CZ323299A3 - Regulační geny Streptomyces avermitilis a způsob zvýšené produkce avermektinů - Google Patents

Abstract

Přípravky a způsob produkce avermektinů na základě identifikace a charakterizace dvou nových genů, označených aveRl a aveR2, které se podílejí na regulaci exprese enzymu avermektinpolyketidsyntázy (PKS) a biosyntéze avermektinů v Streptomyces avermitilis. Inaktivace těchto genů vede k tomu, že S. avermitilis produkuje zvýšené množství avermektinů

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká sloučenin a způsobů pro produkci avermektinů a spadá primárně do veterinární oblasti. Konkrétně se vynález týká identifikace a charakterizace dvou nových genů, které jsou zde nazvány aveRl a aveR2, které se účastní regulace exprese enzymu avermektinpolyketidsyntázy (PKS) a biosyntézy avermektinu ve Streptomyces avermitilis. Předkládaný vynález je založen na objevu, že inaktivace těchto genů vede ke zvýšení množství avermektinu produkovaného S. avermitilis.

Dosavadní stav techniky

Streptomycety tvoří široké spektrum sekundárních metabolitů, včetně avermektinu, který obsahuje řadu osmi příbuzných šestnáctičlenných makrocyklických laktonů se silným antihelmintickým a insekticidním účinkem. Těchto osm různých, ale blízce příbuzných sloučenin se nazývá Ala, Alb, A2a, A2b, Bia, Blb, B2a a B2b. Řada sloučenin „a označuje přírodní avermektin, kde substituentem v poloze C25 je (S)-sek-butyl, a řada „b označuje ty sloučeniny, kde substituentem v poloze C25 je isopropyl. Označení „A a „B se týkají avermektinů s metoxyskupinou nebo hydroxyskupinou jako substituentem v poloze C25. A dále „1 označuje avermektiny, kde je dvojná vazba přítomna v poloze C22,23 a „2 označuje avermektiny mající vodík v poloze C22 a hydroxyskupinu v poloze C23. Z příbuzných avermektinů je typ B1 znám jako avermektin s nejúčinnějši antiparazitární a pesticidní aktivitou a je to tudíž komerčně nejvíce žádoucí typ.

• · ·

»

Avermektiny a jejich produkce aerobní fermentací kmenů S. avermitilis jsou popsány, kromě jiného, v patentech Spojených Států č. 4 310 519 a č. 4 429 042.

Geny pro avermektin (ave geny), stejně jako mnoho genů zúčastněných v tvorbě sekundárních metabolitů a jiných antibiotik Streptomyces, se nalézají blízko sebe nahloučené v genové skupině na bakteriálním chromozómu. Skupina ave genů pro biosyntézu zaujímá fragment genomové DNA velikosti 95 kb, který obsahuje také DNA kódující avermektinpolyketidsyntázu, PKS (MacNeil et al., 1992, Gene 115: 119-125).

Regulace biosyntézy antibiotik ve Streptomyces je zřejmě nejlépe charakterizovaná u druhu Streptomyces coelicolor. Tento druh tvoří čtyři antibiotika, a sice aktinorhodin (Act) , undecylprodigiosin (Red), antibiotikum závislé na kalciu (CDA) a metylenomycin (Mmy). Každé z těchto antibiotik je kódováno odlišnou genovou skupinou geneticky odlišných genů. Byly identifikovány geny, které jsou spojeny s genovou skupinou Act nebo s genovou skupinou Red, a které specificky regulují expresi biosyntetické genové skupiny Act nebo Red. Byla také identifikována řada lokusů obsahujících geny, které regulují globálně více než jednu genovou skupinu biosyntézy antibiotik. Např. bylo ukázáno, že mutace ve dvou nezávislých lokusech absA a absB blokují syntézu všech čtyřech antibiotik u Streptomyces coelicolor (Brian et al., 1996, J. Bact. 178: 3221-3231) . Lokus absA byl klonován a charakterizován a bylo ukázáno, že jeho genový produkt se účastní v dráze signální transdukce, která normálně působí jako globální negativní regulátor syntézy antibiotik u S. coelicolor (Brian et al., 1996, viz výše).

Patent U.S. 5 707 839 (Denoya) a U.S. 5 728 561 (Denoya et al.) se týkají DNA sekvencí kódujících komplexy dehydrogenázy alfaketokyselin s rozvětveným řetězcem ze Streptomycet a způsobů zvýšení produkce nových avermektinů.

• · · · · ·

Porozumění mechanismu, kterým je regulována exprese polyketidsyntázy typu I u S. avermitilis umožní genové manipulace ave genů vedoucí ke zvýšení tvorby avermektinů.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující produkt genu aveRl ze S. avermitilis. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu produkt genu aveRl obsahuje aminokyselinovou sekvenci identifikačního čísla 2 (id. č. 2). V provedení předkládaného vynálezu, které vynález nijak neomezuje, izolovaná molekula polynukleotidu podle vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci aveRl ORF (otevřeného čtecího rámce aveRl] ze S. avermitilis uvedenou zde jako sekvenci id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317. V jiném provedení, které také vynález neomezuje, izolovaná molekula polynukleotidu obsahuje nukleotidovou sekvenci id. č. 1.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která je homologní s molekulou polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci aveRl ORF ze S. avermitilis, která je zde uvedena jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci homologní s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, jehož nukleotidová sekvence je podstatnou částí kteréhokoliv výše uvedeného polynukleotidu příbuzného aveRl. Ve výhodném provedení podstatná část molekuly polynukleotidu příbuzného aveRl je nukleotidová sekvence kódující peptidový fragment z produktu genu aveRl ze a : • 4 • · ·· '··'··'..... '··

I · 4 4«

S. avermitilis nebo homologní polypeptid příbuzný aveRl. Ve specifickém neomezujícím provedení předkládaný vynález poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, kterou je nukleotidová sekvence kódující peptidový fragment, který je subsekvencí aminokyselinové sekvence id. č. 2.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu obsahující jednu nebo několik nukleotidových sekvencí, které přirozeně in sítu obklopují z obou stran sekvenci aveRl ORF v S. avermitilis. Takové lemující sekvence lze vybrat ze sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1 do nukleotidu 1111 a od nukleotidu 2318 do nukleotidu 5045. Předkládaný vynález také poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu obsahující jednu nebo několik nukleotidových sekvencí, které jsou homologní k sekvencím, které přirozeně in šitu lemují sekvenci aveRl ORF v S. avermitilis. každá z těchto lemujících sekvencí nebo jejích homologů v izolované molekule polynukleotidu podle předkládaného vynálezu je výhodně dlouhá nejméně 200 nukleotidů. V neomezujícím provedení vynálezu izolovaná molekula polynukleotidu obsahuje jednu nebo několik výše uvedených nukleotidových sekvencí, které přirozeně in šitu lemují sekvenci aveRl ORF v S. avermitilis nebo sekvencí s nimi homologními, a dále obsahuje jednu z výše zmíněných nukleotidových sekvencí příbuzných aveRl podle vynálezu jako je např. nukleotidová sekvence aveRl ORF ze S. avermitilis uvedená zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317 nebo její podstatnou část.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje produkt genu aveR2 ze S. avermitilis. Ve výhodném provedení vynálezu produkt genu aveR2 obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 4. V neomezujícím provedení předkládaného vynálezu izolovaná molekula polynukleotidu obsahuje nukleotidovou sekvenci aveR2 ORF ze

S. avermitilis uvedenou zde jako sekvence id. č. 3 (pozor, sekvence id. č. 3 je identická se sekvenci id. č. 1) od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021. V dalším neomezujícím provedená vynálezu izolovaná molekula polynukleotidu podle vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci id. č. 3.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, který je homologní s polynukleotidem obsahujícím nukleotidovou sekvenci aveR2 ORF ze S. avermitilis jak je uvedena v sekvenci id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která je homologní s aminokyselinovou sekvencí id. č. 4.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, kterou tvoří nukleotidová sekvence, jež je podstatnou částí kterékoliv výše zmíněné molekuly polynukleotidu příbuzného aveR2 podle vynálezu. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu podstatná část molekuly polynukleotidu příbuzného aveR2 je tvořena nukleotidovou sekvencí, která kóduje peptidový fragment produktu genu aveR2 ze S. avermitilis nebo příbuzný peptid homologní s aveR2 podle vynálezu. Ve specifickém neomezujícím provedení vynález poskytuje molekulu polynukleotidu tvořenou nukleotidovou sekvenci, která kóduje peptidový fragment, který je subsekvencí aminokyselinové sekvence id. č. 4.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu obsahující jednu nebo několik nukleotidových sekvencí, které přirozeně in šitu lemují aveR2 ORF v S. avermitilis. Takové lemující sekvence lze vybrat z nukleotidové sekvence id. č. 3 od nukleotidu 1 do nukleotidu 2313 a od nukleotidu 3022 do nukleotidu 5045. Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu • · · · · · sekvencí, které přirozeně v S. avermitilis, nebo obsahující jednu nebo několik nukleotidových sekvencí, které jsou homologní s nukleotidovými sekvencemi, které přirozeně in šitu lemují aveR2 v S. avermitilis. Každá z lemujících sekvencí v izolované molekule polynukleotidu podle vynálezu je dlouhá nejméně 200 nukleotidů. V neomezujícím provedení vynález poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje jednu nebo několik z výše uvedených nukleotidových in šitu lemují aveR2 ORF j sou s takovými homologní nukleotidovými sekvencemi, a která dále obsahuje jednu z výše zmíněných nukleotidových aveR2 podle sekvencí příbuzných vynálezu jako je např. nukleotidová sekvence aveR2 ORF uvedená zde jako sekvence id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021 nebo její podstatná část.

Dále předkládaný vynález poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, který obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující jak produkt genu aveRl tak i genu aveR2 ze S. avermitilis. Ve výhodném provedení vynálezu produkty genů aveRl a aveR2 obsahují aminokyselinové sekvence id. č. 2 a id. č. 4. V nemezujícím provedení vynálezu izolovaná molekula polynukleotidu obsahuje nukleotidovou sekvenci aveRl ORF ze S. avermitilis uvedenou jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317 a aveR2 ORF ze S. avermitilis uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021. V dalším neomezujícím provedení vynálezu izolovaná molekula polynukleotidu obsahuje nukleotidovou sekvenci id. č.

do nukleotidu 3021.

izolovaná molekula obsahuje nukleotidovou sekvenci id. č. 1.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, který je homologní s molekulou polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci jak aveRl tak i aveR2 ze S. avermitilis. V nemezujícím provedení vynález poskytuje ještě v dalším polynukleotidu od nukleotidu 1112 nemezujícím provedení »· ··· · • · 9 9

9999 99 izolovanou molekulu polynukleotidu, která je homologni s polynukleotidovou molekulou obsahující nukleotidovou sekvenci aveRl uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317 a aveR2 ze . S. avermítilis uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, který obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující první polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci homologni s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2a druhý polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci homologni s aminokyselinovou sekvencí id. č. 4.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která je tvořena nukleotidovou sekvencí, která je podstatnou částí z kterékoliv výše zmíněné polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci kódující jak produkt genu aveRl tak produkt genu aveR2 ze S. avermítilis nebo kteroukoliv z výše zmíněných polynukleotidových molekul s nimi homologními. Ve specifickém neomezujícím provedení podstatná část polynukleotidové molekuly je tvořena nukleotidovou sekvencí aveRl ORF uvedenou jako sekvence i. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317. V jiném specifickém neomezujícím provedení vynálezu podstatná část molekuly polynukleotidu je nukleotidové sekvence aveR2 ORF uvedená jako sekvence id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje jednu nebo několik nukleotidových sekvencí přirozeně'in šitu lemujících aveRl ORF a aveR2 ORF v S. avermítilis. Takové lemující sekvence lze vybrat z nukleotidové sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1 do nukleotidu 2313 a od nukleotidu 3022 do nukleotidu 5045. Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu obsahující jednu nebo několik nukleotidových

9 9 •9 9999

9

99 • 9 9

9 9 • 9 9 sekvencí, které jsou homologní s nukleotidovými sekvencemi, které přirozeně in šitu lemují aveRl ORF a aveR2 ORF v S. avermitilis. Každá z lemujících sekvencí nebo jejích homologů v izolované molekule polynukleotidu podle vynálezu je dlouhá výhodně nejméně 200 nukleotidů. V neomezujícím provedení vynález poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje jednu nebo několik z výše uvedených nukleotidových sekvencí, které přirozeně in šitu lemují aveRl ORF a aveR2 ORF v S. avermitilis, nebo jsou homologní s takovými nukleotidovými sekvencemi, a která dále obsahuje jednu z výše zmíněných nukleotidových sekvencí podle vynálezu kódujících buďto oba nebo jeden z produktů genů aveRl a aveR2 ze S. avermitilis, jako je např. nukleotidové sekvence aveRl ORF z S. avermitilis uvedená zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317 a nebo nukleotidové sekvence aveR2 ORF z S. avermitilis uvedená zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021, anebo jejich podstatná část.

Předkládaný vynález dále poskytuje oligonukleotidové molekuly, které jsou užitečné jako oligonukleotidové primery (očka) pro amplifikaci kterékoliv z výše zmíněných polynukleotidových molekul podle vynálezu nebo jejich částí, nebo které se mohou užít ke kódování nebo působení jako „anti-sense molekuly užitečné v regulaci genové exprese genů ave a v produkci avermektinu.

Dále předkládaný vynález poskytuje způsob klonování a exprese kterékoliv molekuly polynukleotidu nebo oligonukleotidové molekuly podle vynálezu, včetně klonovacích vektorů, expresních vektorů, transformovaných hostitelských buněk obsahujících kterýkoliv z uvedených vektorů, a nových kmenů nebo buněčných linií z nich odvozených. V neomezujícím provedení předkládaný vynález poskytuje rekombinantní expresní vektor, který obsahuje polynukleotidovou molekulu podle

4444 44 • 4 4444 44 ·♦ »4 4 · 4 4 · » · 4 4 · * · »4 44444 · » 4 4 1

44 vynálezu operativně regulačními prvky polynukleotidu, Ve s jedním nebo pro expresi neomezuj ícím několika molekuly provedení spoj enou nezbytnými specifickém předkládaný vynález poskytuje plazmid pSE201 .(ATCC 203182), který obsahuje úplný ORF jak pro gen aveRl tak i pro aveR2 z S. avermitilis. Další plazmidy jsou popsány dále v textu.

Předkládaný vynález dále poskytuje v podstatě čistý nebo izolovaný polypeptid, který je kódován molekulou polynukleotidu podle vynálezu. Ve specifickém neomezujícím provedení tento polypeptid je produkt genu aveRl obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 2. V jiném neomezujícím provedení polypeptid je produkt obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 4. vynález dále poskytuje v postatě čisté nebo specifickém genu aveR2 Předkládaný izolované nebo aveR2 nebo homologní poskytuje způsob přípravy polypeptidy, které jsou homologní buďto s produktem genu aveRl nebo produktem genu aveR2 podle vynálezu. Předkládaný vynález dále poskytuje v podstatě čistý nebo izolovaný polypeptidový fragment produktu genu aveRl polypeptidy podle vynálezu.

Předkládaný vynález dále v podstatě čistého nebo izolovaného produktu genu aveRl, genu aveR2, homologního polypeptidu nebo peptidového fragmentu podle předkládaného vynálezu, který spočívá v tom, že se kultivují hostitelské buňky transformované nebo transfekované rekombinantním expresním vektorem podle vynálezu za podmínek vhodných pro expresi konkrétního kódovaného genového produktu, polypeptidu nebo peptidového fragmentu, a pak se z buněčné kultury izoluje exprimovaný genový produkt, polypeptid nebo peptidový fragment.

Předkládaný vynález dále poskytuje sloučeniny a způsoby pro genetickou modifikaci buněk druhů nebo kmenů Streptomyces, včetně genových konstruktů jako jsou např. vektory pro nahrazování genů. Podle předkládaného vynálezu buňky druhů • »

• φ • φ φ φ φ φ * φ φ φ Φ· φ φ φ «φ *φ φ

φφφφ nebo kmenů Streptomyces geneticky modifikovány tak, aby produkovaly množství avermektinů, které je detekovatelně odlišné od množství avermektinů produkovaných buňkami stejného druhu nebo kmenu, který nebyl takto modifikován. Ve výhodném provedení buňky druhů nebo kmenů Streptomyces jsou geneticky modifikovány tak, aby produkovaly zvýšené množství avermektinů ve srovnání s množstvím avermektinů produkovaným buňkami stejného druhu nebo kmenu, které nebyly modifikovány. V dalším výhodném provedení vynálezu druhem Streptomyces je S. avermitilis. Podle předkládaného vynálezu taková genetická modifikace výhodně obsahuje mutaci buďto genu aveRl nebo genu aveR2 nebo obou genů aveRl a aveR2, přičemž tato mutace vede k detekovatelnému zvýšení v množství avermektinů produkovaného buňkami druhu nebo kmenu S. avermitilis nesoucího mutaci v genu aveRl nebo aveR2 nebo v obou těchto genech ve srovnání s buňkami stejného druhu nebo kmenu, který nenese tuto mutaci. Mutaci genu aveRl nebo genu aveR2 nebo obou genů aveRl a aveR2 je možné provést standardními mutačními postupy, jako je např. expozice chemickému mutagenu nebo záření, nebo pomocí genového konstruktu podle vynálezu, jako je např. vektor nahrazující gen pro mutaci genu aveRl nebo aveR2 nebo obou těchto genů např. adicí, delecí nebo substitucí nukleotidů, nebo vnesením posunové mutace, nebo vnesením odlišné nebo heterologní nukleotidové sekvence do genu aveRl nebo aveR2, nebo delecí části nebo celého genu aveRl nebo aveR2 nebo obou těchto genů, nebo nahrazením části nebo celého genu aveRl nebo aveR2 nebo obou těchto genů odlišnou nebo heterologní nukleotidovou sekvencí, a nebo kombinací těchto způsobů mutace.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob identifikace mutace v genu aveRl nebo aveR2 nebo v obou těchto genech aveRl i aveR2, u druhů nebo kmenů Streptomyces, kteréžto mutace jsou schopné detekovatelně zvýšit množství avermektinů produkovaných buňkami druhů nebo kmenů Streptomyces nesoucích »'·' ' · · · ·......

• · • · • · · ί···»· ·<-· mutace ve srovnání s buňkami stejných kmenů nebo druhů Streptomyces bez genové mutace, přičemž tento způsob spočívá v tom, že se: a) měří množství avermektinů produkované buňkami určitého druhu nebo kmenu Streptomyces, b) vnese se mutace do genu aveRl nebo aveR2 nebo do obou těchto genů aveRl a aveR2 v buňkách tohoto druhu nebo kmenu, c) porovná se množství avermektinů tvořené buňkami nesoucích genovou mutaci připravených v b) s množstvím avermektinů tvořených buňkami v a), které nenesou mutaci, přičemž jestliže je množství avermektinů produkované buňkami nesoucími genovou mutaci podle b) detekovatelně vyšší než množství avermektinů produkovaných buňkami v kroku a) , které nenesou mutaci, pak mutace v genu aveRl nebo v genu aveR2 nebo v obou genech aveRl i aveR2, schopná zvýšit detekovatelně množství avermektinů byla identifikována. Druhem Streptomyces ve výhodném provedení je S. avermitilis.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob přípravy geneticky modifikovaných buněk z určitého druhu nebo kmenu Streptomyces, kde modifikované buňky produkují detekovatelně vyšší množství avermektinů ve srovnání s nemodifikovanými buňkami téhož druhu nebo kmenu, přičemž tento způsob spočívá v tom, že se mutuje gen aveRl nebo gen aveR2 nebo oba geny aveRl i aveR2, v buňkách druhu nebo kmenu Streptomyces a selektují se takové buňky, které produkují detekovatelně vyšší množství, avermektinů v důsledku mutace ve srovnání s buňkami téhož druhu nebo kmenu, které nenesou mutaci. Druhem Streptomyces je ve výhodném provedení vynálezu S. avermitilis. ve specifickém neomezujícím provedení vynálezu popsaném dále v části 6.9.1, byl jak gen aveRl tak gen aveR2 ze S. avermitilis mutován tím, že se nahradila část ORF v každém genu heterologním genem, což vedlo k vytvoření buněk S. avermitilis, které produkovaly detekovatelně vyšší množství avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmenu '44 ···· ^ι'4· ' 4444 ' 44 ·· · · · · · · · · ·· ··· 4 4 4 4 • · · 4 4 444 44 4 • · 4 4444 · 4 4 4

S. avermitilis, ve kterých nebyly geny aveRl ani aveR2 takto mutovány.

Předkládaný vynález dále poskytuje nové kmeny Streptomyces, jejichž buňky produkuji detekovatelně vyšší množství avermektinů v důsledku jedné nebo několika mutací v genu aveRl nebo v genu aveR2 nebo v obou těchto genech aveRl i aveR2‘, ve srovnání s buňkami stejného kmenu Streptomyces, které nenesou mutaci. Kmen Streptomyces je ve výhodném provedení vynálezu kmen druhu S. avermitilis. Nové kmeny podle předkládaného vynálezu jsou užitečné pro průmyslovou výrobu avermektinů, jako je např. komerčně žádaný doramektin.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob zvýšení množství avermektinů produkovaného kulturami Streptomyces, který spočívá v tom, že se kultivují buňky určitého druhu nebo kmenu Streptomyces, které obsahují mutaci v genu aveRl nebo v genu aveR2 nebo v obou těchto genech aveRl i aveR2, kterážto mutace slouží k detekovatelnému zvýšení množství avermektinů produkovaného buňkami druhu nebo kmenu nesoucími mutaci ve srovnání s buňkami téhož druhu nebo kmenu, které nenesou mutaci, v kultivačním médiu v podmínkách, které jim dovolují nebo v nich indukují produkci avermektinů, a avermektiny se izolují z kultury. Druhem Streptomyces je ve výhodném provedení S. avermitilis. způsob je užitečný pro zvýšení účinnosti výroby avermektinů.

Předkládaný vynález dále poskytuje protilátky namířené proti produktu genu aveRl, produktu genu aveR2, homolognímu polypeptidu nebo peptidovému fragmentu podle předkládaného vynálezu.

Přehled obrázků

Obr. 1. A. Srovnání dedukované aminokyselinové sekvence kódované genem pro homolog histidinkinázy (absAl) • · · · · · ···· • · · · · · • · · · · • · » · · · z S. coelicolor a genu aveRl ze S. avermitilis ukazuje 32% sekvenční identity.

B. Srovnání dedukované aminokyselinové sekvence kódované genem pro homolog regulátoru odpovědi (absA2) z S. coelicolor a genu aveR2 ze S. avermitilis ukazuje 45% sekvenční identity. Silně konzervativní aminokyseliny jsou vyznačeny tučně.

Obr. 2. A. Plazmidový vektor pSE201 (ATCC 203182) obsahující aveRlORF a aveR20RF.

B. Plazmidový vektor pSE210 obsahující aveRl ORF a aveR2 ORF.

Obr. 3. A. Vektor nahrazující gen pSE214 obsahující gen ermE, kterým byla nahrazena část genu aveRl ORF a aveR2 ORF.

B. Vektor nahrazující gen pSE216 obsahující gen ermE, který byl vložen do aveR2 ORF.

Obr. 4. Restrikční mapa štěpení BamHI genové skupiny avermektinpolyketidsyntázy ze S. avermitilis s pěti překrývajícími se kosmidovými klony, které byly identifikovány (tj. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68 a pSE69).

Detailní popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká identifikace a charakterizace molekul polynukleotidu, které mají nukleotidovou sekvenci kódující produkty genu aveRl a aveR2 ze S. avermitilis a využití objevu, že mutace těchto genů může modulovat množství produkovaných avermektinů. Vynález je dále popsán formou příkladu pro molekulu polynukleotidu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci aveRl ORF uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317, nebo přítomnou v plazmidu pSE201 (ATCC 203182) a pro molekulu polynukleotidu, »·· · « · která obsahuje nukleotidovou sekvenci aveR2 ORF, uvedenou zde jako sekvence id. č. 3 (sekvence id. č. je identická se sekvencí id. č. 1) od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021, nebo přítomnou v plazmidu pSE201 (ATCC 203182) a. pro molekuly polynukleotidu obsahující mutované nukleotidové sekvence z nich odvozené. Odkazy na nukleotidové sekvence uvedené zde jako sekvence id. č. 1 a id. č. 3 a na jejich podstatné části, jsou zamýšleny také jako odkazy na odpovídající nukleotidové sekvence a jejich podstatné části, které jsou přítomny v plazmidech pSE201 (ATCC 203182), pokud není uvedeno jinak. Kromě toho odkazy na aminokyselinové sekvence uvedené zde jako sekvence id. č. 2 a id. č. 4 a jejich peptidové fragmenty, se také vztahují k odpovídajícím aminokyselinovým sekvencím a jejich peptidovým fragmentům, kódovaným odpovídajícími nukleotidovými sekvencemi kódujícími geny aveRl a aveR2 přítomnými v plazmidu pSE201 (ATCC 203182) pokud není uvedeno j inak.

1. Molekuly polynukleotidu

Termíny „molekuly polynukleotidu, „polynukleotidová sekvence, „kódující sekvence, „otevřený čtecí rámec (ORF) apod. se týkají jak DNA tak i RNA molekul, které jsou buďto jednořetězcové nebo dvouřetězcové. Kódující sekvence nebo ORF je prokaryotická sekvence, sekvence cDNA, sekvence genomové DNA nebo chemicky syntetizovaná sekvence DNA nebo RNA, přičemž tento výčet není omezující.

Příprava a úpravy molekul polynukleotidu a oligonukleotidů jsou odborníkům dostatečně známy a jejich popis lze najít např. v publikaci Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Ausubel et al., 1989, Greene Publishing Associates And Wiley Interscience, NY, Sambrook et al., 1989,

4 4 4 • ·· ·

4 44 4 4444

44 4 4444

444 4 444 44 4 • 44 4444 4444

4444 44 44 44 44 44 ed., Cold Spring NY, Innis et al. Inc., San Diego, University Press, Manipulation of Innes Foundation,

Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, (eds.), 1995, PCR Strategies, Academie Press, Erlich (ed.), 1992, PCR technology, Oxford

New York, Hopwood et al., 1985, Genetic

Streptomyces. A Laboratory Manual. John Norwich, UK, na které se tímto odkazujeme.

1.1. Molekuly polynukleotidu příbuzné aveRl

Předkládaný vynález poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující produkt genu aveRl z S. avermitilis. Ve výhodném provedení genový produkt aveRl obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 2. V neomezujícím provedení vynálezu izolovaná molekula polynukleotidu podle vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci aveRl ORF ze S. avermitilis uvedenou jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317. V dalším neomezujícím provedení izolovaná molekula polynukleotidu podle vynálezu obsahuje sekvenci id. č. 1.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která je homologní s molekulou polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci aveRl ORF ze S. avermitilis uvedenou jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317. Termín „homologní, pokud se užívá v této souvislosti, znamená molekulu polynukleotidu, které obsahuje nukleotidovou sekvenci: a) která kóduje tentýž polypeptid jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317, ale obsahuje jednu nebo několik umlčených záměn v nukleotidové sekvenci díky degeneraci genetického kódu, nebo b) která hybridizuje s komplementem k molekule polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 2 v mírně

4444' ‘4444 44 44 ·· 4 4 4 · · · · 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4 φ 4 · 4 4 444 44 4

4444 44 44 44 44 44 stringentních podmínkách, tj. hybridizuje s DNA vázanou na filtr v 0,5 M NaHPCh, 7% SDS (dodecylsulfát sodný), 1 mM EDTA při 65 °C po opláchnutí ve 0,2xSSC(0,l% SDS při 42 °C (viz Ausubel et al.(eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology,' Vol I, Green Publishing Associates, lne. and John Wiley and Sons, lne., New York, p. 2.10.3), a je užitečná k provádění předkládaného vynálezu. Ve výhodném provedení homologní molekula polynukleotidu hybridizuje s komplementem molekuly polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 2 za silně stringentních podmínek, tj . hybridizuje s DNA vázanou na filtr v 0,5 M NaHPO₄, 7% SDS (dodecylsulfát sodný), 1 mM EDTA při 65 °C po opláchnutí ve 0,2xSSC/0,l% SDS při 68°C (viz Ausubel et al., výše), a je užitečná k provádění vynálezu. V dalším výhodném provedení homologní molekuly polynukleotidu hybridizuje s komplementem nukleotidovou za silně stringentních podmínek polynukleotidu obsahující od nukleotidu 1112 do užitečná že molekula molekuly sekvenci id nukleotidu 2317, a je užitečná k provádění vynálezu.

Molekula polynukleotidu příbuzná aveRl je k provádění vynálezu znamená v tomto popisu, polynukleotidu může být užita k vnesení mutací do aveRl ORF v S. avermitilis místně cílenou mutací, např. homologní rekombinaci, nebo může být užita k amplifikaci molekuly polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci aveRl ORF z S. avermitilis pomocí standardních způsobů amplifikace. Taková homologní molekula polynukleotidu může obsahovat v přírodě se vyskytující geny aveRl přítomné u jiných druhů Streptomyces kromě S. coelicolor, nebo v jiných kmenech S. avermitilis, a také mutované alely aveRl, ať již přirozeně se vyskytující nebo chemicky syntetizované nebo upravené metodami genového inženýrství.

4 4 4 4 4 4 4 4 » #4 4 4 · · 4 4 4

444 4 444 44 «

44 4444 4444

4444 44 44 44 44 44

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci, která je homologní s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2.· Pokud se týče polypeptidů majících aminokyselinovou sekvenci homologní s aminokyselinovou sekvencí produktu genu aveRl ze S. avermitilis, pak termín „homologní znamená polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 2, ve které byl jeden nebo několik aminokyselinových zbytků konzervativně nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem, přičemž výsledný polypeptid je užitečný k provádění předkládaného vynálezu. Konzervativní substituce aminokyselin jsou odborníkovi dobře známy. Pravidla pro provádění takových substitucí lze najít např. v publikaci Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3. a dalších. Konkrétně konzervativní substituce jsou takové, které se odehrávají v rámci rodiny aminokyselin, které jsou příbuzné aciditou, polaritou nebo velikostí postranních řetězců. Genově kódované aminokyseliny se obecně rozdělují do čtyř skupin: 1) kyselé = kyselina asparagová, kyselina glutamová, 2) bazické = lysin, arginin, histidin, 3) nepolární = alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan a 4) nenabité polární = glycin, asparagin, glutamin, cystein, serin, threonin a tyrosin. Fenylalanin, tryptofan a tyrosin se také společně řadí do skupiny aromatických aminokyselin, jedna nebo několik substitucí v rámci určité skupiny, např. nahrazení leucinu isoleucinem nebo valinem, nebo nahrazení kyseliny asparagové kyselinou glutamovou, nebo nahrazení threoninu serinem, nebo nahrazení jakéhokoliv aminokyselinové zbytku strukturně příbuzným aminokyselinovým zbytkem, např. aminokyselinovým zbytkem s podobnou aciditou, polaritou, velikostí nebo s podobnou kombinací uvedených znaků, obecně nemá vliv na funkci polypeptidu.

··♦'»'· 0 0 0‘0'' · -«♦«

Polypeptid příbuzný aveRl je „užitečný k provádění předkládaného vynálezu jestliže polypeptid může být využit k přípravě protilátek proti produktu genu aveRl ze S. avermitilis nebo pro screening sloučenin, .které modulují aktivitu aveRl nebo produkci avermektinů v Streptomyces.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která částí kterékoliv z výše uvedených molekul příbuzných aveRl polynukleotidu je podstatnou polynukleotidu „Podstatná část předkládaného vynálezu, příbuzného aveRl znamená molekulu polynukleotidu, která je menší než je úplná kódující sekvence produktu genu aveRl ze S. avermitilis nebo homologního polypeptidu příbuzného aveRl podle vynálezu, ale přitom obsahuje alespoň 20 % a více, výhodně alespoň 30 % uvedené nukleotidové sekvence, a která je užitečná k provádění předkládaného vynálezu, kdy užitečnost již byla definována výše pro molekulu polynukleotidu příbuznou aveRl.

V neomezujícím provedení vynálezu podstatná část molekuly polynukleotidu příbuzná aveRl je nukleotidová sekvence kódující peptidový fragment produktu genu aveRl ze S. avermitilis nebo homologního polypeptidu příbuzného aveRl podle vynálezu. „Peptidový fragment polypeptidu příbuzného aveRl znamená polypeptid, který je subsekvencí aminokyselinové sekvence produktu genu aveRl plné délky nebo homologního polypeptidu, přičemž subsekvence je kratší než genový produkt aveRl plné délky nebo homologní polypeptid, přičemž subsekvence je užitečná k provádění vynálezu (užitečnost byla definována výše pro polypeptidy příbuzné aveRl. Ve výhodném provedení předkládaný vynález poskytuje molekulu polynukleotidu, kterou je nukleotidová sekvence kódující peptidový fragment, kterým je subsekvence aminokyselinové sekvence id. č. 2. Peptidové fragmenty podle vynálezu mají výhodně délku alespoň 15 aminokyselinových zbytků.

·' 9 9 9 9

9 9 9·9

9999 99 izolovanou molekulu nukleotidovou sekvenci

Molekula polynukleotidu příbuzná aveRl popsaná v této přihlášce může být užita pro expresi produktu genu aveRl, k přípravě nových kmenů Streptomyces, ve kterých byl gen aveRl mutován, a také k identifikaci genů homologních.aveRl v jiných druzích nebo kmenech bakterií pomocí způsobů, které jsou odborníkům známy. Tudíž předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidu, která obsahuje kódující produkt genu homologního s aveRl. Termín „produkt genu homologního s aveRl definuje v tomto textu genový produkt kódovaný genem homologním s aveRl, kterýžto homologní gen je definován jako gen z jiného druhu Streptomyces nebo z blízce příbuzného rodu Saccharopolyspora, který je odborníkem uznán za homologní s genem aveRl z S. avermítílís na základě stupně identity nukleotidové sekvence, který je vyšší než 80 % nebo na základě toho, že obsahuje konzervativní zbytky aktivních míst typicky se vyskytující ve složkách histidinkinázy ve dvousložkových signálních systémech. Např. srovnání homologie aveRl s eubakteriálními dvousložkovými systémy z Nar/Deg subskupin ukazuje 100 % zachování histidinového zbytku (H) , který je místem autofosforylace, a také asparaginového zbytku (N) , který je nutný pro autokinázovou aktivitu.

Způsoby identifikace polynukleotidových klonů obsahujících geny homologní s aveRl jsou odborníkům známy. např. molekula polynukleotidu obsahující část aveRl ORF z S. avermitilis se může označit tak, že je detekovatelná, a pak použít . pro screening genomové knihovny zkonstruované z DNA pocházející z požadovaného organismu. Stringenci (přísnost) hybridizačních podmínek je možné vybrat na základě vztahu referenčního organismu, v tomto případě S. avermitilis, a požadovaného organismu. Požadavky podmínek s různou stringenci jsou také odborníkovi dobře známy, a tyto podmínky se mění v závislosti na organismech, ze kterých pochází knihovna a značená

4444 »4 4 · 4 4 4 4 4 4 ·· • 4 4 4 · 4 4 4 » 4 4* 444*

4*4 4 444 44 · *4 44 polynukleotidu, nukleotidových sekvence. Knihovna genomové DNA může být prohledávána pomocí sekvence genu homologního s aveRl postupem, který popsali např. Benton a Davis, 1977, Science 196: 180 pro bakteriofágové knihovny, nebo Grunstein a Hogness, 1975, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965, pro plazmidové knihovny.

Polynukleotidové molekuly, které mají nukleotidové sekvence, o kterých je známo, že obsahují aveRl ORF, jako je sekvence id. č. 1, nebo oligonukleotidové molekuly představující jejich části, se mohou využít jako sondy pro výše popsaný screening. Alternativně, mohou být syntetizovány oligonukleotidové sondy, které odpovídají nukleotidovým sekvencím dedukovaným z aminokyselinové sekvence purifikovaného produktu genu aveRl.

Klony identifikované jako klony obsahující kódující sekvence genu homologního s aveRl mohou být testovány na příslušnou biologickou funkci. Např. klon se podrobí sekvencování, aby se identifikoval odpovídající čtecí rámec a iniciační a terminační signály. Klonovaná sekvence DNA se pak vloží do vhodného expresního vektoru, který je pak transformován do buněk kmenu S. avermitilis, ve kterém byl gen aveRl vyřazen pro test komplementace. Transformované hostitelské buňky S. avermitilis se pak analyzují na produkci avermektinů metodami jako je např. analýza fermentačních produktů pomocí HPLC, jak bude popsáno v části 6.6 dále.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu která obsahuje jednu nebo několik sekvencí které přirozeně in šitu lemují aveRl ORF v S. avermitilis. Takové lemující sekvence lze vybrat z nukleotidové sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1 do nukleotidu 1111 a od nukleotidu 2318 do nukleotidu 5045. Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje jednu nebo několik nukleotidových sekvencí které jsou homologní se sekvencemi, které přirozeně in šitu lemují aveRl ORF v S. avermitilis.

• 99 ·

9

9999 99 • 9 ·

Nukleotidové sekvence je homologní se sekvencí přirozeně lemující in šitu aveRl ORF v S. avermitilis, pokud homologní nukleotidové sekvence hybridizuje s komplementem nukleotidové sekvence přirozeně lemující in šitu aveRl ORF v-S. avermitilis za mírně stringentních podmínek, tj. hybridizuje s DNA vázanou na filtr v 0,5 M NaHPO₄, 7% SDS, 1 mM EDTA při 65 °C po opláchnutí ve 0,2xSSC/0,l% SDS při 42 °C (viz Ausubei et al., výše), a je užitečná k provádění vynálezu, přičemž užitečnost byla již definována výše pro molekuly polynukleotidu příbuzné aveRl. Každá lemující sekvence, nebo její homolog, v izolované molekule polynukleotidu podle vynálezu je výhodně dlouhá alespoň 200 nukleotidů. V neomezujícím provedení vynález poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje jednu nebo několik výše zmíněných nukleotidových sekvencí, které přirozeně in šitu lemují aveRl ORF v S. avermitilis, nebo které jsou homologní s takovou nukleotidovou sekvencí, a dále obsahuje jednu z výše zmíněných nukleotidových sekvencí příbuzných aveRl podle vynálezu, jako je např. nukleotidové sekvence aveRl ORF ze S. avermitilis uvedená zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317 nebo její podstatná část.

1.2. Molekuly polynukleotidu příbuzné aveR2

Předkládaný vynález poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující produkt genu aveR2 z S. avermitilis. Ve výhodném provedení genový produkt aveR2 obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 4. V neomezujícím provedení vynálezu izolovaná molekula polynukleotidu podle vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci aveR2 ORF ze S. avermitilis uvedenou jako sekvence id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021. V dalším neomezujícím •0 0000 00 0000

0 0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0000 00 00 00

0 • 0 0

0 0

0 0

00 provedení izolovaná molekula polynukleotidu podle vynálezu obsahuje sekvenci id. č. 3.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která je homologní s molekulou.polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci aveR2 ORF ze S. avermitilis uvedenou jako sekvence id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021. Termín „homologní, pokud se užívá v této souvislosti, znamená molekulu polynukleotidu, které obsahuje nukleotidovou sekvenci: a) která kóduje tentýž polypeptid jako sekvence id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021, ale obsahuje jednu nebo několik umlčených záměn v nukleotidové sekvenci díky degeneraci genetického kódu, nebo b) která hybridizuje s komplementem k molekule polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 4 v mírně stringentních podmínkách, tj . hybridizuje s DNA vázanou na filtr v 0,5 M NaHPO4, 7% SDS, 1 mM EDTA při 65 °C po opláchnutí ve 0,2xSSC(0,l% SDS při 42 °C (viz Ausubel et al.(eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol I, Green Publishing Associates, lne. and John Wiley and Sons, lne., New York, p. 2.10.3), a je užitečná k provádění předkládaného vynálezu. Ve výhodném provedení homologní molekula polynukleotidu hybridizuje s komplementem molekuly polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 4 za silně stringentních podmínek , tj. hybridizuje s DNA vázanou na filtr v 0,5 M NaHPCh, 7% SDS (dodecylsulfát sodný), lmM EDTA při 65 °C po opláchnutí ve 0,2xSSC/0,l% SDS při 68 °C (viz Ausubel et al., výše), a je užitečná k provádění vynálezu. V dalším výhodném provedení homologní molekuly polynukleotidu hybridizuje za silně stringentních podmínek s komplementem molekuly polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci

9999 « 9 · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 · • 9 9 9 9 9 9 9 9 · 9

9999 99 99 99 99 99 id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021, a je užitečná k provádění vynálezu.

Označení, že molekula polynukleotidu příbuzná aveR2 je „užitečná k provádění vynálezu znamená v tomto popisu, že molekula polynukleotidu může být užita k vnesení mutací do aveR2 ORF v S. avermitilis homologní rekombinací, nebo místně cílenou mutací, např.

může být užita k amplifikaci molekuly polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci aveR2 ORF z S. avermitilis pomocí standardních způsobů amplifikace. Taková homologní molekula polynukleotidu může obsahovat v přírodě se vyskytující geny aveR2 přítomné u jiných druhů Streptomyces kromě S. coelicolor, nebo v jiných kmenech S. avermitilis, a také mutované alely aveR2, ať již přirozeně se vyskytující nebo chemicky syntetizované nebo upravené metodami genového inženýrství.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci, která je homologní s aminokyselinovou sekvencí id. č. 4. Pokud se týče polypeptidů majících aminokyselinovou s aminokyselinovou sekvencí produktu S. avermitilis, pak termín „homologní který obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 4 ve které byl jeden nebo několik aminokyselinových zbytků konzervativně nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem, přičemž konzervativní substituce aminokyselin byly definovány výše, a výsledný polypeptid je užitečný k provádění předkládaného vynálezu.

Polypeptid příbuzný aveR2 je „užitečný k provádění předkládaného vynálezu jestliže polypeptid může být využit k přípravě protilátek proti produktu genu aveR2 ze S. avermitilis nebo pro screening sloučenin, které modulují aktivitu aveR2 nebo produkci avermektinu v Streptomyces.

sekvenci homologní genu aveR2 ze znamená polypeptid,

99

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

99

MM ·· ** ♦♦♦♦ • · * « · ·

Φ · · • W · Φ

ΦΦ ·♦

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která částí kterékoliv z výše uvedených molekul příbuzných aveR2 předkládaného vynálezu, polynukleotidu příbuzného aveR2 znamená je podstatnou polynukleotidu „Podstatná část nukleotidové sekvence, předkládaného vynálezu, molekulu polynukleotidu, která je menší než je úplná kódující sekvence produktu genu aveR2 ze S. avermítilis nebo homologního polypeptidu příbuzného aveR2 podle vynálezu, ale přitom obsahuje alespoň 25 %, výhodně alespoň 30 % uvedené a která je užitečná k provádění kdy užitečnost již byla definována výše pro molekulu polynukleotidu příbuznou aveR2.

V neomezujícím provedení vynálezu podstatná část molekuly polynukleotidu příbuzná aveR2 je nukleotidové sekvence kódující peptidový fragment produktu genu aveR2 ze S. avermitilis nebo homologního polypeptidu příbuzného aveR2 podle vynálezu. „Peptidový fragment polypeptidu příbuzného aveR2 znamená polypeptid, který je subsekvencí aminokyselinové sekvence produktu genu aveR2 plné délky nebo homologního polypeptidu, přičemž subsekvence je kratší než genový produkt aveR2 plné délky nebo homologni polypeptid, přičemž subsekvence je užitečná k provádění vynálezu (užitečnost byla definována výše pro polypeptidy příbuzné aveR2) . Ve výhodném provedení předkládaný vynález poskytuje molekulu polynukleotidu, kterou je nukleotidové sekvence kódující peptidový fragment, kterým je subsekvence aminokyselinové sekvence id. č. 4. Peptidové fragmenty podle vynálezu mají výhodně délku alespoň 15 aminokyselinových zbytku.

Molekula polynukleotidu příbuzná aveR2 popsaná v této přihlášce může být užita pro expresi produktu genu aveR2, k přípravě nových kmenů Streptomyces, ve kterých byl gen aveR2 mutován, a také k identifikaci genů homologních aveR2 v jiných druzích nebo kmenech bakterií pomocí způsobů, které jsou

9 9999

9 9999

9 9 9 9 • · 9 · · 1 • · · · 9 9 <

»·· · 99 9 9 9 9

9’9 ' 9 9 » · · * » · · 9 » · · · > · 9 9

99 odborníkům známy. Tudíž předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu nukleotidovou sekvenci která obsahuje genu homologního genu homologního s aveR2 citovaných v části 5.1.1.

polynukleotidu, kódující produkt s aveR2. Termín „produkt genu homologního s aveRl definuje v tomto textu genový produkt kódovaný genem homologním s aveR2, kterýžto homologní gen je definován jako gen z jiného druhu Streptomyces nebo z blízce příbuzného rodu Saccharopolyspora, který je odborníkem uznán za homologní s genem aveR2 z S. avermitilis na základě stupně identity nukleotidové sekvence, který je vyšší než 80 % nebo na základě toho, že obsahuje konzervativní zbytky aktivních míst typicky se vyskytující ve složkách histidinkinázy ve dvousložkových signálních systémech. Např. srovnání homologie aveR2 s eubakteriálními dvousložkovými systémy z Nar/Deg subskupin ukazuje 100 % zachování dvou zbytků kyseliny asparagové (D) , z nichž jeden je místem autofosforylace, a také lysinového zbytku (K).

Způsoby identifikace polynukleotidových klonů obsahujících geny homologní s aveR2 jsou odborníkům známy. např. molekula polynukleotidu obsahující část aveR2 ORF z S. avermitilis se může označit tak, že je detekovatelná, a pak použít pro screening genomové knihovny zkonstruované z DNA pocházející z požadovaného organismu. Stringenci hybridizačních podmínek je možné vybrat na základě vztahu referenčního organismu, v tomto případě S. avermitilis, a požadovaného organismu. Požadavky podmínek s různou stringenci jsou také odborníkovi dobře známy, a tyto podmínky se mění v závislosti na organismech, ze kterých pochází knihovna a značená sekvence. Knihovna genomové DNA může být prohledávána pomocí sekvence postupem publikovaným v pracích Polynukleotidové molekuly, které mají nukleotidové sekvence, o kterých je známo, že obsahují aveR2 ORF, jako je sekvence id. č. 3, nebo oligonukleotidové

Β 0 0 <

I 0 0 <

00

0 0

0 'tV 0 » 0 0

0··· ·· molekuly představující jejich části, se mohou využít jako sondy pro výše popsaný screening. Alternativně, mohou být syntetizovány oligonukleotidové sondy, které odpovídají nukleotidovým sekvencím dedukovaným z aminokyselinové sekvence purifikovaného produktu genu aveR2.

Klony identifikované jako klony obsahující kódující sekvence genu homologního s aveR2 mohou být testovány na příslušnou biologickou funkci. Např. klon se podrobí sekvencování, aby se identifikoval odpovídající čtecí rámec a iniciační a terminační signály. Klonovaná sekvence DNA se pak vloží do vhodného expresního vektoru, který je pak transformován do buněk kmenu 5. avermitilis, ve kterém byl gen aveR2 vyřazen pro test komplementace. Transformované hostitelské buňky S. avermitilis se pak analyzují mna produkci avermektinů metodami jako je např. analýza fermentačních produktů pomocí HPLC, jak bude popsáno v části 6.6 dále.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu která obsahuje jednu nebo několik sekvencí které přirozeně in šitu lemují aveR2 ORF v S. avermitilis. Takové lemující sekvence lze vybrat z nukleotidové sekvence id. č. 3 od nukleotidu 1 do nukleotidu 2313 a od nukleotidu 3022 do nukleotidu 5045. Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje jednu nebo několik nukleotidových sekvencí které jsou homologní se sekvencemi, které přirozeně in šitu lemují aveR2 ORF v S. avermitilis. Nukleotidová sekvence je homologní se sekvencí přirozeně in sítu lemující aveR2 ORF v S. avermitilis, pokud homologní nukleotidová sekvence hybridizuje s komplementem nukleotidové sekvence přirozeně in šitu lemující aveR2 ORF v S. avermitilis za mírně stríngentních podmínek, tj . hybridizuje s DNA vázanou na filtr v 0,5 M NaHPO₄, 7% SDS, 1 mM EDTA při 65 °C po opláchnutí ve 0,2xSSC/0,l% SDS při 42 °C (viz Ausubel et al., polynukleotidu, nukleotidových ·*·· 44 »444 «4 44

4 · 44 4 4444

4· 4 4444

444 4 444 44 4

44 4444 4444

4444 44 44 »4 44 44 výše), a je užitečná k provádění vynálezu, přičemž užitečnost byla již definována výše pro molekuly polynukleotidu příbuzné aveR2. Každá lemující sekvence, nebo její homolog, v izolované molekule polynukleotidu podle vynálezu je výhodně dlouhá alespoň 200 nukleotidů. V neomezujícím provedení vynález poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje jednu nebo několik výše zmíněných nukleotidových sekvencí, které přirozeně in šitu lemují aveR2 ORF v S. avermitilis, nebo které jsou homologní s takovou nukleotidovou sekvencí, a dále obsahuje jednu z výše zmíněných nukleotidových sekvencí příbuzných aveR2 podle vynálezu, jako je např. nukleotidová sekvence aveR2 ORF ze S. avermitilis uvedená zde jako sekvence id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021 nebo její podstatná část.

1.3. Molekuly polynukleotidu příbuzné aveRl/aveR2

Předkládaný vynález poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující současně jak produkt genu aveRl tak i produkt genu aveR2 ze S. avermitilis (označován dále jako aveRl/aveR2) . Ve výhodném provedení genové produkty aveRl a aveR2 obsahují aminokyselinovou sekvenci id. č. 2 a sekvenci id. č. 4, v uvedeném pořadí. V neomezujícím provedení vynálezu izolovaná molekula polynukleotidu aveRl/aveR2 podle vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci aveRl ORF ze S. avermitilis uvedenou zde jako sekvenci id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317 a nukleotidovou sekvenci aveR2 ORF ze S. avermitilis uvedenou jako sekvence id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021. V dalším neomezujícím provedení izolovaná molekula polynukleotidu aveRl/aveR2 obsahuje sekvenci id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 3021. V dalším neomezujícím provedení izolovaná molekula polynukleotidu podle vynálezu

44 * * 4

4 4 4

4 4 4 « «

4 4 4 4

44 »444 • 4 · • · 4 • 444 «4

obsahuj e	sekvenci	id. č. 1. Nukleotidová sekvence	id. č.	1 má
částečný	překryv	mezi otevřenými	čtecími	rámci	(ORF)	aveRl
a aveR2,	avšak	předkládaný	vynález	obsahuje	také
polynukleotidovou	molekulu aveRl/aveR2, ve	které	se ORF pro

aveRl a ORF pro aveR2 nepřekrývají.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která je homologní s molekulou polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci aveRl ORF ze S. avermitilis uvedenou jako sekvence id. nukleotidu 2317 a sekvenci uvedenou jako sekvence id.

od nukleotidu 1112 do

ORF ze S. avermitilis od nukleotidu 2314 do

č. 1 aveR2 č. 3 nukleotidu 3021. Termín „homologní, pokud se užívá v této souvislosti, znamená molekulu polynukleotidu, které obsahuje nukleotidovou sekvenci: a) která kóduje tentýž polypeptid jako aveRl ORF a aveR2 ORF uvedené zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317 a sekvence id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021, ale obsahuje jednu nebo několik umlčených záměn v nukleotidové sekvenci díky degeneraci genetického kódu, nebo b) která s komplementem k molekule polynukleotidu nukleotidovou sekvenci, která kóduje první obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č.

hybridi zuj e obsahuj ící polypeptid a druhý aminokyselinovou sekvenci id. č. 4 podmínkách, t j . hybridizuje s DNA vázanou na filtr v 0,5 M NaHPO4, 7% SDS, 1 mM EDTA při 65 °C po opláchnutí ve 0,2xSSC(0,l% SDS při 42 °C (viz Ausubel et a je užitečná k provádění předkládaného výhodném provedení homologní molekula hybridizuje s komplementem molekuly polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje první polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 2 a druhý polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 4 za silně stringentních podmínek, tj. hybridizuje polypeptid obsahující v mírně stringentních al. , viz výše) vynálezu. Ve polynukleotidu ···· *· ··*· ·· ·* • · · · ♦ φ ···· • · · · * ···· φ · · · · φ · · · · · • · · β·«* · · · · *··· ·« ·♦ ·· *· ·* s DNA vázanou na filtr v 0,5 M NaHPO₄, 7% SDS (dodecylsulfát sodný), 1 mM EDTA při 65 °C po opláchnutí ve 0,2xSSC/0,l% SDS při 68°C (viz Ausubel et al., výše), a je užitečná k provádění vynálezu. V dalším výhodném provedení homologní molekuly silně stringentních podmínek polynukleotidu obsahující polynukleotidu hybridizuje za s komplementem molekuly nukleotidovou sekvenci aveRl ORF a aveR2 ORF ze S. avermitilis sekvence uvedenou zde jako sekvenci id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317 a od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021, v uvedeném pořadí, a je užitečná k provádění vynálezu.

Označení, že molekula polynukleotidu příbuzná aveRl/aveR2 je „užitečná k provádění vynálezu znamená v tomto popisu, že molekula polynukleotidu může být užita k vnesení mutací buďto do aveRl ORF nebo do aveR2 ORF anebo současně do obou aveRl ORF i aveR2 ORF v S. avermitilis místně cílenou mutací, např. homologní rekombinací, nebo může být užita k amplifikaci molekuly polynukleotidu obsahující nukleotidovou sekvenci aveRl ORF nebo aveR2 ORF nebo obě tyto sekvence aveRl ORF i aveR2 ORF ze S. avermitilis pomocí standardních způsobů amplifikace. Taková homologní molekula polynukleotidu může obsahovat v přírodě se vyskytující geny aveRl/aveR2 přítomné u jiných druhů Streptomyces kromě S. coelicolor, nebo v jiných kmenech S. avermitilis, a také mutované alely aveRl nebo aveR2, ať již přirozeně se vyskytující nebo chemicky syntetizované nebo upravené metodami genového inženýrství.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující první a druhý polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci, která je homologní s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2 v uvedeném poradí. Pokud se týče aminokyselinovou sekvenci homologní s aminokyselinovou sekvencí produktů genů aveRl a aveR2 ze S. avermitilis, pak termín „homologní znamená a sekvencí id. č. 4, polypeptidů majících polypeptid, '· ·' '9 · · <

který obsahuje aminokyselinové sekvence id. č. 2 a id. č. 4, ve kterých byl jeden nebo několik aminokyselinových zbytků konzervativně nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem, přičemž konzervativní substituce aminokyselin byly definovány výše, a výsledné polypeptidy jsou užitečné k provádění vynálezu.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je podstatnou částí kterékoliv z výše uvedených molekul polynukleotidu příbuzných aveRl/aveR2 předkládaného vynálezu. „Podstatná část polynukleotidu příbuzného aveRl/aveR2 znamená molekulu polynukleotidu, která je menší než je úplná kódující sekvence jak produktu genu aveRl tak aveR2 ze S. avermitilis nebo homologního polypeptidu příbuzného aveRl a aveR2 podle vynálezu, ale přitom obsahuje alespoň 10 %, výhodně alespoň 20 % uvedené nukleotidové sekvence, a která je užitečná k provádění předkládaného vynálezu, kdy užitečnost již byla výše pro molekulu polynukleotidu příbuznou V neomezujícím výhodném provedení vynálezu podstatná část molekuly polynukleotidu příbuzná aveRl/aveR2 je nukleotidová sekvence kódující buďto produkt genu aveR2 nebo produkt genu aveR2 ze S. avermitilis nebo jejich homologního polypeptidu podle vynálezu. Ve specifickém nemezujícím provedení vynálezu je podstatnou částí molekuly polynukleotidu příbuzné aveRl/aveR2 je nukleotidová sekvence aveRl ORF uvedená zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317. V dalším specifickém nemezujícím provedení vynálezu je podstatnou částí molekuly polynukleotidu příbuzné aveRl/aveR2 je nukleotidová sekvence aveR2 ORF uvedená zde jako sekvence id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu která obsahuje jednu nebo několik sekvencí které přirozeně in šitu lemují rámce (ORF) aveRl/aveR2 v S. avermitilis.

definována aveRl/aveR2 polynukleotidu, nukleotidových otevřené čtecí •Λ..·.. Ό·', 'λα..'*·'·>·'··' ' · · ·· .

9 9 9 · · · • · 9 9 9 9 · β · · · · · ·

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99

Takové lemující sekvence lze vybrat z nukleotidové sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1 do nukleotidu 1111 a od nukleotidu 3022 od do nukleotidu 5045. Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje jednu nebo několik nukleotidových sekvencí které jsou homologní se sekvencemi, které přirozeně in šitu lemují aveRl/aveR2 ORF v S. avermitilis. Nukleotidová sekvencí přirozeně lemující v S. avermitilis, pokud homologní nukleotidová hybridizuje s komplementem nukleotidové sekvence sekvence je homologní in šitu aveRl/aveR2 sekvence přirozeně se

ORF in šitu lemující aveRl/aveR2 ORF v S. avermitilis za mírně stringentních podmínek, tj. hybridizuje s DNA vázanou na filtr v 0,5 M NaHPOo 7% SDS, 1 mM EDTA při 65 °C po opláchnutí ve 0,2xSSC/0,l% SDS při 42 °C (viz Ausubel et al., výše), a je užitečná k provádění vynálezu, přičemž užitečnost byla již definována výše pro molekuly polynukleotidu příbuzné aveRl/aveR2. Každá lemující sekvence, nebo její homolog, v izolované molekule polynukleotidu podle vynálezu je výhodně dlouhá alespoň 200 nukleotidů. V neomezujícím provedení vynález poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která obsahuje jednu nebo několik výše zmíněných nukleotidových sekvencí, které přirozeně in šitu lemují aveRl/aveR2 ORF v S. avermitilis, nebo které jsou homologní s takovou nukleotidovou sekvencí, a dále obsahuje jednu z výše zmíněných nukleotidových sekvencí příbuzných aveRl/aveR2 podle vynálezu, jako je např. nukleotidová sekvence kódující jeden z ORF pro aveRl nebo aveR2 nebo současně oba ORF, jak aveRl tak i aveR2 ORF ze S. avermitilis uvedené zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 3021.

· -'-»·' ' ··'·«'·' '44'·· 444 4 ···· · ’ 4·4···’· · '4 ·4 • « · ·· · 4 4 4 4 • 4 444 4444

4 4 4 4 444 44 4

2. Oligonukleotidové molekuly

Předkládaný vynález dále poskytuje oligonukleotidové molekuly, které hybridizují s kteroukoliv -výše uvedenou polynukleotidovou molekulou podle vynálezu nebo které hybridizují s polynukleotidovou molekulou mající nukleotidovou sekvenci, která je komplementární s kteroukoliv z výše uvedených polynukleotidových molekul podle vynálezu. Takové oligonukleotidové molekuly jsou výhodně dlouhé alespoň 10 nukleotidů, ale mohou dosahovat až délky jakékoliv subsekvence kterékoliv výše uvedené polynukleotidové molekuly podle vynálezu a mohou hybridizovat s jednou nebo několika výše uvedenými polynukleotidovými molekulami za mírně nebo silně stringentních podmínek. Pro krátké oligonukleotidy příklad silně stringentních podmínek obsahuje promývání v 6xSSC/0,5% hydrogenfosforečnanu sodném při 37 °C pro oligonukleotidy obsahující 14 baží, při teplotě 48 °C pro oligonukleotidy obsahující 17 baží a 55 °C pro oligonukleotidy obsahující 20 baží a 60 °C pro oligonukleotidy obsahující 23 baží. Pro delší oligonukleotidové molekuly (tj. delší než 100 nukleotidů) je příklad mírně a vysoce stringentních podmínek popsán výše v části 5.1 pro homologní polynukleotidové molekuly, hybridizační podmínky mohou být vhodně nastaveny v závislosti na konkrétním užitém oligonukleotidu, jak je odborníkovi známo.

Ve výhodném provedení vynálezu oligonukleotidové molekula podle vynálezu hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s polynukleotidovou molekulou obsahující nukleotidovou sekvenci id. č. 1 nebo s polynukleotidovou sekvencí obsahující nukleotidovou sekvencí, která je komplementem k sekvenci id. č. 1.

Oligonukleotidové molekuly podle předkládaného vynálezu jsou užitečné pro řadu účelů, např. jako oligonukleotidové

4 · 4 ·

...... .v-:.. . »4·· ·'-» 4 ·'·'-··

4 44 4 4444

4 4· 4 4444

444 4 444 44 4

44 4444 4449

4444 ·4 44 44 44 44 primery (očka) při amplifikaci polynukleotidových molekul kódujících genové produkty aveRl a aveR2 nebo jako „anti-sense molekuly užitečné pro regulaci genů ave a biosyntézy avermektinů ve Streptomyces. Amplifikace se provádí pomocí vhodně navržených oligonukleotidových molekul pomocí standardní techniky jako je např. polymerázová řetězová reakce (PCR), ačkoliv se mohou užít i jiné techniky odborníkovi známé, např. ligázová řetězová reakce. Tak např. pro PCR se připraví podle standardního protokolu směs obsahující vhodně navržené oligonukleotidové primery, templát obsahující nukleotidovou sekvenci, která má být amplifikována, a příslušné enzymy a pufr pro PCR, aby se amplifikovaly specifické polynukleotidové sekvence příbuzné aveRl nebo aveR2.

3. Rekombinantní expresní systém

3.1. Expresní vektory

Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantní klonovací vektory a rekombinantní expresní vektory obsahující polynukleotidovou molekulu podle předkládaného vynálezu, kteréžto vektory jsou užitečné pro klonování a expresi uvedených polynukleotidových molekul, včetně polynukleotidových molekul obsahujících buďto aveRl nebo aveR2 nebo jak aveRl tak i aveR2 ze S. avermitilis. V neomezujícím provedení předkládaný vynález poskytuje plazmid pSE201 (ATCC 203182), který obsahuje celý aveRl ORF a celý aveR2 ORF ze S. avermitilis.

Následující popis se týká všech dříve uvedených polynukleotidových molekul a polypeptidů podle předkládaného vynálezu, včetně polynukleotidových molekul obsahujících otevřené čtecí rámce jak aveRl tak aveR2 ze S. avermitilis ·· ././,.9.9.-/9/9/9.9/.λ· /./ ·;*

9 9 99 9 9 9 9 · a jejich genových polynukleotidových podstatných částí produktů, molekul, takových a také všech homologních homologních polypeptidů, polynukleotidových molekul a peptidových fragmentů takových genových produktů a polypeptidů, které byly zmíněny výše, pokud není uvedeno j inak.

Byla vyvinuta řada různých vektorů pro specifické použití ve Streptomyces včetně fágů, plazmidů s vysokým počtem kopií, plazmidú s nízkým počtem kopií, „sebevražedných plazmidů, teplotně-senzitivních plazmidů a kyvadlových vektorů E. coli-Streptomyces a dalších, z nichž kterýkoliv se může použít k provádění předkládaného vynálezu. Ze Streptomyces již byla klonována řada genů rezistence k léčivům a mnohé z těchto genů byly vloženy do vektorů jako selekční markéry. Příklady současných vektorů pro použití ve Streptomyces uvádí např. Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16: 169-190.

Rekombinantní vektory podle předkládaného vynálezu, zejména expresní vektory, jsou výhodně konstruovány tak, že kódující sekvence polynukleotidové molekuly podle vynálezu je operativně spojena s jedním nebo několika regulačními prvky nutnými pro transkripci a translaci kódující sekvence nutné k produkci polypeptidu. Termín „regulační prvek zde znamená, přičemž tato definice není omezující, nukleotidovou sekvenci, která kóduje indukovatelný nebo neindukovatelný promotor, zesilovače, operátory a další prvky známé v oboru, které slouží k řízení a regulaci exprese polynukleotidové sekvence kódující polypeptid. Kódující sekvence je „operativně spojena s jedním nebo několika regulačními prvky znamená, že regulační prvky účinně regulují a umožňují transkripci kódující sekvence nebo translaci její mRNA nebo obojí.

Typické plazmidové vektory, které je možné upravit tak, aby obsahovaly polynukleotidovou molekulu podle předkládaného vynálezu jsou např. pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf • »

4 4 0 0 · 4 · 0 ·

000 0 · 0 0 0 040 0 000 40 0

40 4040 4004

0000 00 44 00 00 4* (Promega) a kyvadlový vektor pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171: 5872-5881), mimo jiné.

Regulační prvky těchto vektorů jsou různé pokud jde o jejich sílu a specifičnost. V závislosti na použitém systému hostitel/vektor lze užít kterýkoliv z celé řady vhodných transkripčních a translačních prvků. Neomezujícími příklady transkripčních regulačních úseků nebo promotorů pro bakterie jsou např. promotor β-gal, promotor T7, promotor TAC, levý a pravý λ promotor, promotory lac a trp, fúzní promotor lac-trp a promotory s větší specifitou pro Streptomyces jako promotory ermE, mele a tipA a další.

V oboru jsou známy metody konstrukce rekombinantních vektorů obsahujících konkrétní kódující sekvence operativně spojené s vhodnými regulačními prvky, a jakákoliv z nich může být užita k provedení předkládaného vynálezu. K těmto metodám patří rekombinantní techniky in vitro, syntetické techniky a genetická rekombinace in vivo, viz např. techniky popsané v příručce Maniatis et al., 1989, Ausubel et al, 1989, Sambrook et al, 1989, Innis et al., 1995, Erlich 1992 a Hopwood, 1985, zmíněné již výše.

Expresní vektory fúzních proteinů se mohou užít pro expresi fúzního proteinu produktů genů aveRl nebo aveR2. purifikovaný fúzní protein se může užít pro přípravu antiséra proti produktům genů aveRl a aveR2, pro zkoumání biochemických vlastností produktů genů aveRl a aveR2, ke spojení fúzních proteinů aveRl a aveR2 s různými biochemickými aktivitami metodami genového inženýrství nebo jako pomůcka k identifikaci nebi purifikaci exprimovaných produktů genů aveRl a aveR2 v rekombinantním expresním systému. K možným expresním vektorům fúzních proteinů patří, ale výčet není na ně omezen, vektory obsahující sekvence, které kódují fúze β-galaktosidázy a trpE, fúze s vazebným proteinem pro maltózu, fúze glutathion-S-transferázy a fúze polyhistidinu (nosičový úsek).

• · 4 4 4 • 4 · 4 4 4

4 4 4 4 4 4 • 444 4 4 44 4 4

44

Fúzní proteiny aveRl a aveR2 mohou být metodami genového inženýrství upraveny tak, aby obsahovaly úsek užitečný pro purifikaci. Tak např. proteinové fúze aveRl- nebo „aveR2vazebný protein pro maltózu může být purifikována pomocí amylózové pryskyřice, proteinové fúze aveRl- nebo aveR2glutathion-S-transferáza se mohou purifikovat pomocí glutathion-agarózových perliček, proteinové fúze aveRl- nebo aveR2-polyhistidin se mohou purifikovat pomocí divalentní niklové pryskyřice. Alternativně protilátky proti nosičovému proteinu nebo polypeptidu se mohou užít pro purifikaci fúzního proteinu metodou afinitní chromatografie. Např. nukleotidová sekvence kódující cílový epitop monoklonální protilátky se může vložit do expresního vektoru v operativním spojení s regulačními prvky a tak situovaná, že exprimovaný epitop je fúzován s aveRl nebo aveR2 polypeptidem. Např. nukleotidová sekvence kódující epitop pro značku FLAG™ (International Biotechnologies, lne.), což je hydrofilní peptidový markér, muže být vložena standardními technikami do expresního vektoru v bodě odpovídajícím aminovému nebo karboxylovému konci polypeptidu aveRl nebo aveR2. Exprimovaný fúzní produkt aveRlnebo aveA2-FLAG™ pak může být detekován a purifikován afinitní chromatografií pomocí komerčně dostupných anti-FLAG™ protilátek.

Expresní vektor kódující aveRl nebo aveR2 fúzní protein může být upraven také tak, aby obsahoval polylinkerovou sekvenci (vícenásobné klonovací/štěpné místo), která kóduje štěpné místo pro specifickou proteázu, takže exprimovaný polypeptid aveRl nebo aveR2 může být uvolněn od nosičového úseku nebo fúzního partnera pomocí specifické proteázy. Např. vektor fúzního proteinu může obsahovat DNA sekvenci kódující štěpné místo pro trombin nebo faktor Xa a další.

Aby se směroval přenos a sekrece exprimovaného genového produktu, může být do expresního vektoru vložena signální

99 · ¹ ·

9

99*9 99

9

9 • 9 9 • 9 · · sekvence „upstream (proti směru transkripce) od čtecích rámců (ORF) pro aveRl nebo aveR2 a v souladu s nimi metodami, které jsou odborníkovi známé. Neomezujícím příkladem signálních sekvencí jsou např. signální se z α-faktoru, imunoglobulinů, vnějších membránových proteinů, penicilinázy, receptorů T buněk a další.

Pro pomoc při selekci hostitelských buněk transformovaných nebo trnasfekovaných klonovacím nebo expresním vektorem podle předkládaného vynálezu, vektor může být upraven tak, aby dále obsahoval kódující sekvenci pro produkt reportérového genu nebo jiný selekční markér. Taková kódující sekvence je výhodně operativně spojena s kódujícím sekvencemi regulačních prvků, které byly popsány výše. reportérové geny užitečné v předkládaném vynálezu jsou odborníkovi dobře známy a patří k nim např. geny kódující fluorescenční proteiny, luciferázu, xylE a tyrosinázu, a další. Nukleotidové sekvence kódující selekční markéry jsou také odborníkovi dobře známy a patří k nim sekvence, které kódují genové produkty, které udělují rezistenci k antibiotikům nebo antimetabolitúm, nebo které dodávají auxotrofní požadavek. K příkladům takových sekvencí patří sekvence kódující rezistenci k erytromycinu, thiostreptonu nebo kanamycinu a dalším.

3.2. Hostitelské buňky

Předkládaný vynález dále poskytuje transformované hostitelské buňky, které obsahují polynukleotidovou molekulu nebo rekombinantní vektor podle předkládaného vynálezu, a nové buněčné kmeny nebo linie z nich pocházející. Hostitelské buňky užitečné k provedení předkládaného vynálezu jsou výhodně buňky Streptomyces, ačkoliv mohou být užity i jiné prokaryotické nebo eukaryotické buňky. K takovým transformovaným hostitelským buňkám typicky patří, přičemž tento výčet není ♦ · ···· • 0 • · • · • ·

Streptomyces, bakteriálních klonování a exprese např. kmen DH5a, omezen na mikroorganismy, např. bakterie transformované DNA rekombinantního bakteriofágu, plazmidovým DNA vektorem nebo kosmidovým vektorem, nebo kvasinky transformované rekombinantním vektorem.

Bakteriální buňky jsou obecně výhodné jako hostitelské buňky. Je třeba chápat, že polynukleotidové molekuly podle předkládaného vynálezu jsou zamýšleny pro funkce v buňkách ale mohou být transformovány i do jiných nebo eukaryotických buněk, např. pro účely Typicky lze užít kmen E. coli jako je který je dostupný z Americké sbírky mikroorganismů (ATCC), Rockwille, MD, USA (položka č. 31343) nebo je lze získat komerčně (Stratagene). K výhodným eukaryotickým buňkám patří kvasinkové buňky, i když lze účinně využít i savčí nebo hmyzí buňky.

Rekombinantní expresní vektor podle předkládaného vynálezu je výhodně transformován nebo transfekován do jedné nebo několika hostitelských buněk v podstatě homogenní buněčné kultuře. Expresní vektor je obecně vnesen do hostitelských buněk odborníkovi známým způsobem, např. protoplastovou transformací, kalciumfosfátovou precipitací, ošetřením kalciumchloridem, mikroinjekcí, elektroporací, transfekcí zprostředkovanou kontaktem s rekombinantním virem, transfekcí zprostředkovanou liposomy, DEAE-dextranovou transfekcí, transdukcí, konjugací nebo ostřelováním mikročásticemi. Selekce transformant se provádí standardním způsobem, jako je např. selekce na expresi selekčního markéru, např. rezistence k antibiotikům,spojeného s rekombinantním vektorem, jak bylo již popsáno výše.

Jakmile je jednou expresní vektor vnesen do hostitelské buňky, integrace a udržování kódující sekvence příbuzné aveRl, aveR2 nebo aveRl/aveR2, buďto v hostitelském chromosomu nebo episomálně, může být potvrzena standardnímu technikami, např.

·· . «44 4

Southernovou hybridizační analýzou, analýzou restrikčními enzymy nebo pomocí PCR včetně PCR spřažené s reverzní transkriptázou (rt-PCR) nebo imunologickým testem pro detekci specifického genového produktu. Hostitelské buňky obsahující a/nebo exprimující rekombinantní kódující sekvence příbuzné aveRl, aveR2 nebo aveRl/aveR2 mohou být identifikovány jednou z přinejmenším 4 obecných metod známých odborníkovi, kam patří: I) DNA-DNA, DNA-RNA nebo RNA-antisenseRNA hybridizace,

II) detekce přítomnosti funkce markerového genu,

III) hodnocení hladiny transkripce měřením exprese mRNA transkriptů specifických pro aveRl nebo aveR2 v hostitelské buňce a IV) detekce přítomnosti zralého polypeptidového produktu měřená např. imunotestem nebo jako přítomnost biologické aktivity AveRl nebo AveR2.

3.3. Exprese a charakterizace produktu rekombinantního genu aveRl nebo aveR2

Jakmile byla jednou kódující sekvence příbuzné aveRl, aveR2 nebo aveRl/aveR2 stabilně vloženy do vhodných hostitelských buněk, transformované buňky se klonálně namnoží a výsledné buňky se pěstují v podmínkách vedoucích k maximální tvorbě produktů genů příbuzných aveRl, aveR2 nebo aveRl/aveR2. K takovým podmínkám obvykle patří kultivace buněk do vysoké hustoty. Když expresní vektor obsahuje indukovatelný promotor, užívají se vhodné indukční podmínky jako např. změna teploty, vyčerpání živin, přidání induktorů (např. analogů sacharidů jako je isopropyl-p-D-thiogalaktopyranosid (IPTG), akumulace nadbytku vedlejšího produktu a pod., které jsou nutné k indukci exprese.

Pokud se exprimované produkty genů příbuzných aveRl a/nebo aveR2 zadržují uvnitř hostitelské buňky, buňky se sklidí a lyžují a produkt se izoluje z lyzátu a purifikuje • · ··♦· ·♦ ···· v podmínkách vhodných pro extrakci odborníkovi známých, kdy se minimalizuje degradace proteinů, jako je např. teplota 4 °C nebo přítomnost inhibitorů proteáz nebo obojí. Pokud je exprimovaný produkt genu aveRl a/nebo aveR2 sekretován z hostitelských buněk, vyčerpané kultivační médium může být snadno sbíráno a z něho izolován produkt.

Exprimované produkty genů příbuzných aveRl a/nebo aveR2 mohou být izolovány nebo v podstatě purifikovány z buněčných lyzátů nebo kultivačního média, podle potřeby, a sice pomocí standardních metod, ke kterým patří, i když tento výčet není omezující, jakákoliv kombinace následujících metod: precipitace síranem amonným, frakcionace podle velikosti, iontoměničová chromatografie, HPLC, centrifugace v hustotním gradientu a afinitní chromatografie. Když exprimované produkty genů příbuzných aveRl a/nebo aveR2 projevují biologickou aktivitu, zlepšení čistoty preparátu je možné monitorovat v každém kroku purifikačního postupu použitím vhodného testu. Ať už exprimované produkty genů příbuzných aveRl a/nebo aveR2 projevují biologickou aktivitu nebo ne, každý může být detekován na základě např. velikosti, reaktivity s protilátkou specifickou pro AveRl nebo AveR2 nebo na základě přítomnosti fúzované značky.

Předkládaný vynález tak poskytuje v podstatě čistý nebo izolovaný polypeptid kódovaný izolovanou molekulu polynukleotidu podle vynálezu. Ve specifickém, avšak neomezujícím provedení vynálezu je polypeptid produkt genu aveRl ze S. avermitilis obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 2. V jiném specifickém, avšak neomezujícím provedení vynálezu je polypeptid produkt genu aveR2 ze S. avermitilis obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 4. Předkládaný vynález dále poskytuje v podstatě čisté nebo izolované polypeptidy, které jsou homologní buďto s produktem genu aveRl nebo aveR2 podle vynálezu. Předkládaný vynález dále poskytuje

99 » · 9 4 » 9 9 <

I 9 9 4 ► 9 9 4

9999 peptidové fragmenty produktů genů aveRl nebo aveR2 nebo homologních polypeptidů podle vynálezu. V podstatě purifikované nebo izolované polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou užitečné k řadě účelů, např. . pro screening sloučenin, které mění funkci produktu genu aveRl nebo aveR2, a tím modulují biosyntézu avermektinu, a také pro přípravu protilátek namířených proti produktům genů aveRl nebo aveR2.

V předkládané přihlášce užívaná formulace, že polypeptid je „v podstatě purífikován znamená, že daný polypeptid tvoří z hlediska hmotnosti většinu materiálu v konkrétním preparátu. Formulace, že polypeptid je „izolovaný znamená, že polypeptid tvoří alespoň 90 % hmot. materiálu konkrétního preparátu.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob přípravy podstatě purifikovaného nebo izolovaného produktu genu aveRl nebo aveR2, homologních polypeptidů nebo peptidových fragmentů podle vynálezu, který spočívá v tom, že se kultivují hostitelské buňky transformované nebo transfekované rekombinantním expresním vektorem, přičemž tento rekombinantní expresní vektor obsahuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující produkt genu aveRl, produkt genu aveR2, homologní polypeptid nebo peptidový fragment, kde nukleotidové sekvence je operativně spojena s jedním nebo několika regulačními prvky, v podmínkách napomáhajících expresi konkrétního genového produktu, polypeptidu nebo peptidového fragmentu a z buněčné kultury se získá exprimovaný genový produkt, polypeptid nebo peptidový fragment v postatě purifikované nebo izolované formě.

Jakmile byly získány produkty genů aveRl nebo aveR2 v dostatečné čistotě, charakterizují se standardními metodami, k nimž patří SDS-PAGE, vylučovací chromatografie, aminokyselinová sekvenční analýza, biologická aktivita ve tvorbě vhodných produktů biosyntetické dráhy avermektinu apod. Např. aminokyselinová sekvence produktů genů aveRl nebo aveR2

0* 000« «««0 «« « 0 0 0 0 0*00 » 0 0 0 0

0 0 0 0 0

0 0 0 0 » 00 00 může být určena pomocí standardních způsobů sekvencování peptidů. produkty genů aveRl nebo aveR2 se mohou dále charakterizovat analýzou hydrofilnosti (viz např. Hopp a Woods, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 3824) nebo obdobnými softwarovými algoritmy, aby se identifikovaly hydrofilní a hydrofobní úseky produktů genů aveRl nebo aveR2. Dále je možné provést strukturní analýzu pro identifikaci úseků v produktech genů aveRl nebo aveR2, u kterých lze předpokládat specifickou sekundární strukturu. Dále se mohou užít biofyzikální metody jako je rentgenová krystalografie Exp. Biol. 11: 7-13), počítačové

Zoller (eds.), 1986, In: Current

Communication in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) a nukleární magnetická rezonance (NMR) pro mapování a zkoumání míst interakce produkty genů aveRl nebo aveR2 a jejich substráty. Informace získané z takových studií se mohou užít k selekci nových míst pro mutace v aveRl ORF nebo aveR2 ORF, což pomůže ve snaze vyvinout nové kmeny Streptomyces s lepšími charakteristikami produkce avermektinu.

(Engstrom, 1974, Biochem. modelování (Fletterick a

4. Konstrukce mutant aveRl a aveR2

Předkládaný vynález dále poskytuje sloučeniny a způsoby pro genetickou modifikaci buněk druhů nebo kmenů Streptomyces, včetně genových konstruktů jako jsou např. vektory nahrazující geny. Ve výhodném provedení buňky druhu nebo kmenu Streptomyces jsou geneticky modifikovány, aby tvořily množství avermektinů, které je detekovatelně odlišné od množství avermektinů tvořeného buňkami stejného druhu nebo kmenu, který nebyl modifikován. Ve výhodnějším provedení vynálezu jsou buňky druhu nebo kmenu Streptomyces geneticky modifikovány, aby tvořily množství avermektinů, které je detekovatelně vyšší

4444

4444

4 4 4 4 4444 4 4444 444 44 4

44 4444 *444 4444 44 44 ·· 44 44 než množství avermektinů tvořeného buňkami stejného druhu nebo kmenu, který nebyl modifikován. Takové genetické modifikace podle předkládaného vynálezu výhodně obsahují mutace buďto genu aveRl nebo genu aveR2 nebo obou genů aveRl a aveR2, přičemž mutace vedou k detekovatelnému zvýšení množství avermektinů tvořených buňkami kmene S. avermitilis, který nese genovou mutaci, ve srovnání s buňkami téhož kmenu, které nenesou genovou mutaci.

Podle předkládaného vynálezu se mutace mohou vnést do genu aveRl nebo genu aveR2 nebo obou genů aveRl a aveR2, užitím způsobů známých ve stavu techniky nebo způsoby, které budou teprve vyvinuty v budoucnosti. Např. náhodná mutageneze se může provést pomocí standardních mutagenních postupů, kam patří expozice buněk Streptomyces ultrafialovému záření nebo Rentgenovým paprskům, nebo expozice chemickým mutagenům jako je N-metyl-N'-nitrosoguanidin, etylmetylsulfonát, kyselina dusitá nebo dusíkatý yperit, a pak selektovat buňky projevující detekovatelně zvýšenou tvorbu avermektinů v důsledku jedné nebo více mutací v genech aveRl a/nebo aveR2. Pro přehled způsobů mutageneze viz Ausubel et al., 1989.

Alternativně lze mutace genu aveRl nebo aveR2 nebo obou těchto genů provádět místně cílenou mutagenezí použitím jedné z mnoha známých rekombinantních metod včetně PCR vnášející chybu nebo kazetové mutageneze. Např. místně cílená mutageneze, která využívá výhody homologní rekombinace, se může užít specificky ke změně buďto aveRl nebo aveR2 nebo jejich obklopujících sekvencí nebo obou těchto genů nebo obklopujících sekvencí, takže se specificky vnese jedna nebo několik mutací do těchto genů. kromě toho pro vytvoření velké knihovny polynukleotidových molekul majících nukleotidové sekvence kódující mutace aveRl a/nebo aveR2 je možné využít způsob popsaný v patentu U.S. 5 605 793, který obsahuje

9 999· ·· ♦···

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 99 náhodnou fragmentaci, opakované cykly mutageneze a nukleotidové záměny.

Mutace genu aveRl nebo aveR2 nebo obou těchto genů aveRl a aveR2, které jsou užitečné pro provádění předkládaného vynálezu, obsahují adice, delece nebo substituce, nebo jejich kombinace, jednoho nebo několika nukleotidů buďto v genu aveRl nebo v genu aveR2 nebo v obou těchto genech nebo v regulačních sekvencích obklopujících tyto geny, a které vedou k požadovanému výsledku, tj . detekovatelnému zvýšení množství avermektinú produkovaných buňkami kmenu Streptomyces nesoucího genové mutace ve srovnání s buňkami stejného druhu nebo kmenu Streptomyces, který nenese mutace. Takové mutace slouží k vnesení jednoho nebo několika nových restrikčních míst, terminačních kodonů nebo k posunu čtecího rámce, buďto do jednoho nebo obou ORF sekvencí nebo do obklopujících regulačních sekvencí účastnících se transkripce genu. K dalším užitečným mutacím patří takové, které vkládají odlišnou nebo heterologní nukleotidovou sekvenci buďto do genu aveRl nebo aveR2 nebo do obou těchto genů, nebo které deletují celý nebo část genu aveRl nebo aveR2 nebo obou genů. nebo které nahrazují celý nebo část genu aveRl nebo aveR2 nebo obou těchto genů jinou nebo heterologní sekvencí, přičemž mutace vedou k požadovanému výsledku, tj . detekovatelnému zvýšení množství avermektinú produkovaných buňkami kmenu Streptomyces nesoucího genové mutace ve srovnání s buňkami stejného druhu nebo kmenu Streptomyces, který nenese mutace.

Místně cílené mutace jsou užitečné zvláště pokud slouží ke změně jednoho nebo několika konzervativních aminokyselinových zbytků buďto v produktu genu aveRl nebo aveR2 nebo v produktech obou genů aveRl a aveR2. Např. srovnání dedukovaných aminokyselinových sekvencí produktů genů aveRl a aveR2 ze S. avermitilis s analogickými genovými produkty ze

S. coelicolor, jak je uvedeno na obr. IA a IB, ukazuje místa • 00 0

0000 00 000 0 0 0

Φ 0 0 0

0 0 0 • 0 0 0 0 00 ·♦ 00

0 0 • 00 ·· • 0 0 0 významných konzervativních aminokyselinových zbytků pro tyto druhy. Místně cílená mutageneze, která odstraňuje nebo nekonzervativním způsobem substituuje jednu nebo několik z těchto konzervativních aminokyselin je zvláště účinná pro přípravu nových mutovaných kmenů, které vykazují požadované změny v produkci avermektinů.

Ve výhodném provedení vynálezu je jedna nebo několik mutací vnesena homologní rekombinací buďto do genu aveRl nebo genu aveR2 nebo do obou těchto genů, pomocí genového konstruktu podle předkládaného vynálezu, jako je např. vektor pro nahrazení genu. Genový konstrukt obsahuje celý aveRl ORF nebo jeho homologní polynukleotidovou molekulu nebo jeho podstatnou část nebo nukleotidovou sekvenci která ho přirozeně obklopuje, nebo obsahuje celý aveR2 ORF nebo jeho homologní polynukleotidovou molekulu nebo jeho podstatnou část nebo nukleotidovou sekvenci která ho přirozeně obklopuje nebo obsahuje jak celý aveRl ORF tak i celý aveR2 ORF nebo jejich homologní polynukleotidové molekuly nebo jejich podstatné části nebo nukleotidové sekvence, které přirozeně in šitu obklopují aveRl ORF nebo aveR2 ORF nebo oba aveRl i aveR2 v S. avermitilis, nebo jejich kombinace, přičemž tento genový konstrukt se může užít k vnesení mutace do genu aveRl nebo genu aveR2 nebo do obou těchto genů, kterážto mutace vede k požadovanému výsledku, tj . detekovatelnému zvýšení množství avermektinů produkovaných buňkami kmenu Streptomyces nesoucího genové mutace ve srovnání s buňkami stejného druhu nebo kmenu Streptomyces, který nenese mutace.

Ve specifickém avšak neomezujícím provedení vynálezu je genový konstrukt pro použití podle vynálezu plazmid, který obsahuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je jinak stejná jako nukleotidová sekvence aveRl ORF nebo aveR2 ORF nebo obou ORF nebo jejich podstatná část, ze S. avermitilis, přičemž dále obsahuje jednu nebo ·φφ-·_#·φ· • · φ

···♦ • » · 9

9 9 9

9 9 9 • 9 9 9

99 několik mutací, tj. jednu nebo několik delecí nukleotidu, inzercí nebo substitucí, nebo jejich kombinace, a tento plazmid se může užít k transformaci buněk Streptomyces, čímž vnese mutaci do genu aveRl nebo aveR2 nebo do obou těchto genů, aby se narušila nebo jinak změnila aktivita nebo biologická funkce buďto genu aveRl nebo genu aveR2 nebo obou těchto genů, nebo aby se narušila nebo jinak změnila aktivita nebo biologická funkce buďto produktu genu aveRl nebo produktu genu aveR2 nebo produktů obou těchto genů, tak aby množství avermektinů produkovaných buňkami druhu nebo kmenu Streptomyces nesoucího genové mutace bylo detekovatelně vyšší ve srovnání s buňkami stejného druhu nebo kmenu Streptomyces, který nenese mutace. Výhodně takový plazmid obsahuje dále selekční markér.

Jakmile je jednou transformována do hostitelských buněk Streptomyces, polynukleotidové molekula genového konstruktu je specificky cílena homologni rekombinací do genu aveRl nebo genu aveR2 nebo do obou těchto genů, a buďto nahrazuje gen aveRl nebo jeho část nebo gen aveR2 nebo jeho část, nebo oba geny aveRl a aveR2 nebo jejich části, nebo je vložena do genu aveRl nebo aveR2. V důsledku této rekombinační události jsou gen aveRl nebo gen aveR2 nebo oba tyto geny hostitelské buňky nebo jejich produkty jimi kódované částečně nebo úplně vyřazeny z funkce. Transformované buňky jsou selektovány, výhodně s využitím přítomnosti selekčního markéru v genovém konstruktu, a jsou testovány standardními technikami, které jsou popsány dále v části 6.6, aby se vyhledaly buňka produkující detekovatelně vyšší množství avermektinů ve srovnáni s buňkami stejného kmenu, které nebyly transformovány.

Ve specifickém avšak neomezujícím provedení popsaném v následující části 6.9.1 byl použit vektor pro nahrazování genu k narušení jak genu aveRl tak genu aveR2 nahrazením části

4444 4«

4444

4444

44 » 4 4 ί

I 4 4 1

I ·4 1 • 4 4 4

44

ORF každého genu heterologní nukleotidovou sekvencí (ermE). V dalším specifickém neomezující provedení popsaném dále v části 6.9.2 byl použit vektor pro nahrazení genu k narušení genu aveR2 nahrazením části ORF genu heterologní nukleotidovou sekvencí (ermE). Každý z těchto vektorů pro nahrazení genu byl samostatně transformován do buněk kmenu S. avermitilis a integrován do chromosomu homologní rekombinací. Fermentační analýza každé z těchto nových transformant Streptomyces ukázala významné zvýšení množství avermektinů produkované buňkami nesoucími genové mutace ve srovnání s buňkami stejného kmenu, které nenesou tyto genové mutace.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob identifikace mutace genu aveRl nebo genu aveR2 nebo obou těchto genů aveRl a aveR2 u druhu nebo kmenu Streptomyces, přičemž mutace je schopna detekovatelně zvýšit množství avermektinů produkovaných buňkami druhu nebo kmenu Streptomyces nesoucího genovou mutaci ve srovnání s buňkami stejného druhu nebo kmenu, který nenese genovou mutaci, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se a) měří množství avermektinů produkované buňkami konkrétního druhu nebo kmenu Streptomyces, b) vnese mutace do genu aveRl nebo aveR2 nebo do obou těchto genů v buňkách druhu nebo kmenu Streptomyces z kroku a) , a c) porovná množství avermektinů produkované buňkami nesoucími mutaci připravenými podle kroku b) s množstvím avermektinů produkovaným buňkami z kroku a) , které nenesou genovou mutaci, přičemž jestliže je množství avermektinů produkované buňkami nesoucími genovou mutaci připravenými v kroku b) detekovatelně vyšší než množství avermektinů produkované buňkami z kroku a), které nenesou genovou mutaci, pak mutace v genu aveRl nebo genu aveR2 nebo v obou těchto genech, pak byla identifikována mutace schopná detekovatelně zvýšit množství produkovaných avermektinů. Druhem Streptomyces je ve výhodném provedení S. avermitilis.

·· 9999

9999

99 > · # 9 9 9 9 >9 9 9 9 9 9 » 9 9 9 9 9 9 9 i 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 produkuj i srovnání ve výhodném kmeny podle nenesou genovou mutaci. provedení vynálezu je S

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob přípravy geneticky modifikovaných buněk druhu nebo kmenu Streptomyces, kteréžto modifikované buňky produkují detekovatelně vyšší množství avermektinů ve srovnání s nemodifikovanými buňkami stejného druhu nebo kmenu, přičemž tento způsob obsahuje mutaci genu aveRl nebo genu aveR2 nebo obou těchto genů ze Streptomyces v buňkách druhu nebo kmenu Streptomyces a selekci mutovaných buněk, které modifikované buňky detekovatelně vyšší množství avermektinů ve s nemodifikovanými buňkami stejného druhu nebo kmenu, které nenesou genovou mutaci. Druh Streptomyces ve výhodném provedení vynálezu je S. avermitilis.

Předkládaný vynález dále poskytuje nový kmen Streptomyces, jehož buňky produkují detekovatelně vyšší množství avermektinů jakožto výsledek jedené nebo několika mutací genu aveRl nebo genu aveR2 nebo obou těchto genů, ve srovnání s nemodifikovanými buňkami stejného druhu nebo kmenu, které Druh Streptomyces avermitilis. Nové předkládaného vynálezu jsou užitečné pro produkci avermektinů v průmyslovém měřítku, např. pro produkci komerčně žádaného doramektinu.

Předkládaný vynález ještě dále poskytuje způsob produkce zvýšeného množství avermektinů produkovaných kulturami Streptomyces, kterýžto způsob obsahuje kultivaci buněk druhu nebo kmenu Streptomyces, jehož buňky obsahují mutaci v genu aveRl nebo genu aveR2 nebo v obou těchto genech, přičemž tato mutace slouží k detekovatelnému zvýšení množství produkovaných avermektinů buňkami druhu nebo kmenu Streptomyces nesoucími mutaci ve srovnání s nemodifikovanými buňkami stejného druhu nebo kmenu, které nenesou genovou mutaci, v kultivačním médiu v podmínkách, které v nich dovolují nebo indukují produkci avermektinů, a dále obsahuje izolaci avermektinů z této

4» V·*· »4 44*4

44 • · 4 4 · 4 4 4 4 4 « * 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • · · 4 4 4 4 4 4 4 4

4444 44 »4 44 44 4» kultury. Druh Streptomyces ve výhodném provedení vynálezu je S. avermitilis. Způsob podle vynálezu je užitečný ke zvýšení účinnosti produkce avermektinů.

5. Anti-sense oligonukleotidy a ribozymy vynálezu jsou také kterým patří anti-sense

Předmětem předkládaného oligonukleotidové sekvence, ke oligonukleotidy, fosforothioáty a ribozymy, které působí tak, že váží na aveRl mRNA nebo aveR2 mRNA nebo ji degradují a/nebo inhibují její translaci.

Anti-sense oligonukleotidy, včetně molekul anti-sense RNA a molekul anti-sense DNA, působí tak, že přímo blokují translaci mRNA tím, že se váží na cílovou mRNA a zabraňují tak translaci proteinu. Např. konvenční fosfodiesterovou metodou lze syntetizovat anti-sense oligonukleotid alespoň velikosti 15 baží a komplementární k jedinečným úsekům DNA kódující polypeptid AveRl nebo AveR2.

Ribozymy jsou enzymatické molekuly RNA schopné katalyzovat specifické štěpení RNA. Mechanismus působení ribozymů zahrnuje sekvenčně specifickou hybridizaci ribozymové molekuly s komplementární cílovou RNA, po které následuje endonukleolytické štěpení. Předmětem vynálezu je také metodami genového inženýrství upravená ribozymová molekula s „kladivovým motivem, která specificky a účinně katalyzuje endonukleolytické štěpení sekvence aveRl mRNA nebo aveR2 mRNA.

Specifická místa ribozymového štěpení v potenciální se nejdříve identifikují postupným molekuly na přítomnost štěpných ribozymových míst, která obsahují následující sekvence: GUA, GUU a GUC. Jakmile jsou jednou identifikovány, krátké sekvence RNA velikosti 15 až 20 ribonukleotidů odpovídající úseku v cílovém genu obsahujícím štěpné ribozymové místo se mohou cílové molekule RNA prohledáváním cílové

999«

• 9 9999 • · 9 • · • 9 · · • 9 · 9

9 9 9 9 * 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

99 99 vyhodnotit z hlediska predikovaných strukturních rysů, jako je např. sekundární struktura, čímž se může ukázat oligonukleotidová sekvence jako nevhodná. Vhodnost vybraných cílů lze také hodnotit testováním jejich přístupnosti pro hybridizaci s komplementárními oligonukleotidy např. metodou ribonukleázové ochrany.

Jak anti-sense oligonukleotidy tak ribozymy podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny metodami, které jsou v oboru známé. K těmto metodám patří techniky chemické fosfoamiditové syntézy na pevné fázi. Alternativně lze molekuly anti-sense RNA připravit in vitro nebo in vivo transkripcí sekvence DNA kódující molekulu RNA. Takové sekvence DNA mohou být vloženy do celé řady vektorů, které obsahují vhodné promotory pro RNA polymerázu jako jsou např. promotory pro T7 nebo SP6 polymerázu.

Do oligonukleotidů podle předkládaného vynálezu lze vnést různé modifikace jako prostředek ke zvýšení vnitrobuněčné stability a biologického poločasu. K možným modifikacím patří, přičemž tento výčet není omezující, adice obklopujících sekvencí ribonukleotidů nebo deoxyribonukleotidů k 5'- nebo 3'-konci molekuly nebo použití fosforothioátové vazby nebo 2'-0-metylové vazby místo fosfodiesterové vazby v oligonukleotidové kostře.

6. Protilátky

Předkládaný vynález dále poskytuje polyklonální a monoklonální protilátky, které se váží na produkt genu aveRl nebo aveR2 nebo na homologní polypeptidy nebo peptidové fragmenty podle vynálezu. Takové protilátky se mohou použít jako afinitní činidla, pomocí kterých lze purifikovat nativní produkty genu aveRl nebo aveR2 nebo analyzovat aktivitu nebo biologickou funkci produktů genu aveRl nebo aveR2.

• · · · • · · • · · · • · · · ···· ·· β ·

Protilátky lze připravit proti kterémukoliv z polypeptidů příbuzných AveRl nebo AveR2 podle předkládaného vynálezu. K hostitelům, které lze užít pro přípravu specifických protilátek anti-AveRl nebo anti-AveR2 metodami v oboru známými patří, přičemž tento výčet není omezující, krávy, koně, králíci, kozy, ovce a myši. Ke zvýšení tvorby protilátek lze užít různá odborníkovi známá adjuvans.

Polyklonální protilátky lze získat z imunizovaných zvířat a lze je testovat, zda mají specifičnost anti-AveRl nebo AveR2 standardními technikami. Alternativně lze připravit monoklonální protilátky proti polypeptidům AveRl nebo AveR2 způsobem, který využívá pro tvorbu protilátek kontinuální buněčné kultury. Patří sem, přičemž tento výčet není omezující, způsoby užívající hybridomy poprvé popsané v práci Kohler a Milstein (Nátuře, 1975, 256: 495-497), způsoby užívající hybridomy B-buněk (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72, Cote et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030) a způsoby užívající EBV-hybridomy (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Lis, lne., str. 77-96). Alternativně je možné pro přípravu jednořetězcových protilátek specifických pro AveRl nebo AveR2 upravit techniky popsané pro přípravu jednořetězcových protilátek (víz např. patent U.S. 4 946 778). Tyto publikace jsou zahrnuty formou odkazu.

Do předmětu předkládaného vynálezu patří také fragmenty protilátek obsahující specifická vazebná místa pro polypeptid AveRl nebo AveR2, které lze připravit způsoby v oboru známými. K takovým fragmentům patří, i když výčet není omezující, fragmenty F(ab')₂, které lze připravit pepsinovým štěpením intaktni molekuly protilátky, a fragmenty Fab, které lze připravit redukcí disulfidických můstků fragmentů F(ab')2· Alternativně lze zkonstruovat Fab expresní knihovny (Huse et al, 1989, Science 246, 1275-1281), které umožňují rychlou identifikaci fragmentů Fab, které mají požadovanou specifičnost pro polypeptid AveRl nebo AveR2.

Způsoby pro přípravu monoklonálních protilátek jsou odborníkovi dobře známy a jsou např. popsány v publikacích Harloww a Lané, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Library, a J.W.Goding, 1986, Monoclonal Antibodies, Principle and Practice, Academie Press, London. Výše uvedené publikace jsou v přihlášce zahrnuty formou odkazu.

7. Použiti avermektinů

Avermektiny jsou činidla s vysokou antiparazitární aktivitou, která jsou zejména užitečná jako antihelmintika, ektoparaziticidy, insekticidy a akaricidy, přičemž avermektiny připravené využitím přípravků a způsobů podle předkládaného vynálezu jsou užitečné pro kteroukoliv z výše zmíněných aplikací.

Avermektiny připravené podle předkládaného vynálezu jsou užitečné k léčení různých nemocí u lidí, zvláště nemocí, které jsou způsobeny parazitárními infekcemi, jak je v oboru známo (viz např. Ikeda a Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7):2591-2609.

Avermektiny připravené podle předkládaného vynálezu jsou účinné k léčení různých nemocí způsobených endoparazity, ke který patří např. helmintiázy, které jsou způsoben nejčastěji skupinou parazitických nematod (hlístic) způsobujících onemocnění u lidí a vedoucí ke značným ekonomickým ztrátám v chovech vepřů, ovcí, drůbeže, koní a dobytka, a také poškozující zdraví domácích zvířat. Takže avermektiny připravené podle předkládaného vynálezu jsou účinné proti nematodám, které infikují člověka, stejně tak jako proti těm, které napadají různé druhy zvířat, jako je např. Dirofilaria u psů, a proti parazitů, kteří infikují člověka, včetně • · • · · · • · gastrointestinálních parazitů jako je Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, a parazitům nalézaným v krvi nebo i jiných tkáních a orgánech, jako jsou filárie a nebo extraintestinální stadia Strongyloides a Trichinella.

Avermektiny připravené podle předkládaného vynálezu jsou užitečné také při léčení ektoparazitárních infekcí, ke kterým patří zamoření arthropody (členovci) u savců nebo ptáků, způsobené parazity jako je např. klíště, roztoč, veš, blecha, střeček, bodavý hmyz anebo migrující larvy dipter (dvoukřídlých), které kromě jiného napadají dobytek a koně.

Avermektiny připravené podle předkládaného vynálezu jsou užitečné také jako insekticidy v domácnosti proti domácímu škodlivému hmyzu jako je kromě jiných např. šváb, mol šatní, kožojedi a moucha domácí, a také proti škodlivému hmyzu napadajícímu uskladněné obilí nebo plodiny, jako je kromě jiných např. různé druhy mšic, housenky a orthoptera (rovnokřídlí) jako např. kobylky.

Ke zvířatům, která mohou být léčena avermektiny podle předkládaného vynálezu, patří ovce, hovězí dobytek, koně, jeleni, kozy, vepři, ptáci včetně drůbeže, a psi a kočky.

Avermektiny připravené podle předkládaného vynálezu se podávají formulovány do přípravku vhodného pro specifický zamýšlený účel v závislosti na tom, jaký druh zvířete má být léčen a o jakého parazita se jedná. Pro použití jako paraziticid se avermektin podle předkládaného vynálezu podává perorálně formulovaný do tobolky, bolusu, tablety nebo kapalné lékové formy pro namáčení (mořidla) nebo se podává jako postřik, injekcí nebo jako implantát. Takové přípravky lze připravit obvyklým způsobem v souladu se standardní veterinární praxí. Tobolky, bolusy nebo tablety se připravují smícháním účinné látky s vhodným rozpouštědlem nebo nosičem navíc obsahujícím rozvolňovací činidlo a/nebo pojidlo jako je • · • · · ·

1· * · < 14 · · 4 » ·· škrob, laktóza, mastek, stearát hořečnatý a pod. Mořidla se připraví dispergováním účinné látky ve vodném roztoku společně s dispergujícím nebo zvlhčovacím činidlem atd. Injikovatelné přípravky se připraví ve formě sterilního roztoku, který může obsahovat i další látky, jako je dostatek solí a/nebo glukóza, aby byl roztok isotonický s krví.

Takové přípravky se liší pokud jde o hmotnost účinné látky v závislosti na pacientovi nebo druhu hostitelského zvířete, které má být ošetřováno, na intenzitě a druhu infekce a tělesné hmotnosti ošetřovaného jedince. Obecně je dostatečná dávka účinné látky pro perorální podávání 0,001 až 10 mg na 1 kg hmotnosti pacienta nebo léčeného zvířete, a to v jedné dávce nebo rozdělená na několik dávek na dobu 1 až 5 dnů. Avšak mohou nastat případy, kdy je indikována menší nebo větší dávka, např. ošetřujícím lékařem nebo veterinářem na základě klinických příznaků.

Alternativně avermektin připravený podle předkládaného vynálezu se podává zvířatům v kombinaci s potravou, a pro tento účel lze připravit koncentrovaný doplněk krmiv nebo předem připravenou směs k přimíchání do krmivá.

Pro použití jako insekticid a pro agrotechnické ošetření proti škůdcům lze sloučeniny podle předkládaného vynálezu aplikovat jako spreje, poprašky, emulze apod. v souladu se standardní zemědělskou praxí.

Následující příklady slouží k ilustraci popisu vynálezu a nijak předmět vynálezu neomezují.

• · • · · · • · · · · ···· • · ··· · · · · • » · · · ····<· • · « * · · · · · · · «··· ·· φ· ·♦ ·· ··

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace genů aveRl a aveR2

Tento příklad popisuje izolaci a charakteristiky dvou nových genů S. avermitilis, které kódují genové produkty aveRl a aveR2, které jsou zapojeny do regulace biosyntézy avermektinů.

1. Pěstování S. avermitilis pro izolaci DNA

Jednotlivé kolonie S. avermitilis ATCC 31272 (izolát jednotlivých kolonií č. 2) byly izolovány v 1/2 koncentraci média YPD-6 obsahujícího: kvasinkový extrakt Difco - 5 g,

Difco Bacto-pepton - 5 g, dextrózu - 2,5 g, MOPS - 5 g, Difco Bacto agar - 15 g. Konečný objem byl upraven na 1 litr s dH₂O, pH bylo upraveno na 7,0 a médium bylo sterilizováno v autoklávu ve 121 °C po dobu 25 minut. Mycelia narostlá ve výše uvedeném médiu byla použita k inokulaci 10 ml média TSB (Difco Tryptic Soy Broth v 1 litru dH₂O, sterilizováno v autoklávu ve 121 °C po dobu 25 minut) ve zkumavce o rozměrech 25 mm x 150 mm, která byla udržována ve 28 °C po dobu 48-72 hodin za třepání.

2. Izolace chromozomové DNA S. avermitilis

Alikvoty (0,25 ml nebo 0,5 ml) mycelií pěstovaných tak, jak bylo popsáno výše, byly přeneseny do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek a buňky byly koncentrovány stočením ve 12 000 x g po 60 s. Supernatant byl odsát a buňky byly resuspendovány v 0,25 ml pufru TSE (20 ml 1,5M sacharózy, 2,5 ml 1M Tris HCI, pH 8,0, 2,5 ml 1M EDTA, pH 8,0 a 75 ml dH₂O) obsahujícím 2 mg/ml lysozymu. Vzorky byly inkubovány ve • ·

9 9

9· 99 » · · 1 k · · °C 20 minut za třepání, vloženy do přístroje AutoGen 540™ pro automatizovanou izolaci nukleových kyselin (Integrated Separation Systems, Natick, ΜΆ) a byla izolována genomová DNA s použitím Cycle 159 (program pro zařízení) podle instrukcí výrobce.

Alternativně bylo přeneseno 5 ml mycelií do zkumavky o rozměrech 17 mm x 100 mm, buňky byly koncentrovány stočením ve 3000 rpm po 5 minut a supernatant byl odsát. Buňky byly resuspendovány v 1 ml pufru TSE, koncentrovány stočením ve 3000 rpm po 5 minut a supernatant byl odsát. Buňky byly resuspendovány v 1 ml pufru TSE obsahujícím 2 mg/ml lysozymu a inkubovány ve 37 °C 30-60 minut za třepání. Po inkubaci bylo přidáno 0,5 ml 10% SDS a buňky byly inkubovány ve 37 °C, dokud nebyla lýze buněk úplná. Lyzát se inkuboval v 65 °C 10 minut, ochladil na teplotu místnosti, rozdělil do dvou 1,5 ml Eppendorfových zkumavek a extrahoval se 1 x s 0,5 ml fenol/chloroformu (50% fenol byl předem ekvilibrován s 0,5M Tris, pH 8,0, 50% chloroform). Vodná fáze byla odstraněna a extrahována 2-5 x směsí chloroform:isoamylalkohol (24:1). DNA se precipitovala přidáním 1/10 objemu 3M acetátu sodného, pH 4,8, směs se inkubovala 10 minut na ledu, pak se stočila v 15 000 rpm v 5 °C po 10 minut a supernatant se přenesl do čisté zkumavky, do které se přidal 1 objem isopropanolu. Směs se pak inkubovala na ledu 20 minut, stočila v 15 000 rpm 20 minut v 5 °C, supernatant se odstranil a DNA pelet se 1 x promyl 70% etanolem. Poté, co byl pelet suchý, se DNA resuspendovala v pufru TE (lOmM Tris, lmM EDTA, pH 8,0).

3. Izolace plazmidové DNA ze S. avermitilis

Alikvoty (1,0 ml) mycelií byly přeneseny do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek a buňky byly koncentrovány stočením ve 12 000 x g po 60 s. Supernatant byl odsát, buňky byly resuspendovány v 1,0 ml 10,3% sacharózy a koncentrovány • 9 9 9 9 ····** • « · · · · · ···· «·*··· * · ** ·· ·· stočením ve 12 000 x g po 60 s a supernatant byl odsát. Buňky byly pak resuspendovány v 0,25 ml pufru TSE obsahujícím 2 mg/ml lysozymu, inkubovány ve 37 °C 20 minut za třepání a vloženy do přístroje AutoGen 540™ pro automatizovanou izolaci nukleových kyselin. Plazmidová DNA byla izolována s použitím Cycle 106 (program pro zařízení) podle instrukcí výrobce.

Alternativně bylo přeneseno 1,5 ml mycelií do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek a buňky byly koncentrovány stočením ve 12 000 x g po 60 s. Supernatant byl odsát, buňky byly resuspendovány v 1,0 ml 10,3% sacharózy a koncentrovány stočením ve 12 000 x g po 60 s a supernatant byl odsát. Buňky byly resuspendovány v 0,5 ml pufru TSE obsahujícím 2 mg/ml lysozymu a inkubovány ve 37 °C 15-30 minut. Po inkubaci bylo přidáno 0,25 ml alkalického SDS (0,3N NaOH, 2% SDS) a buňky byly inkubovány v 55 °C 15-30 minut nebo dokud nebyl roztok čirý. K roztoku DNA byl pak přidán acetát sodný (0,1 ml, 3M, pH 4,8) a následovala 10 minut inkubace na ledu. Vzorky DNA byly stočeny ve 14 000 rpm v 5 °C po dobu 10 minut. Supernatant byl přenesen do čisté zkumavky a bylo přidáno 0,2 ml fenol/chloroformu (50% fenol:50% chloroform) a jemně promíšeno. Roztok DNA byl stočen ve 14 000 rpm v 5 °C po dobu 10 minut a vrchní vrstva byla přenesena do čisté Eppendorfovy zkumavky. Byl přidán isopropanol (0,75 ml) a roztok byl jemně promíšen a pak inkubován při teplotě místnosti po dobu 20 minut. Roztok DNA byl stočen ve 14 000 rpm v 5 °C po dobu 15 minut, supernatant byl odstraněn, pelet DNA byl promyť 70% etanolem, usušen a DNA byla resuspendována v pufru TE.

4. Izolace plazmidové DNA z E. coli

Jedna transformovaná kolonie E. coli byla naočkována do ml média Luria-Bertani (LB) (Bacto-trypton - 10 g, kvasinkový extrakt Bacto - 5 g, NaCl - 10 g v 1 litru dH_>O, • 0 0 0·· «00 0 0 0 « *00 * *00 0«« * 0 « « «· 0 0 0« · • 000 0« «0 «· «· ·· pH 7,0, sterilizováno v autoklávu ve 121 °C po dobu 25 minut) doplněného 100 gg/ml ampicilinem. Tkáňová kultura se inkubovala přes noc a alikvoty 1 ml se přenesly do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek. Vzorky tkáňové, kultury byly vloženy do přístroje AutoGen 540™ pro automatizovanou izolaci nukleových kyselin a byla izolována plazmidová DNA s použitím Cycle 3 (program pro zařízení) podle instrukcí výrobce.

5. Příprava a transformace protoplastů S. avermitilis

Jednotlivé kolonie S. avermitilis byly izolovány v 1/2 koncentraci média YPD-6. Mycelia byla použita k inokulaci 10 ml média TSB ve zkumavce o rozměrech 25 mm x 150 mm, která pak byla inkubována ve 28 °C po dobu 48 hodin za třepání (300 rpm) . 1 ml mycelií byl použit k inokulaci 50 ml média YEME. Médium YEME obsahuje v 1 1: kvasinkový extrakt

Difco - 3 g, Difco Bacto-pepton - 5 g, sladový extrakt Difco 3 g a sacharózu - 300 g. Po sterilizaci v autoklávu ve 121 °C po dobu 25 minut bylo přidáno 2,5M MgCl₂.6 H₂O (odděleně sterilizováno v autoklávu ve 121 °C po dobu 25 minut) - 2 ml a glycin (20%) (sterilizován filtrací) - 25 ml.

Mycelia byla pěstována ve 30 °C po dobu 48-72 hodin a sklízena stočením v 50 ml centrifugačních zkumavkách (Falcon) ve 3000 rpm po dobu 20 minut. Supernatant byl odsát a mycelia byla resuspendována v pufru P, který obsahuje: sacharózu - 205 g, K2SO4 - 0,25 g, MgCl2.6 H2O - 2,02 g, H2O 600 ml, K2PO4 (0,5%) - 10 ml, roztok stopových prvků* - 20 ml, CaCl₂.2 H₂O (3,68%) - 100 ml, pufr MES (1,0 M, pH 6,5) - 10 ml. (*Roztok stopových prvků obsahuje v 1 1: ZnCl₂ - 40 mg,

FeCl-,.6 H₂O - 200 mg, CuCl₂.2 H₂0 - 10 mg, MnCl₂.4 H₂O - 10 mg, Na₂B₄O-,.10 H₂O - 10 mg, (NH₄) 6M07O24.4 H₂O - 10 mg). pH bylo upraveno na 6,5, konečný objem byl upraven na 1 litr a horké médium se filtrovalo přes filtr o velikosti pórů 0,45 μ.

• · · · · · • · • * « 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 9» *♦ 9· ··

Z mycelií se vytvořily pelety stočením ve 3000 rpm po dobu 20 minut, supernatant byl odsát a mycelia byla resuspendována ve 20 ml pufru P obsahujícím 2 mg/ml lysozymu. Mycelia byla za třepání inkubována 15 minut ve 35 °C a kontrolovala se v mikroskopu, aby se určil stupeň tvorby protoplastů. Když byla tvorba protoplastů kompletní, protoplasty se stočily 10 minut v 8000 rpm. Supernatant byl odstraněn a protoplasty byly resuspendovány v 10 ml pufru P. Protoplasty se stočily 10 minut v 8000 rpm, supernatant byl odstraněn, protoplasty byly resuspendovány ve 2 ml pufru P a rozděleny do kryogenních lahviček o objemu 2,0 ml (Nalgene) po přibližně 1 x 10⁹ protopíastech.

Lahvička obsahující 1 x 10⁹ protoplastů byla centrifugována 10 minut v 8000 rpm, supernatant byl odstraněn a protoplasty byly resuspendovány ve 0,1 ml pufru P. K protoplastům bylo přidáno 2 až 5 μg transformující DNA a pak se okamžitě přidalo 0,5 ml pracovního pufru T. Bazický pufr T obsahuje: PEG 1000 (Sigma) - 25 g, sacharóza - 2,5 g a H₂O 83 ml. pH bylo upraveno na 8,8 s IN NaOH (sterilizováno filtrací) a bazický pufr T byl sterilizován filtrací a uložen ve 4 °C. Pracovní pufr T vyrobený v den použití obsahuje bazický pufr T - 8,3 ml, K₂PO₄ (4mM) - 1,0 ml, CaCl₂.2 H₂O (5M)

- 0,2 ml, a TES (1M, pH 8) - 0,5 ml. Každá složka pracovního pufru T byla sterilizována filtrací a uložena ve 4 °C.

Během 20 s od přidání pufru T k protoplastům byl také přidán 1,0 ml pufru P a protoplasty byly stočeny 10 minut v 8000 rpm. Supernatant byl odstraněn a protoplasty byly resuspendovány v 0,1 ml pufru P. Protoplasty pak byly vysety na misky s médiem RM14, které obsahuje: sacharózu - 205 g,

K₂SO₄ - 0,25 g, MgCl₂.6 H₂O - 10,12 g, glukózu - 10 g, Difco Casamíno Acids - 0,1 g, kvasinkový extrakt Difco - 5 g, agar Difco Oatmeal - 3 g, Difco Bacto agar - 22 g, a H₂O - 800 ml. Roztok byl sterilizován v autoklávu ve 121 °C po dobu 25

9999

9 ··*» 99 • 9 9 9

9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 99 · 9 minut. Po sterilizaci byly přidány následující sterilní zásobní roztoky: K₂PO₄ (0,5%) - 10 ml, CaCl₂.2 H₂O (5M) - 5 ml, L-prolin (20%) - 15 ml, pufr MES (1,0 M, pH 6,5) - 10 ml, roztok stopových prvků (tentýž jak uvedeno výše) - 2 ml, zásobní roztok cykloheximidu (25 mg/ml) - 40 ml, a IN NaOH 2 ml. Na misky byly rozděleny alikvoty o objemu 25 ml média RM14 a misky byly usušeny 24 hodin před použitím.

Protoplasty byly inkubovány při 95% vlhkosti ve 30 °C 20 až 24 hodin. Aby se vybraly transformanty rezistentní na erytromycin, byl na regenerační misky s RM14 rovnoměrně nanesen 1 ml překryvného pufru se 125 pg erytromycinu (za vzniku konečné koncentrace 5 gg/ml erytromycinu). Překryvný pufr obsahuje na 100 ml: sacharózu - 10,3 g, roztok stopových prvků (tentýž jak uvedeno výše) - 0,2 ml, a pufr MES (l,0M, pH 6,5) - 1 ml. Protoplasty byly inkubovány při 95% vlhkosti ve °C po dobu 7-14 dnů, dokud nebyly viditelné kolonie rezistentní na erytromycin (Erm')·

6. Fermentační analýza kmenů S. avermitilis

Mycelia S. avermitilis pěstovaná v poloviční koncentraci média YPD-6 po dobu 4-7 dnů byla naočkována do zkumavek o rozměrech 2,54 x 15, 24 cm (1 x 6 palců) obsahujících 8 ml přeformovaného média a dvě 5 mm skleněné perly. Přeformované médium obsahuje: rozpustný škrob (buď řídký vařený škrob nebo KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) - 20 g/1, Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) - 15 g, Ardamine pH (Champlain, lne. Clifton, NJ) - 5 g/1, 2 x bcfa („bcfa znamená mastné kyseliny s rozvětveným řetězcem - branched chaín fatty acids) obsahující v konečné koncentraci v médiu 50 ppm 2-(±)-metylmáselné kyseliny, 60 ppm isomáselné kyseliny a 20 ppm isovalerové kyseliny. pH bylo upraveno na 7,2 a médium bylo sterilizováno v autoklávu ve 121 °C po dobu 25 minut.

• 9 V 9

9«·♦ ·· «9 ♦· 9 · ··

Zkumavka byla protřepávána v úhlu 17 ° ve 215 rpm po dobu 3 dnů ve 29 °C. Alikvoty očkovací kultury o objemu 2 ml byly použity k inokulaci 300 ml Erlenmayerovy baňky obsahující 25 ml produkčního média, které obsahovalo: škrob (buď řídký vařený škrob nebo KOSO) - 160 g/1, Nutrisoy (Archer Daniels

Midland, Decatur, IL) - 10 g/1, Ardamine pH - 10 g/1, K₂HPO₄ 2 g/1, MgSO₄.4 H₂0 - 2 g/1, FeSO₄.7 H₂0 - 0,02 g/1, MnCl₂ 0,002 g/1, ZnSO₄.7 Η-Ό - 0,002 g/1, CaCO₃ - 14 g/1 a 2 x bcfa (jak uvedeno výše) . pH bylo upraveno na 6,9 a médium bylo sterilizováno v autoklávu ve 121 °C po dobu 25 minut.

Po inokulaci se baňka inkubovala ve 29 °C 12 dnů s třepáním o 200 rpm. Po inkubaci byl z baňky odebrán vzorek o objemu 2 ml, naředěn 8 ml metanolu, smíchán a směs byla stočena ve 1250 x g po dobu 10 minut, aby se usadily buněčné zlomky. Supernatant byl pak testován vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) při použití kolony Beckman Ultrasphere ODS (25 cm x 4,6 mm ID) s průtokovou rychlostí 0,75 ml/min a detekcí měřením absorbance ve 240 nm. Mobilní fáze byla 86/8,9/5,1 metanol/voda/acetonitril.

7. Identifikace a izolace genů PKS ze S. avermitilis

Byla připravena kozmidová knihovna z chromozomové DNA ze S. avermitilis (ATCC 31272) a hybridizována se sondou pro ketosyntázu (KS) vyrobené z fragmentu genu polyketidsyntázy (PKS) ze Saccharopolyspora erythraea. Detailní popis přípravy kozmidových knihoven může být nalezen v Sambrook et al., 1989, výše. Detailní popis přípravy knihoven chromozomové DNA ze Streptomyces je uveden v Hopwood et al., 1985, výše. Kozmidové klony obsahující oblasti hybridizující s ketosyntázou byly identifikovány hybridizací s fragmentem NdeI/Eco47III o velikosti 2,7 kb z pEX26 (laskavě poskytnutým Dr. P. Leadleym, Cambridge, UK). Přibližně 5 μg pEX26 bylo štěpeno za použití restrikčních endonukleáz Ndel a Eco47III.

• · · · ♦ »· (Epicentre

Fragment α-³²Ρ1 dCTP

Reakční směs byla nanesena na 0,8% agarózový gel SeaPlaque™ GTG (FMC BioProducts, Rockland, ME) . Fragment NdeI/Eco47lII o velikosti 2,7 kb byl po elektroforéze vyříznut z gelu a DNA byla z gelu opětně získána za použití GELase™

Technologies) s použitím Rychlého protokolu. NdeI/Eco47III o velikosti 2,7 kb byl označen s (deoxycytidin-5'-trifosforečnan, tetra(trietylamonná) sul, [a-’~P]-) (NEN-Dupont, Boston, MA) s použitím systému BRL Nick Translation (BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) podle instrukcí dodavatele. Typická reakce byla prováděna v objemu 0,05 ml. Po přidání 5 μΐ ukončovacího pufru byla značená DNA oddělena od volných nukleotidů za použití kolony G-25 Sephadex Quicj Spin TM (Boehringer Mannheim) podle instrukcí dodavatele.

Přibližně 1800 kozmidových klonů se testovalo hybridizací kolonií. Bylo identifikováno deset klonů, které silně hybridizovaly se sondou KS ze Sace. erythraea. Kolonie E. coli obsahující kozmidovou DNA byly pěstovány v tekutém médiu LB a z každé kultury byla izolována kozmidová DNA přístrojem AutoGen 540™ pro automatizovanou izolaci nukleových kyselin s použitím Cycle 3 (program pro zařízení) podle instrukcí restrikčních endonukleáz výrobce. Mapování pomocí a hybridizační analýzy Southernovým přenosem odhalily, že 5 klonů obsahovalo překrývající se chromozomové oblasti. Pomocí analýzy překrývajících se kozmidů a hybridizacemi (obrázek 4) byla konstruována genomová BamHI restrikční mapa pěti kozmidů (tj. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) ze S. avermitilis (obrázek 4).

8. Identifikace regulačního genu ORF

Pro subklonování fragmentů pocházejících z klonu pSE68 byly použity následující metody. pSE68 (5 μg) byl štěpen Xbal a EcoRI. Reakční směs byla nanesena na 0,8% agarózový gel

9· 99

9 9

9 «9

SeaPlaque™ GTG (FMC BioProducts) , po elektroforéze byl z gelu vyříznut fragment Xbal/EcoRI o velikosti ~19 kb a DNA byla z gelu opětně získána za použití GELase™ (Epicentre Technologies) s použitím Rychlého protokolu. Přibližně 5 μg pGEM7Zf(+) (Promega) bylo štěpeno s Xbal a EcoRI. Přibližně 0,5 pg fragmentu Xbal/EcoRI o velikosti 19 kb a 0,5 pg naštěpeného pGEM7Zf(+) bylo smícháno dohromady a inkubováno přes noc s 1 jednotkou ligázy (New England Biolabs., Inc., Beverly, MA) v 15 °C v celkovém objemu 20 pl podle instrukcí dodavatele. Po inkubaci bylo 5 pl ligační směsi inkubováno 10 minut v 70 °C, zchlazeno na teplotu místnosti a použito k transformaci kompetentních buněk E. coli DH5a (BRL) podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována z transformant rezistentních na ampicilin a výskyt inzertu Xbal/EcoRI o velikosti ~19 kb byl potvrzen restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE200.

pSE200 byl dále modifikován štěpením s Exonukleázou III za (Promega) podle instrukcí štěpeno s Clal. Clal tvoří byly chráněny před štěpením □lněný alfa-fosfothioátdeoxyribonukleotidy podle instrukcí výrobce. pSE200 byl pak naštěpen EcoRI a alikvoty byly štěpeny Sl nukleázou různou dobu kolísající od 30 sekund do 12 minut. Vzorky pSE200 ošetřené Sl nukleázou byly ligovány přes noc a transformovány do kompetentních buněk E. coli HB101 (BRL) podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována z transformant rezistentních na ampicilin a velikost inzertu DNA byla určena analýzou restrikčními enzymy. Byl identifikován jeden izolát, který obsahoval inzert o velikosti ~5,9 kb a byl označen jako pSE201 (obrázek 2A) a byl uložen pod ATCC (přístupové č. 203192) . Dále byl identifikován druhý izolát, který

použití systému	Erase	-a-Bas<
výrobce. 5	pg	pSE200	bylo
přečníváj ící	5'	konce,	které
exonukleázou	tak	, že	byly

♦4 4444

4* ·»»·

4 4 4 4 4 * · 4 4

4 4 4 4 4 « 4 4 · · 4 · • 444 44 44 «» obsahoval inzert o velikosti ~8,8 kb a tento izolát byl označen jako pSE210 (obrázek 2B) .

Bylo izolováno přibližně 10 μg pSE201 při použití soupravy pro izolaci plazmidové DNA (Qiagen, Valencia, CA) podle instrukcí výrobce. Tato DNA byla sekvencována s použitím automatizovaného zařízení pro sekvencování DNA ABI 373A (Perkin Elmer, Foster City, CA) . Sekvenční data byla sbírána a zpracovávána programy Genetic Computer Group (GCG, Madison, WI). Sekvence DNA ORF regulačních genů, aveRl a aveR2, jsou přítomny totožně jak v sekvence id. č. 1, tak v sekvence id. č. 2. aveRl ORF je od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317 ze sekvence id. č. 1. aveR2 ORF je od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021 ze sekvence id. č. 1.

Srovnání aminokyselinové sekvence odvozené z aveRl ORF ze S. avermitilis ukazuje 32% totožnost s odvozeným genovým produktem absAl ze S. coelicolor (obrázek IA) (Brian et al., J. Bacteriology, 178, 3221-3231, 1996). Srovnání odvozené z aveR2 ORF ze aminokyselinové sekvence S. avermitilis ukazuje 45% totožnost s odvozeným genovým produktem absA2 ze S. coelicolor (obrázek IB)

9. Konstrukce a použití vektorů pro nahrazování genu

Obecný popis technik pro zavádění mutací do genů

Streptomyces je poskytnut Kieserem a Hopwoodem (Meth. Enzym., 204, 430-458, 1991) . Detailnější popis je poskytnut autory

Anzai et al. (J. Antibiot., XLI(2), 226-233, 1998), StutzmanEngwall et al. (J. Bacteriol., 174(1), 144-154, 1992) a Oh a Cháter (J. Bact., 179, 122-127, 1997). Tyto publikace jsou zde zahrnuty v odkazech.

9.1. Inaktivace obou genů aveRl a aveR2

Oba geny aveRl a aveR2 byly inaktivovány nahrazením fragmentu BglII/StuI o velikosti 988 bp v pSE210 (obrázek 2B)

4 4444

4 4 4

4 4

4 4 4

4444 44 44

4 4 4 4 4

4 4 4 4 #

4 4 4 4 4 4 •444 44

4· 4· genem erytromycinové rezistence (ermE) ze Saccharopolyspora erythraea, tímto způsobem. Přibližně 5 μg pSE210 bylo štěpeno s BglII a Stul, aby se uvolnil fragment o velikosti ~10,8 kb. Konec BglII byl doplněn inkubací DNA s dNTP v konečné koncentraci 100 μΜ v lx Klenowově pufru a s 1 U Klenowova enzymu (Boehringer Mannheim) po dobu 30 minut ve 37 °C.

Fragment o velikosti ~10,8 kb byl purifikován z agarózového gelu a inkubován v 1 x pufru pro alkalickou fosfatázu a s 1 U alkalické fosfatázy po dobu 1 hodiny v 50 °C, aby se defosforylovaly konce. Po inkubaci byl defosforylovaný fragment purifikován fenol/chloroformovou extrakcí, jak je popsáno v části 6.3 resuspendován v pufru TE. Gen ermE byl izolován z pIJ4026 (poskytnutým z John Innes Institute, Norwich, Velká Británie, viz také Bibb et al., Gene, 41, 357368, 1985) štěpením s BglII a konce BglII byly doplněny inkubací fragmentu ermE s dNTP v konečné koncentraci 100 μΜ v lx Klenowově pufru a s 1 U Klenowova enzymu po dobu 30 minut ve 37 °C. Fragment ermE o velikosti ~1,7 kb byl purifikován z agarózového gelu a 0,5 μg bylo smícháno s 0,5 μg fragmentu velikosti ~10,8 kb a ligováno. Ligační směs byla použita k transformaci kompetentních buněk E. coli HB101 (BRL) podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována z transformant rezistentních na ampicilin a výskyt inzertu ermE byl potvrzen restrikční analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSE214 (obrázek 3A) , byl transformován do E. coli DMI (BRL) a z transformant rezistentních na ampicilin byla izolována plazmidová DNA. Inzerce genu ermE na místo fragmentu BglII/StuI o velikosti 988 bp odstranila 752 bp z genu aveRl a 232 bp z genu aveR2.

PSE214, který se v S. avermitilis nereplikuje autonomně, byl použit jako vektor pro nahrazování genu pro integrační náhradu genu tak, jak následuje. 8 μΐ DNA pSE214 (1 μg) bylo denaturováno přidáním 2 μΐ 1M NaOH, inkubováno 10 minut ve

4444

4·44

4

4 4

4 * • 4 44 4 4 » 44

4 4

V 4 4 °C, pak rychle zchlazeno na ledu, poté následovalo přidání 2 μΐ 1M HCl, podle postupu autorů Oh a Cháter, 1997, výše. Protoplasty denaturovaným pSE214.

transformovány regenerovány za se na

S. avermitilis byly Transformanty byly selektivních podmínek vyžadujících expresi erytromycinového genu tak, aby se indukovala integrační genová rekombinace plazmidu do chromozomu hostitelské buňky. Protože plazmid nereplikuje autonomně, transformanty rezistentní erytromycin by měly mít plazmidové sekvence integrované do chromozomu buď jednoduchou homologní rekombinací mezi jedním ze dvou segmentů DNA, které ohraničují gen ermE a jeho homologní protějšek v chromozomu, což má za následek integraci celého vektoru pSE214, nebo dvojité překřížení, když nastane druhá rekombinace mezi druhým segmentem DNA, který ohraničuje mutaci a její homologní protějšek v chromozomu, což má za následek výměnu aveRl/aveR2 (inaktivovaných) sekvencí z plazmidu do chromozomu a doprovodnou ztrátu alely divokého typu a vektorových sekvencí z chromozomu. Transformanty rezistentní na erytromycin byly izolovány a testovány pomocí PCR na výskyt vektorové kostry. Všechny transformanty postrádaly vektorovou kostru, což ukazuje, že nastalo dvojité překřížení a chromozomové sekvence aveRl/aveR2 byly nahrazeny deletovanými sekvencemi aveRl/aveR2. Transformanty rezistentní na erytromycin byly analyzovány pomocí analýzy HPLC fermentačních produktů. Kmeny S. avermitilis obsahující aveRl/aveR2 deleci tvořily průměrně 3,4 x více úplných avermektinů než kontrolní kmen (tabulka 1).

9.2. Inaktivace genu aveR2

Gen aveR2 byl inaktivován vložením genu ermE do místa BglII v pSE210 (obrázek 2B) a použitím výsledného plazmidu jako vektoru pro nahrazování genu ve S. avermitilis následujícím způsobem. Přibližně 5 gg pSE210 bylo štěpeno

9 9 •*99 9 9

9 9 9 9 ♦ 9 9

9

9 9

BglII. Linearizovaný pSE210 byl pak inkubován v 1 x pufru pro alkalicku fosfatázu a s 1 U alkalické fosfatázy, aby se defosforylovaly konce po dobu 1 hodiny v 50 °C. Gen ermE byl izolován z pIJ4026 štěpením s BglII, pak následovala elektroforéza a gen ermE o velikosti ~1,7 kb byl purifikován z gelu. Přibližně 0,5 μg linearizovaného pSE210 a 0,5 μg fragmentu ermE byly smíchány dohromady a ligovány. Ligační směsí se transformovaly kompetentní buňky E. coli HB101 (BRL) podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována z transformant rezistentních na ampicilin a výskyt inzertu ermE byl potvrzen restrikční analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSE216 (obrázek 3B), byl transformován do E. coli DMI (BRL) podle instrukcí výrobce a z transformant rezistentních na ampicilin byla izolována plazmidová DNA.

PSE216, který se v S. avermitilis nereplikuje autonomně, byl použit jako vektor pro nahrazování genu pro integrační náhradu genu tak, jak následuje. 8 μΐ DNA pSE216 (1 μg) bylo denaturováno přidáním 2 μΐ ÍM NaOH, inkubováno 10 minut ve 37 °C, a pak rychle zchlazeno na ledu, poté následovalo přidání 2 μΐ ÍM HCI (Oh a Cháter, 1997, výše) . Protoplasty S. avermitilis byly transformovány denaturovaným pSE216. Transformanty byly regenerovány za selektivních podmínek vyžadujících expresi erytromycinového genu tak, aby se indukovala integrační genová rekombinace plazmidu do chromozomu hostitelské buňky. Protože plazmid se nereplikuje autonomně, transformanty rezistentní na erytromycin by měly mít plazmidové sekvence integrované do chromozomu buď jednoduchou homologní rekombinací mezi jedním ze dvou segmentů DNA, které ohraničují gen ermE a jeho homologní protějšek v chromozomu, což má za následek integraci celého vektoru pSE216, nebo dvojité překřížení, když nastane druhá rekombinace mezi druhým segmentem DNA, který ohraničuje mutaci a její homologní protějšek v chromozomu, což má za následek

4444 «444

4 4 * 4

4 · · •444 44

4 4

4 4

4 4 · 4 4

44

44 ·

• 4 4 4 • 4 výměnu aveR2 (inaktivované) sekvence z plazmidu do chromozomu a doprovodnou ztrátu alely divokého typu a vektorových sekvencí z chromozomu. Transformanty rezistentní na erytromycin byly izolovány a testovány pomocí PCR na výskyt vektorové kostry. Všechny transformanty postrádaly vektorovou kostru, což ukazuje, že nastalo dvojité překřížení a chromozomové sekvence aveR2 byly nahrazeny inaktivovanými sekvencemi aveR2. Transformanty rezistentní na erytromycin byly analyzovány pomocí analýzy HPLC fermentačních produktů. Kmeny S. avermitilis obsahující inaktivovaný gen aveR2 tvořily průměrně 3,1 x více úplných avermektinů než kontrolní kmen (tabulka 1).

Tabulka 1

	Kontrola (průměr z 5 kultur)	Delece aveRl /aveR2 (průměr ze 4 kultur)	Inzerce aveR2 (průměr ze 6 kultur)
Celkové relativní množství avermektinů	1	3,4	3, 1

Uložení biologického materiálu

Následující biologický materiál byl uložen v Americké sbírce mikroorganismů (American Type Culture Collection, ATCC) na 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, 9. září, 1998, a byly mu přiděleny následující přístupová čísla:

Plazmid přístupové číslo plazmid pSE201 203182

Všechny patenty, patentové přihlášky a publikace citované výše jsou zde plně zahrnuty formou odkazu.

	69	99 9 · 9 • 9 9W99	»9«· 9· «999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 «9 99 99 99	..... 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 * 9 9 9 9 9 9
Předkládaný	vynález	není	nijak	omezen specifickými
provedeními zde	popsanými,	která jsou	zamýšlena	jen jako

ilustrace jednotlivých aspektů vynálezu, a funkčně totožná řešení spadají také do předmětu vynálezu. Různé modifikace vynálezu, kromě těch, které jsou ukázány a popsány zde, jsou zřejmé odborníkovi z předchozího popisu a doprovodných obrázků. Tyto modifikace také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu, který je definován následujícími patentovými nároky.

·· #···

ΊΟ ·· *··» φ · ·

9 9

9 9

9 9 9 9

9 9 9

99

99 · · · • · · *

9 9 9

9 9 9

99

SEZNAM SEKVENCÍ <110> PFIZER PRODUCTS INC.

<120> REGULAČNÍ GENY STREPTOMYCES AVERMÍTILIS A ZPŮSOB ZVÝŠENÉ PRODUKCE AVERMEKTINŮ <130> PC9944A <140>

<141>

<150> 60/100,134 <151> 1998-09-14 <160> 4 <170> Patentln Ver. 2.0 - beta <210> 1 <211> 5045 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <220>

<221> CDS <222> (1112)..(2317) <223> aveRl ORF <400> 1 cgagttgctg gtcatcggcg tactcctccc ggcgactccg cccggtactc gaccgcggca 60 gcggtcagcc gcatgaacgc ctcttcgaga gacacggtct tccgcgtcac ctcgtgcacc 120 gtcacggcgt gcgccgcgac gagttcgccg atccgctccg cggcggcggc caccttcagg 180 ctgccgtcgg agcagtcggt gaccgtgatt cccgcgccga ccagcacgtc gcgcagccgc 240 cgcggttccg gagtgcgcac ccgcaccccc acgtccgtgt acctgtcgat gaactcgctc 300 atgctggtgt ccgcgaggag ccgaccgcgg ccgatgatga cgaggtggtc cacggtgagc 360 gccgcctcgc tcatcagatg gctggacacg aagacggtgc gtccctgtgc cgccaggtcc 420 cgcatgaggt gccgcagcca caggacgcct tccgggtcga gcccgttgac cggctcgtcg 480 agcaccagga cggcggggtc gccgagcagc gccgcggcga ttcccagccg ctgactcatg 540 cccagcgaga acgtccccgc ccgccggcgc acggcgctcc gcaggcccgc cagctcgatc 600 • · · • 9 ·· ··*· ♦ · · • · • · • · · ···· ··

··

acctcacgga	cgcggcgggg	cgggatccgg	ttgctgcggg	ccagccagcg	caagtggttc	660
agcgcggttc	ggccggggtg	caccgccctg	gcgtcgagca	gtgcccccac	cgtccgcagc	720
gggtcgcgga	gccgctggta	gggcgcgccg	tcgatgcgta	cctcgccggc	cgtcgggcgg	780
tccaggccca	gcatcatgcg	catcgcggtg	gacttcccgg	cgccgttggg	gccaaggaat	840
ccggtcaccc	gaccggtccg	tacctggaag	gtaagaccct	ccacaacggt	ggtggtcccg	900
tagcgcttgg	tcaggtccgt	gacttcgatc	atgccggtga	tggtccgtga	cgacaggctc	960
ccgccgcgtc	ccgctcgggg	ctgactgccc	cttctccacc	cccggttgga	gaatgaccgc	1020
cacccgcggc	cgcgcatcag	gctgcaggag	gagcggcttt	gaccaccgct	ggacggaggc	1080
ggagcggcgt	acgcctggat	atggtcgagc	g gtg cat gca ggt acc Val His Ala Gly Thr	gcg gtg Ala Val	1132

5

gac Asp

ccc Pro

gac Asp 10

gac cat ccg

atc Ile

ctg Leu 15

gcc cgg

ega Arg

ctg Leu

age Ser 20

cgg Arg

cgc Arg

ega Arg

1180

Asp

His

Pro

Ala

Arg

ctc

atc

gcc

ctg

gac

ggc

gtg

ctc

gta

ttc

gcc

tac

gca

tgc

gcg

ctg

1228

Leu

Ile

Ala

Leu

Asp

Gly

Val

Leu

Val

Phe

Ala

Tyr

Ala

Cys

Ala

Leu

25

30

35

ctg

tcg

acc

ggg

ccg

aca

ggc

atc

tcg

tcg

tcg

tcc

gcg

ccg

ccg

ctc

1276

Leu

Ser

Thr

Gly

Pro

Thr

Gly

Ile

Ser

Ser

Ser

Ser

Ala

Pro

Pro

Leu

40

45

50

55

ccg

gcc

ccg

gtg

ccg

tgg

gag

cgg

ctc

gtg

ctc

atc

gcc

gcg

gcc

act

1324

Pro

Ala

Pro

Val

Pro

Trp

Glu

Arg

Leu

Val

Leu

Ile

Ala

Ala

Ala

Thr

60

65

70

gcg

cct

gtc

gcc

gta

cgg

cgg

atc

tgg

ccg

ttg

ccc

gtg

ttc

gcg

gtc

1372

Ala

Pro

Val

Ala

Val

Arg

Arg

Ile

Trp

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Val

75

80

85

gtg

ctg

gcg

gtg

acc

gcc

gtg

gcc

gtc

gtg

cgg

gac

gcg

gcg

tgg

gac

1420

Val

Leu

Ala

Val

Thr

Ala

Val

Ala

Val

Val

Arg

Asp

Ala

Ala

Trp

Asp

90

95

100

ccg

ttc

ctg

tcg

gcg

gcg

ttc

gcc

ctc

tac

acc

gtc

gcc

gtc

acg

gtg

1468

Pro

Phe

Leu

Ser

Ala

Ala

Phe

Ala

Leu

Tyr

Thr

Val

Ala

Val

Thr

Val

105

110

115

ccc tcg cgc cac tgg tgg caa cgc tgg tta ccc ggc ctg gcg atc gct 1516

Pro Ser Arg His Trp Trp Gin Arg Trp Leu Pro Gly Leu Ala Ile Ala »««·

9« 9999

9 9 9 9 9

9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 · 9 9 9 9 9 •999 99 99 99

9 9 9

9 9 9 • 9 9 9

9 9 9

99

120

125

130

135

ttg

ctg

acc

gtg

gcc

ggc

ctt

gcc

gga

gca

gcg

cgt

gcc

ggc

gag

gcc

1564

Leu

Leu

Thr

Val

Ala

Gly

Leu

Ala

Gly

Ala

Ala

Arg

Ala

Gly

Glu

Ala

140

145

150

ttc

tgg

tgg

cgc

ggc

agc

ccc

ggt

ctg

ctg

ctg

ctc

ggc

ttc

gcc

gca

1612

Phe

Trp

Trp

Arg

Gly

Ser

Pro

Gly

Leu

Leu

Leu

Leu

Gly

Phe

Ala

Ala

155

160

165

ctg

ctc

ggc

gcc

tgg

caa

ctg

gga

cgc

gcc

gcg

cgg

cag

agg

cgc

gca

1660

Leu

Leu

Gly

Ala

Trp

Gin

Leu

Gly

Arg

Ala

Ala

Arg

Gin

Arg

Arg

Ala

170

175

180

ttc

gcc

gtc

cgg

gcg

gcc

gag

cag

ctc

gca

caa

cgg

gcc

gtc

acg

gag

1708

Phe

Ala

Val

Arg

Ala

Ala

Glu

Gin

Leu

Ala

Gin

Arg

Ala

Val

Thr

Glu

185

190

195

gaa

cgc

ctg

cgg

ata

gcc

cgc

gaa

ctg

cat

gac

gtc

gtc

acg

cac

agc

1756

Glu

Arg

Leu

Arg

Ile

Ala

Arg

Glu

Leu

His

Asp

Val

Val

Thr

His

Ser

200

205

210

215

atg

ggc

ctg

atc

gcg

gtc

aag

gtc

ggc

gtc

gcc

aac

cac

gtg

ttg

cac

1804

Met

Gly

Leu

Ile

Ala

Val

Lys

Val

Gly

Val

Ala

Asn

His

Val

Leu

His

220

225

230

atc

agg

ccg

cag

gag

gcg

tac

gac

gcg

ctc

cag

gtc

atc

gaa

cgc

acg

1852

Ile

Arg

Pro

Gin

Glu

Ala

Tyr

Asp

Ala

Leu

Gin

Val

Ile

Glu

Arg

Thr

235

240

245

agc

cgc

acc

gcg

ctg

aac

gac

atg

cgc

cgg

atg

ctc

ggt

gtg

ctg

cgt

1900

Ser

Arg

Thr

Ala

Leu

Asn

Asp

Met

Arg

Arg

Met

Leu

Gly

Val

Leu

Arg

250

255

260

acg

tcc

gag

ggt

gag

cgg

cag

tca

gcg

gct

ctc

ggc

ccg

ctg

cct

ggc

1948

Thr

Ser

Glu

Gly

Glu

Arg

Gin

Ser

Ala

Ala

Leu

Gly

Pro

Leu

Pro

Gly

265

270

275

gcc

ctt

gct

ctc

cct

gac

ctc

gtc

ggg

cag

gcc

ggc

gcg

cag

ctg

act

1996

Ala

Leu

Ala

Leu

Pro

Asp

Leu

Val

Gly

Gin

Ala

Gly

Ala

Gin

Leu

Thr

280

285

290

295

atg

cgc

ggt

gtc

gag

agt

ctg

ccc

gac

gga

gtc

gcg

ctg

gcc

gtc

tac

2044

Met

Arg

Gly

Val

Glu

Ser

Leu

Pro

Asp

Gly

Val

Ala

Leu

Ala

Val

Tyr

300

305

310

cgg

atc

gtg

cag

gag

gcg

ctc

acc

aat

gtc

gcc

aag

cac

gcc

ggc

ccg

2092

Arg

Ile

Val

Gin

Glu

Ala

Leu

Thr

Asn

Val

Ala

Lys

His

Ala

Gly

Pro

315

320

325

φ φ ·*·« ·* ··«· » · φ · · φ • · · φ · • φ φ φ φ · • · · ♦ · · · • •ΦΦ ·« »4 ΦΦ • · · · • Φ Φ Φ • Φ Φ ♦

Φ Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦ

gag Glu	gcc Ala	cgc Arg 330	tgc Cys	cgg Arg	gtg gcg Val Ala	gtc Val 335	gat gcg aac ggc	cac ggc gtc cgg	2140
Asp Ala Asn	Gly	His 340	Gly Val Arg
ctc	gag	ata	acc	gac	gac gga	ggc	gac cgg agc	ccc	ctc	gcg ccg aag	2188
Leu	Glu	Ile	Thr	Asp	Asp Gly	Gly	Asp Arg Ser	Pro	Leu	Ala Pro Lys
	345				350			355
ccc	ggc	ggc	cac	gga	atc gtc	ggc	atg cgc gaa	cgc	gtc	gcc ctg tac	2236
Pro	Gly	Gly	His	Gly	Ile Val	Gly	Met Arg Glu	Arg	Val	Ala Leu Tyr
360					365		370			375
ggc	ggc	acc	ttc	gcc	gcc gga	ccg	cgt cca gag	ggc	ggc	ttc gcg gta	2284
Gly	Gly	Thr	Phe	Ala	Ala Gly	Pro	Arg Pro Glu	Gly	Gly	Phe Ala Val
				380			385			390
cac	gcg	tcc	ctg	ccg	tac gag	gag	aac aca tga	cccggcccgc cgatccgccc	2337
His	Ala	Ser	Leu	Pro	Tyr Glu	Glu	Asn Thr
			395				400

ggtgccccgg	tccgggtcct	catcgccgac	gaccaggcgc	tgctgcgcgg	cagcctgcgg	2397
gtgctcgtcg	acaccgagcc	cggcctggtg	gccacgtcgg	aggcggcgac	cggcacggag	2457
gcggtgcggc	ttgcccggca	ggatccgccg	gacgtggtcc	tgatggacgt	gcggatgccc	2517
gaaatggatg	gcatcgaggc	gacccggcag	atctgcggtt	cccccgagac	cgcggacgtc	2577
aaagtgctga	tcctgacgat	gttcgacctg	gacgagtacg	tctacgccgc	gctgcgggcc	2637
ggtgccagcg	gcttcctgct	gaaggacacg	ccgcccagcg	agttgctcgc	ggcggtacgg	2697
gtcatcgccg	ccggcgaggc	gctgctggca	ccggccgtga	cgcggcgcct	gatcgcggag	2757
ttcgtccacc	gcccggagcc	ctcgcgaccg	ctgcgtcgca	ccctggacgg	cgtgaccgag	2817
cgcgaacgtg	aagtcctcac	cctcatcgcc	tgcggcctgt	ccaacaccga	gatcgccgag	2877
cggctgtatc	tcggcattgc	caccgtgaag	acccacgtca	gccacctgct	caccaagctc	2937
gccacccgcg	atcgcgctca	gttggtgatc	gtcgcgtacg	agagcggcct	ggtcacggtg	2997
gcgcgaccac	cgatcggttc	ctgaggggcg	ccggcgcaca	cggtgcacgg	cctgggcggg	3057
gccgttcaga	atggatcacc	cgggtacacg	aggcgcagtt	cgtcgacatg	gctcatgagg	3117
tactcaccgg	ggcactgggt	ggatgccggg	gcccgggact	gcttcttgcg	cggctggtgg	3177
ccccagacgc	tgctgatgcc	gaagcggacg	gccaggacgt	ccacgaggac	gtcgagtgtt	3237

0000 00 0040 00 0«

0 00 0 0000

0 00 0 0000 0 000 0 000 00 0

00 0 000 0000 0000 00 00 00 00 40

gtgagttgct	tgggcgtcgg	gtggtcgtag	cgtgcccact	ggttctgcca	gcgcggtccg	3297
aagtcgccgg	tgagcacgat	gccgagattg	ccggcgttga	agagttcagc	gtgtgagccc	3357
tcgatgccga	gtggccgccc	ctcgtagatc	gtcccggcgc	cgtcgatgat	gtagtggtaa	3417
ccgatgtcgg	ccttgtcgtc	cgcgaagtgc	gcccgctgga	tcgtgcgcgg	gccctcatgc	3477
gtgtacgtga	cggggtcggc	cgagtggtgg	atggtgatcc	agcggtagac	ggaggccagg	3537
ggccggttct	cgctgagcgg	tacgggactg	ccgcggtagg	gcggtggcgc	gagggggccg	3597
gaggcggcct	cgtggaaatc	ccaggtacgc	agcggggggt	cgatctgcgg	cggggccgcc	3657
ccccaggtgg	cgcggccgac	gacggacacg	gtcagcggcc	ctcgcggtgt	catggcccac	3717
aactcgtagt	cgccgctcgc	cggatgcagg	aagcgcgact	cgtcccagca	ggcggcgacg	3777
gggccgtgcg	cggtgtcgac	cggccgggtg	ccgcaggacg	tcagcctcag	gggagtccgg	3837
tgcgggcgct	gccccgagac	cggcgcgttg	aaccggccga	tgtcggtgat	cacggtggtg	3897
cggagttccg	acaggtcgta	gccgtcgcgg	gggcattcga	gggagcgcgg	cggcggttcc	3957
acgaccctga	gcgccgcatc	gcaccggggg	cagacgagaa	cgagcacctc	gcgggcgacc	4017
agctccgtcg	tcgtaccggg	cgggagccgg	tggtggcggg	gcagatcgag	tggcgtgcgg	4077
ccgggccgca	gttcggtcac	gggcacgggg	tcggtggctt	cggcggcggg	tgccagctcg	4137
tggtcggcgc	aggcgaccgt	ccaggcacgc	gtcccggcgt	cgggaaccat	gagggtgccc	4197
agcgcgtccg	tcgtggccgc	gatcccggaa	tgccgtcctc	ccgatggcgg	gatgagccgt	4257
acggtgaatc	cggggatcgg	gctgccgtcg	cggcgcagga	tcaccagggc	cgtgtccgac	4317
ggtggtgaga	gttcggcggc	cagccccgcc	tcgacgaagt	gcagcaagcg	gtgtgtcagt	4377
tgcagtacct	cgggagagtc	cggcgcgagc	atggcctcgg	cacggctgcg	cacgctctcg	4437
aacgcgccgc	cgagtgcgaa	gcgcaggaag	tcgacggcga	acgcgacgat	ctccccggčg	4497
acgaagccga	ccgcggcgtc	ggcgaagcga	ggcgggccga	agccaggtgc	cagggggagc	4557
gccggcgctc	cggcactggt	cctggtggcg	gcgacgaacg	cggtgcaacg	ccggtccacg	4617
gcgccgtcgt	agtactcacg	cagctgcgcc	gccagcgagc	ggtgcgggtc	gaaggactcg	4677

ccgaggttca ccccgtcgat gtcgcccagc agccgcggcg tcgaagcgtg gcgggcgacc 4737

0090 00 000» 0· ·· ·· 0 00 · 0000

0» 000 0000 0 0000 0 0 0 0 · ♦ • 0* 0000 4 0··

0000 00 90 90 40 00

cagtggtcca	gcgaccgacc	gcggtccgcg	gccggcaccc	cgggcgcgtg	gcgggcgcgg	4797
acgtacgcgg	cgagggcgcg	cccgaggtca	ccgctccagg	tgagggcgag	atccgctcga	4857
ggggccgggt	ccagggggcc	gggcgtctgc	cggtcggccc	cgtcgatgcc	ggccagcacc	4917
tgcgccaggt	cgagccgctc	gaagccgtgc	tgcacccgca	gcagcgcggc	cagccgggcg	4977
gcccggcggg	gcagctccca	ggacgagccc	ggcgtctggt	cgtacggggg	gatgttccgc	5037
cggttctg						5045

<210> 2 <211> 401 <212> PRT <213> Streptomyces avermitilis <400> 2

Val 1

His

Ala

Gly

Thr 5

Ala Val Asp

Pro

Asp 10

Asp

His

Pro

lle

Leu 15

Ala

Arg

Arg

Leu

Ser

Arg

Arg

Arg

Leu

lle

Ala

Leu

Asp

Gly

Val

Leu

Val

20

25

30

Phe

Ala

Tyr

Ala

Cys

Ala

Leu

Leu

Ser

Thr

Gly

Pro

Thr

Gly

lle

Ser

35

40

45

Ser

Ser

Ser

Ala

Pro

Pro

Leu

Pro

Ala

Pro

Val

Pro

Trp

Glu

Arg

Leu

50

55

60

Val

Leu

lle

Ala

Ala

Ala

Thr

Ala

Pro

Val

Ala

Val

Arg

Arg

lle

Trp

65

70

75

80

Pro

Leu

Pro

Val

Phe

Ala

Val

Val

Leu

Ala

Val

Thr

Ala

Val

Ala

Val

85

90

95

Val

Arg

Asp

Ala

Ala

Trp

Asp

Pro

Phe

Leu

Ser

Ala

Ala

Phe

Ala

Leu

100

105

110

Tyr

Thr

Val

Ala

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Arg

His

Trp

Trp

Gin

Arg

Trp

115

120

125

Leu

Pro

Gly

Leu

Ala

lle

Ala

Leu

Leu

Thr

Val

Ala

Gly

Leu

Ala

Gly

130

135

140

Ala

Ala

Arg

Ala

Gly

Glu

Ala

Phe

Trp

Trp

Arg

Gly

Ser

Pro

Gly

Leu

145

150

155

160

Leu

Leu

Leu

Gly

Phe

Ala

Ala

Leu

Leu

Gly

Ala

Trp

Gin

Leu

Gly

Arg

165 • t ···· ·* ···· ·· ·· ·· · · · · · · · · ·· ··· ···· • · · · · ···+·· • ·· · · · · ···· ···· Φ· ·· »· ·· ·9

Ala	Ala	Arg	Gin 180	Arg	Arg	Ala
Ala	Gin	Arg 195	Ala	Val	Thr	Glu
His	Asp 210	Val	Val	Thr	His	Ser 215
Val 225	Ala	Asn	His	Val	Leu 230	His
Leu	Gin	Val	Ile	Glu 245	Arg	Thr
Arg	Met	Leu	Gly 260	Val	Leu	Arg
Ala	Leu	Gly 275	Pro	Leu	Pro	Gly
Gin	Ala 290	Gly	Ala	Gin	Leu	Thr 295
Gly 305	Val	Ala	Leu	Ala	Val 310	Tyr
Val	Ala	Lys	His	Ala 325	Gly	Pro
Ala	Asn	Gly	His 340	Gly	Val	Arg
Arg	Ser	Pro 355	Leu	Ala	Pro	Lys
Arg	Glu 370	Arg	Val	Ala	Leu	Tyr 375
Pro 385	Glu	Gly	Gly	Phe	Ala 390	Val
Thr
<210> 3 <211> 5045 <212> DNA

170 175

Phe Ala Val Arg Ala Ala Glu Gin Leu 185 190

Glu Arg Leu Arg Ile Ala Arg Glu Leu 200 205

Met Gly Leu Ile Ala Val Lys Val Gly 220

Ile Arg Pro Gin Glu Ala Tyr Asp Ala 235 240

Ser Arg Thr Ala Leu Asn Asp Met Arg 250 255

Thr Ser Glu Gly Glu Arg Gin Ser Ala 265 270

Ala Leu Ala Leu Pro Asp Leu Val Gly 280 285

Met Arg Gly Val Glu Ser Leu Pro Asp 300

Arg Ile Val Gin Glu Ala Leu Thr Asn 315 320

Glu Ala Arg Cys Arg Val Ala Val Asp 330 335

Leu Glu Ile Thr Asp Asp Gly Gly Asp 345 350

Pro Gly Gly His Gly Ile Val Gly Met 360 365

Gly Gly Thr Phe Ala Ala Gly Pro Arg 380

His Ala Ser Leu Pro Tyr Glu Glu Asn 395 400

• · · · · ······ • ·· ···· · · · · • ··· ·· ·· · · · · · · <213> Streptomyces avermitilis <220>

<221> CDS <222> (2314)..(3021) <223> aveR2 ORF <400> 3

cgagttgctg	gtcatcggcg	tactcctccc	ggcgactccg	cccggtactc	gaccgcggca	60
gcggtcagcc	gcatgaacgc	ctcttcgaga	gacacggtct	tccgcgtcac	ctcgtgcacc	120
gtcacggcgt	gcgccgcgac	gagttcgccg	atccgctccg	cggcggcggc	caccttcagg	180
ctgccgtcgg	agcagtcggt	gaccgtgatt	cccgcgccga	ccagcacgtc	gcgcagccgc	240
cgcggttccg	gagtgcgcac	ccgcaccccc	acgtccgtgt	acctgtcgat	gaactcgctc	300
atgctggtgt	ccgcgaggag	ccgaccgcgg	ccgatgatga	cgaggtggtc	cacggtgagc	360
gccgcctcgc	tcatcagatg	gctggacacg	aagacggtgc	gtccctgtgc	cgccaggtcc	420
cgcatgaggt	gccgcagcca	caggacgcct	tccgggtcga	gcccgttgac	cggctcgtcg	480
agcaccagga	cggcggggtc	gccgagcagc	gccgcggcga	ttcccagccg	ctgactcatg	540
cccagcgaga	acgtccccgc	ccgccggcgc	acggcgctcc	gcaggcccgc	cagctcgatc	600
acctcacgga	cgcggcgggg	cgggatccgg	ttgctgcggg	ccagccagcg	caagtggttc	660
agcgcggttc	ggccggggtg	caccgccctg	gcgtcgagca	gtgcccccac	cgtccgcagc	720
gggtcgcgga	gccgctggta	gggcgcgccg	tcgatgcgta	cctcgccggc	cgtcgggcgg	780
tccaggccca	gcatcatgcg	catcgcggtg	gacttcccgg	cgccgttggg	gccaaggaat	840
ccggtcaccc	gaccggtccg	tacctggaag	gtaagaccct	ccacaacggt	ggtggtcccg	900
tagcgcttgg	tcaggtccgt	gacttcgatc	atgccggtga	tggtccgtga	cgacaggctc	960
ccgccgcgtc	ccgctcgggg	ctgactgccc	cttctccacc	cccggttgga	gaatgaccgc	1020
cacccgcggc	cgcgcatcag	gctgcaggag	gagcggcttt	gaccaccgct	ggacggaggc	1080
ggagcggcgt	acgcctggat	atggtcgagc	ggtgcatgca	ggtaccgcgg	tggaccccga	1140
cgaccatccg	atcctggccc	ggcgactgag	ccggcgccga	ctcatcgccc	tggacggcgt	1200
gctcgtattc	gcctacgcat	gcgcgctgct	gtcgaccggg	ccgacaggca	tctcgtcgtc	1260

gtccgcgccg	• · · • · — · ♦ θ · · · · · *	• · · · • · · · • 9 9 9 9 9 99 9 9 ctcgtgctca	• · · • · · 9 9 9 9 · 99 tcgccgcggc	1320
ccgctcccgg	ccccggtgcc	gtgggagcgg
cactgcgcct	gtcgccgtac	ggcggatctg	gccgttgccc	gtgttcgcgg	tcgtgctggc	1380
ggtgaccgcc	gtggccgtcg	tgcgggacgc	ggcgtgggac	ccgttcctgt	cggcggcgtt	1440
cgccctctac	accgtcgccg	tcacggtgcc	ctcgcgccac	tggtggcaac	gctggttacc	1500
cggcctggcg	atcgctttgc	tgaccgtggc	cggccttgcc	ggagcagcgc	gtgccggcga	1560
ggccttctgg	tggcgcggca	gccccggtct	gctgctgctc	ggcttcgccg	cactgctcgg	1620
cgcctggcaa	ctgggacgcg	ccgcgcggca	gaggcgcgca	ttcgccgtcc	gggcggccga	1680
gcagctcgca	caacgggccg	tcacggagga	acgcctgcgg	atagcccgcg	aactgcatga	1740
cgtcgtcacg	cacagcatgg	gcctgatcgc	ggtcaaggtc	ggcgtcgcca	accacgtgtt	1800
gcacatcagg	ccgcaggagg	cgtacgacgc	gctccaggtc	atcgaacgca	cgagccgcac	1860
cgcgctgaac	gacatgcgcc	ggatgctcgg	tgtgctgcgt	acgtccgagg	gtgagcggca	1920
gtcagcggct	ctcggcccgc	tgcctggcgc	ccttgctctc	cctgacctcg	tcgggcaggc	1980
cggcgcgcag	ctgactatgc	gcggtgtcga	gagtctgccc	gacggagtcg	cgctggccgt	2040
ctaccggatc	gtgcaggagg	cgctcaccaa	tgtcgccaag	cacgccggcc	cggaggcccg	2100
ctgccgggtg	gcggtcgatg	cgaacggcca	cggcgtccgg	ctcgagataa	ccgacgacgg	2160
aggcgaccgg	agccccctcg	cgccgaagcc	cggcggccac	ggaatcgtcg	gcatgcgcga	2220
acgcgtcgcc	ctgtacggcg	gcaccttcgc	cgccggaccg	cgtccagagg	gcggcttcgc	2280
ggtacacgcg	tccctgccgt	acgaggagaa	cac atg acc	: cgg ccc gcc gat ccg	2334

Met Thr Arg Pro Ala Asp Pro 1 5

ccc ggt gcc ccg gtc cgg gtc

ctc atc gcc gac gac

cag Gin 20

gcg ctg

ctg Leu

2382

Pro

Gly Ala 10

Pro

Val

Arg

Val

Leu 15

lle Ala

Asp

Asp

Ala

Leu

cgc

ggc

agc

ctg

cgg

gtg

ctc

gtc

gac

acc

gag

ccc

ggc

ctg

gtg

gcc

2430

Arg

Gly

Ser

Leu

Arg

Val

Leu

Val

Asp

Thr

Glu

Pro

Gly

Leu

Val

Ala

25

30

35

acg

tcg

gag

gcg

gcg

acc

ggc

acg

gag

gcg

gtg

cgg

ctt

gcc

cgg

cag

2478

Thr

Ser

Glu

Ala

Ala

Thr

Gly

Thr

Glu

Ala

Val

Arg

Leu

Ala

Arg

Gin

40

45

50

55

79

• · • * • • • • · · ·

• · · · • • • * ·

• · • < • « • · 1 • ·

• · · · • > · • • ·

• · • • • · • ·

• · • · · * · · • · · * ·

gat

ccg

ccg

gac

gtg

gtc

ctg

atg

gac

gtg

cgg

atg

ccc

gaa

atg

gat

2526

Asp

Pro

Pro

Asp

Val

Val

Leu

Met

Asp

Val

Arg

Met

Pro

Glu

Met

Asp

60

65

70

ggc

ate

gag

gcg

acc

cgg

cag

ate

tgc

ggt

tec

ccc

gag

acc

gcg

gac

2574

Gly

Ile

Glu

Ala

Thr

Arg

Gin

Ile

Cys

Gly

Ser

Pro

Glu

Thr

Ala

Asp

75

80

85

gtc

aaa

gtg

ctg

ate

ctg

acg

atg

ttc

gac

ctg

gac

gag

tac

gtc

tac

2622

Val

Lys

Val

Leu

Ile

Leu

Thr

Met

Phe

Asp

Leu

Asp

Glu

Tyr

Val

Tyr

90

95

100

gcc

gcg

ctg

cgg

gcc

ggt

gcc

age

ggc

ttc

ctg

ctg

aag

gac

acg

ccg

2670

Ala

Ala

Leu

Arg

Ala

Gly

Ala

Ser

Gly

Phe

Leu

Leu

Lys

Asp

Thr

Pro

105

110

115

ccc

age

gag

ttg

ctc

gcg

gcg

gta

cgg

gtc

ate

gcc

gcc

ggc

gag

gcg

2718

Pro

Ser

Glu

Leu

Leu

Ala

Ala

Val

Arg

Val

Ile

Ala

Ala

Gly

Glu

Ala

120

125

130

135

ctg

ctg

gca

ccg

gcc

gtg

acg

cgg

ege

ctg

ate

gcg

gag

ttc

gtc

cac

2766

Leu

Leu

Ala

Pro

Ala

Val

Thr

Arg

Arg

Leu

Ile

Ala

Glu

Phe

Val

His

140

145

150

ege

ccg

gag

ccc

tcg

ega

ccg

ctg

cgt

ege

acc

ctg

gac

ggc

gtg

acc

2814

Arg

Pro

Glu

Pro

Ser

Arg

Pro

Leu

Arg

Arg

Thr

Leu

Asp

Gly

Val

Thr

155

160

165

gag

ege

gaa

cgt

gaa

gtc

ctc

acc

ctc

ate

gcc

tgc

ggc

ctg

tec

aac

2862

Glu

Arg

Glu

Arg

Glu

Val

Leu

Thr

Leu

Ile

Ala

Cys

Gly

Leu

Ser

Asn

170

175

180

acc

gag

ate

gcc

gag

cgg

ctg

tat

ctc

ggc

att

gcc

acc

gtg

aag

acc

2910

Thr

Glu

Ile

Ala

Glu

Arg

Leu

Tyr

Leu

Gly

Ile

Ala

Thr

Val

Lys

Thr

185

190

195

cac

gtc

age

cac

ctg

ctc

acc

aag

ctc

gcc

acc

ege

gat

ege

get

cag

2958

His

Val

Ser

His

Leu

Leu

Thr

Lys

Leu

Ala

Thr

Arg

Asp

Arg

Ala

Gin

200

205

210

215

ttg

gtg

ate

gtc

gcg

tac

gag

age

ggc

ctg

gtc

acg

gtg

gcg

ega

cca

3006

Leu

Val

Ile

Val

Ala

Tyr

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Thr

Val

Ala

Arg

Pro

220

225

230

ccg ate ggt tec tga ggggcgccgg cgcacacggt gcacggcctg ggcggggccg 3061 Pro Ile Gly Ser

235 ttcagaatgg atcacccggg tacacgaggc gcagttcgtc gacatggctc atgaggtact 3121 ·· ···· ·· ···· 44 ·» • · · 4 4 · · · · ·

4 · · · β · · · • · · · · 4 4 4 4 4 4

44 4444 4444

4444 44 «· 44 44 44

caccggggca	ctgggtggat	gccggggccc	gggactgctt	cttgcgcggc	tggtggcccc	3181
agacgctgct	gatgccgaag	cggacggcca	ggacgtccac	gaggacgtcg	agtgttgtga	3241
gttgcttggg	cgtcgggtgg	tcgtagcgtg	cccactggtt	ctgccagcgc	ggtccgaagt	3301
cgccggtgag	cacgatgccg	agattgccgg	cgttgaagag	ttcagcgtgt	gagccctcga	3361
tgccgagtgg	ccgcccctcg	tagatcgtcc	cggcgccgtc	gatgatgtag	tggtaaccga	3421
tgtcggcctt	gtcgtccgcg	aagtgcgccc	gctggatcgt	gcgcgggccc	tcatgcgtgt	3481
acgtgacggg	gtcggccgag	tggtggatgg	tgatccagcg	gtagacggag	gccaggggcc	3541
ggttctcgct	gagcggtacg	ggactgccgc	ggtagggcgg	tggcgcgagg	gggccggagg	3601
cggcctcgtg	gaaatcccag	gtacgcagcg	gggggtcgat	ctgcggcggg	gccgcccccc	3661
aggtggcgcg	gccgacgacg	gacacggtca	gcggccctcg	cggtgtcatg	gcccacaact	3721
cgtagtcgcc	gctcgccgga	tgcaggaagc	gcgactcgtc	ccagcaggcg	gcgacggggc	3781
cgtgcgcggt	gtcgaccggc	cgggtgccgc	aggacgtcag	cctcagggga	gtccggtgcg	3841
ggcgctgccc	cgagaccggc	gcgttgaacc	ggccgatgtc	ggtgatcacg	gtggtgcgga	3901
gttccgacag	gtcgtagccg	tcgcgggggc	attcgaggga	gcgcggcggc	ggttccacga	3961
ccctgagcgc	cgcatcgcac	cgggggcaga	cgagaacgag	cacctcgcgg	gcgaccagct	4021
ccgtcgtcgt	accgggcggg	agccggtggt	ggcggggcag	atcgagtggc	gtgcggccgg	4081
gccgcagttc	ggtcacgggc	acggggtcgg	tggcttcggc	ggcgggtgcc	agctcgtggt	4141
cggcgcaggc	gaccgtccag	gcacgcgtcc	cggcgtcggg	aaccatgagg	gtgcccagcg	4201
cgtccgtcgt	ggccgcgatc	ccggaatgcc	gtcctcccga	tggcgggatg	agccgtacgg	4261
tgaatccggg	gatcgggctg	ccgtcgcggc	gcaggatcac	cagggccgtg	tccgacggtg	4321
gtgagagttc	ggcggccagc	cccgcctcga	cgaagtgcag	caagcggtgt	gtcagttgca	4381
gtacctcggg	agagtccggc	gcgagcatgg	cctcggcacg	gctgcgcacg	ctctcgaacg	4441
cgccgccgag	tgcgaagcgc	aggaagtcga	cggcgaacgc	gacgatctcc	ccggcgacga	4501
agccgaccgc	ggcgtcggcg	aagcgaggcg	ggccgaagcc	aggtgccagg	gggagcgccg	4561
gcgctccggc	actggtcctg	gtggcggcga	cgaacgcggt	gcaacgccgg	tccacggcgc	4621

00 0

0 · · · ·

• · 0 00 0 • · · 0 9 0 0 81 · · · V 0 0 0 0 00	0 0 0000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 « 00 0 0 0 cgggtcgaag	• 0 0 0 0 9 9 9 · 0 9 0 0 0 « 0 0 0
cgtcgtagta	ctcacgcagc	tgcgccgcca	gcgagcggtg	gactcgccga	4681
ggttcacccc	gtcgatgtcg	cccagcagcc	gcggcgtcga	agcgtggcgg	gcgacccagt	4741
ggtccagcga	ccgaccgcgg	tccgcggccg	gcaccccggg	cgcgtggcgg	gcgcggacgt	4801
acgcggcgag	ggcgcgcccg	aggtcaccgc	tccaggtgag	ggcgagatcc	gctcgagggg	4861
ccgggtccag	ggggccgggc	gtctgccggt	cggccccgtc	gatgccggcc	agcacctgcg	4921
ccaggtcgag	ccgctcgaag	ccgtgctgca	cccgcagcag	cgcggccagc	cgggcggccc	4981
ggcggggcag	ctcccaggac	gagcccggcg	tctggtcgta	cggggggatg	ttccgccggt	5041

tctg 5045 <210> 4 <211> 235 <212> PRT <213> Streptomyces avermitilis

<400> 4

Pro

Gly

Ala 10

Pro

Val

Arg

Val

Leu 15

Ile

Met 1

Thr

Arg

Pro

Ala Asp 5

Pro

Ala

Asp

Asp

Gin 20

Ala Leu

Leu

Arg

Gly 25

Ser

Leu

Arg

Val

'Leu 30

Val

Asp

Thr

Glu

Pro 35

Gly

Leu Val

Ala

Thr 40

Ser

Glu

Ala

Ala

Thr 45

Gly

Thr

Glu

Ala

Val 50

Arg

Leu

Ala Arg

Gin 55

Asp

Pro

Pro

Asp

Val 60

Val

Leu

Met

Asp

Val 65

Arg

Met

Pro

Glu Met 70

Asp

Gly

Ile

Glu

Ala 75

Thr

Arg

Gin

Ile

Cys 80

Gly

Ser

Pro

Glu

Thr Ala 85

Asp

Val

Lys

Val 90

Leu

Ile

Leu

Thr

Met 95

Phe

Asp

Leu

Asp

Glu 100

Tyr Val

Tyr

Ala

Ala 105

Leu

Arg

Ala

Gly

Ala 110

Ser

Gly

Phe

Leu

Leu 115

Lys

Asp Thr

Pro

Pro 120

Ser

Glu

Leu

Leu

Ala 125

Ala

Val

Arg

Val

Ile 130

Ala

Ala

Gly Glu

Ala 135

Leu

Leu

Ala

Pro

Ala 140

Val

Thr

Arg

Arg

Leu Ile Ala Glu Phe Val His Arg 145 150

Arg Thr Leu Asp Gly Val Thr Glu 165

Ile Ala Cys Gly Leu Ser Asn Thr 180

Gly Ile Ala Thr Val Lys Thr His 195 200

Ala Thr Arg Asp Arg Ala Gin Leu 210 215

Leu Val Thr Val Ala Arg Pro Pro 225 230

4 4 4 • 4 ·4 4 ·

4 44 4 4444

4 • 444	♦ · • • 9 9 99	• • · • • «	4 4 4 4 4 99	• 4 4 « 4 4 9	4 4 « 4 4 4 4 4 4 • 4 4
Glu	Pro 155	Ser	Arg	Pro	Leu	Arg 160
Glu 170	Arg	Glu	Val	Leu	Thr 175	Leu
Ile	Ala	Glu	Arg	Leu 190	Tyr	Leu
Ser	His	Leu	Leu 205	Thr	Lys	Leu
Ile	Val	Ala	Tyr	Glu	Ser	Gly

Gly Ser

Claims (58)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaná polynukleotidová molekula, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující produkt genu aveRl ze S. avermitilis.
2. 2. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 1, kde produkt genu aveRl obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 2.
3. 3. Izolovaná polynukleotidová molekula která obsahuje nukleotidovou sekvenci id. č 1112 do nukleotidu 2317.

   podle nároku 2, 1 od nukleotidu
4. 4. Izolovaná polynukleotidová molekula podle která obsahuje nukleotidovou sekvenci id. č. 1.

   nároku

   3,
5. 5. Izolovaná polynukleotidová molekula, která je homologní s polynukleotidovou molekulou obsahující nukleotidovou sekvenci id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317.
6. 6. Izolovaná polynukleotidová molekula podle která hybridizuje za mírně stringentních s komplementem polynukleotidové molekuly nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid aminokyselinovou sekvenci id. č. 2, a která je k provádění vynálezu.

   nároku 5, podmínek obsahuj ící obsahuj ící užitečná
7. 7, Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 6, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s komplementem polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 2.
8. 8. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 7, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s komplementem polynukleotidová molekuly. obsahující nukleotidovou sekvenci id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317.
9. 9. Izolovaná polynukleotidová molekula, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci homologní s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2.
10. 10. Izolovaná polynukleotidová molekula, která sestává z nukleotidové sekvence, která je podstatnou částí polynukleotidová molekuly podle nároků 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nebo 9.
11. 11. Izolovaná polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci, které přirozeně in šitu obklopuje sekvenci aveRl ORF v S. avermitilis, vybranou z nukleotidové sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1 do nukleotidu 1111 a od nukleotidu 2318 do nukleotidu 5045, nebo nukleotidovou sekvenci, která je homologní s obklopující sekvencí.
12. 12. Izolovaná polynukleotidová molekula, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující produkt genu aveR2 ze S. avermitilis.
13. 13. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 12, kde produkt genu aveR2 obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 4.

    44 ···· 44 ···· ·· 44 • 4 4 44 4 · * · 4

    44 44 · 4 4 4 ·

    4 444 4 4 · 4 4 4 4
14. 14. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 13, která obsahuje nukleotidovou sekvenci id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021.
15. 15. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 14, která obsahuje nukleotidovou sekvenci id. č. 3.
16. 16. Izolovaná polynukleotidové molekula, která je homologní s polynukleotidovou molekulou obsahující nukleotidovou sekvenci id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021.
17. 17. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 16, která hybridizuje za mírně stringentních podmínek s komplementem polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 4, a která je užitečná k provádění vynálezu.
18. 18. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 17, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s komplementem polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 4.
19. 19. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 18, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s komplementem polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021.
20. 20. Izolovaná polynukleotidové molekula, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který má

    9 9 9 • 9 9 9 9

    9 9

    9 9

    9 9

    9999 «9

    99 9999 99 99

    9 9 9 9 9 9

    9 9 V 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9

    99 9 · 99 99 aminokyselinovou sekvenci, která s aminokyselinovou sekvencí id. č. 4.

    je homologní
21. 21. Izolovaná polynukleotidová molekula, .která sestává z nukleotidové sekvence, která je podstatnou částí polynukleotidové molekuly podle nároků 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 nebo 20.
22. 22. Izolovaná polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci, která přirozeně in sítu obklopuje sekvenci aveR2 ORF v S. avermitilis, vybranou z· nukleotidové sekvence id. č. 3 od nukleotidu 1 do nukleotidu 2313 a od nukleotidu 3022 do nukleotidu 5045, nebo nukleotidovou sekvenci, která je homologní s obklopující sekvencí.
23. 23. Izolovaná polynukleotidová molekula, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující produkty genů aveRl a aveR2 ze S. avermitilis.
24. 24. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 23, kde produkt genu aveRl obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 2 a produkt genu aveR2 obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 4.
25. 25. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 24, která obsahuje nukleotidovou sekvenci aveRl ORF ze S. avermitilis uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317 a nukleotidovou sekvenci aveR2 ORF ze S. avermitilis uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021.

    9« 9999

    9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

    99 99 9 *999

    9 999 9 999 99 9

    9 9 9 9 99 9 9 99 9

    99*9 99 99 9· 9 9 9 »
26. 26. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 25, která obsahuje nukleotidovou sekvenci id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 3021.
27. 27. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 26, která obsahuje nukleotidovou sekvenci id. č. 1.
28. 28. Izolovaná polynukleotidové molekula, která je homologní s polynukleotidovou molekulou obsahující nukleotidovou sekvenci aveRl ORF ze S. avermitilis uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317 a nukleotidovou sekvenci aveR2 ORF ze S. avermitilis uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021.
29. 29. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 28, která hybridizuje za mírně stringentních podmínek s komplementem polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje první polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 2 a druhý polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 4, a která je užitečná k provádění vynálezu.
30. 30. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 29, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s komplementem polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje první polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 2 a druhý polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 4.
31. 31. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 30, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s komplementem polynukleotidové molekuly obsahující

    99 9999

    9 9 9 • 9

    9 9

    9 9 9

    9999 9» nukleotidovou sekvenci aveRl ORF ze S. avermitilis uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317 a nukleotidovou sekvenci aveR2 ORF ze S. avermitilis uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021.
32. 32. Izolovaná polynukleotidová molekula, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující první polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci homologní s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2, a druhý polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci homologní s aminokyselinovou sekvencí id. č. 4.
33. 33. Izolovaná polynukleotidová molekula, která sestává z nukleotidové sekvence, která je podstatnou částí polynukleotidové molekuly podle nároků 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 nebo 32.
34. 34. Izolovaná polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci, která přirozeně in šitu obklopuje sekvence aveRl ORF a aveR2 ORF v S. avermitilis, vybranou z nukleotidové sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1 do nukleotidu 1111 a od nukleotidu 3022 do nukleotidu 5045, nebo nukleotidovou sekvenci, která je homologní s obklopující sekvencí.
35. 35. Izolovaná polynukleotidová molekula, která hybridizuje za vysoce stríngentních podmínek s polynukleotidovou molekulou sestávající z nukleotidové sekvence id. č. 1 nebo polynukleotidovou molekulou sestávající z nukleotidové sekvence, která je komplementem nukleotidové sekvence id. č. 1.

    « «

    9 9 9

    99 9·

    9 9 9

    9999 99
36. 36. Rekombinantní vektor, který obsahuje:

    a) polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci id. č. 2 nebo sekvenci id. č. 4, nebo

    b) polynukleotidovou molekulu, která je homologni s polynukleotidovou molekulou dle v bodu a) nebo

    c) polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci homologni s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2 nebo sekvencí id. č. 4, nebo

    d) polynukleotidovou molekulu sestávající z nukleotidové sekvence, která je podstatnou částí kterékoliv z polynukleotidových molekul v bodech a, b nebo c.
37. 37. Rekombinantní vektor podle nároku 36, kde polynukleotidové molekula je operativně spojena s jedním nebo několika regulačními prvky.
38. 38. Rekombinantní vektor podle nároku 36, která dále obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující selekční markér nebo produkt reportérového genu.
39. 39. Rekombinantní vektor podle nároku 36, který obsahuje nukleotidovou sekvenci id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu 2317.
40. 40. Rekombinantní vektor podle nároku 36, který obsahuje nukleotidovou sekvenci id. č. 3 od nukleotidu 2314 do nukleotidu 3021.
41. 41. Rekombinantní vektor podle nároku 36, který obsahuje nukleotidovou sekvenci aveRl ORF ze 5. avermitilis uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 od nukleotidu 1112 do nukleotidu

    99 9999 » « · * f · « • · * *

    99 9999 99 4

    9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9

    9999 99 aveR2 ORF ze S. avermitilis č. 1 od nukleotidu 2314 do

    2317 a nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. nukleotidu 3021.
42. 42. Rekombinantní vektor podle nároku 41, který je plazmid pSE201 (Sbírka ATCC, č. 203182) .
43. 43. Transformovaná hostitelská buňka, která obsahuje rekombinantní vektor podle nároku 36.
44. 44. V podstatě čistý nebo izolovaný polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 2 nebo sekvenci id. č. 4, nebo homologní polypeptid nebo jeho fragment.
45. 45. Způsob přípravy V podstatě čistého nebo izolovaného polypeptidů, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 2 nebo sekvenci id. č. 4, nebo homologní polypeptid nebo jeho fragment, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se kultivuje transformovaná hostitelská buňka podle nároku 43 v podmínkách vedoucích k expresi polypeptidů nebo peptidového fragmentu, a exprimovaný polypeptid nebo peptidový fragment se získá z buněčné kultury v podstatě čisté nebo izolované formě.
46. 46. Polynukleotidová molekula, která

    a) obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující produkt genu aveRl nebo aveR2 ze S. avermitilis, nebo

    b) která je homologní s polynukleotidovou molekulou v bodě a), nebo

    c) sestává z nukleotidové sekvence, která je podstatnou částí polynukleotidové molekuly z a) nebo b), nebo

    44 4444 »444

    44 4444

    4 4 4 4 • 4 4 4

    4 4 4 4 4 * «444

    4 · 44 44

    44 4* » 4 4 « » 4 4 I • 4 4 4 » 4 4 I

    4 4 44

    d) obsahuje nukleotidovou sekvenci, která in sítu přirozeně obklopuje aveRl ORF nebo aveR2 ORF ze S. avermitilis, a která dále obsahuje alespoň jednu mutaci, která vede k detekovatelnému zvýšení množství avermektinů produkovaných buňkami kmenu S. avermitilis nesoucími mutaci v genu aveRl nebo aveR2 nebo současně v obou genech aveRl a aveR2 ve srovnání s buňkami téhož kmenu, které nenesou mutace genu.
47. 47. Polynukleotidová molekula podle nároku 46, která obsahuje úplný aveRl ORF ze S. avermitilis nebo homologní polynukleotidovou molekulu nebo její podstatnou část, nebo obsahuje úplný aveR2 ORF ze S. avermitilis nebo homologní polynukleotidovou molekulu nebo její podstatnou část, nebo obsahuje úplný aveRl ORF a aveR2 ORF ze S. avermitilis nebo homologní polynukleotidovou molekulu nebo její podstatnou část, nebo obsahuje nukleotidovou sekvenci která in šitu přirozeně obklopuje aveRl ORF ze S. avermitilis nebo sekvenci která in šitu přirozeně obklopuje aveR2 ORF ze S. avermitilis nebo sekvenci která in šitu přirozeně obklopuje obě aveRl ORF a aveR2 ORF ze S. avermitilis, přičemž polynukleotidová molekula je užitečná k mutování genu aveRl nebo genu aveR2 nebo obou genů aveRl a aveR2 v S. avermitilis, takže množství množství avermektinů produkovaných buňkami kmenu S. avermitilis nesoucími mutaci v genu aveRl nebo aveR2 nebo současně v obou genech aveRl a aveR2 je detekovatelně vyšší ve srovnání s buňkami téhož kmenu, které nenesou mutace genu.
48. 48. Genový konstrukt užitečný pro vnesení mutace buďto do genu aveRl nebo genu aveR2 nebo do obou genů aveRl a aveR2 v S. avermitilis, který obsahuje polynukleotidovou molekulu podle nároku 46 nebo 47.

    44 444 4 44

    4 4 4 4 4

    4 4 4 4

    4 4 4 4 4

    4 4 4 4 4 • 444 44 44

    4444 44 · 4

    4 4 4 4 ·

    4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 ·

    4 4 4 4 4 4

    44 4444
49. 49. Genový konstrukt podle nároku 48, který může mutovat gen aveRl nebo gen aveR2 ze S. avermitilis tím, že odstraní část genu aveRl nebo aveR2, nebo nahradí část genu aveRl nebo aveR2 odlišnou nebo heterologní nukleotidovou sekvencí.
50. 50. Genový konstrukt podle nároku 49, který může mutovat oba geny aveRl a aveR2 ze S. avermitilis tím, že odstraní část genů aveRl a aveR2, nebo nahradí část genů aveRl a aveR2 odlišnou nebo heterologní nukleotidovou sekvencí.
51. 51. Genový konstrukt podle nároku 48, který může mutovat gen aveRl nebo gen aveR2 ze S. avermitilis tím, že vloží odlišnou nebo heterologní nukleotidovou sekvenci do genu aveRl nebo aveR2.
52. 52. Způsob identifikace mutace genu aveRl nebo genu aveR2 nebo obou genů aveRl a aveR2 v druhu nebo kmenu Streptomyces, kterážto mutace je schopna detekovatelně zvýšit množství avermektinů produkovaných buňkami druhu nebo kmenu Streptomyces nesoucími genovou mutaci ve srovnání s buňkami téhož druhu nebo kmenu Streptomyces, které nenesou mutaci genu, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

    a) měří se množství avermektinů produkované buňkami druhu nebo kmenu Streptomyces,

    b) vnese se mutace do genu aveRl nebo genu aveR2 nebo obou genů aveRl a aveR2 v buňkách druhu nebo kmenu Streptomyces dle bodu a), a

    c) porovná se množství avermektinů produkovaných buňkami druhu nebo kmenu Streptomyces nesoucími genovou mutaci připravenými podle bodu b) s množstvím avermektinů produkovaných buňkami dle bodu a) které nenesou mutaci genu,

    9« 9999 99 9999 9* 99

    99 9 99 9 9999 • 9 999 9999

    9 999 9 999 99 9

    9 99 9999 9999

    9999 99 9999 99 *9 a jestliže množství avermektinů produkovaných buňkami druhu nebo kmenu Streptomyces nesoucími genovou mutaci připravenými podle bodu b) je detekovatelně vyšší než množství avermektinů produkovaných buňkami dle bodu a) . které nenesou mutaci genu, pak mutace genu aveRl nebo. genu aveR2 nebo obou genů aveRl a aveR2, která je schopná detekovatelně zvýšit množství produkovaných avermektinů, byla detekována.
53. 53. Způsob podle nároku 52 vyznačující se tím, že druh Streptomyces je S. avermitilis.
54. 54. Způsob přípravy geneticky modifikovaných buněk druhu nebo kmenu Streptomyces, kteréžto modifikované buňky produkují detekovatelně vyšší množství avermektinů ve srovnání s nemodifikovanými buňkami téhož druhu nebo kmenu Streptomyces, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se mutuje gen aveRl nebo gen aveR2 nebo oba geny aveRl a aveR2 v buňkách druhu nebo kmenu Streptomyces a selektují se mutované buňky, které produkují detekovatelně vyšší než množství avermektinů ve srovnání s buňkami téhož druhu nebo kmenu Streptomyces, které nenesou mutaci genu.

    55. Způsob podle nároku 54 vyznačuj i c i s e t i m, že že druh Streptomyces je S . avermitilis. 56. Způsob podle nároku 54 vyznačuj i c i s e t i m, že mutace se provádí tak, že se odstraní část genu aveRl nebo aveR2 nebo se nahradí část genu aveRl nebo aveR2 odlišnou nebo heterologní nukleotidovou sekvencí. 57. Způsob podle nároku 54 vyznačuj i c i s e

    tím, že mutace se provádí tak, že se odstraní část obou genů

    99 9999

    99 «999 99 ·* » · 9 9 9 9 9 9 · 9 • 9 999 9 9 9 9

    9 999 9 999 99 9

    9 99 9999 999»

    9999 99 99 99 99 9« aveRl a aveR2 nebo se nahradí část obou genů aveRl a aveR2 odlišnou nebo heterologní nukleotidovou sekvencí.
55. 58. Způsob podle nároku 54 vyznačující se tím, že mutace se provádí tak, že se vloží odlišná nebo heterologní nukleotidová sekvence do genu aveRl nebo aveR2.
56. 59. Kmen Streptomyces, jehož buňky produkují detekovatelně vyšší množství avermektinů v důsledku jedné nebo několika

    mutací genu aveRl nebo genu aveR2 nebo obou genů aveRl a aveR2, ve srovnání s buňkami téhož druhu nebo kmenu Streptomyces, které nenesou . mutaci genu. 60. Kmen podle nároku 59, kdy druhem je S. avermitilis. 61. Způsob výroby zvýšeného množství avermektinů

    produkovaných kulturami Streptomyces vyznačuj icí se tím, že obsahuje kultivaci buněk druhu nebo kmenu Streptomyces, jehož buňky nesou mutaci v genu aveRl nebo genu aveR2 nebo v obou genech aveRl a aveR2, kterážto mutace vede k detekovatelnému zvýšení množství avermektinů produkovaných buňkami druhu nebo kmenu Streptomyces nesoucími mutaci genu ve srovnání s buňkami téhož druhu nebo kmenu, které nenesou mutaci genu, a tato kultivace probíhá v kultivačním médiu v takových podmínkách, které umožňují nebo indukují produkci avermektinů z buněk, a dále obsahuje izolaci avermektinů z kultury.
57. 62. Způsob podle nároku 61 vyznačující tím, že druhem Streptomyces je S. avermitilis.

    99 9999 9« 9999 99 99

    99 9 99 9 »999

    99 99 9 9999

    9 999 9 999 99 9

    9 9« 9999 9999

    9999 99 99 99 99 «·
58. 63. Protilátka namířená proti produktu genu aveRl nebo produktu genu aveR2, homolognímu polypeptidu nebo peptidovému fragmentu podle vynálezu.