JP2000072766A - ベンゾピラン誘導体 - Google Patents
ベンゾピラン誘導体Info
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- JP2000072766A JP2000072766A JP25609598A JP25609598A JP2000072766A JP 2000072766 A JP2000072766 A JP 2000072766A JP 25609598 A JP25609598 A JP 25609598A JP 25609598 A JP25609598 A JP 25609598A JP 2000072766 A JP2000072766 A JP 2000072766A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１結合阻害作用を有
するベンゾピラン誘導体の提供。 【解決手段】 ストレプトミセス（Streptomyces）の培
養により得ることのできる下記式（Ｉ）で示される化合
物： 【化１】 上記化合物の微生物の培養による製造方法、および上記
化合物を有効成分として含有する医薬。
するベンゾピラン誘導体の提供。 【解決手段】 ストレプトミセス（Streptomyces）の培
養により得ることのできる下記式（Ｉ）で示される化合
物： 【化１】 上記化合物の微生物の培養による製造方法、および上記
化合物を有効成分として含有する医薬。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の生産する
ベンゾピラン誘導体、ならびにその製造方法および医薬
としての用途に関する。
ベンゾピラン誘導体、ならびにその製造方法および医薬
としての用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内では、機能を異にする細胞が相互
作用しながら恒常性の維持に関わっている。接着分子は
細胞と細胞あるいは細胞と細胞外基質との接着を担う分
子である。これまでに多くの接着分子が同定され、モノ
クローナル抗体の利用によってその機能も明らかにされ
ている。接着分子はセレクチン（ＬＥＣＡＭ）ファミリ
ー、イムノグロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー、イ
ンテグリンスーパーファミリー、カドヘリンスーパーフ
ァミリー等に分類されている。
作用しながら恒常性の維持に関わっている。接着分子は
細胞と細胞あるいは細胞と細胞外基質との接着を担う分
子である。これまでに多くの接着分子が同定され、モノ
クローナル抗体の利用によってその機能も明らかにされ
ている。接着分子はセレクチン（ＬＥＣＡＭ）ファミリ
ー、イムノグロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー、イ
ンテグリンスーパーファミリー、カドヘリンスーパーフ
ァミリー等に分類されている。
【０００３】これらの接着分子のうちＩＣＡＭ−１（細
胞間接着分子１、Intercellular Adhesion Moiecule-
1）は、ＬＦＡ−１（リンパ球機能抗原１、Lymphocyte
function-associated Antigen-1）が接着するカウンタ
ー分子（リガンド）として発見された膜糖タンパク質で
ある。ＩＣＡＭ−１は血管内皮細胞、抗原提示細胞、繊
維芽細胞、気管上皮細胞および活性化白血球等に発現
し、インターロイキン１（ＩＬ−１）や腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ）等の炎症性サイトカインにより発現量が有意
に増加することが知られている。さらに、ヒトの慢性関
節リウマチ、自己免疫性甲状腺炎等の炎症局所で発現が
高まっていること等により、炎症の進展にＩＣＡＭ−１
が重要な役割を担っているといわれている。また、中和
抗体を用いた検討からＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の接着
経路が関節炎、虚血再灌流障害、糸球体腎炎、喘息にお
ける気道過敏症などの炎症反応に深く関与し、また、上
記接着の阻害が上記疾患の亢進を抑制しうることも示唆
されている。
胞間接着分子１、Intercellular Adhesion Moiecule-
1）は、ＬＦＡ−１（リンパ球機能抗原１、Lymphocyte
function-associated Antigen-1）が接着するカウンタ
ー分子（リガンド）として発見された膜糖タンパク質で
ある。ＩＣＡＭ−１は血管内皮細胞、抗原提示細胞、繊
維芽細胞、気管上皮細胞および活性化白血球等に発現
し、インターロイキン１（ＩＬ−１）や腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ）等の炎症性サイトカインにより発現量が有意
に増加することが知られている。さらに、ヒトの慢性関
節リウマチ、自己免疫性甲状腺炎等の炎症局所で発現が
高まっていること等により、炎症の進展にＩＣＡＭ−１
が重要な役割を担っているといわれている。また、中和
抗体を用いた検討からＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の接着
経路が関節炎、虚血再灌流障害、糸球体腎炎、喘息にお
ける気道過敏症などの炎症反応に深く関与し、また、上
記接着の阻害が上記疾患の亢進を抑制しうることも示唆
されている。
【０００４】したがって、上記疾患の治療に有用な医薬
を提供すべく、ＩＣＡＭ−１の産生を阻害する物質が提
案されている（例えば、特開平１０−１３０２４０
号）。一方、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の接着（または
結合）を阻害する物質も上記疾患の治療に有用である可
能性が高い。かような物質の代表的なものとして各種疾
患モデル動物での効果が認められているのは、ＩＣＡＭ
−１に対する抗体が挙げられる（後述の文献１〜１１参
照）。
を提供すべく、ＩＣＡＭ−１の産生を阻害する物質が提
案されている（例えば、特開平１０−１３０２４０
号）。一方、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の接着（または
結合）を阻害する物質も上記疾患の治療に有用である可
能性が高い。かような物質の代表的なものとして各種疾
患モデル動物での効果が認められているのは、ＩＣＡＭ
−１に対する抗体が挙げられる（後述の文献１〜１１参
照）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
のようなＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の接着経路に有意に
作用しうる化合物として、ＩＣＡＭ−１に対する抗体の
ごとく高分子量物質とは異なり、比較的低分子量の化合
物を提供することにある。
のようなＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の接着経路に有意に
作用しうる化合物として、ＩＣＡＭ−１に対する抗体の
ごとく高分子量物質とは異なり、比較的低分子量の化合
物を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記各種
疾患モデル動物を用いるイン・ビボ系における被検物質
の評価と良好な相関性を示す、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−
１との（以下、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１ともいう）結
合阻害作用のイン・ビトロ評価系（後述の実施例参照）
により、微生物の生産物について広範囲にスクリーニン
グしてきた。その結果、ストレプトミセス（Streptomyc
es）属に属する一菌株の生産する化合物が、ＩＣＡＭ−
１／ＬＦＡ−１結合阻害作用を示すことを見い出した。
また、本発明者らが知り得る限りでは、かような化合物
それ自体は、従来技術文献に未載の新規化合物であるこ
とも確認した。
疾患モデル動物を用いるイン・ビボ系における被検物質
の評価と良好な相関性を示す、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−
１との（以下、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１ともいう）結
合阻害作用のイン・ビトロ評価系（後述の実施例参照）
により、微生物の生産物について広範囲にスクリーニン
グしてきた。その結果、ストレプトミセス（Streptomyc
es）属に属する一菌株の生産する化合物が、ＩＣＡＭ−
１／ＬＦＡ−１結合阻害作用を示すことを見い出した。
また、本発明者らが知り得る限りでは、かような化合物
それ自体は、従来技術文献に未載の新規化合物であるこ
とも確認した。
【０００７】したがって、本発明は、式（Ｉ）
【０００８】
【化２】
【０００９】で表される新規ベンゾピラン誘導体、その
エステル誘導体、該両誘導体の塩、ならびに該両誘導体
および塩の水和物を提供する。上記式（Ｉ）の化合物ベ
ンゾピラン誘導体（以下、ベンゾピラン誘導体という）
は、優れたＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１結合阻害を示すこ
とから、該誘導体、そのエステル誘導体、該両誘導体の
塩、ならびに該両誘導体および塩の水和物から選ばれる
化合物（以下、本発明の化合物ともいう）の一種以上を
有効成分とするＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との結合阻害
剤、ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１の阻害剤、ならびに
ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との結合形成に随伴する各種
疾患の予防剤または治療剤も、別の態様の本発明として
提供される。
エステル誘導体、該両誘導体の塩、ならびに該両誘導体
および塩の水和物を提供する。上記式（Ｉ）の化合物ベ
ンゾピラン誘導体（以下、ベンゾピラン誘導体という）
は、優れたＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１結合阻害を示すこ
とから、該誘導体、そのエステル誘導体、該両誘導体の
塩、ならびに該両誘導体および塩の水和物から選ばれる
化合物（以下、本発明の化合物ともいう）の一種以上を
有効成分とするＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との結合阻害
剤、ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１の阻害剤、ならびに
ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との結合形成に随伴する各種
疾患の予防剤または治療剤も、別の態様の本発明として
提供される。
【００１０】さらにまた、ベンゾピラン誘導体は、スト
レプトミセス（Streptomyces）属に属する微生物を栄養
培地で培養することにより、効率よく製造できるので、
かような製造方法も、さらに別の態様の本発明として提
供される。
レプトミセス（Streptomyces）属に属する微生物を栄養
培地で培養することにより、効率よく製造できるので、
かような製造方法も、さらに別の態様の本発明として提
供される。
【００１１】上記のように、ベンゾピラン誘導体は、Ｉ
ＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１結合阻害活性を有するので、Ｉ
ＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１接着経路を解明するための生化
学または薬理学的試薬として、また、上記のごとく、喘
息、リウマチ等の炎症性疾患の予防もしくは治療用化合
物としての有用性がある。
ＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１結合阻害活性を有するので、Ｉ
ＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１接着経路を解明するための生化
学または薬理学的試薬として、また、上記のごとく、喘
息、リウマチ等の炎症性疾患の予防もしくは治療用化合
物としての有用性がある。
【００１２】
【発明の具体的な態様】ベンゾピラン誘導体は、上記式
（Ｉ）で表されるとおり、分子中に遊離のカルボキシル
基を有している。したがって、本発明の目的に沿う限
り、塩またはエステルとしても提供できる。かような塩
としては、場合によって医薬の有効成分として用いる際
に有用である、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリ
ウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウ
ム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、またト
リエチルアミン塩やＮ−メチルグルカミン塩、トリス−
（ヒドロキシルメチル）アミノメタン塩等を挙げること
ができる。一方、エステルは、本発明の化合物を合成中
間体やプロドラッグとして用いるのに有用であり、前者
として用いる場合、例えば、アルキルエステル類やベン
ジルエステル類、アルコキシアルキルエステル類、フェ
ニルアルキルエステル類およびフェニルエステル類等を
好ましいものとして挙げることができる。また、後者と
して用いる場合には、例えば、アセトキシメチルエステ
ル、ピバロイルオキシメチルエステル、エトキシカルボ
ニルエステル、コリンエステル、ジメチルアミノエチル
エステル、５−インダニルエステル、フタリジニルエス
テル、５−アルキル−２−オキソ−１，３−ジオキソー
ル−４−イルメチルエステル、３−アセトキシ−２−オ
キソブチルエステル等のオキソアルキルエステル等を好
ましいものとして挙げることができる。
（Ｉ）で表されるとおり、分子中に遊離のカルボキシル
基を有している。したがって、本発明の目的に沿う限
り、塩またはエステルとしても提供できる。かような塩
としては、場合によって医薬の有効成分として用いる際
に有用である、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリ
ウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウ
ム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、またト
リエチルアミン塩やＮ−メチルグルカミン塩、トリス−
（ヒドロキシルメチル）アミノメタン塩等を挙げること
ができる。一方、エステルは、本発明の化合物を合成中
間体やプロドラッグとして用いるのに有用であり、前者
として用いる場合、例えば、アルキルエステル類やベン
ジルエステル類、アルコキシアルキルエステル類、フェ
ニルアルキルエステル類およびフェニルエステル類等を
好ましいものとして挙げることができる。また、後者と
して用いる場合には、例えば、アセトキシメチルエステ
ル、ピバロイルオキシメチルエステル、エトキシカルボ
ニルエステル、コリンエステル、ジメチルアミノエチル
エステル、５−インダニルエステル、フタリジニルエス
テル、５−アルキル−２−オキソ−１，３−ジオキソー
ル−４−イルメチルエステル、３−アセトキシ−２−オ
キソブチルエステル等のオキソアルキルエステル等を好
ましいものとして挙げることができる。
【００１３】また、本発明によれば、ベンゾピラン誘導
体は分子中に第二級水酸基を２個有しており、これらの
少なくとも１個を介して形成されるカルボン酸エステル
も提供される。カルボン酸は脂肪族、脂環式、芳香族カ
ルボン酸のいずれに属するものであってもよい。
体は分子中に第二級水酸基を２個有しており、これらの
少なくとも１個を介して形成されるカルボン酸エステル
も提供される。カルボン酸は脂肪族、脂環式、芳香族カ
ルボン酸のいずれに属するものであってもよい。
【００１４】上記の本発明に係るベンゾピラン誘導体
は、該誘導体の生産能を有するストレプトミセス（Stre
ptomyces）属に属する微生物の培養による発酵法で製造
することができる。
は、該誘導体の生産能を有するストレプトミセス（Stre
ptomyces）属に属する微生物の培養による発酵法で製造
することができる。
【００１５】使用できる微生物の代表的な菌株として
は、土壌より分離された放線菌であって、エムイーアー
ル・８８（Ｍｅｒ−８８）と番号を付した菌株を挙げる
ことができる。このＭｅｒ−８８菌株は、下記の菌学的
性状からストレプトミセス（Streptomyces）属の菌と考
えられている。
は、土壌より分離された放線菌であって、エムイーアー
ル・８８（Ｍｅｒ−８８）と番号を付した菌株を挙げる
ことができる。このＭｅｒ−８８菌株は、下記の菌学的
性状からストレプトミセス（Streptomyces）属の菌と考
えられている。
【００１６】（１）形態 よく伸長した基生菌糸より螺旋状（spirales）あるいは
コイル状（retinaculiaperti）の気中菌糸を伸長する。
成熟した気中菌糸の先に１０個〜５０個の円筒形の胞子
からなる胞子鎖を形成する。胞子のうは認められない。
胞子の大きさは０．５×０．７〜１．０ミクロン位で、
胞子の表面は平滑状（smooth）あるいはしわ状（rugos
e）を示し、鞭毛は認められない （２）各種培地における生育状態 培養は全て２８℃で行った。色調の記載はコンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル（Container Corporationof Americ
a の Color Harmony Manual）の（）内に示す符号で
表示する。
コイル状（retinaculiaperti）の気中菌糸を伸長する。
成熟した気中菌糸の先に１０個〜５０個の円筒形の胞子
からなる胞子鎖を形成する。胞子のうは認められない。
胞子の大きさは０．５×０．７〜１．０ミクロン位で、
胞子の表面は平滑状（smooth）あるいはしわ状（rugos
e）を示し、鞭毛は認められない （２）各種培地における生育状態 培養は全て２８℃で行った。色調の記載はコンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル（Container Corporationof Americ
a の Color Harmony Manual）の（）内に示す符号で
表示する。
【００１７】１）イースト・麦芽寒天培地 生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、灰色系
（４ｉｇ〜５ｆｅ）の胞子が見られる。培養裏面は黒色
である。茶色の溶解性色素を産生する。
（４ｉｇ〜５ｆｅ）の胞子が見られる。培養裏面は黒色
である。茶色の溶解性色素を産生する。
【００１８】２）オートミルール寒天培地 生育は弱く、その表面に気中菌糸を多少着生し、灰色系
（５ｆｅ）または赤色系（５ｄｃ）の胞子が見られる。
培養裏面はうす茶色である。溶解性色素は産生しない。
（５ｆｅ）または赤色系（５ｄｃ）の胞子が見られる。
培養裏面はうす茶色である。溶解性色素は産生しない。
【００１９】３）スターチ・無機塩寒天培地 生育は中程度で、その表面に気中菌糸を多少着生し、灰
色系（５ｆｅ）の胞子が見られる。培養裏面は黒色であ
る。黒色の溶解性色素を多少産生する。また、澱粉は資
化しない。
色系（５ｆｅ）の胞子が見られる。培養裏面は黒色であ
る。黒色の溶解性色素を多少産生する。また、澱粉は資
化しない。
【００２０】４）グリセリン・アスパラギン寒天培地 生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、灰色系
（５ｆｅ）の胞子が見られる。培養裏面は黒色で、茶色
の溶解性色素を産生する。
（５ｆｅ）の胞子が見られる。培養裏面は黒色で、茶色
の溶解性色素を産生する。
【００２１】５）チロシン寒天培地 生育は非常に弱く、気菌糸を産生しない。培地中にメラ
ニン性色素は生成しなかった。
ニン性色素は生成しなかった。
【００２２】（３）各種炭素源の同化性 プリードハム・ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加
え生育を見た。
え生育を見た。
【００２３】 １）Ｌ−アラビノース − ２）Ｄ−キシロース ＋ ３）Ｄ−グルコース ＋ ４）Ｄ−フルクトース ＋ ５）シュークロース ＋ ６）イノシトール − ７）Ｌ−ラムノース ＋ ８）Ｄ−マンニトール ＋ ９）ラフィノース − ＋は同化する、−は同化しない （４）細胞壁成分の性状 細胞を加水分解したものをセルロースの薄層クロマトグ
ラフィーによって分析したところ、本菌の細胞壁成分の
ジアミノピメリン酸（diamino pimeric acid）の異性
体型はＬＬ型であった。
ラフィーによって分析したところ、本菌の細胞壁成分の
ジアミノピメリン酸（diamino pimeric acid）の異性
体型はＬＬ型であった。
【００２４】本発明者らは、本菌をストレプトミセス・
エスピー・エムイーアール・８８（Streptomyces sp．
Mer-88）として平成１０年５月２９日付で工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託し、ＦＥＲＭＰ−１６８２９
の受託番号で保管されている。
エスピー・エムイーアール・８８（Streptomyces sp．
Mer-88）として平成１０年５月２９日付で工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託し、ＦＥＲＭＰ−１６８２９
の受託番号で保管されている。
【００２５】ベンゾピラン誘導体を生産するために、ス
トレプトミセス・エスピー・エムイーアール・８８（以
下、Ｍｅｒ−８８菌株ともいう）を培養するには、スト
レプトミセス属の微生物の培養により各種代謝産物を生
産するのに常用されている条件を広く使用することがで
きる。限定されるものでないが、ベンゾピラン誘導体は
上記微生物を栄養培地に接種し、好気的に培養すること
により製造することができる。上記微生物の培養方法
は、原則的には一般の微生物の培養方法に準ずるが、通
常は液体培養による振とう培養、通気撹拌培養などの好
気的条件下で行うのが好適である。
トレプトミセス・エスピー・エムイーアール・８８（以
下、Ｍｅｒ−８８菌株ともいう）を培養するには、スト
レプトミセス属の微生物の培養により各種代謝産物を生
産するのに常用されている条件を広く使用することがで
きる。限定されるものでないが、ベンゾピラン誘導体は
上記微生物を栄養培地に接種し、好気的に培養すること
により製造することができる。上記微生物の培養方法
は、原則的には一般の微生物の培養方法に準ずるが、通
常は液体培養による振とう培養、通気撹拌培養などの好
気的条件下で行うのが好適である。
【００２６】培養に用いられる培地としてはストレプト
ミセス（Streptomyces）属に属する微生物が利用できる
栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、
半合成培地、天然培地などいずれも用いることができ
る。培地組成としては炭素源としてのグルコース、シュ
ークロース、フルクトース、グリセリン、デキストリ
ン、スターチ、糖蜜などを単独または組合わせて用いる
ことができる。
ミセス（Streptomyces）属に属する微生物が利用できる
栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、
半合成培地、天然培地などいずれも用いることができ
る。培地組成としては炭素源としてのグルコース、シュ
ークロース、フルクトース、グリセリン、デキストリ
ン、スターチ、糖蜜などを単独または組合わせて用いる
ことができる。
【００２７】窒素源としてはファーマメディア、ペプト
ン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、酵母エキ
ス、尿素などの有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アン
モニウムなどの無機窒素源を、単独または組合わせて用
いることができる。その他、塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナト
リウム、リン酸カリウム、塩化コバルトなどの塩類、ビ
タミンＢ、ビオチンなどのビタミン類も必要に応じて添
加することができる。なお、培養中に発泡が著しいとき
は公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもでき
る。
ン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、酵母エキ
ス、尿素などの有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アン
モニウムなどの無機窒素源を、単独または組合わせて用
いることができる。その他、塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナト
リウム、リン酸カリウム、塩化コバルトなどの塩類、ビ
タミンＢ、ビオチンなどのビタミン類も必要に応じて添
加することができる。なお、培養中に発泡が著しいとき
は公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもでき
る。
【００２８】培養温度は通常、２５〜３０℃で、ベンゾ
ピラン誘導体の培養物中での蓄積が適当な濃度になるま
で、通常、３〜５日間培養する。得られる培養物からの
該誘導体の回収は、溶媒抽出、各種クロマトグラフィー
処理、結晶化等を、必要により組み合わせて行うことが
できる。得られたベンゾピラン誘導体は、その分子中の
カルボキシル基を介して、それ自体既知の塩形成反応ま
たはエステル化反応により、上記の塩またはエステルと
することができる。
ピラン誘導体の培養物中での蓄積が適当な濃度になるま
で、通常、３〜５日間培養する。得られる培養物からの
該誘導体の回収は、溶媒抽出、各種クロマトグラフィー
処理、結晶化等を、必要により組み合わせて行うことが
できる。得られたベンゾピラン誘導体は、その分子中の
カルボキシル基を介して、それ自体既知の塩形成反応ま
たはエステル化反応により、上記の塩またはエステルと
することができる。
【００２９】こうして得られるベンゾピラン誘導体は、
後述するごとく用量依存的に優れたＩＣＡＭ−１／ＬＦ
Ａ−１結合阻害活性を有するにもかかわらず、１０００
μｇ／ｍｌの高用量で細胞障害作用を示さない。したが
って、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１接着経路が関与する疾
患、或いはＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１結合形成に随伴す
る疾患の予防または治療に有用である。
後述するごとく用量依存的に優れたＩＣＡＭ−１／ＬＦ
Ａ−１結合阻害活性を有するにもかかわらず、１０００
μｇ／ｍｌの高用量で細胞障害作用を示さない。したが
って、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１接着経路が関与する疾
患、或いはＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１結合形成に随伴す
る疾患の予防または治療に有用である。
【００３０】かような疾患としては、上述の抗ＩＣＡＭ
−１抗体によるＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１経路に依存し
た接着を阻害することを意図した各種疾患モデル動物で
の知見に照らして、次のものを代表例として挙げること
ができる。すなわち、本発明で、予防または治療が強く
意図されている疾患としては、慢性関節リウマチ等の関
節炎（文献９参照）、心筋の虚血再灌流障害（文献６〜
８参照）、気管支喘息（文献１０参照）、糸球体腎炎
（文献３、４参照）、臓器移植時の拒絶反応（文献１
２、１３参照）等を挙げることができ、上記文献の内容
は引用することにより本明細書の内容となる。
−１抗体によるＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１経路に依存し
た接着を阻害することを意図した各種疾患モデル動物で
の知見に照らして、次のものを代表例として挙げること
ができる。すなわち、本発明で、予防または治療が強く
意図されている疾患としては、慢性関節リウマチ等の関
節炎（文献９参照）、心筋の虚血再灌流障害（文献６〜
８参照）、気管支喘息（文献１０参照）、糸球体腎炎
（文献３、４参照）、臓器移植時の拒絶反応（文献１
２、１３参照）等を挙げることができ、上記文献の内容
は引用することにより本明細書の内容となる。
【００３１】ベンゾピラン誘導体またはそのエステル誘
導体を初めとする本発明の化合物の上記疾患に対する投
与量は、患者の年齢、性別、症状等により異なるが、成
人一日当たり２０ｍｇ〜１ｇ、好ましくは２００ｍｇ〜
６００ｍｇの範囲とするのが好ましい。この場合、一日
量を一日１回、あるいは２〜４回に分けて投与すればよ
く、また一日量は必要によっては上記の量を超えてもよ
い。
導体を初めとする本発明の化合物の上記疾患に対する投
与量は、患者の年齢、性別、症状等により異なるが、成
人一日当たり２０ｍｇ〜１ｇ、好ましくは２００ｍｇ〜
６００ｍｇの範囲とするのが好ましい。この場合、一日
量を一日１回、あるいは２〜４回に分けて投与すればよ
く、また一日量は必要によっては上記の量を超えてもよ
い。
【００３２】ベンゾピラン誘導体またはそのエステル誘
導体を初めとする本発明の化合物を含有する医薬は、そ
の投与法、剤型に特に制限はなく、通常用いられている
各種製剤の調製法にてその投与法にあった剤型にすれば
よい。
導体を初めとする本発明の化合物を含有する医薬は、そ
の投与法、剤型に特に制限はなく、通常用いられている
各種製剤の調製法にてその投与法にあった剤型にすれば
よい。
【００３３】経口用製剤としては例えば、錠剤、散剤、
顆粒剤、カプセル剤や、溶液剤、シロップ剤、エリキシ
ル剤または油性もしくは水性の懸濁液剤等を挙げること
ができる。
顆粒剤、カプセル剤や、溶液剤、シロップ剤、エリキシ
ル剤または油性もしくは水性の懸濁液剤等を挙げること
ができる。
【００３４】注射剤としては溶液を容器に収納後、凍結
乾燥等によって固形製剤として用時調製の製剤としても
良く、必要に応じて安定剤、防腐剤、溶解補助剤を使用
してもよい。また一投与量毎に容器に収納してもよく、
また多投与量を同一の容器に収納してもよい。
乾燥等によって固形製剤として用時調製の製剤としても
良く、必要に応じて安定剤、防腐剤、溶解補助剤を使用
してもよい。また一投与量毎に容器に収納してもよく、
また多投与量を同一の容器に収納してもよい。
【００３５】また外用製剤として溶液剤、懸濁液、乳濁
液、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、スプレー等が
挙げられる。
液、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、スプレー等が
挙げられる。
【００３６】固形製剤として活性化合物とともに製剤学
上許容されている添加物を含み、例えば充填剤類や増量
剤類、結合剤類、崩壊剤類、溶解促進剤類、湿潤剤類、
潤滑剤類等を必要に応じて選択して混合し、製剤化する
ことができる。
上許容されている添加物を含み、例えば充填剤類や増量
剤類、結合剤類、崩壊剤類、溶解促進剤類、湿潤剤類、
潤滑剤類等を必要に応じて選択して混合し、製剤化する
ことができる。
【００３７】液体製剤としては溶液、懸濁液、乳液剤等
を挙げることができ、添加剤として懸濁化剤、乳化剤等
を含んでいてもよい。
を挙げることができ、添加剤として懸濁化剤、乳化剤等
を含んでいてもよい。
【００３８】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでな
い。
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでな
い。
【００３９】製造例：下記Ｃ培地２０ｍｌ／２５０ｍｌ
フラスコにＭｅｒ−８８菌株（ＦＥＲＭＰ−１６８２
９）を１白金耳で接種し、２８℃で７２時間振盪培養し
たのち、この培養液をＣ培地５０ｍｌ／５００ｍｌフラ
スコに１フラスコあたり０．５ｍｌ植菌して２８℃で９
６時間振盪培養した。
フラスコにＭｅｒ−８８菌株（ＦＥＲＭＰ−１６８２
９）を１白金耳で接種し、２８℃で７２時間振盪培養し
たのち、この培養液をＣ培地５０ｍｌ／５００ｍｌフラ
スコに１フラスコあたり０．５ｍｌ植菌して２８℃で９
６時間振盪培養した。
【００４０】Ｃ培地１Ｌあたりの成分 ポテト澱粉 ２０ｇ グルコース ２０ｇ エスサンミート ２０ｇ 酵母エキス ５ｇ ＮａＣｌ ２．５ｇ ＣａＣＯ３ ３．２ｇ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ５μｇ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ５μｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2０ ５μｇ （ｐＨ７．４に調整したのち１２０℃、１５分間オート
クレープ） 得られた培養液３．４Ｌを３，０００ｇ×２０分遠心分
離した。上澄液を５Ｎ塩酸でｐＨ２．０に調整し、１／
２容の酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル層に等量
の蒸留水を加え５Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨ８．０
として、分配を行った。こうして得られた水層をとり、
１／２容の酢酸エチルを加えて５Ｎ塩酸でｐＨ２．０に
調整し、抽出した上層を減圧乾固して、以下の精製に供
した。
クレープ） 得られた培養液３．４Ｌを３，０００ｇ×２０分遠心分
離した。上澄液を５Ｎ塩酸でｐＨ２．０に調整し、１／
２容の酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル層に等量
の蒸留水を加え５Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨ８．０
として、分配を行った。こうして得られた水層をとり、
１／２容の酢酸エチルを加えて５Ｎ塩酸でｐＨ２．０に
調整し、抽出した上層を減圧乾固して、以下の精製に供
した。
【００４１】シリカゲルクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃ
ｋ社、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ−６０を４０ｇ使用）に上記
粗製物を供し、１）クロロホルム：メタノール＝２０：
１に酢酸０．１％を添加、２）クロロホルム：メタノー
ル＝１０：１に酢酸０．１％を添加、３）クロロホル
ム：メタノール＝５：１に酢酸０．１％を添加、４）ク
ロロホルム：メタノール＝３：１に酢酸０．１％を添
加、を順に移動相として展開した（１〜３は２００ｍ
ｌ、４は４００ｍｌ）。活性を示した画分を集め、さら
に逆相クロマトグラフィーにより精製を行った。ジーエ
ルサイエンス社製Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（３０
ｍｍｌ．Ｄ．×２５０ｍｍ）を担体として、室温で３３
％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡを移動相に用いて３
０ｍｌ／ｍｉｎで展開を行った。このとき、２１０ｎｍ
でモニターを行ったが、５０分前後に溶出されたピーク
に活性が観察された。この部分を集めて、セファデック
スＬＨ−２０（ファルマシア社）１１０ｍｌカラムでメ
タノールによりゲル濾過クロマトグラフィーを行った。
活性を示す部分を集めて減圧濃縮し、精製物１３．７ｍ
ｇを得た。
ｋ社、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ−６０を４０ｇ使用）に上記
粗製物を供し、１）クロロホルム：メタノール＝２０：
１に酢酸０．１％を添加、２）クロロホルム：メタノー
ル＝１０：１に酢酸０．１％を添加、３）クロロホル
ム：メタノール＝５：１に酢酸０．１％を添加、４）ク
ロロホルム：メタノール＝３：１に酢酸０．１％を添
加、を順に移動相として展開した（１〜３は２００ｍ
ｌ、４は４００ｍｌ）。活性を示した画分を集め、さら
に逆相クロマトグラフィーにより精製を行った。ジーエ
ルサイエンス社製Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（３０
ｍｍｌ．Ｄ．×２５０ｍｍ）を担体として、室温で３３
％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡを移動相に用いて３
０ｍｌ／ｍｉｎで展開を行った。このとき、２１０ｎｍ
でモニターを行ったが、５０分前後に溶出されたピーク
に活性が観察された。この部分を集めて、セファデック
スＬＨ−２０（ファルマシア社）１１０ｍｌカラムでメ
タノールによりゲル濾過クロマトグラフィーを行った。
活性を示す部分を集めて減圧濃縮し、精製物１３．７ｍ
ｇを得た。
【００４２】上記精製物（ベンゾピラン誘導体）の物理
化学的性質は、次のとおりであった。
化学的性質は、次のとおりであった。
【００４３】 Ａ．形状 無色、不定形 Ｂ．分子量および分子式 ３９１．４６ Ｃ21Ｈ29Ｎ
Ｏ6 Ｃ．融点 ８６−８８℃ Ｄ．旋光度 ［α］25,D ＋４３．６゜（ｃ ０．３０
メタノール） Ｅ．赤外吸収スペクトルにおける主要吸収帯（ＫＢｒ錠
剤中） ３８６６、３３８３、２９７６、２９３２、１７３０、
１６４０、１６１１、１５７８、１５３９、１４９１、
１４２２、１３７９、１３２１、１２６５、１２００、
１１５７、１１１３、１０８２、１０１６、９５２、８
９７、８３３、７６７、６６７ ｃｍ-1 Ｆ．紫外吸収スペクトル λｍａｘ（メタノール）ｎｍ
（ε） ２５９（１４，６９２）、２０６（３１，１４４） Ｇ．13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤ3Ｏ
Ｄ） １７８．３ ｓ、１６９．７ ｓ、１５７．９ ｓ、１３
２．５ ｓ、１３０．８ ｄ、１２８．１ ｄ、１２６．
８ ｓ、１２５．４ ｄ、１２１．４ ｓ、１１８．０
ｄ、８０．５ ｓ、６９．３ ｄ、６８．３ ｄ、６０．
８ ｄ、３８．９ ｔ、３２．０ ｔ、２５．９ ｑ、２
２．６ ｔ、２０．１ ｑ、１８．９ ｑ、１７．７ ｑ
（ｐｐｍｆｒｏｍ ＴＭＳ） Ｈ．1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤ3Ｏ
Ｄ） ７．６７（１Ｈ，ｓ）、７．６６（１Ｈ，ｄ）、６．８
３（１Ｈ，ｄ）、５．１３（１Ｈ，ｔ）、４．６３（１
Ｈ，ｄ）、４．４１（１Ｈ，ｄｑ）、３．８８（１Ｈ，
ｄｄ）、３．０７（１Ｈ，ｄｄ）、２．８１（１Ｈ，ｄ
ｄ）、２．１６（２Ｈ，ｍ）、１．６６（３Ｈ，ｓ）、
１．６６（２Ｈ，ｍ）、１．６０（３Ｈ，ｓ）、１．２
６（３Ｈ，ｓ）、１．２１（３Ｈ，ｄ）、（ｐｐｍ ｆ
ｒｏｍ ＴＭＳ） Ｉ．Ｒｆ値：０．２１（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ＴＬＣ
Ｍｅｒｋ １０５７１５、ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ＝
５：１，酢酸０．１％） （以上の物理化学的データに基づき、上記で得られた化
合物の構造は式（Ｉ）のごとく同定された。）細胞接着試験 ：ＩＣＡＭ−１蛋白としては、ＩＣＡＭ−
１蛋白の５つのドメインのうち、ＬＦＡ−１蛋白との結
合に必要であるＮ末端側の２つのドメインをヒトＩｇＧ
lＦｃ部分と融合させた蛋白（以下、ＤｌＤ２−ＩｇＧ
という）を用いた。また結合させる細胞としては、ヒト
Ｔ 白血病細胞株ＳＫＷ３（以下、ＳＫＷ３という）を
用いた。ＤｌＤ２−ＩｇＧをＴＳＭ緩衝液（以下、トリ
ス緩衝液という、組成：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
（ｐＨ７．８）、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１５０ｍＭＮａ
Ｃｌ）で０．８μｇ／ｍｌに希釈後、９６穴平底マイク
ロプレート（住友ベークライト社製）の各穴に５０μｌ
ずつ添加し、４℃で一晩放置して固相化した。翌日２％
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有トリス緩衝液を２
００μｌずつ加え、３７℃で５時間インキュベートする
ことによりブロッキングを行った。マイクロプレートの
各穴を牛胎仔血清を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地
（日研生物医学研究所製）で１回洗浄した後、同培地で
調整した化合物Ｍｅｒ−８８溶液（ジメチルスルフォキ
シドを１％含む）５０μｌを添加し、直ちにＳＫＷ３細
胞懸濁液５０μｌを加え３７℃で３０分間反応させ接着
させた。
Ｏ6 Ｃ．融点 ８６−８８℃ Ｄ．旋光度 ［α］25,D ＋４３．６゜（ｃ ０．３０
メタノール） Ｅ．赤外吸収スペクトルにおける主要吸収帯（ＫＢｒ錠
剤中） ３８６６、３３８３、２９７６、２９３２、１７３０、
１６４０、１６１１、１５７８、１５３９、１４９１、
１４２２、１３７９、１３２１、１２６５、１２００、
１１５７、１１１３、１０８２、１０１６、９５２、８
９７、８３３、７６７、６６７ ｃｍ-1 Ｆ．紫外吸収スペクトル λｍａｘ（メタノール）ｎｍ
（ε） ２５９（１４，６９２）、２０６（３１，１４４） Ｇ．13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤ3Ｏ
Ｄ） １７８．３ ｓ、１６９．７ ｓ、１５７．９ ｓ、１３
２．５ ｓ、１３０．８ ｄ、１２８．１ ｄ、１２６．
８ ｓ、１２５．４ ｄ、１２１．４ ｓ、１１８．０
ｄ、８０．５ ｓ、６９．３ ｄ、６８．３ ｄ、６０．
８ ｄ、３８．９ ｔ、３２．０ ｔ、２５．９ ｑ、２
２．６ ｔ、２０．１ ｑ、１８．９ ｑ、１７．７ ｑ
（ｐｐｍｆｒｏｍ ＴＭＳ） Ｈ．1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤ3Ｏ
Ｄ） ７．６７（１Ｈ，ｓ）、７．６６（１Ｈ，ｄ）、６．８
３（１Ｈ，ｄ）、５．１３（１Ｈ，ｔ）、４．６３（１
Ｈ，ｄ）、４．４１（１Ｈ，ｄｑ）、３．８８（１Ｈ，
ｄｄ）、３．０７（１Ｈ，ｄｄ）、２．８１（１Ｈ，ｄ
ｄ）、２．１６（２Ｈ，ｍ）、１．６６（３Ｈ，ｓ）、
１．６６（２Ｈ，ｍ）、１．６０（３Ｈ，ｓ）、１．２
６（３Ｈ，ｓ）、１．２１（３Ｈ，ｄ）、（ｐｐｍ ｆ
ｒｏｍ ＴＭＳ） Ｉ．Ｒｆ値：０．２１（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ＴＬＣ
Ｍｅｒｋ １０５７１５、ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ＝
５：１，酢酸０．１％） （以上の物理化学的データに基づき、上記で得られた化
合物の構造は式（Ｉ）のごとく同定された。）細胞接着試験 ：ＩＣＡＭ−１蛋白としては、ＩＣＡＭ−
１蛋白の５つのドメインのうち、ＬＦＡ−１蛋白との結
合に必要であるＮ末端側の２つのドメインをヒトＩｇＧ
lＦｃ部分と融合させた蛋白（以下、ＤｌＤ２−ＩｇＧ
という）を用いた。また結合させる細胞としては、ヒト
Ｔ 白血病細胞株ＳＫＷ３（以下、ＳＫＷ３という）を
用いた。ＤｌＤ２−ＩｇＧをＴＳＭ緩衝液（以下、トリ
ス緩衝液という、組成：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
（ｐＨ７．８）、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１５０ｍＭＮａ
Ｃｌ）で０．８μｇ／ｍｌに希釈後、９６穴平底マイク
ロプレート（住友ベークライト社製）の各穴に５０μｌ
ずつ添加し、４℃で一晩放置して固相化した。翌日２％
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有トリス緩衝液を２
００μｌずつ加え、３７℃で５時間インキュベートする
ことによりブロッキングを行った。マイクロプレートの
各穴を牛胎仔血清を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地
（日研生物医学研究所製）で１回洗浄した後、同培地で
調整した化合物Ｍｅｒ−８８溶液（ジメチルスルフォキ
シドを１％含む）５０μｌを添加し、直ちにＳＫＷ３細
胞懸濁液５０μｌを加え３７℃で３０分間反応させ接着
させた。
【００４４】ここで、ＳＫＷ３細胞はあらかじめ蛍光色
素であるＢＣＥＣＦ−ＡＭ（３′−Ｏ−Ａｃｅｔｙｌ−
２′，７′−ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−４
ｏｒ ５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
Ｄｉａｃｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ Ｅｓｔｅｒ、同仁
化学社製）で標識したものを用いた。すなわち、１×１
０7個のＳＫＷ３細胞当たり１０μＭのＢＣＥＣＦ−Ａ
Ｍを添加し３７℃で１時間標識した。標識後ＳＫＷ３細
胞を２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌｍｙｒｉ
ｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ）で３７℃３０分間処理
し、細胞上のＬＦＡ−１分子を活性化させた。洗浄後、
牛胎仔血清を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地に６×１
０6／ｍｌとなるように懸濁し接着試験に用いた。
素であるＢＣＥＣＦ−ＡＭ（３′−Ｏ−Ａｃｅｔｙｌ−
２′，７′−ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−４
ｏｒ ５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
Ｄｉａｃｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ Ｅｓｔｅｒ、同仁
化学社製）で標識したものを用いた。すなわち、１×１
０7個のＳＫＷ３細胞当たり１０μＭのＢＣＥＣＦ−Ａ
Ｍを添加し３７℃で１時間標識した。標識後ＳＫＷ３細
胞を２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌｍｙｒｉ
ｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ）で３７℃３０分間処理
し、細胞上のＬＦＡ−１分子を活性化させた。洗浄後、
牛胎仔血清を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地に６×１
０6／ｍｌとなるように懸濁し接着試験に用いた。
【００４５】反応終了後、３７℃に温めた牛胎仔血清を
１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地でマイクロプレートの
各穴を満たし、プレートシール（住友ベークライト社
製）でマイクロプレートの上面をシールした後、プレー
トの上下を逆にして２５℃で３０分静置後、非接着細胞
を吸引除去した。マイクロプレートの各穴に０．１％の
ＮＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０）を１００μｌ加え
て細胞を溶解し、蛍光リーダー（Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ
ＩＩタイターテック社製）により励起波長４８５ｎｍ、
測定波長５３８ｎｍで蛍光を測定し、薬物添加および非
添加の蛍光強度から抑制率を求めた。
１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地でマイクロプレートの
各穴を満たし、プレートシール（住友ベークライト社
製）でマイクロプレートの上面をシールした後、プレー
トの上下を逆にして２５℃で３０分静置後、非接着細胞
を吸引除去した。マイクロプレートの各穴に０．１％の
ＮＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０）を１００μｌ加え
て細胞を溶解し、蛍光リーダー（Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ
ＩＩタイターテック社製）により励起波長４８５ｎｍ、
測定波長５３８ｎｍで蛍光を測定し、薬物添加および非
添加の蛍光強度から抑制率を求めた。
【００４６】本発明に係るベンゾピラン誘導体は、下記
表１に示されるように３１μｇ／ｍｌから用量依存的に
ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１結合阻害作用を示し。１００
０μｇ／ｍｌで３８．４％の結合阻害を示した。また、
化合物Ｍｅｒ−８８は、１０００μｇ／ｍｌで細胞障害
作用を示さなかった。
表１に示されるように３１μｇ／ｍｌから用量依存的に
ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１結合阻害作用を示し。１００
０μｇ／ｍｌで３８．４％の結合阻害を示した。また、
化合物Ｍｅｒ−８８は、１０００μｇ／ｍｌで細胞障害
作用を示さなかった。
【００４７】
【表１】
【００４８】Ｄ１Ｄ２−ＩｇＧ／ｍＬＦＡ−１結合試
験：ＩＣＡＭ−１蛋白としては、前記のＤ１Ｄ２−Ｉｇ
Ｇを用い、ＬＦＡ−１蛋白としては、膜結合性のｍＬＦ
Ａ−１を用いた。Ｄ１Ｄ２−ＩｇＧをトリス緩衝液で４
μｇ／ｍｌに希釈後、９６穴平底マイクロプレート（コ
ースター社製）の各穴に５０μｌずつ添加し、４℃で一
晩放置して固層化した。翌日２％ＢＳＡ含有トリス緩衝
液を２００μｌずつ加え、室温で２時間インキュベート
することによりブロッキングを行った。マイクロプレー
トの各穴を洗浄用緩衝液（組成：０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０／ＴＳＭ）で１回洗浄した後、希釈用緩衝液（組
成：１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＳＭ）
で８μｌ／ｍｌに調製したｍＬＦＡ−１を２５μｌとベ
ンゾピラン誘導体溶液を２５μｌ添加し、室温で１時間
反応させ接着させた。マイクロプレートの各穴を洗浄用
緩衝液で３回洗浄した後、希釈用緩衝液で１μｇ／ｍｌ
に調製したビオチン化抗ＬＦＡ−１抗体ＴＳ２／４を５
０μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。マイクロ
プレートの各穴を洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、希釈
用緩衝液で１００００倍に希釈したＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ
ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識アビジン
（ザイメット社）を５０μｌずつ添加し、室温で１時間
反応させた。マイクロプレートの各穴を洗浄用緩衝液で
３回洗浄した後、ＡＢＴＳ（２，２’−Ａｚｉｎｏ−ｂ
ｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ
−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））ペルオキシダー
ゼ基質を１００μｌずつ添加し、室温で１５分反応させ
た後、１％ＳＤＳを５０μｌ加えて反応を停止させ、吸
光度リーダーにより４０５ｎｍの特異吸収を測定し、薬
物添加及び非添加反応液の吸光度から抑制率を求めた。
験：ＩＣＡＭ−１蛋白としては、前記のＤ１Ｄ２−Ｉｇ
Ｇを用い、ＬＦＡ−１蛋白としては、膜結合性のｍＬＦ
Ａ−１を用いた。Ｄ１Ｄ２−ＩｇＧをトリス緩衝液で４
μｇ／ｍｌに希釈後、９６穴平底マイクロプレート（コ
ースター社製）の各穴に５０μｌずつ添加し、４℃で一
晩放置して固層化した。翌日２％ＢＳＡ含有トリス緩衝
液を２００μｌずつ加え、室温で２時間インキュベート
することによりブロッキングを行った。マイクロプレー
トの各穴を洗浄用緩衝液（組成：０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０／ＴＳＭ）で１回洗浄した後、希釈用緩衝液（組
成：１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＳＭ）
で８μｌ／ｍｌに調製したｍＬＦＡ−１を２５μｌとベ
ンゾピラン誘導体溶液を２５μｌ添加し、室温で１時間
反応させ接着させた。マイクロプレートの各穴を洗浄用
緩衝液で３回洗浄した後、希釈用緩衝液で１μｇ／ｍｌ
に調製したビオチン化抗ＬＦＡ−１抗体ＴＳ２／４を５
０μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。マイクロ
プレートの各穴を洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、希釈
用緩衝液で１００００倍に希釈したＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ
ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識アビジン
（ザイメット社）を５０μｌずつ添加し、室温で１時間
反応させた。マイクロプレートの各穴を洗浄用緩衝液で
３回洗浄した後、ＡＢＴＳ（２，２’−Ａｚｉｎｏ−ｂ
ｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ
−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））ペルオキシダー
ゼ基質を１００μｌずつ添加し、室温で１５分反応させ
た後、１％ＳＤＳを５０μｌ加えて反応を停止させ、吸
光度リーダーにより４０５ｎｍの特異吸収を測定し、薬
物添加及び非添加反応液の吸光度から抑制率を求めた。
【００４９】ベンゾピラン誘導体は、下記表Ｘに示され
るように３１３μｇ／ｍｌから用量依存的にＩＣＡＭ−
１／ｍＬＦＡ−１結合阻害作用を示し、２５００μｇ／
ｍｌで９１．７％の結合阻害を示した。
るように３１３μｇ／ｍｌから用量依存的にＩＣＡＭ−
１／ｍＬＦＡ−１結合阻害作用を示し、２５００μｇ／
ｍｌで９１．７％の結合阻害を示した。
【００５０】測定結果を下記表２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
【発明の効果】本発明に係るベンゾピラン誘導体は、Ｉ
ＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１結合形成を有意に阻害する作用
を有し、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１結合形成に随伴する
各種疾患の予防または治療に有用である。
ＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１結合形成を有意に阻害する作用
を有し、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１結合形成に随伴する
各種疾患の予防または治療に有用である。
【００５３】（引用する文献の一覧） １．Ｂａｒｔｏｎ ＲＷ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４３：１２７８−１２８２、１９８９ ２．Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＭＳ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５０：２４０７−２４１７、１９９３ ３．Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＭＳ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５０：２４０１−２４０６、１９９３ ４．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１７７：６６７−６７７、１９９３ ５．Ｋｅｌｌｙ ＫＪ、ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８１２−８１
６、１９９４ ６．Ｓｅｋｏ Ｙ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．９１：１３２７−１３３６、１９９３ ７．Ｋｕｉｋｅｌｋａ ＧＬ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５０４−１５１６、１９
９３ ８．Ｙａｍａｚａｋｉ Ｔ、ｅｔ ａｌ： Ａｍ．Ｊ．
Ｐａｔｈｏｌ．１４３：４１０−４１８、１９９３ ９．Ｉｉｇｏ Ｙ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１４７：４１６７−４１７１、１９９１ １０．Ｗｅｇｎｅｒ ＣＤ、ｅｔ ａｌ： Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４７：４５６−４５９、１９９０ １１．Ｗａｌｌａｃｅ ＪＬ、ｅｔ ａｌ： Ａｍ．
Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６５：Ｇ９９３−Ｇ９９８、１
９９３ １２．Ｃｏｓｉｍｉ ＡＢ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１４４：４６０４−４６１２、１９９０ １３．Ｉｓｏｂｅ Ｍ、ｅｔ ａｌ： Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５５：１１２５−１１２７、１９９２
ｎｏｌ．１４３：１２７８−１２８２、１９８９ ２．Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＭＳ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５０：２４０７−２４１７、１９９３ ３．Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＭＳ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５０：２４０１−２４０６、１９９３ ４．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１７７：６６７−６７７、１９９３ ５．Ｋｅｌｌｙ ＫＪ、ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８１２−８１
６、１９９４ ６．Ｓｅｋｏ Ｙ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．９１：１３２７−１３３６、１９９３ ７．Ｋｕｉｋｅｌｋａ ＧＬ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５０４−１５１６、１９
９３ ８．Ｙａｍａｚａｋｉ Ｔ、ｅｔ ａｌ： Ａｍ．Ｊ．
Ｐａｔｈｏｌ．１４３：４１０−４１８、１９９３ ９．Ｉｉｇｏ Ｙ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１４７：４１６７−４１７１、１９９１ １０．Ｗｅｇｎｅｒ ＣＤ、ｅｔ ａｌ： Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４７：４５６−４５９、１９９０ １１．Ｗａｌｌａｃｅ ＪＬ、ｅｔ ａｌ： Ａｍ．
Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６５：Ｇ９９３−Ｇ９９８、１
９９３ １２．Ｃｏｓｉｍｉ ＡＢ、ｅｔ ａｌ： Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１４４：４６０４−４６１２、１９９０ １３．Ｉｓｏｂｅ Ｍ、ｅｔ ａｌ： Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５５：１１２５−１１２７、１９９２
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/35 ＡＣＶ Ａ６１Ｋ 31/35 ＡＣＶ ＡＥＤ ＡＥＤ Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｐ 17/06 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 渡辺 吉雄 神奈川県藤沢市藤が岡２−22−３ (72)発明者 土橋 和之 神奈川県秦野市南が丘３丁目４の１ ５− 204 (72)発明者 高子 徹 東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号 第 一製薬株式会社東京研究開発センター内 Ｆターム(参考） 4B064 AE46 BA04 BC01 BG01 BH01 BH02 BH04 BH06 BJ01 BJ02 BJ04 BJ09 BJ11 CA03 CE07 DA03 4B065 AA50X AC14 AC15 BA22 BB18 BD16 CA18 CA34 CA44 4C062 FF13 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 BA08 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZA59 ZA81 ZB08 ZB11 ZB15 ZC02
Claims (10)
- 【請求項１】 次式 【化１】 で表されるベンゾピラン誘導体、そのエステル誘導体、
該両誘導体の塩、ならびに該両誘導体および塩の水和物
から選ばれる化合物。 - 【請求項２】 請求項１記載のベンゾピラン誘導体の製
造方法であって、該誘導体を生産しうる能力を有するス
トレプトミセス（Streptomyces）属に属する微生物を栄
養培地で培養し、該培養培地または該菌体から該誘導体
を回収することを特徴とする方法。 - 【請求項３】 ストレプトミセス（Streptomyces）属に
属する微生物がストレプトミセスＭｅｒ−８８（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１６８２９）である、請求項２記載の製造方
法。 - 【請求項４】 式（Ｉ）で表されるベンゾピラン誘導
体、そのエステル誘導体、該両誘導体の塩、ならびに該
両誘導体および塩の水和物から選ばれる化合物を有効成
分として含有する、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との結合
阻害剤。 - 【請求項５】 式（Ｉ）で表されるベンゾピラン誘導
体、そのエステル誘導体、該両誘導体の塩、ならびに該
両誘導体および塩の水和物から選ばれる化合物を有効成
分として含有する、ＩＣＡＭ−１阻害剤またはＬＦＡ−
１阻害剤。 - 【請求項６】 式（Ｉ）で表されるベンゾピラン誘導
体、そのエステル誘導体、該両誘導体の塩、ならびに該
両誘導体および塩の水和物から選ばれる化合物を有効成
分として含有する、ＩＣＡＭ−１の結合またはＬＦＡ−
１の結合に随伴する疾患の予防剤又は治療剤。 - 【請求項７】 式（Ｉ）で表されるベンゾピラン誘導
体、そのエステル誘導体、該両誘導体の塩、ならびに該
両誘導体および塩の水和物から選ばれる化合物を有効成
分として含有する、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の結合形
成に随伴する疾患の予防剤または治療剤。 - 【請求項８】 該疾患が、喘息又はリウマチである請求
項６記載の予防剤または治療剤。 - 【請求項９】 式（Ｉ）で表されるベンゾピラン誘導
体、そのエステル誘導体、該両誘導体の塩、ならびに該
両誘導体および塩の水和物から選ばれる化合物を有効成
分として含有する、医薬。 - 【請求項１０】 式（Ｉ）で表されるベンゾピラン誘導
体の生産能を有するストレプトミセス（Streptomyces）
のある種に属する微生物。
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