermectin）を生成するための組成物及び方法に向け
られ、そして主に、動物の健康の分野に関する。より具
体的には、本発明は、ストレプトミセス・アベルミチリ
ス（Streptomyces avermitilis）におけるアベルメクチ
ンポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）発現及びアベルメク
チン生合成の調節に関与する、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ
２遺伝子として本明細書において言及される２種の新規
遺伝子の同定及び特徴づけに関する。本発明は、それら
の遺伝子の不活性化がＳ．アベルミチリスにより生成さ
れるアベルメクチンの量の上昇をもたらすという発見に
基づかれる。
【０００２】
【従来の技術】ストレプトミセス（Streptomyces）属の
種は、効果的な駆虫及び殺昆虫活性を有する８種の関連
する１６−員の大環状ラクトンを含んで成る広範囲の二
次代謝物、たとえばアベルメクチンを生成する。８種の
異なっているが、しかし密接に関連している化合物は、
Ａ１ａ，Ａ１ｂ，Ａ２ａ，Ａ２ｂ，Ｂ１ａ，Ｂ１ｂ，Ｂ
２ａ、及びＢ２ｂとして言及される。“ａ”シリーズの
化合物は、天然のアベルメクチンを意味し、ここでＣ２
５位置での置換基が（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチルであり、そ
して“ｂ”シリーズは、Ｃ２５位置での置換基がイソプ
ロピルである化合物を意味する。
【０００３】名称“Ａ”及び“Ｂ”は、Ｃ５での置換基
がそれぞれ、メトキシ及びヒドロキシであるアベルメク
チンを意味する。数字“１”は、二重結合がＣ２２，２
３位置で存在するアベルメクチンを意味し、そして数字
“２”は、Ｃ２２位置で水素及びＣ２３位置でヒドロキ
シを有するアベルメクチンを意味する。関連するアベル
メクチンの中で、Ｂ１タイプのアベルメクチンは、最と
も効果的な駆虫及び殺虫活性を有するものとして認識さ
れ、そして従って、最とも商業的に所望するアベルメク
チンである。
【０００４】アベルメクチン類、及びＳ．アベルミチリ
スの株の好気性発酵によるそれらの生成が、特に、アメ
リカ特許第４，３１０，５１９号及び第４，４２９，０
４２号に記載されている。二次代謝物及び他のストレプ
トミセス抗生物質の生成に関与する多くの遺伝子のよう
にアベルメクチン（ａｖｅ）遺伝子は、細菌染色体上に
一緒に群がって見出される。アベルメクチン生合成のた
めのａｖｅ遺伝子クラスターは、アベルメクチンポリケ
チドシンターゼ（avermectin polyketide symthase）
（ＰＫＳ）をコードするＤＮＡを包含する９５kbのＤＮ
Ａゲノムに及ぶ（MacNeil など., 1992, Gene 115: 119
-125）。
【０００５】ストレプトミセスにおける抗生物質生合成
の調節は、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptmy
ces coelicolor）において、おそらく最もよく特徴づけ
られている。Ｓ．コリエカラーにより生成される４種の
抗生物質は、アクチノルボシン（Ａｃｔ）、ウンデシル
プロジギオシン（Ｒｅｄ）、カルシウム−依存性抗生物
質（ＣＤＡ）及びメチルノマイシン（Ｍｍｙ）を包含す
る。それらの抗生物質の個々は、遺伝的に異なった遺伝
子の異なったクラスターによりコードされる。それぞ
れ、Ａｃｔ生合成遺伝子クラスター又はＲｅｄ生合成遺
伝子クラスターの発現を特異的に調節する生成物をコー
ドする、Ａｃｔ遺伝子クラスター又はＲｅｄ遺伝子クラ
スターのいづれかに連結される遺伝子が同定されてい
る。
【０００６】１つよりも多くの抗生物質生合成遺伝子ク
ラスターを全体的に調節する遺伝子を含む多くの遺伝子
座がまた、同定されている。たとえば、２種の独立した
遺伝子座、ａｂｓＡ及びａｂｓＢにおける突然変異は、
Ｓ．コエリカラーにおけるすべての４種の抗生物質の合
成をブロックすることが示されている（Brian など.,19
96, J.Bact. 178: 3221-3231 ）。ａｂｓＡ遺伝子座は
クローン化され、そして特徴づけられており、そしてそ
の遺伝子生成物は、Ｓ．コエリカラーにおける抗生物質
合成の全体的な負のレギュレーターとして通常、作用す
るシグナルトランスダクション経路に関与することが示
されている（Brian など., 1996 、上記）。
【０００７】アメリカ特許第５，７０７，８３９号（De
noya）及びアメリカ特許第５，７２８，５６１号（Deno
yaなど．）は、ストレプトミセスの枝分れ鎖のα−ケト
酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードするＤＮＡ配列に関
する。タイプＩポリケチドシンターゼ発現がＳ．アベル
ミチリスにおいて調節される機構の理解は、アベルメク
チンの生成を高めるためにａｖｅ遺伝子の遺伝的操作を
可能にするであろう。
【０００８】
【発明の要約】本発明は、Ｓ．アベルミチリスからのａ
ｖｅＲ１遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列を
含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供す
る。好ましい態様においては、ａｖｅＲ１遺伝子生成物
は、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る。非制限的
態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチド
分子は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１
に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯ
ＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る。さらなる非制限
的態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチ
ド分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成
る。
【０００９】本発明はさらに、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ
２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチ
リスのａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで
成るポリヌクレオチド分子に対して相同である単離され
たポリヌクレオチド分子を供給する。本発明はさらに、
配列番号２のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸
配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供
する。
【００１０】本発明はさらに、本発明の前記ａｖｅＲ１
−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分
であるヌクレオチド配列から成る単離されたポリヌクレ
オチド分子を供給する。好ましい態様において、ａｖｅ
Ｒ１−関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本
発明のＳ．アベルミチリスａｖｅＲ１遺伝子生成物又は
ａｖｅＲ１−関連の相同ポリペプチドのペプチドフラグ
メントをコードするヌクレオチド配列から成る。非制限
的であるが、特定の態様において、本発明は、配列番号
２のアミノ酸配列の副配列から成るペプチドフラグメン
トをコードするヌクレオチド配列から成るポリヌクレオ
チド分子を提供する。
【００１１】本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａ
ｖｅＲ１のＯＲＦに天然において接する（フランキン
グ）１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離さ
れたポリヌクレオチド分子を提供する。そのようなフラ
ンキング配列は、約ｎｔ１〜約ｎｔ１１１１、及び約ｎ
ｔ２３１８〜約ｎｔ５０４５の配列番号１のヌクレオチ
ド配列から選択され得る。本発明はさらに、Ｓ．アベル
ミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦに天然において接する
（フランキング）ヌクレオチド配列に対して相同である
１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離された
ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１２】本発明の単離されたポリヌクレオチド分子
における個々のフランキング配列、及びその相同体は、
好ましくは、少なくとも約２００ntの長さでである。非
制限的態様において、本発明は、Ｓ．アベルミチリスの
ａｖｅＲ１のＯＲＦを天然において端に有し、又はその
ようなヌクレオチド配列に対して相同である１又は複数
の前記ヌクレオチド配列を含んで成り、そしてさらに、
本発明の１つの前記ａｖｅＲ１−関連ヌクレオチド配
列、たとえば約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番
号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１
のＯＲＦのヌクレオチド配列又はその実質的な部分を含
んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１３】本発明は、Ｓ．アベルミチリスからのａｖ
ｅＲ２遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列を含
んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
好ましい態様においては、ａｖｅＲ２遺伝子生成物は、
配列番号４のアミノ酸配列を含んで成る。非制限的態様
おいては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子
は、約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３
（注：配列番号３は配列番号１と同一である）に示され
るようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌ
クレオチド配列を含んで成る。さらなる非制限的態様に
おいては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子
は、配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００１４】本発明はさらに、約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ
３０２１の配列番号３に示されるようなＳ．アベルミチ
リスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで
成るポリヌクレオチド分子に対して相同である単離され
たポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、
配列番号４のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸
配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供
する。
【００１５】本発明はさらに、本発明の前記ａｖｅＲ２
−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分
であるヌクレオチド配列から成る単離されたポリヌクレ
オチド分子を提供する。好ましい態様において、ａｖｅ
Ｒ２−関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本
発明のＳ．アベルミチリスａｖｅＲ２遺伝子生成物又は
ａｖｅＲ２−関連の相同ポリペプチドのペプチドフラグ
メントをコードするヌクレオチド配列から成る。非制限
的であるが、特定の態様において、本発明は、配列番号
４のアミノ酸配列のサブ配列（sub-sequence）から成る
ペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列か
ら成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１６】本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａ
ｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接する（flanking）１
又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポ
リヌクレオチド分子を提供する。そのようなフランキン
グ配列は、約ｎｔ１〜約ｎｔ２３１３、及び約ｎｔ３０
２２〜約ｎｔ５０４５の配列番号３のヌクレオチド配列
から選択され得る。本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリ
スのａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接する（flanki
ng）ヌクレオチド配列に対して相同である１又は複数の
ヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオ
チド分子を提供する。
【００１７】本発明の単離されたポリヌクレオチド分子
中の個々のフランキング配列は、好ましくは、少なくと
も約２００ntの長さである。非制限的態様において、本
発明は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦに天
然において接し（flanking）、又はそのようなヌクレオ
チド配列に対して相同である１又は複数の前記ヌクレオ
チド配列を含んで成り、そしてさらに、本発明の１つの
前記ａｖｅＲ２−関連ヌクレオチド配列、たとえば約ｎ
ｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３に示されるよ
うなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレ
オチド配列又はその実質的な部分を含んで成る単離され
たポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１８】本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスから
のａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物の両者をコー
ドするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌ
クレオチド分子を提供する。好ましい態様において、前
記ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物は、それぞれ
配列番号２及び配列番号４のアミノ酸配列を含んで成
る。非制限的態様においては、単離されたポリヌクレオ
チド分子は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番
号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１
のＯＲＦ、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列
番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ
２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る。さらなる
非制限的態様においては、単離されたポリヌクレオチド
分子は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ３０２１の配列番号１
のヌクレオチド配列を含んで成る。さらなる非制限的態
様においては、単離されたポリヌクレオチド分子は、配
列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００１９】本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａ
ｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの両者のヌクレオチド
配列を含んで成るポリヌクレオチド分子に対して相同で
ある単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。非制
限的態様においては、本発明は、約ｎｔ１１１２〜約ｎ
ｔ２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミ
チリスのａｖｅＲ１のＯＲＦ、及び約ｎｔ２３１４〜約
ｎｔ３０２１の配列番号１に示されるようなＳ．アベル
ミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含
んで成るポリヌクレオチド分子に対して相同である単離
されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２０】本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配
列に対して相同であるアミノ酸配列を有する第１ポリペ
プチド、及び配列番号４のアミノ酸配列に対して相同で
あるアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレ
オチド分子を提供する。
【００２１】本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスから
のａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物の両者をコー
ドするヌクレオチド配列を含んで成る前記ポリヌクレオ
チド分子のいづれか、又はそれに対して相同である前記
ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分である
ヌクレオチド配列から成る。非制限的であるが特定の態
様においては、ポリヌクレオチド分子の実質的な部分
は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示
されるようなａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列か
ら成る。非制限的であるが特定のもう１つの態様におい
ては、ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、約ｎｔ
２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３に示されるよう
なａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列から成る。
【００２２】本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａ
ｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接する
（flanking）１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成
る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。そのよ
うなフランキング配列は、約ｎｔ１〜約ｎｔ１１１１、
及び約ｎｔ３０２２〜約ｎｔ５０４５の配列番号１のヌ
クレオチド配列から選択され得る。本発明はさらに、
Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲ
Ｆに天然において接する（flanking）ヌクレオチド配列
に対して相同である１又は複数のヌクレオチド配列を含
んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子における個々
のフランキング配列、又はその相同体は好ましくは、少
なくとも約２００ntの長さでである。
【００２３】非制限的態様において、本発明は、Ｓ．ア
ベルミチリスのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦに天
然において接する１又は複数の前記ヌクレオチド配列を
含んで成り、又はそのようなヌクレオチド配列に対して
相同であり、そしてさらに、Ｓ．アベルミチリスからの
ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子のいづれか又は両者を
コードする本発明の１つの前記ヌクレオチド配列、たと
えば約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示
されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦ
のヌクレオチド配列、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０
２１の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリス
のａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る
単離されたポリヌクレオチド分子及びその実質的な部分
を提供する。
【００２４】本発明はさらに、本発明の前記ポリヌクレ
オチド分子又はその一部のいづれかを増幅するためにプ
ライマーとして有用であり、又はａｖｅ遺伝子発現及び
アベルメクチン生成の調節において有用なアンチセンス
分子をコードし、又はその分子として作用するために使
用され得るオリゴヌクレオチド分子を提供する。
【００２５】本発明はさらに、クローニングベクター、
発現ベクター、前記ベクターのいづれかを含んで成る形
質転換された宿主細胞、及びそれに由来する新規株又は
細胞系を包含する、本発明のポリヌクレオチド分子又は
オリゴヌクレオチド分子のいづれかをクローニングし、
そして発現するための組成物及び方法を提供する。非制
限的な態様においては、本発明は、本発明のポリヌクレ
オチド分子の発現のために必要な１又は複数の調節要素
と作用可能に関連して前記ポリヌクレオチド分子を含ん
で成る組換え発現ベクターを提供する。非制限的ではあ
るが、特定の態様において、本発明は、Ｓ．アベルミチ
リスのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の完全な
ＯＲＦを含んで成るプラスミドｐＳＥ２０１（ＡＴＣＣ
２０３１８２）を提供する。
【００２６】本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチ
ド分子によりコードされる実質的に精製された、又は単
離されたポリペプチドを提供する。非制限的であるが特
定の態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号２
のアミノ酸配列を含んで成るａｖｅＲ１遺伝子生成物で
ある。非制限的であるが特定のもう１つの態様におい
て、前記ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を
含んで成るａｖｅＲ２遺伝子生成物である。本発明はさ
らに、本発明のａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物
のいづれかに対して相同である実質的に精製され又は単
離されたポリペプチドを提供する。本発明はさらに、本
発明のａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物又は相同
ポリペプチドの実質的に精製され又は単離されたペプチ
ドフラグメントを提供する。
【００２７】本発明はさらに、特定のコードされた遺伝
子生成物、ポリペプチド、又はペプチドフラグメントの
発現の助けとなる条件下で、本発明の組換え発現ベクタ
ーにより形質転換され又はトランスフェクトされた宿主
細胞を培養し、そして細胞培養物から発現された遺伝子
生成物、ポリペプチド又はペプチドフラグメントを回収
することを含んで成る、本発明の実質的に精製され、又
は単離されたａｖｅＲ１遺伝子生成物、ａｖｅＲ２遺伝
子生成物、相同ポリペプチド又はペプチドフラグメント
の調製方法を提供する。
【００２８】本発明はさらに、遺伝子構造体、たとえば
遺伝子置換ベクターを包含する、ストレプトミセスの種
又は株の細胞を遺伝子的に修飾するための組成物及び方
法を提供する。本発明により提供される場合、ストレプ
トミセスの種又は株の細胞は、遺伝子的に修飾され、そ
のように修飾されていない同じ種又は株の細胞により生
成されるアベルメクチンの量とは検出できるほど異なっ
ている多量のアベルメクチンが生成される。好ましい態
様においては、ストレプトミセスの種又は株の細胞は遺
伝子的に修飾され、そのように修飾されていない同じ種
又は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量に比
較して、検出できるほど高められた量のアベルメクチン
が生成される。
【００２９】さらなる好ましい態様において、ストレプ
トミセスの種はＳ．アベルミチリスである。本発明によ
れば、そのような遺伝子修飾は好ましくは、ａｖｅＲ１
遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ
１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者を突然変異誘発すること
を含んで成り、ここでそのような突然変異は、遺伝子突
然変異を担持しない株の細胞に比較して、ａｖｅＲ１又
はａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１もしくはａｖｅＲ
２遺伝子の両者において突然変異を担持するＳ．アベル
ミチリスの株の細胞により生成されるアベルメクチンの
量の検出できる上昇をもたらす。
【００３０】ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝
子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の
両者の突然変異は、標準の突然変異誘発技法、たとえば
化学的突然誘発物質又は放射線への暴露により、又はａ
ｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１
及びａｖｅＲ２遺伝子の両者を突然変異誘発するため
に、本発明により提供される遺伝子構造体、たとえば遺
伝子置換ベクターを用いることによって、ヌクレオチド
を付加し、欠失し、又は置換することによって、又はフ
レームシフトを導入することによって、又はａｖｅＲ１
遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子中に異なった又は異種のヌ
クレオチド配列を挿入することによって、又はａｖｅＲ
１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅ
Ｒ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の一部又はすべてを欠
失することによって、又はａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅ
Ｒ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２
遺伝子の両者の一部又はすべてを、異なった又は異種の
ヌクレオチド配列により置換することによって、又はそ
のような突然変異の組合せによって実施され得る。
【００３１】本発明はさらに、遺伝子突然変異を担持し
ないストレプトミセスの種又は株の細胞に比較して、遺
伝子突然変異を担持するストレプトミセスの種又は株の
細胞により生成されるアベルメクチンの量を検出できる
ほど高めることができる、ストレプトミセスの種又は株
におけるａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、
又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の突然変異
を同定するための方法を提供し、ここで前記方法は、
（ａ）ストレプトミセスの種又は株の細胞により生成さ
れるアベルメクチンの量を測定し；（ｂ）前記種又は株
の細胞の、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子
中に、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者中に
突然変異を導入し；そして（ｃ）遺伝子突然変異を担持
しない段階（ａ）の細胞により生成されるアベルメクチ
ンの量に、段階（ｂ）において生成されるような遺伝子
突然変異を担持する細胞により生成されるアベルメクチ
ンの量を比較することを含んで成り；段階（ｂ）におい
て生成されるような遺伝子突然変異を担持する細胞によ
り生成されるアベルメクチンの量が遺伝子突然変異を担
持しない段階（ａ）の細胞により生成されるアベルメク
チンの量よりも検出できるほど高い場合、アベルメクチ
ンの量を検出できるほど高めることができる、ａｖｅＲ
１もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖ
ｅＲ２遺伝子の両者の突然変異が同定されることを特徴
とする。好ましい態様において、ストレプトミセスの種
は、Ｓ．アベルミチリスである。
【００３２】本発明はさらに、ストレプトミセスの種又
は株の修飾されていない細胞に比較して、検出できるほ
ど高められた量のアベルメクチンを生成する、ストレプ
トミセスの特定の種又は株からの遺伝子的に修飾された
細胞を調製するための方法を提供し、ここで前記方法
は、ストレプトミセスの種又は株の細胞におけるａｖｅ
Ｒ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１
及びａｖｅＲ２遺伝子の両者を突然変異誘発し、そして
遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセスの種又は
株の細胞に比較して、検出できるほど高められた量のア
ベルメクチンを生成する突然変異誘発された細胞を選択
することを含んで成る。
【００３３】好ましい態様においては、ストレプトミセ
スの種は、Ｓ．アベルミチリスである。下記実施例（９
−１）に記載される、非限定的であるが特定の態様にお
いては、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ
２遺伝子の両者は、異種遺伝子により個々の遺伝子のＯ
ＲＦの一部を置換することによって突然変異誘発され、
ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子がそのように突然変異
誘発されていないＳ．アベルミチリスの株の細胞に比較
して、検出できるほど高められた量のアベルメクチンを
生成するＳ．アベルミチリス細胞がもたらされる。
【００３４】実施例（９−２）に記載される、非制限的
であるが特定のもう１つの態様においては、Ｓ．アベル
ミチリスのａｖｅＲ２遺伝子が、異種遺伝子をａｖｅＲ
２のＯＲＦ中に挿入することによって突然変異誘発さ
れ、ａｖｅＲ２遺伝子がそのように突然変異誘発されて
いないＳ．アベルミチリスの株の細胞に比較して、検出
できるほどに高められた量のアベルメクチンを生成する
Ｓ．アベルミチリスがもたらされる。
【００３５】本発明はさらに、遺伝子突然変異を担持し
ないストレプトミセスの株の細胞に比較して、ａｖｅＲ
１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及
びａｖｅＲ２遺伝子の両者への１又は複数の突然変異の
結果として、検出できるほどに高められた量のアベルメ
クチンを生成するストレプトミセスの新規株の細胞を供
給する。好ましい態様においては、ストレプトミセスの
株は、種Ｓ．アベルミチリスからである。本発明の新規
株は、アベルメクチン、たとえば商業的に所望されるド
ラメクチンの大規模生成において有用である。
【００３６】本発明はさらに、ストレプトミセスの培養
により生成されるアベルメクチンの量を高めるための方
法を提供し、ここで前記方法は、遺伝子突然変異を担持
しない種又は株の細胞に比較して、遺伝子突然変異を担
持するストレプトミセスの種又は株の細胞により生成さ
れるアベルメクチンの量を検出できるほど高めるよう作
用する、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、
又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者における突
然変異を含んで成る、ストレプトミセスの種又は株の細
胞を、それからアベルメクチンの生成を可能にし又は誘
発する条件下で、培養培地において培養し、そしてその
培養物からアベルメクチンを回収することを含んで成
る。好ましい態様において、ストレプトミセスの種は、
Ｓ．アベルミチリスである。この方法は、アベルメクチ
ンの生成効率を高めるために有用である。
【００３７】本発明はさらに、本発明のａｖｅＲ１遺伝
子生成物、ａｖｅＲ２遺伝子生成物、相同ポリペプチ
ド、又はペプチドフラグメントに対して向けられる抗体
を提供する。図１．Ａ．Ｓ．コエリカラー（S.coelicol
or）ヒスチジンキナーゼ相同体（ａｂｓＡ１）及びＳ．
アベルミチリスａｖｅＲ１遺伝子によりコードされる推
定されるアミノ酸配列の比較は、約３２％の配列同一性
を示す。Ｂ．Ｓ．コエリカラー応答レギュレーター相同
体（ａｂｓＡ２）及びＳ．アベルミチリスａｖｅＲ２遺
伝子によりコードされる推定されるアミノ酸配列の比較
は、約４５％の配列同一性を示す。高度に保存されたア
ミノ酸は肉太活字型で存在する。
【００３８】図２．Ａ．ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯ
ＲＦを含むプラスミドベクターｐＳＥ２０１（ＡＴＣＣ
２０３１８２）。Ｂ．ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯ
ＲＦを含むプラスミドベクターｐＳＥ２１０。図３．
Ａ．ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの一部を置換し
ているｅｒｍＥ遺伝子を含む遺伝子置換ベクターｐＳＥ
２１４。Ｂ．ａｖｅＲ２のＯＲＦ中に挿入されるｅｒｍ
Ｅ遺伝子を含む遺伝子置換ベクターｐＳＥ２１６。図
４．同定される５種のオーバーラップするコスミドクロ
ーン（すなわち、ｐＳＥ６５，ｐＳＥ６６，ｐＳＥ６
７，ｐＳＥ６８，ｐＳＥ６９）と共に、Ｓ．アベルミチ
リスからのアベルメクチン ポリケチドシンターゼ遺伝
子クラスターのＢａｍＨＩ制限地図。
【００３９】
【発明の実施の形態】本発明は、Ｓ．アベルミチリスか
らのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物をコードす
るヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の同
定及び特徴化、及びそれらの遺伝子の突然変異が生成さ
れるアベルメクチンの量を調節できる発見に関する。例
によれば、本発明は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７
の配列番号１に示されるような又はプラスミドｐＳＥ２
０１（ＡＴＣＣ ２０３１８２）に存在するようなａｖ
ｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌ
クレオチド分子、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１
の配列番号３（注：配列番号３は配列番号１と同一であ
る）に示されるような又はプラスミドｐＳＥ２０１（Ａ
ＴＣＣ ２０３１８２）に存在するようなａｖｅＲ２の
ＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチ
ド分子、及びそれらに由来する突然変異誘発されたヌク
レオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子につい
て、下記セクションにおいて記載される。
【００４０】配列番号１及び３に示されるヌクレオチド
配列、及びその実質的な部分に関する、本明細書におけ
る言及は、特にことわらない限り、プラスミドｐＳＥ２
０１（ＡＴＣＣ ２０３１８２）に存在するような、そ
れぞれの対応するヌクレオチド配列及びその実質的な部
分を意味するためにも意図される。さらに、配列番号２
及び４に示されるアミノ酸配列、及びそのペプチドフラ
グメントに関する、本明細書における言及はまた、特に
ことわらない限り、プラスミドｐＳＥ２０１（ＡＴＣＣ
２０３１８２）に存在する、対応するａｖｅＲ１−及
びａｖｅＲ２−コードのヌクレオチド配列によりコード
される、それぞれの対応するアミノ酸配列及びそのペプ
チドフラグメントを言及するためにも意図される。
【００４１】ポリヌクレオチド分子 本明細書において使用される場合、用語“ポリヌクレオ
チド分子”、“ポリヌクレオチド配列”、“コード配
列”、“リーディングフレーム（ＯＲＦ）”及び同様の
ものは、一本鎖又は二本鎖のいづれかであり得る、ＤＮ
Ａ及びＲＮＡの両分子を言及する。コード配列又はＯＲ
Ｆは、原核配列、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列、及
び化学的に合成されたＤＮＡ及びＲＮＡ配列を包含する
が、但しそれらだけには限定されない。
【００４２】本明細書に開示される、ポリヌクレオチド
分子及びオリゴヌクレオチド分子の生成及び操作は、当
業者の範囲内であり、そして中でも、次の文献に記載さ
れる組換え技法に従って実施され得る：Maniatisなど.
1989, Molecular Cloning ALaboratory Manual , Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r, NY; Ausubelなど., 1989, Greene Publishing Assoc
iates & Wiley Interscience, NY; Sambrookなど., 198
9, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d e
d., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, NY; Innisなど.(eds), 1995, PCR Strategi
es, Academic Press, Inc., San Diego; Erlich(ed), 1
992, PCR Technology, Oxford University Press, New
York; andHopwoodなど., 1985, Genetic Manipulatio
n of Streptomyces, A LaboratoryManual , John Innes
Foundation, Norwich, U.K.; それらのすべては引用に
より、本明細書中に組込まれる。
【００４３】ａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子 本発明は、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１遺伝子
生成物をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離
されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様
においては、ａｖｅＲ１遺伝子生成物は、配列番号２の
アミノ酸配列を含んで成る。非制限的態様においては、
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ１
１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１に示されるよう
な、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレ
オチド配列を含んで成る。さらなる非制限的態様におい
ては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、配
列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００４４】本発明はさらに、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ
２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチ
リスのａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで
成るポリヌクレオチド分子に対して相同である単離され
たポリヌクレオチド分子を供給する。用語“相同”と
は、これに関して使用される場合、（ａ）約ｎｔ１１１
２〜約ｎｔ２３１７の配列番号１と同じポリペプチドを
コードするが、しかし遺伝子コードの縮重に従って、ヌ
クレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を
包含し；又は（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含んで
成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含ん
で成るポリヌクレオチド分子の相補体に対して、適度な
緊縮条件、すなわち０．５ＮのＮａＨＰＯ4 、７％のド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１mMのＥＤＴＡにお
ける６５℃でのフィルター結合されたＤＮＡへのハイブ
リダイゼーション及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤ
Ｓにおける４２℃での洗浄下でハイブリダイズするヌク
レオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を意味
し（Ausubel など. (eds.), 1989, Current Protocols
in Molecular Biology, Vol.I, Green Publishing Asso
ciates, Inc., 及びJohn Wiley & Sons, Inc., New Yor
k, p 2.10.3 を参照のこと）、そして本発明の実施にお
いて有用である。
【００４５】好ましい態様において、相同ポリヌクレオ
チド分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る
ポリヌクレオチド分子の相補体に対して、高い緊縮条
件、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ4 、７％のＳＤＳ、
１mMのＥＤＴＡ下でフィルター結合されたＤＮＡに対す
る６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×Ｓ
ＳＣ／０．１％のＳＤＳにおける６８℃での洗浄下でハ
イブリダイズし（Ausubel など., 1989 、上記）、そし
て本発明の実施において有用である。さらなる好ましい
態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊
縮条件下で、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列番
号１のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド
分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施
において有用である。
【００４６】本明細書において使用される場合、ａｖｅ
Ｒ１−関連ポリヌクレオチド分子は、“本発明の実施に
おいて有用であり”、ここでポリヌクレオチド分子が、
特定部位の突然変異誘発、たとえば相同組換えにより
Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦ中に突然変異
を導入するために、又は標準の増幅技法を用いて、Ｓ．
アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦのヌクレオチド配
列を含んで成るポリヌクレオチド分子を増幅するため
に、使用され得る。そのような相同ポリヌクレオチド分
子は、Ｓ．コエリカラーを除く、ストレプトミセスの他
の種、又はＳ．アベルミチリスの他の株に存在する天然
に存在するａｖｅＲ１遺伝子、及び天然に存在するか、
化学的に合成されるか、又は遺伝的に構築されるかにか
かわらず、突然変異誘発されたａｖｅＲ１対立遺伝子を
包含することができる。
【００４７】本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配
列に対して相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離され
たポリヌクレオチド分子を提供する。Ｓ．アベルミチリ
スからのａｖｅＲ１遺伝子生成物のアミノ酸配列に対し
て相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを言及
するために本明細書において使用される場合、用語“相
同”とは、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るポリ
ペプチドを意味するが、しかしその１又は複数のアミノ
酸残基が異なったアミノ酸残基により保存的に置換され
ており、そしてその得られるポリペプチドは、本発明の
実施において有用である。
【００４８】保存性アミノ酸置換は、当業界において良
く知られている。そのような置換を製造するための規則
は、中でも、Dayhof, M.D., 1978, Nat.Biomed.Res.Fou
nd.,Washington, D.S., Vol.5, Sup.3 により記載され
るものを包含する。より具体的には、保存性アミノ酸置
換は、側鎖の酸度、極性度又は嵩密度に関連するアミノ
酸ファミリー内で一般的に生じるものである。
【００４９】遺伝子的にコードされたアミノ酸は、一般
的に、４種のグループに分けられる：（１）酸性＝アス
パラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、ア
ルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリ
ン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラ
ニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）荷電さ
れていない極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミ
ン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェ
ニルアラニン、トリプトファン及びチロシンはまた、共
同で、芳香族アミノ酸として分類される。いづれかの特
定の基内の１又は複数の置換、たとえばイソロイシン又
はバリンによるロイシンの、又はグルタミン酸によるア
スパラギン酸の、又はセリンによるトレオニンの、又は
構造的に関連するアミノ酸残基、たとえば類似する酸
度、極性度又は嵩密度、又はそれらのいくらかの組合せ
での類似性を有するアミノ酸残基によるいづれか他のア
ミノ酸残基の置換が一般的に、ポリペプチドの機能に対
して微々たる効果を有するであろう。
【００５０】本明細書において使用される場合、ａｖｅ
Ｒ１−関連ポリペプチドは、“本発明の実施において有
用”であり、ここで前記ポリペプチドは、Ｓ．アベルミ
チリスからのａｖｅＲ１遺伝子生成物に対して抗体を生
ぜしめ、又はストレプトミセスにおけるａｖｅＲ１活性
又はアベルメクチン生成を調節する化合物についてスク
リーンするために使用され得る。
【００５１】本発明はさらに、本発明の前記ａｖｅＲ１
−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分
であるヌクレオチド配列から成る単離されたポリヌクレ
オチド分子を提供する。本明細書において使用される場
合、ａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子の“実質的
な部分”は、本発明のＳ．アベルミチリスａｖｅＲ１遺
伝子生成物又はａｖｅＲ１−関連相同ポリペプチドの完
全なコード配列よりも少ない配列から成るが、しかし前
記ヌクレオチド配列の少なくとも約２０％及びより好ま
しくは、少なくとも約３０％を含んで成り、そして有用
性がａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子について上
記のように定義される場合、本発明の実施において有用
であるポリヌクレオチド分子を意味する。
【００５２】非制限的態様においては、ａｖｅＲ１−関
連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明の
Ｓ．アベルミチリスａｖｅＲ１遺伝子生成物又はａｖｅ
Ｒ１−関連相同ポリペプチドのペプチドフラグメントを
コードするヌクレオチド配列から成る。ａｖｅＲ１−関
連ポリペプチドの“ペプチドフラグメント”は、十分な
長さのａｖｅＲ１遺伝子生成物又は相同ポリペプチドの
アミノ酸配列の副配列から成るポリペプチドを意味し、
ここで前記副配列は、十分な長さのａｖｅＲ１遺伝子生
成物又は相同ポリペプチドよりも長さが短かく、そして
有用性がａｖｅＲ１−関連ポリペプチドについて上記に
定義されるように、本発明の実施において有用である。
好ましい態様において、本発明は、配列番号２のアミノ
酸配列の副配列から成るペプチドフラグメントをコード
するヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を
供給する。本発明のペプチドフラグメントは、好ましく
は少なくとも約１５個のアミノ酸残基の長さである。
【００５３】本明細書に開示されるａｖｅＲ１−関連ポ
リヌクレオチド分子は、ａｖｅＲ１遺伝子生成物を発現
するために、ａｖｅＲ１遺伝子が突然変異誘発されてい
るストレプトミセスの新規株を調製するために、又は既
知の技法を用いて、他の細菌種又は株におけるａｖｅＲ
１相同体遺伝子を同定するために使用され得る。従っ
て、本発明はさらに、ａｖｅＲ１相同体遺伝子生成物を
コードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポ
リヌクレオチド分子を供給する。
【００５４】本明細書において使用される場合、“ａｖ
ｅＲ１相同体遺伝子生成物”とは、ストレプトミセスの
異なった種又は密接に関連するサッカロポリスポラ（Sa
ccharopolyspora ）属からの遺伝子として定義され、そ
して約８０％以上のヌクレオチド配列同一性の程度に基
づいて、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１遺伝子の相同
体として当業者により、又は２−成分シグナリングシス
テムのヒスチジンキナーゼ成分に典型的には見出される
保存された活性部位残基を含むことによって認識される
ａｖｅＲ１相同体遺伝子によりコードされる遺伝子生成
物として定義される。たとえば、Ｎａｒ／Ｄｅｇサブグ
ループからの真正細胞２−成分システムとのａｖｅＲ１
相同性の比較は、自己−リン酸化の部位であるヒスチジ
ン残基（Ｈ）、及び自己キナーゼ活性のために必要とさ
れるアスパラギン酸残基（Ｎ）の１００％保存性を示
す。
【００５５】ａｖｅＲ１相同体遺伝子を含むポリヌクレ
オチドクローンを同定するための方法は、当業界におい
て知られている。たとえば、Ｓ．アベルミチリスａｖｅ
Ｒ１のＯＲＦの一部を含んで成るポリヌクレオチド分子
は、検出できるようにラベルされ得、そして興味ある生
物に由来するＤＮＡから構成されるゲノムライブラリー
をスクリーンするために使用され得る。ハイブリダイゼ
ーション条件の緊縮性は、興味ある生物に対する対照生
物（この例においては、Ｓ．アベルミチリス）の関係に
基づいて選択され得る。異なった緊縮性条件についての
必要性は、当業者によく知られており、そしてそのよう
な条件は、ライブラリー及びラベルされた配列が由来す
る特定の生物に依存して変化するであろう。
【００５６】ゲノムＤＮＡライブラリーは、中でも、バ
クテリオファージに関しては、Benton and Davis, 197
7, Science 196: 180、及びプラスミドライブラリーに
関しては、Grunstein and Hogness, 1975, Proc.Natl.A
cad.Sci. USA, 72: 3961-3965に示される技法を用い
て、ａｖｅＲ１相同体遺伝子コード配列についてスクリ
ーンされ得る。配列番号１で示されるようなａｖｅＲ１
のＯＲＦ、又はその一部を表わすオリゴヌクレオチド分
子を含むことが知られているヌクレオチド配列を有する
ポリヌクレオチド分子は、それらのスクリーニング実験
においてプローブとして使用され得る。他方では、精製
されたａｖｅＲ１遺伝子生成物のアミノ酸配列から推定
されるヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド
プローブが合成され得る。
【００５７】ａｖｅＲ１相同体遺伝子コード配列を含む
ものとして同定されるクローンが、適切な生物学的機能
について試験され得る。たとえば、クローンは、適切な
リーディングフレーム、及び開始及び終結シグナルを同
定するために配列分析にゆだねられ得る。次に、クロー
ン化されたＤＮＡ配列が、ａｖｅＲ１の相補性について
の試験を可能にされた、Ｓ．アベルミチリスの株の細胞
を形質転換する適切な発現ベクター中に挿入され得る。
次に、形質転換されたＳ．アベルミチリス宿主細胞が、
たとえば下記セクション６．６．に記載されるように、
発酵生成物のＨＰＬＣ分析のような方法を用いて、アベ
ルメクチン生成について分析され得る。
【００５８】本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａ
ｖｅＲ１のＯＲＦに天然において接する（flanking）１
又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポ
リヌクレオチド分子を提供する。そのようなフランキン
グ配列は、約ｎｔ１〜約ｎｔ１１１１、及び約ｎｔ２３
１８〜約ｎｔ５０４５の配列番号１のヌクレオチド配列
から選択され得る。本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリ
スのａｖｅＲ１のＯＲＦに天然において接する（flanki
ng）ヌクレオチド配列に対して相同である１又は複数の
ヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオ
チド分子を提供する。
【００５９】本明細書において使用される場合、ヌクレ
オチド配列は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲ
Ｆに天然において接するヌクレオチド配列に対して相同
であり、ここでその相同ヌクレオチド配列は、適度な緊
縮条件、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ4 、７％のＳＤ
Ｓ、１mMのＥＤＴＡにおける６５℃でのフィルター結合
されるＤＮＡへのハイブリダイゼーション、及び０．２
×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける４２℃での洗浄下
で、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦを天然に
おいて端に有するヌクレオチド配列の相補体にハイブリ
ダイズし（Ausubel など., 1989 、上記を参照のこ
と）、そしてａｖｅＲ１−関連ポリヌクレオチド分子に
ついて有用性が上記に定義されるように、本発明の実施
において有用である。
【００６０】本発明の単離されたポリヌクレオチド分子
における個々のフランキング配列、又はその相同体は、
好ましくは、少なくとも約２００ntの長さのものであ
る。非制限的な態様において、本発明は、Ｓ．アベルミ
チリスのａｖｅＲ１のＯＲＦに天然において接する１又
は複数の前記ヌクレオチド配列を含んで成り、又はその
ようなヌクレオチド配列に対して相同であり、そしてさ
らに、本発明の１つの前記ａｖｅＲ１−関連ヌクレオチ
ド配列、たとえば約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配
列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅ
Ｒ１のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る単離され
たポリヌクレオチド分子、又はその実質的な部分を供給
する。
【００６１】ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子 本発明は、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ２遺伝子
生成物をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離
されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様
においては、ａｖｅＲ２遺伝子生成物は、配列番号４の
アミノ酸配列を含んで成る。非制限的態様においては、
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、約ｎｔ２
３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３に示されるよう
な、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレ
オチド配列を含んで成る。さらなる非制限的態様におい
ては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、配
列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００６２】本発明はさらに、約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ
３０２１の配列番号３に示されるようなＳ．アベルミチ
リスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで
成るポリヌクレオチド分子に対して相同である単離され
たポリヌクレオチド分子を供給する。用語“相同”と
は、これに関して使用される場合、（ａ）約ｎｔ２３１
４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３と同じポリペプチドを
コードするが、しかし遺伝子コードの縮重に従って、ヌ
クレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を
包含し；又は（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含んで
成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含ん
で成るポリヌクレオチド分子の相補体に対して、適度な
緊縮条件、すなわち０．５ＮのＮａＨＰＯ4 、７％のド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１mMのＥＤＴＡにお
ける６５℃でのフィルター結合されたＤＮＡへのハイブ
リダイゼーション及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤ
Ｓにおける４２℃での洗浄下でハイブリダイズするヌク
レオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を意味
し（Ausubel など. (eds.), 1989, Current Protocols
in Molecular Biology, Vol.I, Green Publishing Asso
ciates, Inc., 及びJohn Wiley & Sons, Inc., New Yor
k, p 2.10.3 を参照のこと）、そして本発明の実施にお
いて有用である。
【００６３】好ましい態様において、相同ポリヌクレオ
チド分子は、配列番号４のアミノ酸配列を含んで成るポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る
ポリヌクレオチド分子の補体に対して、高い緊縮条件、
すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ4 、７％のＳＤＳ、１mM
のＥＤＴＡ下でフィルター結合されたＤＮＡに対する６
５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ
／０．１％のＳＤＳにおける６８℃での洗浄下でハイブ
リダイズし（Ausubel など., 1989 、上記）、そして本
発明の実施において有用である。さらなる好ましい態様
においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条
件下で、約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３
のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子
の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施におい
て有用である。
【００６４】本明細書において使用される場合、ａｖｅ
Ｒ２−関連ポリヌクレオチド分子は、“本発明の実施に
おいて有用であり”、ここでポリヌクレオチド分子が、
特定部位の突然変異誘発、たとえば相同組換えによりａ
ｖｅＲ２のＯＲＦ中に突然変異を導入するために、又は
標準の増幅技法を用いて、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅ
Ｒ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌク
レオチド分子を増幅するために、使用され得る。そのよ
うな相同ポリヌクレオチド分子は、Ｓ．コエリカラーを
除く、ストレプトミセスの他の種、又はＳ．アベルミチ
リスの他の株に存在する天然に存在するａｖｅＲ２遺伝
子、及び天然に存在するか、化学的に合成されるか、又
は遺伝的に構築されるかにかかわらず、突然変異誘発さ
れたａｖｅＲ２対立遺伝子を包含することができる。
【００６５】本発明はさらに、配列番号４のアミノ酸配
列に対して相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離され
たポリヌクレオチド分子を提供する。Ｓ．アベルミチリ
スからのａｖｅＲ２遺伝子生成物のアミノ酸配列に対し
て相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを言及
するために本明細書において使用される場合、用語“相
同”とは、配列番号４のアミノ酸配列を含んで成るポリ
ペプチドを意味するが、しかしその１又は複数のアミノ
酸残基が異なったアミノ酸残基により保存的に置換され
ており、そしてその得られるポリペプチドは、本発明の
実施において有用である。
【００６６】本明細書において使用される場合、ａｖｅ
Ｒ２−関連ポリペプチドは、“本発明の実施において有
用”であり、ここで前記ポリペプチドは、Ｓ．アベルミ
チリスからのａｖｅＲ２遺伝子生成物に対して抗体を生
ぜしめ、又はストレプトミセスにおけるａｖｅＲ２活性
又はアベルメクチン生成を調節する化合物についてスク
リーンするために使用され得る。
【００６７】本発明はさらに、本発明の前記ａｖｅＲ２
−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的な部分
であるヌクレオチド配列から成る単離されたポリヌクレ
オチド分子を供給する。本明細書において使用される場
合、ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子の“実質的
な部分”は、本発明のＳ．アベルミチリスａｖｅＲ２遺
伝子生成物又はａｖｅＲ２−関連相同ポリペプチドの完
全なコード配列よりも少ない配列から成るが、しかし前
記ヌクレオチド配列の少なくとも約２５％及びより好ま
しくは、少なくとも約３０％を含んで成り、そして有用
性がａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子について上
記のように定義される場合、本発明の実施において有用
であるポリヌクレオチド分子を意味する。
【００６８】非制限的態様においては、ａｖｅＲ２−関
連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明の
Ｓ．アベルミチリスａｖｅＲ２遺伝子生成物又はａｖｅ
Ｒ２−関連相同ポリペプチドのペプチドフラグメントを
コードするヌクレオチド配列から成る。ａｖｅＲ２−関
連ポリペプチドの“ペプチドフラグメント”は、十分な
長さのａｖｅＲ２遺伝子生成物又は相同ポリペプチドの
アミノ酸配列の副配列から成るポリペプチドを意味し、
ここで前記サブ−配列は、十分な長さのａｖｅＲ２遺伝
子生成物又は相同ポリペプチドよりも長さが短かく、そ
して有用性がａｖｅＲ２−関連ポリペプチドについて上
記に定義されるように、本発明の実施において有用であ
る。好ましい態様において、本発明は、配列番号４のア
ミノ酸配列の副配列から成るペプチドフラグメントをコ
ードするヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分
子を供給する。本発明のペプチドフラグメントは、好ま
しくは少なくとも約１５個のアミノ酸残基の長さであ
る。
【００６９】本明細書に開示されるａｖｅＲ２−関連ポ
リヌクレオチド分子は、ａｖｅＲ２遺伝子生成物を発現
するために、ａｖｅＲ２遺伝子が突然変異誘発されてい
るストレプトミセスの新規株を調製するために、又は既
知の技法を用いて、他の細菌種又は株におけるａｖｅＲ
２相同体遺伝子を同定するために使用され得る。従っ
て、本発明はさらに、ａｖｅＲ２相同体遺伝子生成物を
コードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポ
リヌクレオチド分子を提供する。
【００７０】本明細書において使用される場合、“ａｖ
ｅＲ２相同体遺伝子生成物”とは、ストレプトミセスの
異なった種又は密接に関連するサッカロポリスポラ（Sa
ccharopolyspora ）属からの遺伝子として定義され、そ
して約８０％以上のヌクレオチド配列同一性の程度に基
づいて、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２遺伝子の相同
体として当業者により、又は２−成分シグナリングシス
テムの応答レギュレーター成分に典型的には見出される
保存された活性部位残基を含むことによって認識される
ａｖｅＲ２相同体遺伝子によりコードされる遺伝子生成
物として定義される。たとえば、Ｎａｒ／Ｄｅｇサブグ
ループからの真正細胞２−成分システムとのａｖｅＲ２
相同性の比較は、２つのアスパラギン酸残基（Ｄ）（こ
の１つは、リン酸化の部位である）、及び保存されたリ
シン残基（Ｒ）の１００％保存性を示す。
【００７１】ａｖｅＲ２相同体遺伝子を含むポリヌクレ
オチドクローンを同定するための方法は、当業界におい
て知られている。たとえば、Ｓ．アベルミチリスａｖｅ
Ｒ２のＯＲＦの一部を含んで成るポリヌクレオチド分子
は、検出できるようにラベルされ得、そして興味ある生
物に由来するＤＮＡから構成されるゲノムライブラリー
をスクリーンするために使用され得る。ハイブリダイゼ
ーション条件の緊縮性は、興味ある生物に対する対照生
物（この例においては、Ｓ．アベルミチリス）の関係に
基づいて選択され得る。
【００７２】ゲノムＤＮＡライブラリーは、セクション
５．１．１において引用される技法を用いて、ａｖｅＲ
２相同体遺伝子コード配列についてスクリーンされ得
る。配列番号３で示されるようなａｖｅＲ２のＯＲＦ、
又はその一部を表わすオリゴヌクレオチド分子を含むこ
とが知られているヌクレオチド配列を有するポリヌクレ
オチド分子は、それらのスクリーニング実験においてプ
ローブとして使用され得る。他方では、精製されたａｖ
ｅＲ２遺伝子生成物のアミノ酸配列から推定されるヌク
レオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブが
合成され得る。
【００７３】ａｖｅＲ２相同体遺伝子コード配列を含む
ものとして同定されるクローンが、適切な生物学的機能
について試験され得る。たとえば、クローンは、適切な
リーディングフレーム、及び開始及び終結シグナルを同
定するために配列分析にゆだねられ得る。次に、クロー
ン化されたＤＮＡ配列が、ａｖｅＲ２の相補性について
の試験を可能にされた、Ｓ．アベルミチリスの株の細胞
を形質転換する適切な発現ベクター中に挿入され得る。
次に、形質転換されたＳ．アベルミチリス宿主細胞が、
たとえば下記セクション６．６．に記載されるように、
発酵生成物のＨＰＬＣ分析のような方法を用いて、アベ
ルメクチン生成について分析され得る。
【００７４】本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａ
ｖｅＲ２のＯＲＦを天然において端に有する１又は複数
のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレ
オチド分子を提供する。そのようなフランキング配列
は、約ｎｔ１〜約ｎｔ２３１３、及び約ｎｔ３０２２〜
約ｎｔ５０４５の配列番号３のヌクレオチド配列から選
択され得る。本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａ
ｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接するヌクレオチド配
列に対して相同である１又は複数のヌクレオチド配列を
含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供す
る。
【００７５】本明細書において使用される場合、ヌクレ
オチド配列は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲ
Ｆに天然において接する（flanking）ヌクレオチド配列
に対して相同であり、ここでその相同ヌクレオチド配列
は、適度な緊縮条件、すなわち０．５ＭのＮａＨＰ
Ｏ4 、７％のＳＤＳ、１mMのＥＤＴＡにおける６５℃で
のフィルター結合されるＤＮＡへのハイブリダイゼーシ
ョン、及び０．２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳにおける
４２℃での洗浄下で、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２
のＯＲＦに天然において接するヌクレオチド配列の相補
体にハイブリダイズし（Ausubel など., 1989 、上記を
参照のこと）、そしてａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチ
ド分子について有用性が上記に定義されるように、本発
明の実施において有用である。
【００７６】本発明の単離されたポリヌクレオチド分子
における個々のフランキング配列、又はその相同体は、
好ましくは、少なくとも約２００ntの長さのものであ
る。非制限的な態様において、本発明は、Ｓ．アベルミ
チリスのａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接する１又
は複数の前記ヌクレオチド配列を含んで成り、又はその
ようなヌクレオチド配列に対して相同であり、そしてさ
らに、本発明の１つの前記ａｖｅＲ２−関連ヌクレオチ
ド配列、たとえば約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配
列番号３に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅ
Ｒ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る単離され
たポリヌクレオチド分子、又はその実質的な部分を供給
する。
【００７７】ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレ
オチド分子 本発明は、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１及びａ
ｖｅＲ２遺伝子生成物（“ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２”と
して下記で言及される）の両者をコードするヌクレオチ
ド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を
さらに提供する。好ましい態様においては、ａｖｅＲ１
及びａｖｅＲ２遺伝子生成物は、それぞれ、配列番号２
及び配列番号４のアミノ酸配列を含んで成る。非制限的
態様においては、単離されたａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２ポ
リヌクレオチド分子は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１
７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスの
ａｖｅＲ１のＯＲＦ、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０
２１の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリス
のａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成
る。
【００７８】さらなる非制限的態様においては、単離さ
れたａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２ポリヌクレオチド分子は、
約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ３０２１の配列番号１のヌクレ
オチド配列を含んで成る。さらなる非制限的態様におい
ては、単離されたポリヌクレオチド分子は、配列番号１
のヌクレオチド配列を含んで成る。配列番号１のヌクレ
オチド配列は、ａｖｅＲ１のＯＲＦとａｖｅＲ２のＯＲ
Ｆとの間での部分的オーバーラップを示すが、しかしな
がら、本発明はまた、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２につい
てのＯＲＦがオーバーラップしないａｖｅＲ１／ａｖｅ
Ｒ２ポリヌクレオチド分子も包含する。
【００７９】本発明はさらに、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ
２３１７の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチ
リスのａｖｅＲ１のＯＲＦ、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎ
ｔ３０２１の配列番号１に示されるようなＳ．アベルミ
チリスのａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含ん
で成るポリヌクレオチド分子に対して相同である単離さ
れたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００８０】用語“相同”とは、これに関して使用され
る場合、（ａ）それぞれ、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３
１７及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号１
に示されるようなａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２と同じポリ
ペプチドをコードするが、しかし遺伝子コード縮重に従
って、ヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレン
ト変化を包含し；又は（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列
を含んで成る第１ポリペプチド、及び配列番号４のアミ
ノ酸配列を含んで成る第２ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子の補
体に対して、適度な緊縮条件、すなわち０．５ＭのＮａ
ＨＰＯ4 、７％のＳＤＳ、１mMのＥＤＴＡにおける６５
℃でのフィルター結合されたＤＮＡへのハイブリダイゼ
ーション及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳにおけ
る４２℃での洗浄下でハイブリダイズするヌクレオチド
配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を意味し（Ausu
bel など., 1989 、前記）、そして本発明の実施におい
て有用である。
【００８１】好ましい態様において、相同ポリヌクレオ
チド分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る第
１ポリペプチド及び配列番号４のアミノ酸配列を含んで
成る第２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含んで成るポリヌクレオチド分子の相補体に対して、高
い緊縮条件、すなわち０．５ＭのＮａＨＰＯ4 、７％の
ＳＤＳ、１mMのＥＤＴＡ下でフィルター結合されたＤＮ
Ａに対する６５℃でのハイブリダイゼーション、及び
０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳにおける６８℃での
洗浄下でハイブリダイズし（Ausubel など., 1989 、上
記）、そして本発明の実施において有用である。さらな
る好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子
は、高い緊縮条件下で、それぞれ約ｎｔ１１１２〜約ｎ
ｔ２３１７及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列
番号１で示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ
１及びａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで
成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、
そして本発明の実施において有用である。
【００８２】本明細書において使用される場合、ａｖｅ
Ｒ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子は、“本
発明の実施において有用であり”、ここでポリヌクレオ
チド分子が、特定部位の突然変異誘発、たとえば相同組
換えによりＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦも
しくはａｖｅＲ２のＯＲＦのいづれか、又はａｖｅＲ１
及びａｖｅＲ２のＯＲＦの両者中に突然変異を導入する
ために、又は標準の増幅技法を用いて、Ｓ．アベルミチ
リスのａｖｅＲ１のＯＲＦもしくはａｖｅＲ２のＯＲＦ
のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの
両者のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド
分子を増幅するために、使用され得る。
【００８３】そのような相同ポリヌクレオチド分子は、
Ｓ．コエリカラーを除く、ストレプトミセスの他の種、
又はＳ．アベルミチリスの他の株に存在する天然に存在
するａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２遺伝子、及び天然に存在す
るか、化学的に合成されるか、又は遺伝的に構築される
かにかかわらず、突然変異誘発されたａｖｅＲ１又はａ
ｖｅＲ２対立遺伝子を包含することができる。
【００８４】本発明はさらに、それぞれ配列番号２及び
４のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸配列を有
する第１及び第２ポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を
提供する。Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１及びａ
ｖｅＲ２遺伝子生成物のアミノ酸配列に対して相同であ
るアミノ酸配列を有するポリペプチドを言及するために
本明細書において使用される場合、用語“相同”とは、
それぞれ配列番号２及び４のアミノ酸配列を含んで成る
ポリペプチドを意味するが、しかしその１又は複数のア
ミノ酸残基が、上記で定義される保存性アミノ酸置換の
ように、異なったアミノ酸残基により保存的に置換され
ており、そしてその得られるポリペプチドは、本発明の
実施において有用である。
【００８５】本発明はさらに、本発明の前記ａｖｅＲ１
／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの
実質的な部分であるヌクレオチド配列から成る単離され
たポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において
使用される場合、ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌ
クレオチド分子の“実質的な部分”は、Ｓ．アベルミチ
リスからのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物の両
者、又は本発明のａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２−関連相同
ポリペプチドの両者をコードするために必要とされる完
全なコード配列よりも少ない配列から成るが、しかし前
記ヌクレオチド配列の少なくとも約１０％及びより好ま
しくは、少なくとも約２０％を含んで成り、そして有用
性がａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分
子について上記のように定義されるように、本発明の実
施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味す
る。
【００８６】好ましい態様においては、ａｖｅＲ１／ａ
ｖｅＲ２−関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分
は、本発明のＳ．アベルミチリスａｖｅＲ１遺伝子生成
物又はＳ．アベルミチリスａｖｅＲ２遺伝子生成物のい
づれか、又はその相同ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列から成る。非限定的であるが、特定の態様に
おいては、ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連ポリヌクレオ
チド分子の実質的な部分は、約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２
３１７の配列番号１に示されるようなａｖｅＲ１のＯＲ
Ｆのヌクレオチド配列から成る。非限定的であるが、特
定のもの１つの態様においては、ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ
２−関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、約ｎ
ｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配列番号３に示されるよ
うなａｖｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列から成る。
【００８７】本発明はさらに、Ｓ．アベルミチリスのａ
ｖｅＲ１／ａｖｅＲ２のＯＲＦを天然において端に有す
る１又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離され
たポリヌクレオチド分子を提供する。そのようなフラン
キング配列は、約ｎｔ１〜約ｎｔ１１１１、及び約ｎｔ
３０２２〜約ｎｔ５０４５の配列番号１のヌクレオチド
配列から選択され得る。本発明はさらに、Ｓ．アベルミ
チリスのａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２のＯＲＦに天然におい
て接するヌクレオチド配列に対して相同である１又は複
数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌク
レオチド分子を提供する。
【００８８】本明細書において使用される場合、ヌクレ
オチド配列は、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１／ａｖ
ｅＲ２のＯＲＦに天然において接するヌクレオチド配列
に対して相同であり、ここでその相同ヌクレオチド配列
は、適度な緊縮条件、すなわち０．５ＭのＮａＨＰ
Ｏ4 、７％のＳＤＳ、１mMのＥＤＴＡにおける６５℃で
のフィルター結合されるＤＮＡへのハイブリダイゼーシ
ョン、及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳにおける
４２℃での洗浄下で、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１
／ａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接するヌクレオチ
ド配列の相補体にハイブリダイズし（Ausubel など., 1
989 、上記を参照のこと）、そしてａｖｅＲ１／ａｖｅ
Ｒ２−関連ポリヌクレオチド分子について有用性が上記
に定義されるように、本発明の実施において有用であ
る。
【００８９】本発明の単離されたポリヌクレオチド分子
における個々のフランキング配列、又はその相同体は、
好ましくは、少なくとも約２００ntの長さのものであ
る。非制限的な態様において、本発明は、Ｓ．アベルミ
チリスのａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２のＯＲＦに天然におい
て接する１又は複数の前記ヌクレオチド配列を含んで成
り、又はそのようなヌクレオチド配列に対して相同であ
り、そしてさらに、本発明の１つの前記ａｖｅＲ１／ａ
ｖｅＲ２−関連ヌクレオチド配列、たとえば約ｎｔ１１
１２〜約ｎｔ３０２１の配列番号１に示されるような
Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲ
Ｆのいづれか又は両者をコードするヌクレオチド配列を
含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供す
る。
【００９０】オリゴヌクレオチド分子 本発明は、本発明の前記ポリヌクレオチド分子のいづれ
かにハイブリダイズし、又は本発明の前記ポリヌクレオ
チド分子のいづれかの相補体であるヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチド分子にハイブリダイズするオリ
ゴヌクレオチド分子を提供する。そのようなオリゴヌク
レオチド分子は好ましくは、少なくとも約１０個の長さ
のヌクレオチドであるが、しかし本発明の前記ポリヌク
レオチド分子のいづれかのサブ−配列の長さで延長する
ことができ、そして適度な又は高い緊縮条件下で、１又
は複数の前記ポリヌクレオチド分子にハイブリダイズす
ることができる。
【００９１】より短いオリゴヌクレオチド分子に関して
は、高い緊縮条件の例は、約１４−塩基オリゴヌクレオ
チドに関しては、約３７℃、約１７−塩基オリゴヌクレ
オチドに関しては、約４８℃、約２０−塩基オリゴヌク
レオチドに関しては、約５５℃、及び約２３−塩基オリ
ゴヌクレオチドに関しては、約６０℃での６×ＳＳＣ／
０．５％ピロリン酸ナトリウムにおける洗浄を包含す
る。より長いオリゴヌクレオチド分子（すなわち、約１
００nt以上）に関しては、適度な及び高い緊縮条件の例
は、相同ポリヌクレオチド分子に関して上記セクション
５．１に記載される。ハイブリダイゼーション条件は、
使用される特定のオリゴヌクレオチド分子に依存して、
当業界において知られているようにして適切に調節され
得る。
【００９２】好ましい態様において、本発明のオリゴヌ
クレオチド分子は、高い緊縮条件下で、配列番号１のヌ
クレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子、又は配
列番号１のヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド
配列から成るポリヌクレオチド分子にハイブリダイズす
る。本発明のオリゴヌクレオチド分子は、種々の目的の
ために、たとえばａｖｅＲ１もしくはａｖｅＲ２遺伝子
生成物コードのポリヌクレオチド分子の増幅におけるプ
ライマーとして、又はストレプトミセスにおけるａｖｅ
遺伝子の調節及びアベルメクチン生合成の調節において
有用なアンチセンス分子として有用である。
【００９３】増幅は、標準の技法、たとえばポリメラー
ゼ鎖反応（ＰＣＲ）（但し、当業界において知られてい
る他の増幅技法も可能である）、たとえばリガーゼ鎖反
応と共に、適切に企画されたオリゴヌクレオチド分子を
用いて実施され得る。たとえば、ＰＣＲに関しては、適
切に企画されたプライマー、増幅されるべきヌクレオチ
ド配列を含んで成る鋳型、及び適切なＰＣＲ酵素及び緩
衝液を含んで成る混合物が、鋳型の特定のａｖｅＲ１−
又はａｖｅＲ２−関連ポリペプチド分子を増幅するため
に、標準のプロトコールに従って、調製され、そして処
理される。
【００９４】組換え発現システム 発現ベクター 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子を含ん
で成る組換えクローニングベクター及び組換え発現ベク
ターを供給し、ここで前記ベクターは、前記ポリヌクレ
オチド分子、たとえばＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１
のＯＲＦもしくはａｖｅＲ２のＯＲＦのいづれか、又は
ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの両者を含んで成る
ポリヌクレオチド分子のクローニング、又は発現におい
て有用である。非限定的態様においては、本発明は、
Ｓ．アベルミチリスの完全なａｖｅＲ１のＯＲＦ及び完
全なａｖｅＲ２のＯＲＦを含んで成るプラスミドｐＳＥ
２０１（ＡＴＣＣ ２０３１８２）を提供する。
【００９５】次の記載は、特にことわらない限り、上記
で定義されたように、本発明の前記ポリヌクレオチド分
子及びポリペプチドのすべてに適用するために意図され
る：たとえば、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１及
びａｖｅＲ２のＯＲＦのいづれか又は両者を含んで成る
ポリヌクレオチド分子及びそれらの遺伝子生成物、及び
すべての相同ポリヌクレオチド分子、相同ポリペプチ
ド、そのようなポリヌクレオチド分子の実質的な部分、
及びそのような遺伝子生成物及びポリペプチドのペプチ
ドフラグメント。
【００９６】次の種々の異なったベクターが、ストレプ
トミセスへの特定の使用のために開発されて来た：たと
えば、中でも、ファージ、高コピー数のプラスミド、低
コピー数のプラスミド、自殺プラスミド、感温性プラス
ミド、及びＥ．コリ−ストレプトミセス シャトルベク
ター、そしてそれらのいづれかが本発明の実施に使用さ
れ得る。多くの耐薬物性遺伝子がまた、ストレプトミセ
スからクローン化されており、そしてそれらの遺伝子の
いくつかが選択マーカーとしてベクター中に組込まれて
いる。ストレプトミセスへの使用のための現在のベクタ
ーの例は、中でも、Hutchinson, 1980, Applied Bioche
m.Biotech. 16: 169-190に示されている。
【００９７】本発明の組換えベクター、特に発現ベクタ
ーは好ましくは、本発明のポリヌクレオチド分子のため
のコード配列が、ポリペプチドを生成するためにコード
配列の転写及び翻訳のために必要な１又は複数の調節要
素と操作的に関連して存在するよう構成される。本明細
書において使用される場合、用語“調節要素”とは、誘
発性及び非誘発性プロモーター、エンハンサー、オペレ
ーター、及びポリヌクレオチドコード配列の発現を駆動
し、そして／又は調節するよう作用する当業界において
知られている他の要素をコードするヌクレオチド配列を
包含するが、但しそれだけには限定されない。また、本
明細書において使用される場合、コード配列は、そのコ
ード配列の転写、又はそのｍＲＮＡの翻訳、又は両者を
効果的に調節し、そして可能にする１又は複数の調節要
素と“作用可能に関連して”存在する。
【００９８】本発明のポリヌクレオチド分子を含むよう
構築され得る典型的なプラスミドベクターは、中でも、
pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega)
、及びシャトルベクターpWHM3 （Varaなど., 1989, J.
Bact. 171: 5872-5881 ）を包含する。それらのベクタ
ーの調節要素は、それらの強さ及び特異性において異な
ることができる。使用される宿主／ベクターシステムに
依存して、多くの適切な転写及び翻訳要素のいづれかが
使用され得る。細菌のための転写調節領域又はプロモー
ターの非制限的な例は、β−ｇａｌプロモーター、Ｔ７
プロモーター、ＴＡＣプロモーター、λ左及び右プロモ
ーター、ｔｒｐ及びｌａｃプロモーター、ｔｒｐ−ｌａ
ｃ融合プロモーター、及びより特定には、ストレプトミ
セスのためのプロモーターｅｒｍＥ，ｍｅｌＣ及びｔｉ
ｐＡ、等を包含する。
【００９９】適切な調節要素と作用可能に関連する特定
のコード配列を含む組換えベクターを構成するための方
法は、当業界においてよく知られており、そしてそれら
のいづれかが本発明の実施に使用され得る。それらの方
法は、インビトロ組換え技法、合成技法及びインビボ遺
伝子組換えを包含する。たとえば、Maniatisなど., 198
9 、上記；Ausubel など., 1989 、上記；Sambrookな
ど., 1989 、上記；Innis など., 1995 、上記；Erlic
h, 1992、上記；及びHopwood など., 1985 、上記に記
載される技法を参照のこと。
【０１００】融合タンパク質発現ベクターが、ａｖｅＲ
１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物−融合タンパク質を発現
するために使用され得る。精製された融合タンパク質
は、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物に対する抗
血清を生ぜしめるために、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺
伝子生成物の生化学性質を研究するために、異なった生
化学活性を有するａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２融合タンパ
ク質を構築するために、又は組換え発現システムにおけ
る発現されたａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物の
同定又は精製を助けるために使用され得る。可能な融合
タンパク質発現ベクターは、β−ガラクトシダーゼ及び
ｔｒｐＥ融合体、マルトース結合融合体、グルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼ融合体及びポリヒスチジン融
合体（キャリヤー領域）をコードする配列を組込むベク
ターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１０１】ＡｖｅＲ１及びＡｖｅＲ２融合タンパク質
は、精製のために有用な領域を含むよう構築され得る。
たとえば、ＡｖｅＲ１−又はＡｖｅＲ２−マルトース−
結合タンパク質融合はアミロース樹脂を用いて精製され
得；そしてＡｖｅＲ１−又はＡｖｅＲ２−グルタチオン
−Ｓ−トランスファーゼ融合タンパク質は、グルタチオ
ン−アガロースビーズを用いて精製される。そしてＡｖ
ｅＲ１−又はＡｖｅＲ２−ポリヒスチジン融合は二価の
ニッケル樹脂を用いて精製され得る。他方では、キャリ
ヤータンパク質又はペプチドに対する抗体が融合タンパ
ク質のアフィニティークロマトグラフィー精製のために
使用され得る。
【０１０２】たとえば、モノクローナル抗体の標的エピ
トープをコードするヌクレオチド配列が、調節要素と操
作的に関連して発現ベクター中に構築され、そして発現
されるエピトープがＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２ポリペプ
チドに融合されるよう、位置決定され得る。たとえば、
親水性マーカーペプチドである、ＦＬＡＧTMエピトープ
標識（International Biotechnologies, Inc. ）をコー
ドするヌクレオチド配列は、標準技法により、ＡｖｅＲ
１又はＡｖｅＲ２ポリペプチドのアミノ又はカルボキシ
ル末端に対応する点で発現ベクター中に挿入され得る。
次に、発現されたＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２ポリペプチ
ド−ＦＬＡＧTMエピトープ融合生成物が検出され、そし
て市販の抗−ＦＬＡＧTM抗体を用いて、アフィニティー
精製され得る。
【０１０３】ＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２融合タンパク質
をコードする発現ベクターはまた、特定のプロテアーゼ
切断部位をコードするポリリンカー配列を含むよう構築
され得、その結果、発現されたＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ
２ポリペプチドが特定のプロテアーゼによる処理により
キャリヤー領域又は融合パートナーから開放され得る。
たとえば、融合タンパク質ベクターは、中でも、トロン
ビン又は第Ｘａ因子切断部位をコードするＤＮＡ配列を
含むことができる。
【０１０４】ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２のＯＲＦの上流
に存在し、そしてそれと読取り枠を整合して存在するシ
グナル配列が、発現される遺伝子生成物のトラフィキン
グ及び分泌を指図するために、既知の方法により発現ベ
クター中に構築され得る。シグナル配列の非制限的例
は、中でも、α−因子、免疫グロブリン、外層膜タンパ
ク質、ペニシリナーゼ、及びＴ−細胞受容体からのもの
を包含する。
【０１０５】本発明のクローニング又は発現ベクターに
より形質転換され、又はトランスフェクトされた宿主細
胞の選択を助けるために、ベクターは、レポーター遺伝
子生成物又は他の選択マーカーのためのコード配列をさ
らに含むよう構築され得る。そのようなコード配列は好
ましくは、上記のように、調節要素コード配列と操作的
に関連して存在する。本発明において有用であるレポー
ター遺伝子は、当業界において良く知られており、そし
て中でも、緑色螢光タンパク質、ルシフェリン、ｘｙｌ
Ｅ、及びチロシナーゼをコードするそれらのものを包含
する。
【０１０６】選択マーカーをコードするヌクレオチド配
列は、当業界において良く知られており、そして抗生物
質又は抗−代謝物に対する耐性を付与する遺伝子生成物
をコードし、又は栄養要求性必要条件を供給するそれら
のものを包含する。そのような配列の例は、中でもエリ
スロマイシン、チオストレプトン又はカナマイシンに対
する耐性をコードするそれらのものを包含する。
【０１０７】宿主細胞 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子又は組
換えベクターを含んで成る形質転換された宿主細胞、及
びそれらに由来する新規株又は細胞系を供給する。本発
明の実施において有用な宿主細胞は、好ましくは、スト
レプトミセス細胞であるが、但し、他の原核細胞又は真
核細胞もまた使用され得る。そのような形質転換された
宿主細胞は典型的には、微生物、たとえば組換えバクテ
リオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤ
ＮＡベクターにより形質転換された細菌、又は組換えベ
クターにより形質転換された酵母を包含するが、但しそ
れらだけには限定されない。
【０１０８】細菌細胞が一般的に、宿主細胞として好ま
しい。本発明のポリヌクレオチド分子はストレプトミセ
ス細胞において機能するよう意図されるが、しかしま
た、たとえばクローニング又は発現目的のために、他の
細菌又は真核細胞を形質転換することができることが理
解されるべきである。Ｅ．コリの株、たとえばAmerican
Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA
（受託番号３１３４３）又は市販源（Stratagene）か
ら入手できるＤＨ５α株が典型的には使用され得る。好
ましい真核宿主細胞は、酵母細胞を包含するが、但し哺
乳類細胞又は昆虫細胞もまた、効果的に使用され得る。
【０１０９】本発明の組換え発現ベクターは好ましく
は、実質的に均質の細胞培養物の１又は複数の宿主細胞
を形質転換し又はトランスフェクトする。発現ベクター
は一般的に、次の既知技法に従って、宿主細胞中に導入
される：たとえばプロトプラスト形質転換、リン酸カル
シウム沈殿、塩化カルシウム処理、マイクロインジェク
ション、エレクトロポレーション、組換えされたウィル
スとの接触によるトランスフェクション、リポソーム仲
介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントラ
ンスフェクション、トランスダクション、接合、又はマ
イクロプロジェクティル衝撃。形質転換体の選択は、標
準の方法、たとえば選択マーカー、たとえば上記のよう
に、組換えベクターと関連する耐抗生物質性を発現する
細胞についての選択により実施され得る。
【０１１０】発現ベクターが宿主細胞中に導入されると
すぐに、宿主細胞染色体における又はエピソームにおけ
る、ａｖｅＲ１−，ａｖｅＲ２−、又はａｖｅＲ１／ａ
ｖｅＲ２−関連コード配列の組込み及び維持が、標準技
法、たとえばサザンハイブリダイゼーション分析、制限
酵素分析、ＰＣＲ分析、たとえば逆転写酵素ＰＣＲ（ｒ
ｔ−ＰＣＲ）、又は予測される遺伝子生成物を検出する
ための免疫学的アッセイにより確かめられ得る。
【０１１１】組換えａｖｅＲ１−，ａｖｅＲ２−又はａ
ｖｅＲ１／ａｖｅＲ２−関連コード配列を含み、そして
／又は発現する宿主細胞が、当業界において良く知られ
ている次の少なくとも４種の一般的アプローチのいづれ
かにより同定され得る：（ｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮＡ
−ＲＮＡ、又はＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダ
イゼーション；（ii）“マーカー”遺伝子機能の存在の
検出；（iii) 宿主細胞におけるａｖｅＲ１−又はａｖ
ｅＲ２−特異的ｍＲＮＡ転写体の発現により測定される
ような転写のレベルの評価；及び（iv）たとえばイムノ
アッセイにより、又はＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２生物学
的活性の存在により測定されるような成熟ポリペプチド
生成物の存在の検出。
【０１１２】組換えａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生
成物の発現及び特徴化 ａｖｅＲ１−，ａｖｅＲ２−、又はａｖｅＲ１／ａｖｅ
Ｒ２−関連コード配列が適切な宿主細胞中に安定して導
入されると、形質転換された細胞宿主がクローン的に増
殖され、そしてその得られる細胞が、ａｖｅＲ１−、及
び／又はａｖｅＲ２−関連遺伝子生成物の最大生成の助
けとなる条件下で増殖せしめられる。そのような条件は
典型的には、細胞の高密度への増殖を包含する。発現ベ
クターが誘発性プロモーターを含んで成る場合、適切な
誘発条件、たとえば温度シフト、栄養物の消耗、必要の
ない誘発物質（たとえば、炭水化物の類似体、たとえば
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰ
ＴＧ））の添加、過剰の副生成物の蓄積、又は同様のこ
とが、発現を誘発する必要がある場合に使用される。
【０１１３】発現されたａｖｅＲ１−及び／又はａｖｅ
Ｒ２−関連遺伝子生成物が宿主細胞内に保持される場
合、細胞は収穫され、そして溶解され、そして生成物
が、タンパク質分解を最少にするために当業界において
知られている抽出条件、たとえば４℃で、又はプロテア
ーゼインヒビターの存在下で、又は両者において、前記
溶解物から単離され、そして精製される。発現されたａ
ｖｅＲ１及び／又はａｖｅＲ２遺伝子生成物が宿主細胞
から分泌される場合、消耗された栄養培地が単純に集め
られ、そして生成物がそれから単離される。
【０１１４】発現されたａｖｅＲ１−及び／又はａｖｅ
Ｒ２−関連遺伝子生成物は、次の標準方法を用いて、細
胞溶解物又は培養培地から適切なように、単離され、又
は実質的に精製され得る：たとえば次の方法のいづれか
の組合せ（但し、それらだけには限定されない）：硫酸
アンモニウム沈殿、サイズ分別、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ＨＰＬＣ、密度遠心分離、及びアフィニティ
ークロマトグラフィー。発現されたａｖｅＲ１−及び／
又はａｖｅＲ２−関連遺伝子生成物が生物学的活性を示
す場合、調製物の上昇する純度が、適切なアッセイの使
用により精製工程の個々の段階でモニターされ得る。発
現されたａｖｅＲ１−及び／又はａｖｅＲ２−関連遺伝
子生成物が生物学的活性を示すか、又は示さないにかか
わらず、個々は、たとえばサイズ、又はＡｖｅＲ１又は
ＡｖｅＲ２に対して特異的な抗体との反応性に基づい
て、又は融合標識の存在により検出され得る。
【０１１５】従って、本発明は、本発明のポリヌクレオ
チド分子によりコードされる、実質的に精製され、又は
単離されたポリペプチドを供給する。非限定的である
が、特定の態様においては、ポリペプチドは、配列番号
２のアミノ酸配列を含んで成るＳ．アベルミチリスから
のａｖｅＲ１遺伝子生成物である。非限定的であるが、
特定のもう１つの態様においては、ポリペプチドは、配
列番号４のアミノ酸配列を含んで成るＳ．アベルミチリ
スからのａｖｅＲ２遺伝子生成物である。本発明はさら
に、本発明のａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物の
いづれかに対して相同である、実質的に精製され、又は
単離されたポリペプチドを供給する。
【０１１６】本発明はさらに、本発明のａｖｅＲ１又は
ａｖｅＲ２遺伝子生成物又は相同ポリペプチドのペプチ
ドフラグメントを供給する。本発明の実質的に精製さ
れ、又は単離されたポリペプチドは、種々の目的、たと
えばａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物機能を変更
する化合物についてスクリーンし、それにより、アベル
メクチン生合成を調節するために、及びａｖｅＲ１又は
ａｖｅＲ２遺伝子生成物に対して向けられた抗体を生ぜ
しめるために有用である。
【０１１７】本明細書において使用される場合、ポリペ
プチドは、そのポリペプチドが特定の調製物において材
料の重量の大部分を構成する場合、“実質的に精製され
ている”。また、本明細書において使用される場合、ポ
リペプチドは、そのポリペプチドが特定の調製物におい
て少なくとも約９０重量％の材料を構成する場合、“単
離されている”。
【０１１８】本発明はさらに、実質的に精製され又は単
離されたａｖｅＲ１遺伝子生成物、ａｖｅＲ２遺伝子生
成物、相同ポリペプチド又はペプチドフラグメントの調
製方法を提供し、ここで前記方法は、それぞれ、ａｖｅ
Ｒ１遺伝子生成物、ａｖｅＲ２遺伝子生成物、相同ポリ
ペプチド、又はペプチドフラグメントをコードする、１
又は複数の調節要素と操作的に関連して存在するヌクレ
オチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を含んで
成る組換え発現ベクターにより、特定の遺伝子生成物、
ポリペプチド、又はペプチドフラグメントの発現の助け
となる条件下で、形質転換され、又はトランスフェクト
された宿主細胞を培養し、そして実質的に精製され、又
は単離された形で、細胞培養物から、発現された遺伝子
生成物、ポリペプチド、又はペプチドフラグメントを回
収することを含んで成る。
【０１１９】十分な純度のａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺
伝子生成物が得られると、それは、標準の方法、たとえ
ばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、
アミノ酸配列分析、アベルメクチン生合成路における適
切な生成物の生成における生物学的活性、等により特徴
づけられ得る。たとえば、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺
伝子生成物のアミノ酸配列は、標準のペプチド配列決定
技法を用いて決定され得る。ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２
遺伝子生成物はさらに、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝
子生成物の疎水性及び親水性領域を同定するために、親
水性分析（たとえば、Hopp and Woods, 1981, Proc.Nat
l.Acad.Sci. USA 78: 3824を参照のこと）、又は類似ソ
フトウェアアルゴリズムを用いて特徴づけられ得る。
【０１２０】構造分析は、特定の二次構造体を想定す
る、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物の領域を同
定するために実施され得る。生物理学的方法、たとえば
Ｘ線結晶学（Engstrom, 1974, Biochem.Exp.Biol. 11:
7 〜13）、コンピューターモデリング（Fletterick and
Zoller (eds), 1986, Current Communications in Mo
lecular Biology , Cold Spring Harbor Laboratory, C
old Spring Harbor, NY）、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）
が、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物とそれらの
基質との間の相互作用の部位をマッピングし、そして研
究するために使用され得る。それらの研究から得られる
情報は、より所望するアベルメクチン生成特徴を有する
ストレプトミセスの新規株の開発を助けるために、ａｖ
ｅＲ１又はａｖｅＲ２のＯＲＦにおける突然変異のため
の新規部位を選択するために使用され得る。
【０１２１】ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２変異体の構成 本発明はさらに、遺伝子構造体、たとえば遺伝子置換ベ
クターを包含する、ストレプトミセスの種又は株の細胞
を遺伝子的に修飾するための組成物及び方法を提供す
る。好ましい態様においては、ストレプトミセスの種又
は株の細胞は、修飾されていない種又は株の細胞により
生成されるアベルメクチンの量とは検出できるほど異な
っている多量のアベルメクチンを生成するために遺伝子
的に修飾される。
【０１２２】より好ましい態様においては、Ｓ．アベル
ミチリスの株の細胞が、修飾されていない同じ株の細胞
により生成されるアベルメクチンの量に比較して、検出
できるほど高められた量のアベルメクチンを生成するよ
う遺伝子的に修飾される。本発明によれば、そのような
遺伝子修飾は好ましくは、ａｖｅＲ１遺伝子、ａｖｅＲ
２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺
伝子の両方を突然変異誘発することを含んで成り、ここ
でそのような突然変異は、遺伝子突然変異を担持しない
同じ株の細胞に比較して、遺伝子突然変異を担持する
Ｓ．アベルミチリスの株の細胞により生成されるアベル
メクチンの量の検出できる上昇をもたらす。
【０１２３】本発明によれば、突然変異は、ａｖｅＲ１
遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖ
ｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者中に、現在知られて
いるか、又は未来において開発されるいづれかの技法を
用いて導入され得る。たとえば、ランダム突然変異誘発
は、標準の突然変異誘発技法、たとえば紫外線又はＸ−
線、又は化学的突然変異誘発物質、たとえばＮ−メチル
−Ｎ′−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネー
ト、亜硝酸、又は窒素マスタードにストレプトミセス細
胞を暴露し、そして次にａｖｅＲ１及び／又はａｖｅＲ
２遺伝子における１又は複数の突然変異の結果として、
検出できるほど高められたアベルメクチン生成を示す細
胞を選択する技法を用いて実施され得る。たとえば、突
然変異誘発技法の総説としては、Ausubel, 1989 、上記
を参照のこと。
【０１２４】他方では、ａｖｅＲ１もしくはａｖｅＲ２
遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者に
対する突然変異は、種々の既知の組換え方法のいづれ
か、たとえばエラー傾向ＰＣＲ又はカセット突然変異誘
発を用いて、特定部位態様で実施され得る。たとえば、
相同組換えを利用する特定部位の突然変異誘発は、１又
は複数の突然変異をそれらの遺伝子中に特異的に導入す
るために、ａｖｅＲ１もしくはａｖｅＲ２のＯＲＦのい
づれか、又はフランキング配列、又はａｖｅＲ１及びａ
ｖｅＲ２のＯＲＦの両者、又はフランキング配列を特異
的に変更するために利用され得る。さらに、ランダム断
片化、突然変異誘発の反復されたサイクル、及びヌクレ
オチドシャフリング（nucleotide shuffling）を包含す
る、アメリカ特許第５，６０５，７９３号に記載される
方法は、ａｖｅＲ１及び／又はａｖｅＲ２突然変異をコ
ードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分
子の大きなライブラリーを生成するために使用され得
る。
【０１２５】本発明の実施において有用である、ａｖｅ
Ｒ１もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａ
ｖｅＲ２遺伝子の両者に対する突然変異は、ａｖｅＲ１
遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ
１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者、又はフランキング領域
における１又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、又は
置換、又はそれらのいくつかの組合せを包含し、そして
それは、遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセス
の同じ種又は株の細胞に比較して、所望する結果、すな
わち遺伝子突然変異を担持するストレプトミセスの株の
細胞により生成されるアベルメクチンの量の検出できる
上昇性をもたらす。
【０１２６】そのような突然変異は、１又は複数の新規
制限部位、終結コドン又はフレームシフトを、ＯＲＦ配
列のいづれか又は両者中に、又は遺伝子転写に関与する
フランキング調節領域中に導入するよう作用することが
できる。他の有用な突然変異は、ａｖｅＲ１及びａｖｅ
Ｒ２遺伝子のいづれか又は両者中に異なった又は異種ヌ
クレオチド配列を挿入し；又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ
２遺伝子のいづれか又は両者のすべて又は一部を欠失
し；又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子のいづれか又
は両者のすべて又は一部を、異なった又は異種ヌクレオ
チド配列により置換し；そして所望する結果、すなわち
遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセスの同じ種
又は株の細胞に比較して、遺伝子突然変異を担持するス
トレプトミセスの種又は株の細胞により生成されるアベ
ルメクチンの量の検出できる上昇性をもたらす突然変異
を包含する。
【０１２７】部位特定突然変異は、特に、それらが、ａ
ｖｅＲ１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物のいづれか、又は
ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物の両者における
１又は複数の保存されたアミノ酸残基を変更するよう作
用する場合に有用である。たとえば、図１Ａ及び１Ｂに
示されるように、Ｓ．コエリカラーからの類似する遺伝
子生成物と、Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１及び
ａｖｅＲ２遺伝子生成物との推定されるアミノ酸配列の
比較は、それらの種間のアミノ酸残基の有意な保存性の
部位を示す。１又は複数のそれらの保存されたアミノ酸
残基を欠失するか又は非保存的に置換する特定部位の突
然変異誘発は、アベルメクチン生成において所望する変
更を示す新規変異体株の生成において特に効果的であ
る。
【０１２８】好ましい態様においては、１又は複数の突
然変異は、本発明により供給される遺伝子構造体、たと
えば遺伝子置換ベクターを用いて、ａｖｅＲ１又はａｖ
ｅＲ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ
２遺伝子の両者中に、相同組換えにより導入される。
【０１２９】前記遺伝子構造体は、完全なａｖｅＲ１の
ＯＲＦ又はその相同ポリヌクレオチド分子、又はその実
質的な部分；又は完全なａｖｅＲ２のＯＲＦ又はその相
同ポリヌクレオチド分子、又はその実質的な部分；又は
完全なａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦの両者又はそ
の相同ポリヌクレオチド分子、又はその実質的な部分；
又はＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦ又はａｖ
ｅＲ２のＯＲＦのいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅ
Ｒ２のＯＲＦの両者を天然において端に有するヌクレオ
チド配列；又はそれらの組合せを含んで成り；そして前
記遺伝子構造体は、遺伝子突然変異を担持しない同じ種
又は株の細胞に比較して、前記遺伝子突然変異を担持す
るストレプトミセスの種又は株の細胞により生成される
アベルメクチンの量の検出できる上昇性をもたらす突然
変異を、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子の
いづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者
中に導入するために使用され得る。
【０１３０】非制限的であるが特定の態様において、本
発明の実施に使用するための遺伝子構造体は、Ｓ．アベ
ルミチリスからのａｖｅＲ１のＯＲＦもしくはａｖｅＲ
２のＯＲＦのいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２
のＯＲＦの両者、又はそれらの実質的な部分のヌクレオ
チド配列と同じであるヌクレオチド配列を含んで成り、
そしてさらに、１又は複数の突然変異、すなわち１又は
複数のヌクレオチド欠失、挿入、置換又はそれらの組合
せを含んで成るプラスミドであり、ここで前記プラスミ
ドは、前記突然変異を担持するストレプトミセスの種又
は株の細胞により生成されるアベルメクチンの量が、前
記遺伝子突然変異を担持しない同じ種又は株の細胞に比
較して、検出できるほど高められるよう、それぞれ、ａ
ｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又は
ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の活性又は生物
学的機能を破壊し又は変更するために、又はそれぞれ、
ａｖｅＲ１遺伝子生成物又はａｖｅＲ２遺伝子生成物の
いづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物
の両者の活性又は生物学的機能を破壊し、又は変更する
ために、ストレプトミセスの細胞を形質転換し、そして
それにより、突然変異を、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅ
Ｒ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２
遺伝子の両者中に導入するために使用され得る。そのよ
うなプラスミドは、好ましくは、さらに、選択マーカー
を含んで成る。
【０１３１】ストレプトミセスの宿主細胞の形質転換に
続いてすぐに、遺伝子構造体のポリヌクレオチド分子
は、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれ
か、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者に相同
組換えにより特異的に標的化され、そしてａｖｅＲ１遺
伝子又はその一部、又はａｖｅＲ２遺伝子又はその一
部、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者又はそ
れらの一部を置換し、又はａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅ
Ｒ２遺伝子中に挿入する。
【０１３２】この組換え現象の結果として、宿主細胞の
ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又
はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者、又はそれに
よりコードされる遺伝子生成物が、部分的に又は完全に
無能される。形質転換された細胞は、好ましくは、遺伝
子構造体における選択マーカーの存在を利用することに
よって選択され、そして形質転換されていない株の細胞
に比較して、検出できるほど高められた量のアベルメク
チンを生成するそれらの細胞について、標準の技法、た
とえば下記の実施例の（６）に記載されるそれらの技法
によりスクリーンされる。
【０１３３】下記実施例の（９−１）に例示される、非
制限的であるが特定の態様においては、遺伝子置換ベク
ターが、異種ヌクレオチド配列（ｅｒｍＥ）により個々
の遺伝子のＯＲＦの一部を選択することによって、ａｖ
ｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者を破壊するために使
用された。下記実施例の（９−２）に例示される、非限
定的であるが特定のもう１つの態様においては、遺伝子
置換ベクターが、ａｖｅＲ２のＯＲＦ中に異種ヌクレオ
チド配列（ｅｒｍＥ）を挿入することによって、ａｖｅ
Ｒ２遺伝子を破壊するために使用された。
【０１３４】それらの遺伝子置換ベクターの個々は、
Ｓ．アベルミチリスの種の細胞を別々に形質転換し、そ
して相同組換えにより染色体中に組込まれた。それらの
新規ストレプトミセス形質転換体の個々の発酵分析は、
それらの遺伝子突然変異のいづれも担持しない株の細胞
に比較して、それらの遺伝子突然変異を担持する細胞に
より生成されるアベルメクチンの量の有意な上昇性を示
す。
【０１３５】本発明はさらに、遺伝子突然変異を担持し
ないストレプトミセスの種又は株の細胞に比較して、遺
伝子突然変異を担持するストレプトミセスの種又は株の
細胞により生成されるアベルメクチンの量を検出できる
ほど高めることができる、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａ
ｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子
の両者の突然変異を同定するための方法を提供し、ここ
で前記方法は、（ａ）ストレプトミセスの種又は株の細
胞により生成されるアベルメクチンの量を測定し；
（ｂ）段階（ａ）のストレプトミセスの種又は株の細胞
の、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子中に、又は
ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者中に突然変異を
導入し；そして（ｃ）遺伝子突然変異を担持しない段階
（ａ）の細胞により生成されるアベルメクチンの量に、
段階（ｂ）において生成されるような遺伝子突然変異を
担持する細胞により生成されるアベルメクチンの量を比
較することを含んで成り；段階（ｂ）において生成され
るような遺伝子突然変異を担持する細胞により生成され
るアベルメクチンの量が遺伝子突然変異を担持しない段
階（ａ）の細胞により生成されるアベルメクチンの量よ
りも検出できるほど高い場合、生成されるアベルメクチ
ンの量を検出できるほど高めることができる、ａｖｅＲ
１又はａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ
２遺伝子の突然変異が同定されることを特徴とする。好
ましい態様では、ストレプトミセスの種は、Ｓ．アベル
ミチリスである。
【０１３６】本発明はさらに、ストレプトミセスの種又
は株の修飾されていない細胞に比較して、検出できるほ
ど高められた量のアベルメクチンを生成する、同じ種又
は株からの遺伝子的に修飾された細胞の調製方法を提供
し、ここで前記方法は、ストレプトミセスの種又は株の
細胞におけるストレプトミセスのａｖｅＲ１遺伝子もし
くはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２
遺伝子の両者を突然変異誘発し、そして遺伝子突然変異
を担持しないストレプトミセスの種又は株の細胞に比較
して、検出できるほど高められた量のアベルメクチンを
生成する突然変異誘発された細胞を選択することを含ん
で成る。好ましい態様において、ストレプトミセスの種
は、Ｓ．アベルミチリスである。
【０１３７】本発明はさらに、ストレプトミセスの新規
株を提供し、その細胞は、遺伝子突然変異を担持しない
ストレプトミセスの種又は株の細胞に比較して、ａｖｅ
Ｒ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子への、又はａｖｅＲ１
及びａｖｅＲ２遺伝子の両者への１又は複数の突然変異
の結果として、検出できるほどに高められた量のアベル
メクチンを生成する。好ましい態様において、ストレプ
トミセスの種は、Ｓ．アベルミチリスである。本発明の
新規株は、アベルメクチン、たとえば商業的に所望のド
ラメクチンの大規模生成において有用である。
【０１３８】本発明はさらに、ストレプトミセスの培養
により生成される高められた量のアベルメクチンを生成
するための方法に関し、ここで遺伝子突然変異を担持し
ない種又は株の細胞に比較して、遺伝子突然変異を担持
するストレプトミセスの種又は株の細胞により生成され
るアベルメクチンの量を検出できるほど高めるよう作用
する、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子、又はａ
ｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者における突然変異
を含んで成る、ストレプトミセスの種又は株の細胞を、
それからアベルメクチンの生成を可能にし又は誘発する
条件下で、培養培地において培養し、そしてその培養物
からアベルメクチンを回収することを含んで成る。好ま
しい態様においては、ストレプトミセスの種は、Ｓ．ア
ベルミチリスである。この方法は、アベルメクチンの生
成効率を高めるために有用である。
【０１３９】アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリポ
ザイム また、本発明の範囲内に、ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ２
ｍＲＮＡの翻訳を退化せしめ、そして／又は阻害するた
めに結合機能する、アンチセンスオリゴヌクレオチド、
ホスホロチオエート及びリボザイムを包含するオリゴヌ
クレオチド配列が存在する。
【０１４０】アンチセンスオリゴヌクレオチド、たとえ
ばアンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子
は、標的化されたｍＲＮＡに結合し、そしてタンパク質
翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接的に
阻害するよう作用する。たとえば、ＡｖｅＲ１又はＡｖ
ｅＲ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のユニーク
領域に対して相補的な、少なくとも約１５個の塩基のア
ンチセンスオリゴヌクレオチドが、たとえば従来のホス
ホジエステル技法により合成され得る。
【０１４１】リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒
することができる酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイム
作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の
配列特異的ハイブリダイゼーション、続くエンドヌクレ
オライティク分解を包含する。ａｖｅＲ１又はａｖｅＲ
２ ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレオライティク分解を特
異的に且つ効率良く触媒する構築されたハンマーヘッド
モチーフリボゾーム分子もまた、本発明の範囲内であ
る。
【０１４２】いづれかの可能性あるＲＮＡ標的物内の特
定のリボザイム切断部位は、次の配列、ＧＵＡ，ＧＵＵ
及びＧＵＣを包含するリボザイム切断部位について標的
分子を走査することによって最初同定される。同定され
るとすぐに、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応す
る約１５〜２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列
が、予測される構造特徴、たとえばオリゴヌクレオチド
配列を不適切にする二次構造について評価され得る。候
補体標的物の適合性がまた、たとえばリボヌクレアーゼ
保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとの
ハイブリダイゼーションへのそれらの接近性を試験する
ことによって評価され得る。
【０１４３】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
及びリボザイムの両者は、既知方法により調製され得
る。それらは、たとえば固相ホスホアミット化学合成に
よる化学合成のための技法を包含する。他方では、アン
チセンスＲＮＡ分子は、そのＲＮＡ分子をコードするＤ
ＮＡ配列のインビトロ又はインビボ転写により生成され
得る。そのようなＤＮＡ配列は、適切なＲＮＡポリメラ
ーゼプロモーター、たとえばＴ７又はＳＰ６ポリメラー
ゼプロモーターを組込む広範囲の種類のベクター中に組
込まれ得る。
【０１４４】本発明のオリゴヌクレオチドの種々の修飾
が、高まる細胞内安定性及び半減期の手段として導入さ
れ得る。可能な修飾は、次のものを包含するが、但しそ
れらだけには限定されない：分子の５′及び／又は３′
端へのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド
のフランキング配列の付加、又はオリゴヌクレオチド主
鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖よりもむしろホスホロ
チオエート又は２′−Ｏ−メチルの使用。
【０１４５】抗体 本発明はさらに、ａｖｅＲ１遺伝子生成物、ａｖｅＲ２
遺伝子生成物、又は相同ポリペプチド、又はペプチドフ
ラグメントに結合するポリクローナル及びモノクローナ
ル抗体を提供する。そのような抗体は、生来のａｖｅＲ
１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物を精製し、又はａｖｅＲ
１又はａｖｅＲ２遺伝子生成物の活性又は生物学的機能
を分析するために親和性試薬として使用され得る。
【０１４６】抗体は、本発明のａｖｅＲ１−又はａｖｅ
Ｒ２−関連ポリペプチドのいづれかに対して生ぜしめら
れ得る。種々の宿主動物、たとえば牛、馬、ウサギ、ヤ
ギ、羊及びマウス（但し、それらだけには限定されな
い）が、抗−ＡｖｅＲ１又は抗−ＡｖｅＲ２−特異的抗
体を生成するために既知の方法に従って使用され得る。
当業界において知られている種々のアジュバントが抗体
生成を増強するために使用され得る。
【０１４７】ポリクローナル抗体は、免疫化された動物
から得られ、そして標準の技法を用いて、抗−ＡｖｅＲ
１又は抗−ＡｖｅＲ２特異性について試験され得る。他
方で、ＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２ポリペプチドに対する
モノクローナル抗体は、培養における連続細胞系による
抗体的の生成を提供するいづれかの技法を用いて調製さ
れ得る。
【０１４８】それらは、Kohler and Milstein (Nature,
1975, 256: 495-497 ）により最初に記載されるハイブ
リドーマ技法；ヒトβ−細胞ハイブリドーマ技法（Kosb
or、など., 1983, Immunology Today 4: 72; Cote,な
ど., 1983, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80: 2026-203
0）；及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Cole、など.,
1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, A
lan R.Liss, Inc., pp.77-96 ）を包含するが、但し、
それらだけには限定されない。他方では、一本鎖抗体の
生成のために記載される技法（例えば、アメリカ特許第
４，９４６，７７８号を参照のこと）は、ＡｖｅＲ１−
又はＡｖｅＲ２−特異的一本鎖抗体を生成するために適
合され得る。それらの出版物は、引用により本明細書中
に組込まれる。
【０１４９】ＡｖｅＲ１又はＡｖｅＲ２ポリペプチドの
ための特異的結合部位を含む抗体フラグメントもまた、
本発明内に包含され、そして既知の技法により生成され
得る。そのようなフラグメントは、損なわれていない抗
体分子のペプシン消化により生成され得るＦ（ａｂ′）
2 、及びＦ（ａｂ′）2 フラグメントのジスルフィド架
橋を還元することによって生成され得るＦａｂフラグメ
ントを包含するが、但し、それらだけには限定されな
い。他方では、Ｆａｂ発現ライブラリーが、ＡｖｅＲ１
又はＡｖｅＲ２ポリペプチドに対する所望する特異性を
有するＦａｂフラグメントの急速な同定を可能にするた
めに構成され得る（Huseなど., 1989, Science 246: 12
75〜1281）。
【０１５０】モノクローナル抗体及び抗体フラグメント
の生成のための技法は、当業界において良く知られてお
り、そしてさらに、中でも次の文献に記載されている：
Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratorg M
anual , Cold Spring HarborLaboratory ；及びJ.W.God
ing, 1986, Monoclonal Antibodies: Principles and P
ractice, Academic Press, London. 上記すべての出版
物は、引用により本明細書中に組込まれる。
【０１５１】アベルメクチンの使用 アベルメクチンは、駆虫剤、外部駆虫剤、殺昆虫剤及び
ダニ駆虫剤としての特別な利用性を有する高い活性の抗
寄生虫剤であり、そして本発明の組成物及び方法を用い
て調製されるアベルメクチンはそれらの目的のいづれか
のために有用である。本発明に従って調製されるアベル
メクチンは、ヒトにおける種々の疾病又は病状を処理す
るために、特に、それらの疾病又は病状が当業界におい
て知られているような、寄生体感染により引き起こされ
る場合に有用である。たとえば、Ikeda and Omura, 199
7, Chem.Rev. 97 (7): 2591-2609を参照のこと。
【０１５２】本発明に従って調製されるアベルメクチン
は、内部寄生体により引き起こされる種々の病状、たと
えば寄生線虫のグループにより最とも頻繁に引き起こさ
れ、そしてヒトにおいて疾病を引き起こし、そしてブ
タ、羊、家禽類、馬及び牛において重度の経済的損失を
引き起こし、そして家畜の健康に影響を及ぼす蠕虫病の
処理において効果的である。
【０１５３】従って、本発明に従って調製されたアベル
メクチンは、ヒトに影響を及ぼす線虫、及び種々の動物
種に影響を及ぼす線虫、たとえば犬におけるジロフィラ
リア（Dirofilaria ）、ヒトに感染する種々の寄生体、
たとえば胃腸寄生体、たとえばアンシロストマ（Ancylo
stoma ）、ネカトル（Necator ）、アスカリス（Ascari
s ）、ストロンギロイデス（Strongyloides ）、トリン
キネラ（Trinchinella）、カピラリア（Capillaria）、
トリクリス（Trichuris ）、エンテロビウス（Enterobi
us）、及び血液又は他の組織又は器官に見出される寄生
体、たとえばフィラリア、及びストロンギロイデス及び
トリンキネラの腸寄生状態に対して効果的である。
【０１５４】本発明に従って調製されたアベルメクチン
はまた、外部寄生体感染、たとえばマダニ、ダニ、シラ
ミ、ノミ、ハエ、昆虫、又は牛及び馬に影響を及ぼす移
動性双翅類幼虫により引き起こされる、哺乳類及び鳥類
の節足動物侵入の処理においても有用である。本発明に
従って調製されたアベルメクチンはまた、日常の害虫、
たとえばゴキブリ、蛾、甲虫類及びハエ、並びにクモ、
ダニ、アリマキ、イモムシ、及び直翅類、たとえば中で
も、バッタに対する殺昆虫剤としても有用である。本発
明のアベルメクチンにより処理され得る動物は、羊、
牛、馬、シカ、ヤギ、ブタ、鳥、たとえば家禽、及び犬
及びネコを包含する。
【０１５５】本発明に従って調製されたアベルメクチン
は、特定の意図された使用に適切な配合物に投入され、
特定種の宿主動物及び関与する寄生体又は昆虫が処理さ
れる。駆虫剤としての使用のためには、本発明のアベル
メクチンは、カプセル、ボーラス、錠剤又は液体飲薬の
形で経口投与され得、又は他方では、注入物として、注
射により、又は移植物として投与され得る。そのような
配合物は、標準の獣医学的実施に従って、従来の態様で
調製される。
【０１５６】従って、カプセル、ボーラス又は錠剤は、
活性成物を、適切な細かく分割された希釈剤又はキャリ
ヤー、さらに、砕解剤及び／又は結合剤、たとえばスタ
ーチ、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウ
ム、等と共に混合することによって調製され得る。飲薬
配合物は、分散又は湿潤剤、等と共に水溶液において活
性成分を分散することによって調製され得る。注射用配
合物は、血液と等張の溶液を製造するために、他の物
質、たとえば十分な塩及び／又はグルコースを含むこと
ができる無菌溶液の形で調製され得る。
【０１５７】そのような配合物は、患者、又は処理され
るべき宿主動物の種類、感染の重症度及び型、及び宿主
の体重に依存して、活性化合物の重量に関して変化する
であろう。一般的に、経口投与のためには、１〜５日
間、一回の用量として又は分割された用量で与えられ
る、患者又は動物体重１kg当たり約０．００１〜１０mg
の活性化合物の用量が満足のいくものであろう。しかし
ながら、より高いか又はより低い投与量範囲が、たとえ
ば医者又は獣医により決定されるように、臨床学的徴候
に基づいて示される場合が存在する。
【０１５８】他の選択として、本発明に従って調製され
たアベルメクチンは、動物飼料と組合して投与され得、
そしてこの目的のためには、濃縮された飼料添加剤又は
プレミックスが、通常の動物用飼料と共に混合するため
に調製され得る。殺昆虫剤としての使用のためには、及
び、農業用害虫を処理するためには、本発明の化合物
は、標準の農業実施に従って、噴霧、微粉、エマルジョ
ン、及び同様のものとして適用され得る。次の例は単な
る例示であって、本発明の範囲を限定するものではな
い。
【０１５９】
【実施例】実施例：ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の
単離 この例は、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子生成物をコ
ードし、そしてアベルメクチン生合成の調節に関与する
２種の新規Ｓ．アベルミチリス遺伝子の単離及び特徴化
を記載する。
【０１６０】（１）ＤＮＡ単離のためにＳ．アベルミチ
リスの増殖 Ｓ．アベルミチリスＡＴＣＣ ３１２７２の単一コロニ
ー（単一コロニー単離物＃２）を、次のものを含む１／
２強さのＹＰＤ−６培地上で単離した：Ｄｉｆｃｏ酵母
抽出物−５ｇ；Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ−ペプトン−５
ｇ；デキストロース−２，５ｇ；ＭＯＰＳ−５ｇ；Ｄｉ
ｆｃｏ Ｂａｃｔｏ寒天−１５ｇ。最終体積をｄＨ2 Ｏ
により１ｌに調整し、pHを７．０に調節し、そして培地
を１２１℃で２５分間、オートクレーブ処理した。上記
培地において増殖される菌糸体を用いて、２８℃で４８
〜７２時間、振盪しながら（３０００rpm ）、維持され
る２５mm×１５０mmの管における１０mlのＴＳＢ培地
（１２１℃で２５分間、オートクレーブ処理された、１
ｌのｄＨ2 Ｏ中、Difco Tryptic Soy Broth ）を接種し
た。
【０１６１】（２）Ｓ．アベルミチリスからの染色体Ｄ
ＮＡ単離 上記の増殖された菌糸体のアリコート（０．２５ml又は
０．５ml）を、１．５mlの微小遠心分離管に配置し、そ
して細胞を、１２，０００×ｇでの６０秒間の遠心分離
により濃縮した。上清液を捨て、そして細胞を、２mg／
mlのリゾチームを含む０．２５mlのＴＳＥ緩衝液（１．
５mMのスクロース２０ml、１ＭのトリスＨＣｌ ２．５
ml、pH８．０、１ＭのＥＤＴＡ ２．５ml、pH８．０及
びｄＨ2Ｏ ７５ml）。サンプルを、３７℃で２０分
間、振盪しながら、インキュベートし、ＡｕｔｏＧｅｎ
５４０TM自動核酸単離装置（Integrated Separation
Systems, Natick, MA ）中に負荷し、そしてゲノムＤＮ
Ａを、製造業者の説明に従って、Ｃｙｃｌｅ１５９（装
備ソフトウェア）を用いて単離した。
【０１６２】他方では、菌糸体５mlを、１７mm×１００
mmの管に配置し、細胞を３，０００rpm での５分間の遠
心分離により濃縮し、そして上清液を除いた。細胞を１
mlのＴＳＥ緩衝液に再懸濁し、３，０００rpm での５分
間の遠心分離により濃縮し、そして上清液を除いた。細
胞を、２mg／mlのリゾチームを含む１mlのＴＳＥ緩衝液
に再懸濁し、そして振盪しながら、３７℃で３０〜６０
分間インキュベートした。インキュベーションの後、１
０％のＳＤＳ ０．５mlを添加し、そして細胞を；溶解
が完結するまで、３７℃でインキュベートした。
【０１６３】溶解物を６５℃で１０分間インキュベート
し、室温に冷却し、２つの１．５mlのＥｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ管に分け、そして０．５mlのフェノール／クロロホル
ム（０．５Ｍのトリス（pH８．０）により前もって平衡
化された５０％フェノール；５０％クロロホルム）によ
り１度抽出した。水性相を除き、そして２〜５回、クロ
ロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）により抽
出した。
【０１６４】ＤＮＡを、１／１０体積の３Ｍの酢酸ナト
リウム（pH４．８）を添加し、その混合物を氷上で１０
分間インキュベートし、前記混合物を１５，０００rpm
で１０分間５℃で遠心分離し、そして１体積のイソプロ
パノールが添加されている清浄した管に前記上清液を移
すことによって沈殿せしめた。次に、前記混合物を氷上
で２０分間インキュベートし、１５，０００rpm で２０
分間、５℃で遠心分離し、上清液を除き、そしてＤＮＡ
ペレットを７０％エタノールにより１度洗浄した。ペレ
ットを乾燥した後、ＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０mMのトリ
ス、１mMのＥＤＴＡ、pH８．０）に再懸濁した。
【０１６５】（３）Ｓ．アベルミチリスからのプラスミ
ドＤＮＡの単離 菌糸体のアリコート（１．０ml）を、１．５mlの微小遠
心分離管に配置し、そして細胞を、１２，０００×ｇで
の６０秒間の遠心分離により濃縮した。上清液を捨て、
細胞を１０．３％のスクロース１．０mlに再懸濁し、そ
して１２，０００×ｇでの６０秒間の遠心分離により濃
縮し、そして上清液を捨てた。次に、細胞を、２mg／ml
のリゾチームを含む０．２５mlのＴＳＥ緩衝液に再懸濁
し、３７℃で２０分間、振盪しながらインキュベート
し、そしてＡｕｔｏＧｅｎ ５４０ TM自動核酸単離装置
中に負荷した。プラスミドＤＮＡを、製造業者の説明に
従って、Ｃｙｃｌｅ１０６（装備ソフトウェア）を用い
て単離した。
【０１６６】他方では、菌糸体１．５mlを、１．５mlの
微小遠心分離管に配置し、そして細胞を１２，０００×
ｇでの６０秒間の遠心分離により濃縮した。上清液を捨
て、細胞を１０．３％のスクロース１．０mlに再懸濁
し、そして１２，０００×ｇでの６０秒間の遠心分離に
より濃縮した。細胞を、２mg／mlのリゾチームを含む
０．５mlのＴＳＥ緩衝液に再懸濁し、そして３７℃で１
５〜３０分間インキュベートした。インキュベーション
の後、０．２５mlのアルカリ性ＳＤＳ（０．３ＮのＮａ
ＯＨ、２％のＳＤＳ）を添加し、そして細胞を５５℃で
１５〜３０分間、又は溶液が透明になるまで、インキュ
ベートした。次に、酢酸ナトリウム（０．１ml、３Ｍ、
pH４．８）を、ＤＮＡ溶液に添加し、それを氷上で１０
分間インキュベートした。
【０１６７】ＤＮＡサンプルを、１４，０００rpm で１
０分間５℃で遠心分離した。上清液を清浄した管に移
し、そして０．２mlのフェノール：クロロホルム（５０
％フェノール：５０％クロロホルム）を添加し、そして
軽く混合した。ＤＮＡ溶液を１４，０００rpm で１０分
間５℃で遠心分離し、そして上方の層を、清浄したＥｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ管に移した。イソプロパノール（０．７
５ml）を添加し、そしてその溶液を軽く混合し、そして
次に、室温で２０分間インキュベートした。ＤＮＡ溶液
を１４，０００rpm で１５分間５℃で遠心分離し、上清
液を除き、ＤＮＡペレットを７０％エタノールにより洗
浄し、乾燥せしめ、そしてＤＮＡをＴＥ緩衝液に再懸濁
した。
【０１６８】（４）Ｅ．コリからのプラスミドＤＮＡ単
離 単一の形質転換されたＥ．コリコロニーを、１００μｇ
／mlのアンピシリンにより補充された５mlのLuria-Bert
ani （ＬＢ）培地（Ｂａｃｔｏ−トリプトン−１０ｇ；
Ｂａｃｔｏ−酵母−５ｇ；及び１ｌのｄＨ2 Ｏ中、Ｎａ
Ｃｌ−１０ｇ、pH７．０、１２１℃で２５分間オートク
レーブ処理されている）中に接種した。その培養物を一
晩インキュベートし、そして１mlのアリコートを１．５
mlの微小遠心分離管に配置した。培養物サンプルを、Ａ
ｕｔｏＧｅｎ ５４０TM自動核酸単離装置中に負荷し、
そしてプラスミドＤＮＡを、製造業者の説明に従って、
Ｃｙｃｌｅ３（装備ソフトウェア）を用いて単離した。
【０１６９】（５）Ｓ．アベルミチリスプロトプラスト
の調製及び形質転換 Ｓ．アベルミチリスの単一コロニーを、１／２強度のＹ
ＰＤ−６上で単離した。菌糸体を用いて、２５mm×１５
０mmの管中の１０mlのＴＳＢ培地を接種し、次に、２８
℃で４８時間、振盪しながら（３００rpm ）インキュベ
ートした。１mlの菌糸体を用いて、５０mlのＹＥＭＥ培
地を接種した。ＹＥＭＥ培地は１ｌ当たり次の成分を含
む：Ｄｉｆｃｏ酵母抽出物−３ｇ；Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃ
ｔｏ−ペプトン−５ｇ；Ｄｉｆｃｏ麦芽抽出物−３ｇ；
及びスクロース−３００ｇ。１２１℃で２５分間オート
クレーブ処理した後、次のものを添加した：２．５Ｍの
ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ（１２１℃で２５分間、別々にオ
ートクレーブ処理された）−２ml；及びグリシン（２０
％）（フィルター殺菌された）−２５ml。
【０１７０】菌糸体を３０℃で４８〜７２時間、増殖せ
しめ、そして５０mlの遠心分離管（Ｆａｌｃｏｎ）にお
いての３，０００ｒｐｍでの２０分間の遠心分離により
収穫した。上清液を捨て、そして菌糸体を、次のものを
含むＰ緩衝液に再懸濁した：スクロース−２０５ｇ；Ｋ
2 ＳＯ4 −０．２５ｇ；ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ−２．０
２ｇ；Ｈ2 Ｏ−６００ml；Ｋ2 ＰＯ4 （０．５％）−１
０ml；微量元素溶液*−２０ml；ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ
（３．６８％）−１００ml；ＭＥＳ緩衝液（１．０Ｍ、
pH６．５）−１０ml。（* 微量元素溶液は１ｌ当たり次
の成分を含む：ＺｎＣｌ2 −４０mg；ＦｅＣｌ3 ・６Ｈ
2 Ｏ−２００mg；ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ−１０mg；Ｍｎ
Ｃｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ−１０mg；Ｎａ2 Ｂ4 Ｏ7 ・１０Ｈ2
Ｏ−１０mg；（ＮＨ4 ）6 Ｍｏ7 Ｏ24・４Ｈ2 Ｏ−１０
mg）。pHを６．５に調整し、最終体積を１ｌに調整し、
そして培地を０．４５ミクロンのフィルターを通して濾
過した。
【０１７１】菌糸体を３，０００rpm で２０分間の遠心
分離によりペレット化し、上清液を捨て、そして菌糸体
を、２mg／mlのリゾチームを含む２０mlのＰ緩衝液に再
懸濁した。菌糸体を３５℃で１５分間、振盪しながらイ
ンキュベートし、そして顕微鏡で調べ、プロトプラスト
形成の程度を決定した。プロトプラスト形成が完結した
場合、そのプロトプラストを８，０００rpm で１０分
間、遠心分離した。上清液を除き、そしてプロトプラス
トを１０mlのＰ緩衝液に再懸濁した。プロトプラストを
８，０００rpm で１０分間、遠心分離し、上清液を除
き、プロトプラストを２mlのＰ緩衝液に再懸濁し、そし
て約１×１０9 個のプロトプラストを、２．０mlの極低
温バイアル（Ｎａｌｇｅｎｅ）に分配した。
【０１７２】１×１０9 個のプロトプラストを含むバイ
アルを、８，０００rpm で１０分間、遠心分離、上清液
を除き、そしてプロトプラストを０．１mlのＰ緩衝液に
再懸濁した。２〜５μｇの形質転換ＤＮＡを、プロトプ
ラストに添加し、続いてすぐに、０．５mlの作用Ｔ緩衝
液を添加した。Ｔ緩衝液基材は次のものを含む：ＰＥＧ
１０００（Ｓｉｇｍａ）−２５ｇ；スクロース−２．５
ｇ；及びＨ2 Ｏ−８３ml。pHを１ＮのＮａＯＨ（フィル
ター殺菌された）により８．８に調整し、そしてＴ緩衝
液基材をフィルター殺菌し、そして４℃で貯蔵した。使
用される同じ日に製造された作用Ｔ緩衝液は、次のもの
を含む：Ｔ緩衝液基材−８．３ml；Ｋ2ＰＯ4 （４mM）
−１．０ml；ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ（５Ｍ）−０．２m
l；及びＴＥＳ（１Ｍ，pH８）−０．５ml。作用Ｔ緩衝
液中の個々の成分をフィルター殺菌し、そして４℃で貯
蔵した。
【０１７３】プロトプラストへのＴ緩衝液の添加の２０
秒以内に、１．０mlのＰ緩衝液をまた添加し、そしてプ
ロトプラストを８，０００rpm で１０分間、遠心分離し
た。上清液を捨て、そしてプロトプラストを０．１mlの
Ｐ緩衝液に再懸濁した。次に、プロトプラストを、次の
成分を含むＲＭ１４培地上にプレートした：スクロース
−２０５ｇ；Ｋ2 ＳＯ4 −０．２５ｇ；ＭｇＣｌ2 ・６
Ｈ2 Ｏ−１０．１２ｇ；グルコース−１０ｇ；Ｄｉｆｃ
ｏカサミノ酸−０．１ｇ；Ｄｉｆｃｏ酵母抽出物−５
ｇ；Ｄｉｆｃｏオートミール寒天−３ｇ；Ｄｉｆｃｏ麦
芽寒天−２２ｇ；及びＨ2 Ｏ−８００ml。
【０１７４】その溶液を１２１℃で２５分間オートクレ
ーブ処理した。オートクレーブの後、次のものの無菌ス
トックを添加した：Ｋ2 ＰＯ4 （０．５％）−１０ml；
ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ（５Ｍ）−５ml；Ｌ−プロリン
（２０％）−１５ml；ＭＥＳ緩衝液（１．０Ｍ、pH６．
５）−１０ml；微量元素溶液（上記と同じ）−２ml；シ
クロヘキシミドストック（２５mg／ml）−４０ml；及び
１ＮのＮａＯＨ−２ml。２５mlのＲＭ１４培地をプレー
ト当たり等分し、そしてプレートを、使用の前、２４時
間、乾燥せしめた。
【０１７５】プロトプラストを、３０℃で２０〜２４時
間、９５％湿度下でインキュベートした。エリトロマイ
シン耐性形質転換体を選択するために、１mlのオーバー
レイ緩衝液及び１２５μｇのエリトロマイシン（５μｇ
／mlの最終濃度のエリトロマイシンにされている）を、
ＲＭ１４再生プレート上に均等に広げた。オーバーレイ
緩衝液は１００ml当たり次の成分を含む：スクロース−
１０．３ｇ；微量元素溶液（上記と同じ）−０．２ml；
及びＭＥＳ（１Ｍ、pH６．５）−１ml。プロトプラスト
を、エリトロマイシン耐性（Ｅｒｍr ）コロニーが見ら
れるまで、３０℃で７〜１４日間、９５％湿度下でイン
キュベートした。
【０１７６】（６）Ｓ．アベルミチリス株の発酵分析 １／２強度ＹＰＤ−６上で４〜７日間、増殖されたＳ．
アベルミチリス菌糸体を、８mlの予備培地及び２種の５
mmのガラスビーズを含む１×６インチの管中に接種し
た。予備培地は次のものを含む：可溶性スターチ（薄煮
沸スターチ又はＫＯＳＯ、Japan Corn Starch Co., Nag
oya ）−２０ｇ／ｌ；Pharmamedia （Trader's Protei
n, Memphis TN）−１５ｇ／ｌ；Ardomine pH （Champla
in, Inc. Clifton, NJ ）−５ｇ／ｌ；ＣａＣＯ3 −２
ｇ／ｌ；２×ｂｃｆａ（“ｂｃｆａ”は、枝分れ鎖の脂
肪酸を言及する）（培地に次の最終濃度の成分を含む：
５０ppm の２−（±）−メチル酪酸、６０ppm のイソ酪
酸、及び２０ppm のイソ吉草酸）。pHを７．２に調整
し、そして培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処
理した。
【０１７７】管を１７度の角度で、２１５rpm で３日
間、２９℃で振盪した。種子培養物の２mlアリコートを
用いて、次の成分を含む２５mlの生成培地を含む３００
mlの三角フラスコを接種した：スターチ（薄煮沸スター
チ又はＫＯＳＯのいづれか）−１６０ｇ／ｌ；Nutrisoy
（Archer Daniels Midland, Decatur, IL ）−１０ｇ／
ｌ；Ardamine pH −１０ｇ／ｌ；Ｋ2 ＨＰＯ4 −２ｇ／
ｌ；ＭｇＳＯ4 ・４Ｈ2Ｏ−２ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ−０．０２ｇ／ｌ；ＭｇＣｌ2 −０．００２ｇ／
ｌ；ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ−０．００２ｇ／ｌ；ＣａＣ
Ｏ3 −１４ｇ／ｌ；及び２×ｂｃｆａ（上記のよう
な）。pHを６．９に調整し、そして培地を１２１℃で２
５分間オートクレーブ処理した。
【０１７８】接種の後、フラスコを２９℃で１２日間、
２００rpm で振盪しながらインキュベートした。インキ
ュベーションの後、２mlのサンプルをフラスコから採取
し、８mlのメタノールにより希釈し、混合し、そしてそ
の混合物を１２５０×ｇで１０分間、遠心分離し、残骸
をペレット化した。次に、上清液を、０．７５ml／分の
流速及び２４０nmでの吸光度測定による検出を伴って、
Beckman UltrasphereODS カラム（２５cm×４．６mmI
D）を用いての高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）によりアッセイした。移動相は、メタノール／水／
アセトニトリル（８６／８．９／５．１）であった。
【０１７９】（７）Ｓ．アベルミチリスＰＫＳ遺伝子の
同定及び単離 Ｓ．アベルミチリス（ＡＴＣＣ ３１２７２）染色体Ｄ
ＮＡのコスミドライブラリーを調製し、そしてサッカロ
ポリスポラ エリスラエア（Saccharopolyspora erythr
aea ）ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）遺伝子のフラグ
メントから製造されたケトシンターゼ（ＫＳ）プローブ
によりハイブリダイズせしめた。コスミドライブラリー
の調製についての詳細な説明は、Sambrookなど., 1989
、前記に見出され得る。ストレプトミセス染色体ＤＮ
Ａライブラリーの調製についての詳細な説明は、Hopwoo
d など., 1985 、前記に存在する。
【０１８０】ケトシンターゼ−ハイブリダイジング領域
を含むコスミドクローンを、ｐＥＸ２６（Dr. P.Leadle
y, Cambridge, UKから供給された）からの２．７kbのＮ
ｄｅＩ／Ｅｃｏ４７III フラグメントへのハイブリダイ
ゼーションにより同定した。約５μｇのｐＥＸ２６を、
制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＥｃｏ４７IIIを
用いて消化した。反応混合物を、０．８％ ＳｅａＰｌ
ａｑｕｅTM ＧＴＧアガロースゲル（FMC BioProducts,
Rockland, ME ）上に負荷した。２．７kbのＮｄｅＩ／
Ｅｃｏ４７III フラグメントを、電気泳動の後、ゲルか
ら切除し、ＤＮＡを、Fast Protcolと共にＧＥＬａｓｅ
TM（Epicentre Technologios）を用いてのゲルから回収
した。
【０１８１】２．７kbのＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７III フラ
グメントを、供給者の説明書に従って、BRL Nick Trans
lation System （BRL Life Technologies, Ins., Gaith
ersburg, MD ）を用いて、〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ（デオ
キシシチジン５′−三リン酸、四（トリエチルアンモニ
ウム）塩、〔α32−Ｐ〕−）（NEN-Dupont, Boston,M
A）によりラベルした。５μｌの停止緩衝液の添加の
後、ラベルされたＤＮＡを、供給者の説明書に従って、
G-25 Sephadex Quick SpinTMカラム（Boehringer Mannh
eim ）を用いて、組込まれていないヌクレオチドから分
離した。
【０１８２】約１８００のコスミドクローンを、コロニ
ーハイブリダイゼーションによりスクリーンした。Ｓ．
エリスラエアＫＳプローブに対して強くハイブリダイズ
した１０個のクローンを同定した。コスミドＤＮＡを含
むＥ．コリコロニーを、ＬＢ溶液培地において増殖せし
め、そしてコスミドＤＮＡを、製造業者の説明書に従っ
て、Ｃｙｃｌｅ３（装備ソフトウェア）を用いて、Ａｕ
ｔｏＧｅｎ ５４０TM自動核酸単離装置において個々の
培養物から単離した。制限エンドヌクレアーゼマッピン
グ及びサザンブロットハイブリダイゼーション分析は、
５つのクローンがオーバーラップする染色体領域を含む
ことを示した。５種のコスミド（すなわち、ｐＳＥ６
５，ｐＳＥ６６，ｐＳＥ６７，ｐＳＥ６８，ｐＳＥ６
９）のＳ．アベルミチリスゲノムＢａｍＨＩ制限地図
を、オーバーラップするコスミド及びハイブリダイゼー
ションの分析により構成した（図７）。
【０１８３】（８）調節遺伝子ＯＲＦの同定 次の方法を用いて、ｐＳＥ６８クローンに由来するフラ
グメントをサブクローン化した。ｐＳＥ６８（５μｇ）
を、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより消化した。その反応
混合物を０．８％ ＳｅａＰｌａｑｕｅTM ＧＴＧアガ
ロースゲル（FMC BioProducts ）上に負荷し、約１９kb
のＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、電気泳動の
後、ゲルから切除し、そして：ＤＮＡをFast Protocol
と共にＧＥＬａｓｅTM（Epicentre Technologies）を用
いてゲルから回収した。約５μｇのｐＧＥＭ７Ｚｆ
（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩに
より消化した。
【０１８４】約０．５μｇの１９kbのＥｃｏＲＩ／Ｘｂ
ａＩフラグメント及び０．５μｇの消化されたｐＧＥＭ
７Ｚｆ（＋）を一緒に混合し、そして１単位のリガーゼ
（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）と共に、
１５℃で、２０μｌの合計体積において一晩インキュベ
ートした（供給者の説明書に従って）。インキュベーシ
ョンの後、５mlの連結混合物を７０℃で１０分間インキ
ュベートし、室温に冷却し、そしてコンピテントＥ．コ
リＤＨ５α細胞（ＢＲＬ）を製造業者の説明書に従って
形質転換するために使用した。プラスミドＤＮＡをアン
ピシリン耐性形質転換体から単離し、そして約１９kbの
ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ挿入体の存在を制限分析により確
かめた。このプラスミドをｐＳＥ２００として命名し
た。
【０１８５】ｐＳＥ２００をさらに、Erase-a-Base Sys
tem (Promega）を用いて、製造業者の説明書に従って、
エキソヌクレアーゼIII 消化により修飾した。５μｇの
ｐＳＥ２００をＣｌｅＩにより消化した。ＣｌａＩは、
製造業者の説明書に従ってα−ホスホロチオエートデオ
キシリボヌクレオチドによりフィルインされることによ
って、エキソヌクレアーゼ消化から保護された５′突出
物を生成する。次に、ｐＳＥ２００をＥｃｏＲＩにより
消化し、そしてアリコートを３０秒〜１２分の範囲の種
々の時間、Ｓ１ヌクレアーゼにより消化した。
【０１８６】ｐＳＥ２００のＳ１ヌクレアーゼ−処理サ
ンプルを一晩、連結し、そして製造業者の説明書に従っ
て、Ｅ．コリＨＢ１０１（ＢＲＬ）コンピテント細胞を
形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形
質転換体から単離し、そして挿入体ＤＮＡのサイズを制
限酵素分析により決定した。約５．９kbの挿入体を含む
１つの単離物を同定し、これをｐＳＥ２０１（図３）と
命名し、そしてＡＴＣＣ（受託番号２０３１８２）に寄
託した。約８．８kbの挿入体を含む第２単離物を同定
し、そしてこれをｐＳＥ２１０（図４）と命名した。
【０１８７】約１０μｇのｐＳＥ２０１を、プラスミド
ＤＮＡ単離キット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、
製造業者の説明書に従って単離した。このＤＮＡを、Ａ
ＢＩ３７３Ａ自動ＤＮＡ配列決定機（Perkin Elmer, Fo
ster City, CA ）を用いて配列決定した。配列データを
集め、そしてGenetic Computer Groupプログラム（GCG,
Madison, WI）を用いて編集した。調節遺伝子ａｖｅＲ
１及びａｖｅＲ２のＯＲＦのＤＮＡ配列を、配列番号１
及び配列番号３の両者において同等に表わす。ａｖｅＲ
１のＯＲＦは、配列番号１のｎｔ１１１２〜ｎｔ２３１
７からである。ａｖｅＲ２のＯＲＦは、配列番号１のｎ
ｔ２３１４〜ｎｔ３０２１からである。
【０１８８】Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦ
から推定されるアミノ酸配列の比較は、Ｓ．コエリカラ
ーの推定されるａｂｓＡ１遺伝子生成物に対して３２％
の同一性を示す（図１）（Brian など., 1996, J.Bacte
ridogy 178: 3221-3231 ）。Ｓ．アベルミチリスのａｖ
ｅＲ２のＯＲＦから推定されるアミノ酸の比較は、Ｓ．
コエリカラーの推定されるａｂｓＡ２遺伝子生成物に対
して４５％の同一性を示す（図２）。
【０１８９】（９）遺伝子置換ベクターの構成及び使用 ストレプトミセス遺伝子中への突然変異の導入のための
技術の一般的な説明は、Kieser and Hopwood, 1991, Me
th.Enzym. 204: 430-458により提供される。より詳細な
説明は、Anzai など. 1998, J.Antibiot. XL1 (2): 226
-233; Stutzman-Engwallなど., 1992, J.Bacteriol. 17
4 (1): 144-145; 及びOhand Chater, 1997, J.Bact. 17
9: 122-127により提供される。それらの出版物は、引用
により本明細書に組込まれる。
【０１９０】（９−１）ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝
子の不活性化 ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者を、ｐＳＥ２１
０における９８８bpのＢｇｌII／ＳｔｕＩフラグメント
（図４）を、サッカロポリスポラ エリスラエアからの
エリトロマイシン耐性遺伝子により次の通りに置換する
ことによって不活性化した。約５μｇのｐＳＥ２１０を
ＢｇｌII及びＳｔｕＩにより消化し、約１０．８kbのフ
ラグメントを開放した。ＢｇｌII末端を、１×クレノウ
緩衝液及び１Ｕのクレノウ酵素（Boehringer Mannheim
）において、前記ＤＮＡを１００μＭの最終濃度のｄ
ＮＴＰと共に３７℃で３０分間インキュベートすること
によってフィルインした。
【０１９１】約１０．８kbのフラグメントを、アガロー
スゲルから精製し、そして１×アルカリホスファターゼ
緩衝液及び１Ｕのアルカリホスファターゼにおいて５０
℃で１時間インキュベートし、末端を脱リン酸化した。
インキュベーションの後、脱リン酸化されたフラグメン
トを、セクション６．３に記載のようにして、フェノー
ル／クロロホルム抽出により精製し、そしてＴＥ緩衝液
に再懸した。ｅｒｍＥ遺伝子を、ＢｇｌIIによる消化に
より、ｐＩＪ４０２６（John Imnes Institute, Norwic
h, U.K. により提供される；また、Bibbなど., 1985, G
ene 41: 357-368 も参照のこと）から単離し、そしてＢ
ｇｌII末端を、１×クレノウ緩衝液及び１Ｕのクレノウ
酵素において、ｅｒｍＥフラグメントを、１００μＭの
最終濃度のｄＮＴＰと共に３７℃で３０分間インキュベ
ートすることによってフィルインした。
【０１９２】約１．７kbのｅｒｍＥフラグメントをアガ
ロースゲルから精製し、そしてその０．５μｇを、０．
５μｇの約１０．８kbのフラグメントと共に混合し、そ
して連結した。その連結混合物を用いて、コンピテント
Ｅ．コリＨＢ１０１細胞（ＢＲＬ）を、製造業者の説明
書に従って形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシ
リン耐性形質転換体から単離し、そしてｅｒｍＥ挿入体
の存在を制限分析により確かめた。ｐＳＥ２１４（図
５）として命名されたこのプラスミドを用いて、Ｅ．コ
リＤＭ１（ＢＲＬ）を形質転換し、そしてプラスミドＤ
ＮＡをアンピシリン耐性形質転換体から単離した。９８
８bpのＢｇｌII／ＳｔｕＩフラグメントの代わりにｅｒ
ｍＥ遺伝子の挿入は、ａｖｅＲ１遺伝子から７５２bp及
びａｖｅＲ２遺伝子から２３２bpを除去する。
【０１９３】Ｓ．アベルミチリスにおいて自主的に複製
しないであろうｐＳＥ２１４を、次の通りに、組込み遺
伝子置換のための遺伝子置換ベクターとして使用した。
８μｌのｐＳＥ２１４ ＤＮＡ（１μｇ）を、２μｌの
１ＭのＮａＯＨを添加し、３７℃で１０分間インキュベ
ートし、次に、氷上で急速に冷却し、続いて、１ＭのＨ
Ｃｌ ２μｌを添加することによって、Oh and Chater,
1997 、前記の方法に従って変性した。Ｓ．アベルミチ
リスのプロトプラストを、その変性されたｐＳＥ２１４
により形質転換した。形質転換体を、宿主細胞染色体中
へのプラスミドの組込み遺伝子組換えを誘発するため
に、エリトロマイシン遺伝子の発現を必要とする選択条
件下で再生した。
【０１９４】前記プラスミドは自主的に複製しないの
で、エリトロマイシン−耐性−形質転換体は、ｅｒｍ遺
伝子を端に有する２つのＤＮＡセグメントの１つと、完
全なｐＳＥ２１４ベクターの組込みをもたらすであろ
う、染色体におけるその相同相対物との間での単一の相
同組換え、又は突然変異を端に有する第２ＤＮＡセグメ
ントと、染色体中へのプラスミドからのａｖｅＲ１／ａ
ｖｅＲ２（不活性化された）配列の交換及び染色体から
の野生型対立遺伝子及びベクター配列の同時損失をもた
らすであろう、染色体におけるその相同相対物との間
で、第２の組換え現象が生じる、二重クロス−オーバー
のいづれかにより、染色体中に組込まれたプラスミド配
列を有するべきである。
【０１９５】エリトロマイシン−耐性形質転換体を単離
し、そしてベクター主鎖の存在についてＰＣＲによりス
クリーンした。すべての形質転換体は、ベクター主鎖を
ミッシングしており、このことは、二重クロス−オーバ
ー現象が起こり、そして染色体ａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２
配列がａｖｅＲ１／ａｖｅＲ２欠失配列により置換され
たことを示唆する。エリトロマイシン−耐性形質転換体
を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析により分析した。ａｖｅ
Ｒ１／ａｖｅＲ２欠失を含むＳ．アベルミチリス株は、
対照株よりも平均３．４倍、アベルメクチンを生成した
（表１）。
【０１９６】（９−２）ａｖｅＲ２遺伝子の不活性化 ａｖｅＲ２遺伝子を、ｐＳＥ２１０（図４）におけるＢ
ｇｌII部位中にｅｒｍＥ遺伝子を挿入し、そしてＳ．ア
ベルミチリスにおいて遺伝子置換ベクターとしてその得
られるプラスミドを用いることによって不活性化した。
約５μｇのｐＳＥ２１０を、ＢｇｌIIにより消化した。
線状化されたｐＳＥ２１０を、１×アルカリホスファタ
ーゼ緩衝液及び１Ｕのアルカリホスファターゼにおいて
５０℃で１時間インキュベートし、末端を脱リン酸化し
た。
【０１９７】ｅｒｍＥ遺伝子を、ＢｇｌIIによる消化に
よりｐＩＪ４０２６から単離し、続いて電気泳動し、そ
して約１．７kbのｅｒｍＥ遺伝子をゲルから精製した。
約０．５μｇの線状化されたｐＳＥ２１０及び０．５μ
ｇのｅｒｍＥフラグメントを一緒に混合し、そして連結
した。その連結混合物を用いて、コンピテントＥ．コリ
ＨＢ１０１細胞（ＢＲＬ）を、製造業者の説明書に従っ
て形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性
形質転換体から単離し、そしてｅｒｍＥ挿入体の存在を
制限分析により確かめた。ｐＳＥ２１６（図６）として
命名されたこのプラスミドを用いて、Ｅ．コリＤＭ１
（ＢＲＬ）を形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡをア
ンピシリン耐性形質転換体から単離した。
【０１９８】Ｓ．アベルミチリスにおいて自主的に複製
しないであろうｐＳＥ２１６を、次の通りに、組込み遺
伝子置換のための遺伝子置換ベクターとして使用した。
８μｌのｐＳＥ２１６ ＤＮＡ（１μｇ）を、２μｌの
１ＭのＮａＯＨを添加し、３７℃で１０分間インキュベ
ートし、次に、氷上で急速に冷却し、続いて、１ＭのＨ
Ｃｌ ２μｌを添加することによって、Oh and Chater,
1997 、前記の方法に従って変性した。次にＳ．アベル
ミチリスのプロトプラストを、その変性されたｐＳＥ２
１６により形質転換した。
【０１９９】形質転換体を、宿主細胞染色体中へのプラ
スミドの組込み遺伝子組換えを誘発するために、エリト
ロマイシン遺伝子の発現を必要とする選択条件下で再生
した。前記プラスミドは自主的に複製しないので、エリ
トロマイシン−耐性−形質転換体は、ｅｒｍ遺伝子を端
に有する２つのＤＮＡセグメントの１つと、完全なｐＳ
Ｅ２１６ベクターの組込みをもたらすであろう、染色体
におけるその相同相対物との間での単一の相同組換え、
又は突然変異を端に有する第２ＤＮＡセグメントと、染
色体中へのプラスミドからのａｖｅＲ２（不活性化され
た）配列の交換及び染色体からの野生型対立遺伝子及び
ベクター配列の同時損失をもたらすであろう、染色体に
おけるその相同相対物との間で、第２の組換え現象が生
じる、二重クロス−オーバーのいづれかにより、染色体
中に組込まれたプラスミド配列を有するべきである。
【０２００】エリトロマイシン−耐性形質転換体を単離
し、そしてベクター主鎖の存在についてＰＣＲによりス
クリーンした。すべての形質転換体は、ベクター主鎖を
ミッシングしており、このことは、二重クロス−オーバ
ー現象が起こり、そして染色体ａｖｅＲ２配列がａｖｅ
Ｒ２欠失配列により置換されたことを示唆する。エリト
ロマイシン−耐性形質転換体を、発酵生成物のＨＰＬＣ
分析により分析した。ａｖｅＲ２欠失を含むＳ．アベル
ミチリス株は、対照株よりも平均３．１倍、アベルメク
チンを生成した（表１）。
【０２０１】
【表１】
【０２０２】生物学的材料の寄託物 次の生物学的材料は、1998年９月９日、American Type
Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, R
ockville, MD. 20852, USAに寄託され、そして次の受託
番号が割り当てられた。
【０２０３】 プラスミド 受託番号 プラスミドｐＳＥ２０１ ２０３１８２ 引用される、すべての特許、特許出願、及び出版物は、
引用により本明細書中に組込まれる。本発明は、本明細
書に記載される特定の態様により限定されるものではな
く、前記態様は、発明の個々の観点の単なる例示であっ
て、そして機能的に同等の方法及び成分は、本発明の範
囲内である。実際、本発明の種々の修飾は、前述の記載
及び添付図面から当業者に明らかになるであろう。その
ような修飾は、本発明の範囲内である。
【０２０４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> PFIZER PRODUCTS INC. <120> STREPTOMYCES AVERMITILIS REGULATORY GENES FOR INCREASED AVERMECTIN PRODUCTION <130> A996618 <150> 60/100,134 <151> 1998-09-14 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 - beta <210> 1 <211> 5045 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <220> <221> CDS <222> (1112)..(2317) <223> aveR1 ORF <400> 1 cgagttgctg gtcatcggcg tactcctccc ggcgactccg cccggtactc gaccgcggca 60 gcggtcagcc gcatgaacgc ctcttcgaga gacacggtct tccgcgtcac ctcgtgcacc 120 gtcacggcgt gcgccgcgac gagttcgccg atccgctccg cggcggcggc caccttcagg 180 ctgccgtcgg agcagtcggt gaccgtgatt cccgcgccga ccagcacgtc gcgcagccgc 240 cgcggttccg gagtgcgcac ccgcaccccc acgtccgtgt acctgtcgat gaactcgctc 300 atgctggtgt ccgcgaggag ccgaccgcgg ccgatgatga cgaggtggtc cacggtgagc 360 gccgcctcgc tcatcagatg gctggacacg aagacggtgc gtccctgtgc cgccaggtcc 420 cgcatgaggt gccgcagcca caggacgcct tccgggtcga gcccgttgac cggctcgtcg 480 agcaccagga cggcggggtc gccgagcagc gccgcggcga ttcccagccg ctgactcatg 540 cccagcgaga acgtccccgc ccgccggcgc acggcgctcc gcaggcccgc cagctcgatc 600 acctcacgga cgcggcgggg cgggatccgg ttgctgcggg ccagccagcg caagtggttc 660 agcgcggttc ggccggggtg caccgccctg gcgtcgagca gtgcccccac cgtccgcagc 720 gggtcgcgga gccgctggta gggcgcgccg tcgatgcgta cctcgccggc cgtcgggcgg 780 tccaggccca gcatcatgcg catcgcggtg gacttcccgg cgccgttggg gccaaggaat 840 ccggtcaccc gaccggtccg tacctggaag gtaagaccct ccacaacggt ggtggtcccg 900 tagcgcttgg tcaggtccgt gacttcgatc atgccggtga tggtccgtga cgacaggctc 960 ccgccgcgtc ccgctcgggg ctgactgccc cttctccacc cccggttgga gaatgaccgc 1020 cacccgcggc cgcgcatcag gctgcaggag gagcggcttt gaccaccgct ggacggaggc 1080 ggagcggcgt acgcctggat atggtcgagc g gtg cat gca ggt acc gcg gtg 1132 Val His Ala Gly Thr Ala Val 1 5 gac ccc gac gac cat ccg atc ctg gcc cgg cga ctg agc cgg cgc cga 1180 Asp Pro Asp Asp His Pro Ile Leu Ala Arg Arg Leu Ser Arg Arg Arg 10 15 20 ctc atc gcc ctg gac ggc gtg ctc gta ttc gcc tac gca tgc gcg ctg 1228 Leu Ile Ala Leu Asp Gly Val Leu Val Phe Ala Tyr Ala Cys Ala Leu 25 30 35 ctg tcg acc ggg ccg aca ggc atc tcg tcg tcg tcc gcg ccg ccg ctc 1276 Leu Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ile Ser Ser Ser Ser Ala Pro Pro Leu 40 45 50 55 ccg gcc ccg gtg ccg tgg gag cgg ctc gtg ctc atc gcc gcg gcc act 1324 Pro Ala Pro Val Pro Trp Glu Arg Leu Val Leu Ile Ala Ala Ala Thr 60 65 70 gcg cct gtc gcc gta cgg cgg atc tgg ccg ttg ccc gtg ttc gcg gtc 1372 Ala Pro Val Ala Val Arg Arg Ile Trp Pro Leu Pro Val Phe Ala Val 75 80 85 gtg ctg gcg gtg acc gcc gtg gcc gtc gtg cgg gac gcg gcg tgg gac 1420 Val Leu Ala Val Thr Ala Val Ala Val Val Arg Asp Ala Ala Trp Asp 90 95 100 ccg ttc ctg tcg gcg gcg ttc gcc ctc tac acc gtc gcc gtc acg gtg 1468 Pro Phe Leu Ser Ala Ala Phe Ala Leu Tyr Thr Val Ala Val Thr Val 105 110 115 ccc tcg cgc cac tgg tgg caa cgc tgg tta ccc ggc ctg gcg atc gct 1516 Pro Ser Arg His Trp Trp Gln Arg Trp Leu Pro Gly Leu Ala Ile Ala 120 125 130 135 ttg ctg acc gtg gcc ggc ctt gcc gga gca gcg cgt gcc ggc gag gcc 1564 Leu Leu Thr Val Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Arg Ala Gly Glu Ala 140 145 150 ttc tgg tgg cgc ggc agc ccc ggt ctg ctg ctg ctc ggc ttc gcc gca 1612 Phe Trp Trp Arg Gly Ser Pro Gly Leu Leu Leu Leu Gly Phe Ala Ala 155 160 165 ctg ctc ggc gcc tgg caa ctg gga cgc gcc gcg cgg cag agg cgc gca 1660 Leu Leu Gly Ala Trp Gln Leu Gly Arg Ala Ala Arg Gln Arg Arg Ala 170 175 180 ttc gcc gtc cgg gcg gcc gag cag ctc gca caa cgg gcc gtc acg gag 1708 Phe Ala Val Arg Ala Ala Glu Gln Leu Ala Gln Arg Ala Val Thr Glu 185 190 195 gaa cgc ctg cgg ata gcc cgc gaa ctg cat gac gtc gtc acg cac agc 1756 Glu Arg Leu Arg Ile Ala Arg Glu Leu His Asp Val Val Thr His Ser 200 205 210 215 atg ggc ctg atc gcg gtc aag gtc ggc gtc gcc aac cac gtg ttg cac 1804 Met Gly Leu Ile Ala Val Lys Val Gly Val Ala Asn His Val Leu His 220 225 230 atc agg ccg cag gag gcg tac gac gcg ctc cag gtc atc gaa cgc acg 1852 Ile Arg Pro Gln Glu Ala Tyr Asp Ala Leu Gln Val Ile Glu Arg Thr 235 240 245 agc cgc acc gcg ctg aac gac atg cgc cgg atg ctc ggt gtg ctg cgt 1900 Ser Arg Thr Ala Leu Asn Asp Met Arg Arg Met Leu Gly Val Leu Arg 250 255 260 acg tcc gag ggt gag cgg cag tca gcg gct ctc ggc ccg ctg cct ggc 1948 Thr Ser Glu Gly Glu Arg Gln Ser Ala Ala Leu Gly Pro Leu Pro Gly 265 270 275 gcc ctt gct ctc cct gac ctc gtc ggg cag gcc ggc gcg cag ctg act 1996 Ala Leu Ala Leu Pro Asp Leu Val Gly Gln Ala Gly Ala Gln Leu Thr 280 285 290 295 atg cgc ggt gtc gag agt ctg ccc gac gga gtc gcg ctg gcc gtc tac 2044 Met Arg Gly Val Glu Ser Leu Pro Asp Gly Val Ala Leu Ala Val Tyr 300 305 310 cgg atc gtg cag gag gcg ctc acc aat gtc gcc aag cac gcc ggc ccg 2092 Arg Ile Val Gln Glu Ala Leu Thr Asn Val Ala Lys His Ala Gly Pro 315 320 325 gag gcc cgc tgc cgg gtg gcg gtc gat gcg aac ggc cac ggc gtc cgg 2140 Glu Ala Arg Cys Arg Val Ala Val Asp Ala Asn Gly His Gly Val Arg 330 335 340 ctc gag ata acc gac gac gga ggc gac cgg agc ccc ctc gcg ccg aag 2188 Leu Glu Ile Thr Asp Asp Gly Gly Asp Arg Ser Pro Leu Ala Pro Lys 345 350 355 ccc ggc ggc cac gga atc gtc ggc atg cgc gaa cgc gtc gcc ctg tac 2236 Pro Gly Gly His Gly Ile Val Gly Met Arg Glu Arg Val Ala Leu Tyr 360 365 370 375 ggc ggc acc ttc gcc gcc gga ccg cgt cca gag ggc ggc ttc gcg gta 2284 Gly Gly Thr Phe Ala Ala Gly Pro Arg Pro Glu Gly Gly Phe Ala Val 380 385 390 cac gcg tcc ctg ccg tac gag gag aac aca tga cccggcccgc cgatccgccc 2337 His Ala Ser Leu Pro Tyr Glu Glu Asn Thr 395 400 ggtgccccgg tccgggtcct catcgccgac gaccaggcgc tgctgcgcgg cagcctgcgg 2397 gtgctcgtcg acaccgagcc cggcctggtg gccacgtcgg aggcggcgac cggcacggag 2457 gcggtgcggc ttgcccggca ggatccgccg gacgtggtcc tgatggacgt gcggatgccc 2517 gaaatggatg gcatcgaggc gacccggcag atctgcggtt cccccgagac cgcggacgtc 2577 aaagtgctga tcctgacgat gttcgacctg gacgagtacg tctacgccgc gctgcgggcc 2637 ggtgccagcg gcttcctgct gaaggacacg ccgcccagcg agttgctcgc ggcggtacgg 2697 gtcatcgccg ccggcgaggc gctgctggca ccggccgtga cgcggcgcct gatcgcggag 2757 ttcgtccacc gcccggagcc ctcgcgaccg ctgcgtcgca ccctggacgg cgtgaccgag 2817 cgcgaacgtg aagtcctcac cctcatcgcc tgcggcctgt ccaacaccga gatcgccgag 2877 cggctgtatc tcggcattgc caccgtgaag acccacgtca gccacctgct caccaagctc 2937 gccacccgcg atcgcgctca gttggtgatc gtcgcgtacg agagcggcct ggtcacggtg 2997 gcgcgaccac cgatcggttc ctgaggggcg ccggcgcaca cggtgcacgg cctgggcggg 3057 gccgttcaga atggatcacc cgggtacacg aggcgcagtt cgtcgacatg gctcatgagg 3117 tactcaccgg ggcactgggt ggatgccggg gcccgggact gcttcttgcg cggctggtgg 3177 ccccagacgc tgctgatgcc gaagcggacg gccaggacgt ccacgaggac gtcgagtgtt 3237 gtgagttgct tgggcgtcgg gtggtcgtag cgtgcccact ggttctgcca gcgcggtccg 3297 aagtcgccgg tgagcacgat gccgagattg ccggcgttga agagttcagc gtgtgagccc 3357 tcgatgccga gtggccgccc ctcgtagatc gtcccggcgc cgtcgatgat gtagtggtaa 3417 ccgatgtcgg ccttgtcgtc cgcgaagtgc gcccgctgga tcgtgcgcgg gccctcatgc 3477 gtgtacgtga cggggtcggc cgagtggtgg atggtgatcc agcggtagac ggaggccagg 3537 ggccggttct cgctgagcgg tacgggactg ccgcggtagg gcggtggcgc gagggggccg 3597 gaggcggcct cgtggaaatc ccaggtacgc agcggggggt cgatctgcgg cggggccgcc 3657 ccccaggtgg cgcggccgac gacggacacg gtcagcggcc ctcgcggtgt catggcccac 3717 aactcgtagt cgccgctcgc cggatgcagg aagcgcgact cgtcccagca ggcggcgacg 3777 gggccgtgcg cggtgtcgac cggccgggtg ccgcaggacg tcagcctcag gggagtccgg 3837 tgcgggcgct gccccgagac cggcgcgttg aaccggccga tgtcggtgat cacggtggtg 3897 cggagttccg acaggtcgta gccgtcgcgg gggcattcga gggagcgcgg cggcggttcc 3957 acgaccctga gcgccgcatc gcaccggggg cagacgagaa cgagcacctc gcgggcgacc 4017 agctccgtcg tcgtaccggg cgggagccgg tggtggcggg gcagatcgag tggcgtgcgg 4077 ccgggccgca gttcggtcac gggcacgggg tcggtggctt cggcggcggg tgccagctcg 4137 tggtcggcgc aggcgaccgt ccaggcacgc gtcccggcgt cgggaaccat gagggtgccc 4197 agcgcgtccg tcgtggccgc gatcccggaa tgccgtcctc ccgatggcgg gatgagccgt 4257 acggtgaatc cggggatcgg gctgccgtcg cggcgcagga tcaccagggc cgtgtccgac 4317 ggtggtgaga gttcggcggc cagccccgcc tcgacgaagt gcagcaagcg gtgtgtcagt 4377 tgcagtacct cgggagagtc cggcgcgagc atggcctcgg cacggctgcg cacgctctcg 4437 aacgcgccgc cgagtgcgaa gcgcaggaag tcgacggcga acgcgacgat ctccccggcg 4497 acgaagccga ccgcggcgtc ggcgaagcga ggcgggccga agccaggtgc cagggggagc 4557 gccggcgctc cggcactggt cctggtggcg gcgacgaacg cggtgcaacg ccggtccacg 4617 gcgccgtcgt agtactcacg cagctgcgcc gccagcgagc ggtgcgggtc gaaggactcg 4677 ccgaggttca ccccgtcgat gtcgcccagc agccgcggcg tcgaagcgtg gcgggcgacc 4737 cagtggtcca gcgaccgacc gcggtccgcg gccggcaccc cgggcgcgtg gcgggcgcgg 4797 acgtacgcgg cgagggcgcg cccgaggtca ccgctccagg tgagggcgag atccgctcga 4857 ggggccgggt ccagggggcc gggcgtctgc cggtcggccc cgtcgatgcc ggccagcacc 4917 tgcgccaggt cgagccgctc gaagccgtgc tgcacccgca gcagcgcggc cagccgggcg 4977 gcccggcggg gcagctccca ggacgagccc ggcgtctggt cgtacggggg gatgttccgc 5037 cggttctg 5045
【０２０５】 <210> 2 <211> 401 <212> PRT <213> Streptomyces avermitilis <400> 2 Val His Ala Gly Thr Ala Val Asp Pro Asp Asp His Pro Ile Leu Ala 1 5 10 15 Arg Arg Leu Ser Arg Arg Arg Leu Ile Ala Leu Asp Gly Val Leu Val 20 25 30 Phe Ala Tyr Ala Cys Ala Leu Leu Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ile Ser 35 40 45 Ser Ser Ser Ala Pro Pro Leu Pro Ala Pro Val Pro Trp Glu Arg Leu 50 55 60 Val Leu Ile Ala Ala Ala Thr Ala Pro Val Ala Val Arg Arg Ile Trp 65 70 75 80 Pro Leu Pro Val Phe Ala Val Val Leu Ala Val Thr Ala Val Ala Val 85 90 95 Val Arg Asp Ala Ala Trp Asp Pro Phe Leu Ser Ala Ala Phe Ala Leu 100 105 110 Tyr Thr Val Ala Val Thr Val Pro Ser Arg His Trp Trp Gln Arg Trp 115 120 125 Leu Pro Gly Leu Ala Ile Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Leu Ala Gly 130 135 140 Ala Ala Arg Ala Gly Glu Ala Phe Trp Trp Arg Gly Ser Pro Gly Leu 145 150 155 160 Leu Leu Leu Gly Phe Ala Ala Leu Leu Gly Ala Trp Gln Leu Gly Arg 165 170 175 Ala Ala Arg Gln Arg Arg Ala Phe Ala Val Arg Ala Ala Glu Gln Leu 180 185 190 Ala Gln Arg Ala Val Thr Glu Glu Arg Leu Arg Ile Ala Arg Glu Leu 195 200 205 His Asp Val Val Thr His Ser Met Gly Leu Ile Ala Val Lys Val Gly 210 215 220 Val Ala Asn His Val Leu His Ile Arg Pro Gln Glu Ala Tyr Asp Ala 225 230 235 240 Leu Gln Val Ile Glu Arg Thr Ser Arg Thr Ala Leu Asn Asp Met Arg 245 250 255 Arg Met Leu Gly Val Leu Arg Thr Ser Glu Gly Glu Arg Gln Ser Ala 260 265 270 Ala Leu Gly Pro Leu Pro Gly Ala Leu Ala Leu Pro Asp Leu Val Gly 275 280 285 Gln Ala Gly Ala Gln Leu Thr Met Arg Gly Val Glu Ser Leu Pro Asp 290 295 300 Gly Val Ala Leu Ala Val Tyr Arg Ile Val Gln Glu Ala Leu Thr Asn 305 310 315 320 Val Ala Lys His Ala Gly Pro Glu Ala Arg Cys Arg Val Ala Val Asp 325 330 335 Ala Asn Gly His Gly Val Arg Leu Glu Ile Thr Asp Asp Gly Gly Asp 340 345 350 Arg Ser Pro Leu Ala Pro Lys Pro Gly Gly His Gly Ile Val Gly Met 355 360 365 Arg Glu Arg Val Ala Leu Tyr Gly Gly Thr Phe Ala Ala Gly Pro Arg 370 375 380 Pro Glu Gly Gly Phe Ala Val His Ala Ser Leu Pro Tyr Glu Glu Asn 385 390 395 400 Thr
【０２０６】 <210> 3 <211> 5045 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <220> <221> CDS <222> (2314)..(3021) <223> aveR2 ORF <400> 3 cgagttgctg gtcatcggcg tactcctccc ggcgactccg cccggtactc gaccgcggca 60 gcggtcagcc gcatgaacgc ctcttcgaga gacacggtct tccgcgtcac ctcgtgcacc 120 gtcacggcgt gcgccgcgac gagttcgccg atccgctccg cggcggcggc caccttcagg 180 ctgccgtcgg agcagtcggt gaccgtgatt cccgcgccga ccagcacgtc gcgcagccgc 240 cgcggttccg gagtgcgcac ccgcaccccc acgtccgtgt acctgtcgat gaactcgctc 300 atgctggtgt ccgcgaggag ccgaccgcgg ccgatgatga cgaggtggtc cacggtgagc 360 gccgcctcgc tcatcagatg gctggacacg aagacggtgc gtccctgtgc cgccaggtcc 420 cgcatgaggt gccgcagcca caggacgcct tccgggtcga gcccgttgac cggctcgtcg 480 agcaccagga cggcggggtc gccgagcagc gccgcggcga ttcccagccg ctgactcatg 540 cccagcgaga acgtccccgc ccgccggcgc acggcgctcc gcaggcccgc cagctcgatc 600 acctcacgga cgcggcgggg cgggatccgg ttgctgcggg ccagccagcg caagtggttc 660 agcgcggttc ggccggggtg caccgccctg gcgtcgagca gtgcccccac cgtccgcagc 720 gggtcgcgga gccgctggta gggcgcgccg tcgatgcgta cctcgccggc cgtcgggcgg 780 tccaggccca gcatcatgcg catcgcggtg gacttcccgg cgccgttggg gccaaggaat 840 ccggtcaccc gaccggtccg tacctggaag gtaagaccct ccacaacggt ggtggtcccg 900 tagcgcttgg tcaggtccgt gacttcgatc atgccggtga tggtccgtga cgacaggctc 960 ccgccgcgtc ccgctcgggg ctgactgccc cttctccacc cccggttgga gaatgaccgc 1020 cacccgcggc cgcgcatcag gctgcaggag gagcggcttt gaccaccgct ggacggaggc 1080 ggagcggcgt acgcctggat atggtcgagc ggtgcatgca ggtaccgcgg tggaccccga 1140 cgaccatccg atcctggccc ggcgactgag ccggcgccga ctcatcgccc tggacggcgt 1200 gctcgtattc gcctacgcat gcgcgctgct gtcgaccggg ccgacaggca tctcgtcgtc 1260 gtccgcgccg ccgctcccgg ccccggtgcc gtgggagcgg ctcgtgctca tcgccgcggc 1320 cactgcgcct gtcgccgtac ggcggatctg gccgttgccc gtgttcgcgg tcgtgctggc 1380 ggtgaccgcc gtggccgtcg tgcgggacgc ggcgtgggac ccgttcctgt cggcggcgtt 1440 cgccctctac accgtcgccg tcacggtgcc ctcgcgccac tggtggcaac gctggttacc 1500 cggcctggcg atcgctttgc tgaccgtggc cggccttgcc ggagcagcgc gtgccggcga 1560 ggccttctgg tggcgcggca gccccggtct gctgctgctc ggcttcgccg cactgctcgg 1620 cgcctggcaa ctgggacgcg ccgcgcggca gaggcgcgca ttcgccgtcc gggcggccga 1680 gcagctcgca caacgggccg tcacggagga acgcctgcgg atagcccgcg aactgcatga 1740 cgtcgtcacg cacagcatgg gcctgatcgc ggtcaaggtc ggcgtcgcca accacgtgtt 1800 gcacatcagg ccgcaggagg cgtacgacgc gctccaggtc atcgaacgca cgagccgcac 1860 cgcgctgaac gacatgcgcc ggatgctcgg tgtgctgcgt acgtccgagg gtgagcggca 1920 gtcagcggct ctcggcccgc tgcctggcgc ccttgctctc cctgacctcg tcgggcaggc 1980 cggcgcgcag ctgactatgc gcggtgtcga gagtctgccc gacggagtcg cgctggccgt 2040 ctaccggatc gtgcaggagg cgctcaccaa tgtcgccaag cacgccggcc cggaggcccg 2100 ctgccgggtg gcggtcgatg cgaacggcca cggcgtccgg ctcgagataa ccgacgacgg 2160 aggcgaccgg agccccctcg cgccgaagcc cggcggccac ggaatcgtcg gcatgcgcga 2220 acgcgtcgcc ctgtacggcg gcaccttcgc cgccggaccg cgtccagagg gcggcttcgc 2280 ggtacacgcg tccctgccgt acgaggagaa cac atg acc cgg ccc gcc gat ccg 2334 Met Thr Arg Pro Ala Asp Pro 1 5 ccc ggt gcc ccg gtc cgg gtc ctc atc gcc gac gac cag gcg ctg ctg 2382 Pro Gly Ala Pro Val Arg Val Leu Ile Ala Asp Asp Gln Ala Leu Leu 10 15 20 cgc ggc agc ctg cgg gtg ctc gtc gac acc gag ccc ggc ctg gtg gcc 2430 Arg Gly Ser Leu Arg Val Leu Val Asp Thr Glu Pro Gly Leu Val Ala 25 30 35 acg tcg gag gcg gcg acc ggc acg gag gcg gtg cgg ctt gcc cgg cag 2478 Thr Ser Glu Ala Ala Thr Gly Thr Glu Ala Val Arg Leu Ala Arg Gln 40 45 50 55 gat ccg ccg gac gtg gtc ctg atg gac gtg cgg atg ccc gaa atg gat 2526 Asp Pro Pro Asp Val Val Leu Met Asp Val Arg Met Pro Glu Met Asp 60 65 70 ggc atc gag gcg acc cgg cag atc tgc ggt tcc ccc gag acc gcg gac 2574 Gly Ile Glu Ala Thr Arg Gln Ile Cys Gly Ser Pro Glu Thr Ala Asp 75 80 85 gtc aaa gtg ctg atc ctg acg atg ttc gac ctg gac gag tac gtc tac 2622 Val Lys Val Leu Ile Leu Thr Met Phe Asp Leu Asp Glu Tyr Val Tyr 90 95 100 gcc gcg ctg cgg gcc ggt gcc agc ggc ttc ctg ctg aag gac acg ccg 2670 Ala Ala Leu Arg Ala Gly Ala Ser Gly Phe Leu Leu Lys Asp Thr Pro 105 110 115 ccc agc gag ttg ctc gcg gcg gta cgg gtc atc gcc gcc ggc gag gcg 2718 Pro Ser Glu Leu Leu Ala Ala Val Arg Val Ile Ala Ala Gly Glu Ala 120 125 130 135 ctg ctg gca ccg gcc gtg acg cgg cgc ctg atc gcg gag ttc gtc cac 2766 Leu Leu Ala Pro Ala Val Thr Arg Arg Leu Ile Ala Glu Phe Val His 140 145 150 cgc ccg gag ccc tcg cga ccg ctg cgt cgc acc ctg gac ggc gtg acc 2814 Arg Pro Glu Pro Ser Arg Pro Leu Arg Arg Thr Leu Asp Gly Val Thr 155 160 165 gag cgc gaa cgt gaa gtc ctc acc ctc atc gcc tgc ggc ctg tcc aac 2862 Glu Arg Glu Arg Glu Val Leu Thr Leu Ile Ala Cys Gly Leu Ser Asn 170 175 180 acc gag atc gcc gag cgg ctg tat ctc ggc att gcc acc gtg aag acc 2910 Thr Glu Ile Ala Glu Arg Leu Tyr Leu Gly Ile Ala Thr Val Lys Thr 185 190 195 cac gtc agc cac ctg ctc acc aag ctc gcc acc cgc gat cgc gct cag 2958 His Val Ser His Leu Leu Thr Lys Leu Ala Thr Arg Asp Arg Ala Gln 200 205 210 215 ttg gtg atc gtc gcg tac gag agc ggc ctg gtc acg gtg gcg cga cca 3006 Leu Val Ile Val Ala Tyr Glu Ser Gly Leu Val Thr Val Ala Arg Pro 220 225 230 ccg atc ggt tcc tga ggggcgccgg cgcacacggt gcacggcctg ggcggggccg 3061 Pro Ile Gly Ser 235 ttcagaatgg atcacccggg tacacgaggc gcagttcgtc gacatggctc atgaggtact 3121 caccggggca ctgggtggat gccggggccc gggactgctt cttgcgcggc tggtggcccc 3181 agacgctgct gatgccgaag cggacggcca ggacgtccac gaggacgtcg agtgttgtga 3241 gttgcttggg cgtcgggtgg tcgtagcgtg cccactggtt ctgccagcgc ggtccgaagt 3301 cgccggtgag cacgatgccg agattgccgg cgttgaagag ttcagcgtgt gagccctcga 3361 tgccgagtgg ccgcccctcg tagatcgtcc cggcgccgtc gatgatgtag tggtaaccga 3421 tgtcggcctt gtcgtccgcg aagtgcgccc gctggatcgt gcgcgggccc tcatgcgtgt 3481 acgtgacggg gtcggccgag tggtggatgg tgatccagcg gtagacggag gccaggggcc 3541 ggttctcgct gagcggtacg ggactgccgc ggtagggcgg tggcgcgagg gggccggagg 3601 cggcctcgtg gaaatcccag gtacgcagcg gggggtcgat ctgcggcggg gccgcccccc 3661 aggtggcgcg gccgacgacg gacacggtca gcggccctcg cggtgtcatg gcccacaact 3721 cgtagtcgcc gctcgccgga tgcaggaagc gcgactcgtc ccagcaggcg gcgacggggc 3781 cgtgcgcggt gtcgaccggc cgggtgccgc aggacgtcag cctcagggga gtccggtgcg 3841 ggcgctgccc cgagaccggc gcgttgaacc ggccgatgtc ggtgatcacg gtggtgcgga 3901 gttccgacag gtcgtagccg tcgcgggggc attcgaggga gcgcggcggc ggttccacga 3961 ccctgagcgc cgcatcgcac cgggggcaga cgagaacgag cacctcgcgg gcgaccagct 4021 ccgtcgtcgt accgggcggg agccggtggt ggcggggcag atcgagtggc gtgcggccgg 4081 gccgcagttc ggtcacgggc acggggtcgg tggcttcggc ggcgggtgcc agctcgtggt 4141 cggcgcaggc gaccgtccag gcacgcgtcc cggcgtcggg aaccatgagg gtgcccagcg 4201 cgtccgtcgt ggccgcgatc ccggaatgcc gtcctcccga tggcgggatg agccgtacgg 4261 tgaatccggg gatcgggctg ccgtcgcggc gcaggatcac cagggccgtg tccgacggtg 4321 gtgagagttc ggcggccagc cccgcctcga cgaagtgcag caagcggtgt gtcagttgca 4381 gtacctcggg agagtccggc gcgagcatgg cctcggcacg gctgcgcacg ctctcgaacg 4441 cgccgccgag tgcgaagcgc aggaagtcga cggcgaacgc gacgatctcc ccggcgacga 4501 agccgaccgc ggcgtcggcg aagcgaggcg ggccgaagcc aggtgccagg gggagcgccg 4561 gcgctccggc actggtcctg gtggcggcga cgaacgcggt gcaacgccgg tccacggcgc 4621 cgtcgtagta ctcacgcagc tgcgccgcca gcgagcggtg cgggtcgaag gactcgccga 4681 ggttcacccc gtcgatgtcg cccagcagcc gcggcgtcga agcgtggcgg gcgacccagt 4741 ggtccagcga ccgaccgcgg tccgcggccg gcaccccggg cgcgtggcgg gcgcggacgt 4801 acgcggcgag ggcgcgcccg aggtcaccgc tccaggtgag ggcgagatcc gctcgagggg 4861 ccgggtccag ggggccgggc gtctgccggt cggccccgtc gatgccggcc agcacctgcg 4921 ccaggtcgag ccgctcgaag ccgtgctgca cccgcagcag cgcggccagc cgggcggccc 4981 ggcggggcag ctcccaggac gagcccggcg tctggtcgta cggggggatg ttccgccggt 5041 tctg 5045
【０２０７】 <210> 4 <211> 235 <212> PRT <213> Streptomyces avermitilis <400> 4 Met Thr Arg Pro Ala Asp Pro Pro Gly Ala Pro Val Arg Val Leu Ile 1 5 10 15 Ala Asp Asp Gln Ala Leu Leu Arg Gly Ser Leu Arg Val Leu Val Asp 20 25 30 Thr Glu Pro Gly Leu Val Ala Thr Ser Glu Ala Ala Thr Gly Thr Glu 35 40 45 Ala Val Arg Leu Ala Arg Gln Asp Pro Pro Asp Val Val Leu Met Asp 50 55 60 Val Arg Met Pro Glu Met Asp Gly Ile Glu Ala Thr Arg Gln Ile Cys 65 70 75 80 Gly Ser Pro Glu Thr Ala Asp Val Lys Val Leu Ile Leu Thr Met Phe 85 90 95 Asp Leu Asp Glu Tyr Val Tyr Ala Ala Leu Arg Ala Gly Ala Ser Gly 100 105 110 Phe Leu Leu Lys Asp Thr Pro Pro Ser Glu Leu Leu Ala Ala Val Arg 115 120 125 Val Ile Ala Ala Gly Glu Ala Leu Leu Ala Pro Ala Val Thr Arg Arg 130 135 140 Leu Ile Ala Glu Phe Val His Arg Pro Glu Pro Ser Arg Pro Leu Arg 145 150 155 160 Arg Thr Leu Asp Gly Val Thr Glu Arg Glu Arg Glu Val Leu Thr Leu 165 170 175 Ile Ala Cys Gly Leu Ser Asn Thr Glu Ile Ala Glu Arg Leu Tyr Leu 180 185 190 Gly Ile Ala Thr Val Lys Thr His Val Ser His Leu Leu Thr Lys Leu 195 200 205 Ala Thr Arg Asp Arg Ala Gln Leu Val Ile Val Ala Tyr Glu Ser Gly 210 215 220 Leu Val Thr Val Ala Arg Pro Pro Ile Gly Ser 225 230 235
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ａｂｓＡ１及びａｖｅＲ１遺伝子によ
りコードされる推定上のアミノ酸配列の比較（Ａ）を示
す。
【図２】図２は、ａｂＡ２及びａｖｅＲ２遺伝子により
コードされる推定上のアミノ酸の比較（Ｂ）を示す。
【図３】図３は、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦを
含むプラスミドベクターｐＳＥ２０１（Ａ）を示す。
【図４】図４は、ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦを
含むプラスミドベクターｐＳＥ２１０（Ｂ）を示す。
【図５】図５は、ｅｒｍＥ遺伝子を含む遺伝子置換ベク
ターｐＳＥ２１４（Ａ）を示す。
【図６】図６は、ｅｒｍＥ遺伝子を含む遺伝子置換ベク
ターｐＳＥ２１６（Ｂ）を示す。
【図７】図７は、５種のコスミドクローンと共に、アベ
ルメクチンポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターの制
限地図を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 19/62 Ｃ１２Ｐ 19/62 21/02 Ｃ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ 33/50 Ｐ 33/50 33/569 Ｆ 33/569 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims (63)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ストレプトミセス・アベルミチリス（St
    reptomyces avermitilis）からのａｖｅＲ１遺伝子生成
    物をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離され
    たポリヌクレオチド分子。
  2. 【請求項２】 前記ａｖｅＲ１遺伝子生成物が配列番号
    ２のアミノ酸配列を含んで成る請求項１記載の単離され
    たポリヌクレオチド分子。
  3. 【請求項３】 約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列
    番号１のヌクレオチド配列を含んで成る請求項２記載の
    単離されたポリヌクレオチド分子。
  4. 【請求項４】 配列番号１のヌクレオチド配列を含んで
    成る請求項３記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  5. 【請求項５】 約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列
    番号１のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチ
    ド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチド
    分子。
  6. 【請求項６】 配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る
    ポリペプチドをコードし、そして本発明の実施において
    有用であるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオ
    チド分子の相補体に対して適度な緊縮条件下でハイブリ
    ダイズする請求項５記載の単離されたポリヌクレオチド
    分子。
  7. 【請求項７】 配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る
    ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成
    るポリヌクレオチド分子の相補体に対して高い緊縮条件
    下でハイブリダイズする請求項６記載の単離されたポリ
    ヌクレオチド分子。
  8. 【請求項８】 約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配列
    番号１のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチ
    ド分子の補体に対して高い緊縮条件下でハイブリダイズ
    する請求項７記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  9. 【請求項９】 配列番号２のアミノ酸配列に対して相同
    であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
    ヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオ
    チド分子。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいづれか１項記載のポ
    リヌクレオチド分子の実質的な部分であるヌクレオチド
    配列から成る単離されたポリヌクレオチド分子。
  11. 【請求項１１】 約ｎｔ１〜約ｎｔ１１１１及び約ｎｔ
    ２３１８〜約ｎｔ５０４５のヌクレオチド配列から現場
    選択された、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１オープン
    リーディングフレーム（ＯＲＦ）に天然に接する（フラ
    ンキング）ヌクレオチド配列、又は前記フランキング配
    列に対して相同であるヌクレオチド配列を含んで成る単
    離されたポリヌクレオチド分子。
  12. 【請求項１２】 Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ２
    遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列を含んで成
    る単離されたポリヌクレオチド分子。
  13. 【請求項１３】 前記Ｒ２遺伝子生成物が配列番号４の
    アミノ酸配列を含んで成る請求項１２記載の単離された
    ポリヌクレオチド分子。
  14. 【請求項１４】 約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配
    列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る請求項１３記
    載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  15. 【請求項１５】 配列番号３のヌクレオチド配列を含ん
    で成る請求項１４記載の単離されたポリヌクレオチド分
    子。
  16. 【請求項１６】 約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配
    列番号３のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオ
    チド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチ
    ド分子。
  17. 【請求項１７】 配列番号４のアミノ酸配列を含んで成
    るポリペプチドをコードし、そして本発明の実施におい
    て有用であるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレ
    オチド分子の相補体に対して適度な緊縮条件下でハイブ
    リダイズする請求項１６記載の単離されたポリヌクレオ
    チド分子。
  18. 【請求項１８】 配列番号４のアミノ酸配列を含んで成
    るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで
    成るポリヌクレオチド分子の相補体に対して高い緊縮条
    件下でハイブリダイズする請求項１７記載の単離された
    ポリヌクレオチド分子。
  19. 【請求項１９】 約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配
    列番号３のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオ
    チド分子の相補体に対して高い緊縮条件下でハイブリダ
    イズする請求項１８記載の単離されたポリヌクレオチド
    分子。
  20. 【請求項２０】 配列番号４のアミノ酸配列に対して相
    同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
    るヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレ
    オチド分子。
  21. 【請求項２１】 請求項１２〜２０のいづれか１項記載
    のポリヌクレオチド分子の実質的な部分であるヌクレオ
    チド配列から成る単離されたポリヌクレオチド分子。
  22. 【請求項２２】 約ｎｔ１〜約ｎｔ２３１３及び約ｎｔ
    ３０２２〜約ｎｔ５０４５のヌクレオチド配列から現場
    選択された、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ２ ＯＲＦ
    に天然に接する（フランキング）ヌクレオチド配列、又
    は前記フランキング配列に対して相同であるヌクレオチ
    ド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。
  23. 【請求項２３】 Ｓ．アベルミチリスからのａｖｅＲ１
    及びａｖｅＲ２遺伝子生成物をコードするヌクレオチド
    配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。
  24. 【請求項２４】 前記ａｖｅＲ１遺伝子生成物が配列番
    号２のアミノ酸配列を含んで成り、そして前記ａｖｅＲ
    ２遺伝子生成物が配列番号４のアミノ酸配列を含んで成
    る請求項２３記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  25. 【請求項２５】 約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配
    列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅ
    Ｒ１のＯＲＦ、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の
    配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖ
    ｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る請求項
    ２４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  26. 【請求項２６】 約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ３０２１の配
    列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成
    る請求項２５記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
  27. 【請求項２７】 配列番号１のヌクレオチド配列を含ん
    で成る請求項２６記載の単離されたポリヌクレオチド分
    子。
  28. 【請求項２８】 約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配
    列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅ
    Ｒ１のＯＲＦ、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の
    配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖ
    ｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌ
    クレオチド分子に対して相同である単離されたポリヌク
    レオチド分子。
  29. 【請求項２９】 配列番号２のアミノ酸配列を含んで成
    る第１ポリペプチド及び配列番号４のアミノ酸配列を含
    んで成る第２ポリペプチドをコードし、そして本発明の
    実施において有用であるヌクレオチド配列を含んで成る
    ポリヌクレオチド分子の相補体に対して適度な緊縮条件
    下でハイブリダイズする請求項２８記載の単離されたポ
    リヌクレオチド分子。
  30. 【請求項３０】 配列番号２のアミノ酸配列を含んで成
    る第１ポリペプチド及び配列番号４のアミノ酸配列を含
    んで成る第２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
    列を含んで成るポリヌクレオチド分子の相補体に対して
    高い緊縮条件下でハイブリダイズする請求項２９記載の
    単離されたポリヌクレオチド分子。
  31. 【請求項３１】 約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配
    列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅ
    Ｒ１のＯＲＦ、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の
    配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖ
    ｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成るポリヌ
    クレオチド分子の相補体に対して、高い緊縮条件下でハ
    イブリダイズする請求項３０記載の単離されたポリヌク
    レオチド分子。
  32. 【請求項３２】 配列番号２のアミノ酸配列に対して相
    同であるアミノ酸配列を有する第１ポリペプチド及び配
    列番号４のアミノ酸配列に対して相同であるアミノ酸配
    列を有する第２ポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。
  33. 【請求項３３】 請求項２３〜３２のいづれか１項記載
    のポリヌクレオチド分子の実質的な部分であるヌクレオ
    チド配列から成る単離されたポリヌクレオチド分子。
  34. 【請求項３４】 約ｎｔ１〜約ｎｔ１１１１及び約ｎｔ
    ３０２２〜約ｎｔ５０４５のヌクレオチド配列から現場
    選択された、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１及びａｖ
    ｅＲ２のＯＲＦに天然において接する（フランキング）
    ヌクレオチド配列、又は前記フランキング配列に対して
    相同であるヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポ
    リヌクレオチド分子。
  35. 【請求項３５】 配列番号１のヌクレオチド配列から成
    るポリヌクレオチド分子に対して、又は配列番号１のヌ
    クレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列から成
    るポリヌクレオチド分子に対して高い緊縮条件下でハイ
    ブリダイズするオリゴヌクレオチド分子。
  36. 【請求項３６】 （ａ）配列番号２又は配列番号４のア
    ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成る
    ポリヌクレオチド分子；又は（ｂ）前記（ａ）のポリヌ
    クレオチド分子に対して相同であるポリヌクレオチド分
    子；又は（ｃ）配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配
    列に対して相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチ
    ドをコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌク
    レオチド分子；又は（ｄ）前記（ａ），（ｂ）又は
    （ｃ）のポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分
    であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子
    を含んで成る組換えベクター。
  37. 【請求項３７】 前記ポリヌクレオチド分子が１又は複
    数の調節要素と作用可能に関連して存在する請求項３６
    記載の組換えベクター。
  38. 【請求項３８】 選択マーカー又はレポーター遺伝子生
    成物をコードするヌクレオチド配列をさらに含んで成る
    請求項３６記載の組換えベクター。
  39. 【請求項３９】 約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配
    列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る請求項３６記
    載の組換えベクター。
  40. 【請求項４０】 約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の配
    列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る請求項３６記
    載の組換えベクター。
  41. 【請求項４１】 約ｎｔ１１１２〜約ｎｔ２３１７の配
    列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖｅ
    Ｒ１のＯＲＦ、及び約ｎｔ２３１４〜約ｎｔ３０２１の
    配列番号１に示されるようなＳ．アベルミチリスのａｖ
    ｅＲ２のＯＲＦのヌクレオチド配列を含んで成る請求項
    ３６記載の組換えベクター。
  42. 【請求項４２】 プラスミドｐＳＥ２０１（ＡＴＣＣ
    ２０３１８２）である請求項４１記載の組換えベクタ
    ー。
  43. 【請求項４３】 請求項３６記載の組換えベクターを含
    んで成る、形質転換された宿主細胞。
  44. 【請求項４４】 配列番号２又は配列番号４のアミノ酸
    配列を含んで成る実質的に精製され又は単離されたポリ
    ペプチド、又はその相同ポリペプチド又はペプチドフラ
    グメント。
  45. 【請求項４５】 配列番号２又は配列番号４のアミノ酸
    配列を含んで成る実質的に精製されもしくは単離された
    ポリペプチド、又はその相同ポリペプチドもしくはペプ
    チドフラグメントを製造するための方法であって、前記
    ポリペプチド又はペプチドフラグメントの発現の助けと
    なる条件下で請求項４３記載の形質転換された宿主細胞
    を培養し、そして発現されたポリペプチド又はペプチド
    フラグメントを、実質的に精製され又は単離された形で
    前記細胞培養物から回収することを含んで成る方法。
  46. 【請求項４６】 （ａ）ストレプトミセス アベルミチ
    リスからのａｖｅＲ１遺伝子生成物又はａｖｅＲ２遺伝
    子生成物をコードするヌクレオチド配列を含んで成り；
    又は（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチド分子に対して
    相同であり；又は（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリヌ
    クレオチド分子の実質的な部分であるヌクレオチド配列
    から成り；又は（ｄ）Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１
    のＯＲＦ又はａｖｅＲ２のＯＲＦに天然において接する
    （フランキング）ヌクレオチド配列を含んで成り；そし
    て前記ポリヌクレオチド分子がさらに、ａｖｅＲ１遺伝
    子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖ
    ｅＲ２遺伝子の両者において突然変異を担持するＳ．ア
    ベルミチリスの株の細胞により生成されるアベルメクチ
    ンの量において、前記遺伝子突然変異を担持しない同じ
    株の細胞に比較して、検出できる上昇をもたらす少なく
    とも１つの突然変異を含んで成るポリヌクレオチド分
    子。
  47. 【請求項４７】 完全なＳ．アベルミチリスａｖｅＲ１
    のＯＲＦもしくはその相同ポリヌクレオチド分子、又は
    その実質的な部分；完全なＳ．アベルミチリスａｖｅＲ
    ２のＯＲＦもしくはその相同ポリヌクレオチド分子、又
    はその実質的な部分；又は完全なＳ．アベルミチリスａ
    ｖｅＲ１及びａｖｅＲ２のＯＲＦ又はその相同ポリヌク
    レオチド分子、又はその実質的な部分；又はＳ．アベル
    ミチリスのａｖｅＲ１のＯＲＦに天然において接し、又
    はＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ２のＯＲＦに天然にお
    いて接し、又はＳ．アベルミチリスのａｖｅＲ１及びａ
    ｖｅＲ２のＯＲＦの両者に天然において接するヌクレオ
    チド配列を含んで成り；そして前記ポリヌクレオチド分
    子が、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又
    はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者に突然変異を
    担持するＳ．アベルミチリスの株の細胞により生成され
    るアベルメクチンの量が前記突然変異を担持しない同じ
    株の細胞に比較して、検出できるなど高められるよう、
    Ｓ．アベルミチリスのａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅ
    Ｒ２遺伝子のいづれか、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２
    遺伝子の両者を突然変異するのに有用である請求項４６
    記載のポリヌクレオチド分子。
  48. 【請求項４８】 請求項４６又は４７記載のポリヌクレ
    オチド分子を含んで成る、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅ
    Ｒ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子のいづれか、又は
    ａｖｅＲ１遺伝子及びａｖｅＲ２遺伝子の両者中に突然
    変異を導入するために有用な遺伝子構造体。
  49. 【請求項４９】 それぞれ、ａｖｅＲ１遺伝子もしくは
    ａｖｅＲ２遺伝子の一部を欠失することによって、又は
    それぞれ、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子
    の一部を、異なったもしくは異種のヌクレオチド配列に
    より置換することによって、Ｓ．アベルミチリスのａｖ
    ｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子を突然変異誘発でき
    る請求項４８記載の遺伝子構造体。
  50. 【請求項５０】 ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の一
    部を欠失することによって、又はａｖｅＲ１及びａｖｅ
    Ｒ２遺伝子の一部を、異なった又は異種ヌクレオチド配
    列により置換することによって、Ｓ．アベルミチリスの
    ａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２の両者を突然変異誘発するこ
    とができる請求項４９記載の遺伝子構造体。
  51. 【請求項５１】 それぞれ、異なった又は異種ヌクレオ
    チド配列を、ａｖｅＲ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子中
    に挿入することによって、Ｓ．アベルミチリスのａｖｅ
    Ｒ１遺伝子又はａｖｅＲ２遺伝子を突然変異誘発するこ
    とができる請求項４８記載の遺伝子構造体。
  52. 【請求項５２】 遺伝子突然変異を担持しないストレプ
    トミセスの種又は株の細胞に比較して、遺伝子突然変異
    を担持するストレプトミセスの種又は株の細胞により生
    成されるアベルメクチンの量を検出できるほど高めるこ
    とができる、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝
    子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の突然
    変異を同定するための方法であって、（ａ）ストレプト
    ミセスの種又は株の細胞により生成されるアベルメクチ
    ンの量を測定し；（ｂ）段階（ａ）のストレプトミセス
    の種又は株の細胞の、ａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅ
    Ｒ２遺伝子中に、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子
    の両者中に突然変異を導入し；そして（ｃ）遺伝子突然
    変異を担持しない段階（ａ）の細胞により生成されるア
    ベルメクチンの量に、段階（ｂ）において生成されるよ
    うな遺伝子突然変異を担持する細胞により生成されるア
    ベルメクチンの量を比較することを含んで成り；段階
    （ｂ）において生成されるような遺伝子突然変異を担持
    する細胞により生成されるアベルメクチンの量が遺伝子
    突然変異を担持しない段階（ａ）の細胞により生成され
    るアベルメクチンの量よりも検出できるほど高い場合、
    生成されるアベルメクチンの量を検出できるほど高める
    ことができる、ａｖｅＲ１もしくはａｖｅＲ２遺伝子、
    又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の突然変異が同定
    されることを特徴とする方法。
  53. 【請求項５３】 前記ストレプトミセスの種が、Ｓ．ア
    ベルミチリスである請求項５２記載の方法。
  54. 【請求項５４】 ストレプトミセスの種又は株の修飾さ
    れていない細胞に比較して、検出できるほど高められた
    量のアベルメクチンを生成する、ストレプトミセスの種
    又は株の遺伝子的に修飾された細胞の調製方法であっ
    て、ストレプトミセスの種又は株の細胞におけるａｖｅ
    Ｒ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１
    及びａｖｅＲ２遺伝子の両者を突然変異誘発し、そして
    遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセスの種又は
    株の細胞に比較して、検出できるほど高められた量のア
    ベルメクチンを生成する突然変異誘発された細胞を選択
    することを含んで成る方法。
  55. 【請求項５５】 前記ストレプトミセスの種がＳ．アベ
    ルミチリスである請求項５４記載の方法。
  56. 【請求項５６】 前記突然変異が、ａｖｅＲ１遺伝子も
    しくはａｖｅＲ２遺伝子の一部を欠失することによっ
    て、又はａｖｅＲ１遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子の
    一部を、異なったもしくは異種ヌクレオチド配列により
    置換することによって実施される請求項５４記載の方
    法。
  57. 【請求項５７】 前記突然変異が、ａｖｅＲ１及びａｖ
    ｅＲ２遺伝子の両者の一部を欠失することによって、又
    はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺伝子の両者の一部を、異
    なった又は異種ヌクレオチド配列により置換することに
    よって実施される請求項５４記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記突然変異が、ａｖｅＲ１遺伝子又
    はａｖｅＲ２遺伝子中に、異なった又は異種ヌクレオチ
    ド配列を挿入することによって実施される請求項５４記
    載の方法。
  59. 【請求項５９】 ストレプトミセスの株であって、その
    細胞が、遺伝子突然変異を担持しないストレプトミセス
    の種又は株の細胞に比較して、ａｖｅＲ１遺伝子もしく
    はａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及びａｖｅＲ２遺
    伝子の両者への１又は複数の突然変異の結果として検出
    できるほど高められた量のアベルメクチンを生成するこ
    とを特徴とする株。
  60. 【請求項６０】 前記ストレプトミセスの種がＳ．アベ
    ルミチリスである請求項５９記載の株。
  61. 【請求項６１】 ストレプトミセスの培養により生成さ
    れる高められた量のアベルメクチンを生成するための方
    法であって、遺伝子突然変異を担持しない種又は株の細
    胞に比較して、遺伝子突然変異を担持するストレプトミ
    セスの種又は株の細胞により生成されるアベルメクチン
    の量を検出できるほど高めるよう作用する、ａｖｅＲ１
    遺伝子もしくはａｖｅＲ２遺伝子、又はａｖｅＲ１及び
    ａｖｅＲ２遺伝子の両者における突然変異を含んで成
    る、ストレプトミセスの種又は株の細胞を、それからア
    ベルメクチンの生成を可能にし又は誘発する条件下で、
    培養培地において培養し、そしてその培養物からアベル
    メクチンを回収することを含んで成る方法。
  62. 【請求項６２】 前記ストレプトミセスの種がＳ．アベ
    ルミチリスである請求項６１記載の方法。
  63. 【請求項６３】 本発明のａｖｅＲ１遺伝子生成物、ａ
    ｖｅＲ２遺伝子生成物、相同ポリペプチド、又はペプチ
    ドフラグメントに対して向けられた抗体。
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