JP2000037188A - アルツハイマー病の診断および治療用の新規な手段 - Google Patents

アルツハイマー病の診断および治療用の新規な手段

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マンデルコー，エヴァ−マリア
Eckhard Mandelkow
マンデルコー，エクハルト
Birgit Dr Lichtenberg-Kraag
リヒテンベルク−カラーク，ビルギット
Jacek Dr Biernat
ビルナット，ジャセク
Gerard Dr Drewes
ドレヴェス，ゲラルド
Barbara Steiner
スタイナー，バーバラ
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 アルツハイマータウタンパク質に特徴的なリ
ン酸化エピトープ、このリン酸化を特異的に触媒するキ
ナーゼ活性、該キナーゼに対する阻害剤を含有する医薬
組成物、該エピトープを認識する抗体、該エピトープを
含有する診断用組成物、キナーゼおよび／または抗体を
用いるアルツハイマー病のin vitro診断法、正常タウタ
ンパク質のアルツハイマータウタンパク質へのin vitro
変換方法、およびアルツハイマーＰＨＦを溶解したり、
またはその形成を防止するのに効果的な薬剤の試験方法
の提供。 【解決手段】 アルツハイマー病の発症のin vitro診断
法であって、患者の脳脊髄液単離物を検定するか、また
は神経組織の生検を実施して、タウタンパク質の262位
のリン酸化セリン残基の存在について該組織を調べるこ
とからなる方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アルツハイマーの
対になったラセン状フィラメント（paired helical fil
aments：ＰＨＦ）からのタウタンパク質中にリン酸化さ
れた状態で特異的に存在しているタウタンパク質のエピ
トープ、タウタンパク質のアミノ酸のリン酸化に関与し
て該エピトープを生じさせるプロテインキナーゼ、およ
び該エピトープに特異的な抗体に関する。本発明は、ま
た、アルツハイマー病の治療または予防用の医薬組成
物、アルツハイマー病の診断用組成物および検出方法、
並びに該エピトープを使用することによるアルツハイマ
ータウタンパク質を特異的に検出する抗体の産生に関す
る。さらに、本発明は、アルツハイマーの対になったラ
セン状フィラメントを溶解したり、またはその形成を防
止するのに効果的な薬剤の試験方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アルツハイマー患者の脳には２つの特徴
的なタンパク質の沈着物である斑点(plaque)ともつれ(t
angle)が存在する。これらの構造物はここ２，３年の間
にアルツハイマー病の研究において最も重要になってき
ている（最近の論文として、Goedert et al., Current
Opinion in Neurobiology 1 (1991), 441-447 を参照さ
れたい）。もつれの主要成分は対になったラセン状フィ
ラメント（ＰＨＦ）である。今や、このＰＨＦは微小管
結合タンパク質のタウ（通常はニューロンの微小管網状
構造に付着しており、特に軸索に豊富に存在している）
から主に構成されていることが明らかになっている。
【０００３】ヒト脳のタウには、単一の遺伝子の異なる
スプライシングから生じる６種類のイソフォーム(isofo
rm) が存在する。これらのイソフォームも全てＰＨＦ中
に見られる (Goedert et al., Neuron 3 (1989), 519-5
26) 。これまでに知られている正常のタウタンパク質と
アルツハイマーのＰＨＦタウタンパク質との主な生化学
的差異は次のように要約することができる： （１）ＰＨＦタウタンパク質は、正常のタウタンパク質
とは対照的に、非常に不溶性であり、このことが生化学
的分析を困難にしている； （２）ＰＨＦタウタンパク質はリン酸化に依存する様式
である種の抗体と反応し、このことは特別なリン酸化状
態を示唆している (Grundke-Iqbal et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 83 (1986), 4913-4917; Nukina et
al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 84 (1987), 3415-341
9)； （３）ＰＨＦタウタンパク質はＳＤＳゲル電気泳動にお
いて比較的低い移動度を有し、このことはそのリン酸化
パターンに関係しうるより高いＭr 値を示唆している
(Steiner et al., EMBO J. 9 (1990), 3539-3544)； （４）ＰＨＦタウタンパク質は特徴的な７８ｎｍの交差
反復(crossover repeat)を有するラセン状フィラメント
の対を形成している (Crowther and Wischik, EMBO J.
4 (1985), 3661-3665)。
【０００４】脳から精製されたタウタンパク質はごくわ
ずかな二次構造（ＣＤ分光分析により測定）と２．６Ｓ
の沈降定数を有して、高度に非対称的な形状を示すが
(Cleveland et al., J. Mol. Biol. 1161 (1977), 227-
247) 、これは電子顕微鏡データと一致する (Hirokawa
et al., J. Cell. Biol. 107 (1988), 1449-1459)。Ｃ
末端の半分は３または４個の内部反復を含み、これらは
微小管結合とそれらのアセンブリーを促進すること（そ
れ故「アセンブリードメイン (assembly domain)」と言
う）に関係している。このドメインは数種類のプロテイ
ンキナーゼによってリン酸化され (Steiner et al., EM
BO J. 9 (1990), 3539-3544)、アルツハイマータウの異
常なリン酸化を考慮するとこの位置は重要となろう（例
えば、Grundke-Iqbal et al., 前掲を参照されたい）。
さらに、この反復領域はアルツハイマーＰＨＦのコア部
分にも存在する（例えば、Goedert et al., 前掲; Jake
s etal., EMBO J. 10 (1991), 2725-2729を参照された
い）。
【０００５】ＰＨＦタウタンパク質は正常タウタンパク
質と比べて微小管に対する親和性が低いと仮定されてき
た。そのわけは、正常タウをin vitroでいくつかのキナ
ーゼによりリン酸化すると、同様の効果が見られたから
である (Lindwall and Cole,J. Biol. Chem. 259 (198
4), 5301-5305)。かくして、微小管への結合の欠如また
は低下はタウタンパク質の異常なリン酸化の結果である
かもしれない。この異常な状態は微小管の崩壊へと導
き、迅速な軸索輸送といった活動的なニューロンプロセ
スを妨げるだろう。その後、異常にリン酸化されたタウ
タンパク質は凝集してＰＨＦを形成するだろう。その結
果として、ニューロンが最終的に死んでしまい、かくし
てアルツハイマー病が発症することとなる。
【０００６】これまで、どのプロテインキナーゼが異常
なリン酸化に関与するのか知られていなかった。イシグ
ロら (Neuroscience Letters 128, (1991), 195-198)
は、セリン／トレオニンプロリンモチーフを認識するプ
ロテインキナーゼを含むウシ脳抽出物からキナーゼ画分
を単離した。このキナーゼはタウタンパク質のSer 14
4、Thr 147 、Ser 177 およびSer 315 の残基をリン酸
化した。これらの残基は他の人達が報告したものとは違
っていた (Lee et al., Science 251 (1991), 675-67
8)。従って、どのプロテインキナーゼとどの標的アミノ
酸残基がアルツハイマー病の発症に関与しているのか依
然として解明されないでいる。
【０００７】さらに、アルツハイマー病の、特に早期段
階での診断には、アルツハイマーの症状に特徴的なタン
パク質上のエピトープに対する特異的抗体を開発するこ
とが最も重要となる。モノクローナル抗体ＴＡＵ１が単
離されており、これはリン酸化タウタンパク質と非リン
酸化タウタンパク質とを識別することができる（例え
ば、Lee et al., 前掲を参照されたい）。しかし、この
抗体はアルツハイマーの症状とは無関係であると思われ
る脱リン酸化タウタンパク質を特異的に認識する。別の
抗体Ａｌｚ５０ (Ksiezak-Reding et al., J. Biol. Ch
em. 263 (1988),7943-7947)はＰＨＦともタウタンパク
質とも反応する。Sternberger ら (Proc.Natl. Acad. S
ci. USA 82 (1985), 4774-4776)は、アルツハイマーの
タウタンパク質と神経繊維タンパク質に共通したリン酸
化エピトープを認識する抗体ＳＭＩ３４を単離した。最
後に、Lee ら（前掲）は、タウタンパク質のＣ末端領域
中のＫＳＰＶモチーフからなるリン酸化ペプチドに対す
る抗体を製造した。当分野で知られているこれらの抗体
は、どれをとって見ても、アルツハイマーの病状にのみ
特徴的なエピトープを認識するのかどうか不明であると
いう欠点をもっている。
【０００８】さらに、アルツハイマーの対になったラセ
ン状フィラメントの微細構造や、タウタンパク質からの
それらの形成の様式または調節に関する信頼できるデー
タがこれまでに得られていない。タウタンパク質からの
ＰＨＦの形成様式および該形成の土台となる調節機構が
解明されたならば、ＰＨＦ形成の防止にとって非常に有
利であろう。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】かくして、本発明の基
礎をなす技術的課題は、アルツハイマータウタンパク質
に特徴的なリン酸化エピトープ、このリン酸化を特異的
に触媒するキナーゼ活性、該キナーゼに対する阻害剤を
含有する医薬組成物、該エピトープを認識する抗体、該
エピトープを含有する診断用組成物、キナーゼおよび／
または抗体を用いるアルツハイマー病のin vitro診断
法、正常タウタンパク質のアルツハイマータウタンパク
質へのin vitro変換方法、およびアルツハイマーＰＨＦ
を溶解したり、またはその形成を防止するのに効果的な
薬剤の試験方法を提供することであった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記の技術的課題の解明
は請求の範囲に記載される態様により達成される。従っ
て、本発明は、アルツハイマーの対になったラセン状フ
ィラメントからのタウタンパク質中にリン酸化された状
態で特異的に存在しているタウタンパク質のエピトープ
に関する。「アルツハイマーの対になったラセン状フィ
ラメントからのタウタンパク質中にリン酸化された状
態」という表現は、タウが上方のＭr シフトを示し、微
小管への結合低下を有し、そしてpro があとに続くser
またはthr、あるいは反復領域内のいくつかのセリンで
リン酸化されているタウタンパク質の状態を指す（下記
参照）。注：アミノ酸は１文字または３文字表記で表さ
れる；例えば、Lehninger, Biochemistry,第２版, ワー
スパブリッシャーズ(Worth Publishers), ニューヨー
ク,1975年, 72頁を参照されたい。
【００１１】
【発明の実施の形態】アルツハイマーの対になったラセ
ン状フィラメント中にリン酸化された状態で特異的に存
在しているタウタンパク質のエピトープは１つ以上存在
している。さらに、これらのエピトープはリン酸化活性
を示す単一のまたは異なる酵素によってリン酸化されう
る。
【００１２】本発明の好ましい態様において、該エピト
ープは次の生化学的性質を有する哺乳動物脳由来のプロ
テインキナーゼによって特異的にリン酸化される： （ａ）それはタウタンパク質中のser-pro およびthr-pr
o モチーフをリン酸化する； （ｂ）それは４２ｋＤのＭr を有する； （ｃ）それはＡＴＰにより活性化され、１．５ｍＭのＫ
m を有する； （ｄ）それはチロシンのリン酸化により活性化される； （ｅ）それは抗ＭＡＰキナーゼ抗体によって認識され
る；そして （ｆ）それはホスファターゼＰＰ２ａによって非活性化
される。
【００１３】ここで用いる「ser-pro およびthr-pro モ
チーフ」という用語はpro 残基があとに続くリン酸化可
能なser またはthr 残基を指す。このタイプの部位はＭ
ＡＰキナーゼのイソフォーム、ＧＳＫ−３およびｃｄｋ
２によってリン酸化される（下記参照）。
【００１４】「抗ＭＡＰキナーゼ抗体」という用語は、
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰキナー
ゼ）を特異的に認識する抗体を意味する。このキナーゼ
は、例えばＭＡＰ２（微小管結合タンパク質２、例えば
de Miguel et al., DNA andCell Biology 10 (1991),
505-514参照）キナーゼ、ＭＢＰ（ミエリン塩基性タン
パク質）キナーゼまたはＥＲＫ１（Hunter, Meth. Enzy
m. 200 (1991), 1-37参照）のような異なる名称で当分
野において呼ばれている密接に関連した酵素の１ファミ
リーに属するだろう。ＭＡＰキナーゼはその生化学的性
質の点で種々の供給源からの機能的に類似している酵素
と似ている（Hunter，前掲）。
【００１５】本発明の他の好ましい態様において、前記
のエピトープはリン酸化可能なセリン残基 46, 199, 20
2, 235, 396, 404および／または422 および／またはリ
ン酸化可能なトレオニン残基 50, 69, 111, 153, 175,
181, 205, 212, 217および／または231 を含む。図１ａ
を参照されたい。アミノ酸の番号付けは最大のヒトタウ
イソフォーム htau 40と整列させて行った。Goedert et
al. (1989, 前掲) を参照されたい。
【００１６】特に好ましい態様では、前記のエピトープ
はアミノ酸位置 262のリン酸化可能なセリン残基を含
む。これは脳抽出物とそれから調製された３５ｋＤおよ
び７０ｋＤキナーゼとによってリン酸化される（下記参
照）。本発明によると、この残基のリン酸化は微小管へ
のタウタンパク質の結合を著しく妨げることがわかっ
た。このエピトープはアルツハイマー病の発症を試験す
るin vitro診断法に使えるかもしれない。
【００１７】その他の特に好ましい態様では、このエピ
トープはリン酸化可能なセリン残基262, 293, 324およ
び409 を含む。
【００１８】従って、本発明の別の目的は、262 位のセ
リンと上記の他のser-pro またはthr-pro モチーフのリ
ン酸化状態をアッセイすることによるアルツハイマー病
の発症の試験方法を提供することにある。これは、例え
ば、患者の脳脊髄液のサンプルまたは生検後の神経組織
のサンプルを、エピトープに含まれるリン酸化セリン26
2と非リン酸化セリン 262とを識別し得るモノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体とインキュベートすること
によって行うことができる。
【００１９】本発明のエピトープは１つまたはそれ以上
の上で挙げた残基を含むことができる。さらに、本発明
のエピトープは１つまたはそれ以上のリン酸化セリン残
基、１つまたはそれ以上のリン酸化トレオニン残基、あ
るいはこれらの組合せを含んでいてもよい。エピトープ
の実際の組成は当分野で知られた方法によって決定しう
る。また、当業者には、タンパク質の他のアミノ酸がＭ
ＡＰキナーゼによってリン酸化されるタウタンパク質の
部位に対する抗体により認識されるエピトープに関与し
うることも明らかだろう。
【００２０】本発明のさらに好ましい態様では、このエ
ピトープは次のアミノ酸配列を含む：
【００２１】
【化１】
【００２２】また、ペプチドの全アミノ酸が抗体によっ
て実際に認識される特定部位に必ずしも関与しないこと
が理解されるだろう。
【００２３】本発明の他の目的は、アミノ酸モチーフの
ser-pro またはthr-pro のリン酸化によってタウタンパ
ク質をアルツハイマータウタンパク質に特異的に変換す
ることができるプロテインキナーゼを提供することにあ
る。好ましくは、このプロテインキナーゼはＭＡＰキナ
ーゼのクラスに属するものである。これらのキナーゼは
いろいろな目的に使うことができ、例えばタウタンパク
質のアルツハイマータウタンパク質へのin vitro変換に
用いられる。こうして得られるアルツハイマータウタン
パク質は、例えばその形成またはＰＨＦの形成を阻止し
うる物質の研究に使用できるだろう。さらに、それらは
ＰＨＦを溶解する薬剤の開発やアルツハイマータウタン
パク質の正常タウタンパク質への変換のために使用でき
るだろう。また、正常タウタンパク質をアルツハイマー
タウタンパク質へ変換する本発明のプロテインキナーゼ
の能力に基づいた系はアルツハイマー病の明確なin vit
ro系を提供すると考えられる。
【００２４】本発明の好ましい態様において、このプロ
テインキナーゼは次の生化学的性質を有する： （ａ）それはタウタンパク質中のser-pro およびthr-pr
o モチーフをリン酸化する； （ｂ）それは４２ｋＤのＭr を有する； （ｃ）それはＡＴＰにより活性化され、１．５ｍＭのＫ
m を有する； （ｄ）それはチロシンのリン酸化により活性化される； （ｅ）それは抗ＭＡＰキナーゼ抗体によって認識され
る；そして （ｆ）それはホスファターゼＰＰ２ａによって非活性化
される。
【００２５】用語「Ｍr 」はＳＤＳゲル電気泳動により
測定された相対的分子量と定義される。
【００２６】本発明のさらに別の好ましい態様では、こ
のプロテインキナーゼは次の工程を実施することにより
得られる： （ａ）ブタ脳を 10 mMトリス-HCl、pH 7.2、5 mM EGTA
、2 mM DTTおよびプロテアーゼ阻害剤（ロイペプチ
ン、アプロチニン、ペプスタチンＡ、α２−マクログロ
ブリン、ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニ
ル））の混合物中でホモジナイズする； （ｂ）このホモジネートを 100,000×g で３０分、４℃
にて遠心分離する； （ｃ）遠心分離後上清を取り出す； （ｄ）硫酸アンモニウム沈殿により粗タンパク質を沈殿
させる； （ｅ）粗調製物をゲル濾過により脱塩する； （ｆ）活性化バッファー中でのインキュベーションによ
り粗酵素を活性化する； （ｇ）粗調製物をイオン交換クロマトグラフィーにより
さらに精製する；そして （ｈ）ウエスタンブロット法により酵素を同定する。
【００２７】「活性化バッファー」という用語は 25 mM
トリス、2 mM EGTA 、2 mM DDT、40mM p-ニトロフェニ
ルホスフェート、10μM オカダ酸 (okadaic acid) 、2
mM MgATP、およびプロテアーゼ阻害剤を含有するバッフ
ァーと定義される。
【００２８】本発明の他の好ましい態様は、タウタンパ
ク質の反復領域中のＩＧＳおよび／またはＣＧＳモチー
フをリン酸化することによりタウタンパク質をアルツハ
イマータウタンパク質に特異的に変換することができる
プロテインキナーゼに関する。
【００２９】本発明のキナーゼのさらに好ましい態様に
おいて、このキナーゼは次の工程を行うことにより得ら
れる： （Ａ）哺乳動物の脳抽出物を Mono Q (Pharmacia社製)
でイオン交換クロマトグラフィーにかける； （Ｂ）溶出画分を微小管への結合およびタンパク質のリ
ン酸化について試験する； （Ｃ）微小管に結合しかつタウタンパク質をリン酸化し
得る画分をゲルクロマトグラフィーによりさらに精製す
る； （Ｄ）約３５ｋＤで溶出する画分を Mono Q でイオン交
換クロマトグラフィーにかける； （Ｅ）２００から２５０ｍＭのＮａＣｌ間で溶出する主
ピークを集める。
【００３０】そして、このキナーゼは次の特徴を有す
る： （ａ）それは Mono Q に結合するが、Mono Sには結合し
ない； （ｂ）それは酸性ｐＩを有する； （ｃ）それは銀染色ゲルで３５ｋＤに主要バンド（＞９
５％）を、そして４１ｋＤに小バンド（＜５％）を示
す； （ｄ）それは htau34 に3.2 Piの、htau40に3.4 Piの、
htau23に3.3 Piの、そして変異体 htau23 (Ser262 →Al
a)に2.8 Piのリン酸量を組み込む；そして （ｅ）それはタウタンパク質のセリン残基 262, 293, 3
24および356 をリン酸化する。
【００３１】前記の脳抽出物は例えばヒトまたはウシの
脳抽出物でありうる。
【００３２】さらに別の好ましい態様において、本発明
のキナーゼは次の工程により得られる： （Ａ）哺乳動物の脳抽出物の高スピン上清を調製する； （Ｂ）脳抽出物をイオン交換Ｑ−セファロース(Pharmac
ia社製)でクロマトグラフィーにかける； （Ｃ）溶出画分と通り抜け画分をタウタンパク質のリン
酸化および微小管結合への影響について試験する； （Ｄ）通り抜け画分をＳ−セファロースでクロマトグラ
フィーにかける（その際、キナーゼ活性は２５０ｍＭ
ＮａＣｌで溶出する）； （Ｅ）ヘパリンアガロースでクロマトグラフィーにかけ
る（その際、キナーゼ活性は２５０ｍＭ ＮａＣｌで溶
出する）； （Ｆ）ゲル濾過にかける（その際、キナーゼ活性は７０
ｋＤで溶出する）； （Ｇ）Mono Qでクロマトグラフィーにかける（その際、
キナーゼ活性は１５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出する）。
【００３３】そして、このキナーゼは次の特徴を有す
る： （ａ）それはＱ−セファロースに結合しないが、Ｓ−セ
ファロースには結合する； （ｂ）それはアルカリ性ｐＩを有する； （ｃ）それはＳＤＳゲルで７０ｋＤ付近に主要バンドを
示す； （ｄ）それはhtau34、htau40、htau23および構築物Ｋ１
９（すなわち、４反復微小管結合領域）に３〜４個のリ
ン酸を組み込む； （ｅ）それはＫ１９の変異体（Ser 262, 293, 324 およ
び356 がAla に変更されている）をリン酸化しない；
そして （ｆ）それはタウタンパク質のSer 262, 293, 324 およ
び356 をリン酸化する。
【００３４】本発明の別の好ましい態様において、タウ
タンパク質の２つのＩＧＳモチーフと２つのＣＧＳモチ
ーフ（Ser 262, 293, 324, 356 ）をリン酸化する７０
ｋＤキナーゼは次の工程により得られる： （Ａ）脳抽出物の高スピン上清を調製する； （Ｂ）Ｑ−セファロースでクロマトグラフィーにかけ
る； （Ｃ）通り抜け画分をＳ−セファロースでクロマトグラ
フィーにかける（その際、キナーゼ活性は２５０ｍＭ
ＮａＣｌで溶出する）； （Ｄ）ヘパリンアガロースでクロマトグラフィーにかけ
る（その際、キナーゼ活性は２５０ｍＭ ＮａＣｌで溶
出する）； （Ｅ）ゲル濾過にかける（その際、キナーゼ活性は７０
ｋＤで溶出する）； （Ｆ）Mono Qでクロマトグラフィーにかける（その際、
キナーゼ活性は１５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出する）。 （図４５参照）工程Ａの脳抽出物は例えばヒトまたは他
の哺乳動物の脳抽出物であり得る。上記の精製工程は本
明細書に記載されるような当業界で知られた慣用工程で
あり、かくして脳抽出物の調製は実施例１１に記載する
とおりに行い、一方タウとタキソール安定化微小管との
間の結合実験は実施例（６）に記載するように行うこと
ができる。
【００３５】さらに、イン−ゲル(in-gel)アッセイのよ
うなタウ−リン酸化のアッセイは実施例１１に詳述する
ように行うことができる。
【００３６】Mono Qでのクロマトグラフィーは実施例１
１に記載するように行うことができる。
【００３７】該キナーゼを得るために採用した実際の条
件に関して、当業者は上に概説したプロトコールから逸
脱しても本発明のキナーゼを得ることができるだろう。
かかる逸脱は、例えば工程（ａ）のプロテアーゼ阻害剤
混合物の組成に関係する。すなわち、キナーゼ活性が低
下または破壊されないという条件で、異なる阻害剤を使
用することが考えられる。
【００３８】最も好ましい態様において、本発明は、タ
ウタンパク質のセリン残基 46, 199, 202, 235, 262, 3
96, 404, 422およびトレオニン残基 50, 69, 111, 153,
175, 181, 205, 212, 217, 231 を特異的にリン酸化す
るプロテインキナーゼに関する。
【００３９】他の最も好ましい態様では、該キナーゼは
セリン残基 262をリン酸化する。
【００４０】さらに好ましい態様はグリコーゲンシンタ
ーゼキナーゼ−３、すなわちイソフォームα（５１ｋ
Ｄ）またはβ（４５ｋＤ）および／またはｃｄｋ２−サ
イクリンＡ（３３ｋＤ）であるプロテインキナーゼに関
する。
【００４１】本発明の別の好ましい態様において、該キ
ナーゼはヒト脳、ブタ脳または他の供給源に由来するプ
ロテインキナーゼである。
【００４２】本発明の他の目的は、本発明キナーゼの特
異的阻害剤を、場合により製剤上許容される担体および
／または希釈剤と共に含有する医薬組成物を提供するこ
とにある。
【００４３】「プロテインキナーゼの特異的阻害剤」と
いう用語は、本発明のプロテインキナーゼの酵素作用を
特異的に阻害する物質を指す。プロテインキナーゼのよ
うな酵素の阻害剤およびそれらの作用機序は当分野でよ
く知られている。例えば、このような阻害剤は酵素の触
媒ドメインに結合し、そのため酵素はその基質を変換で
きなくなってしまう。かかる阻害剤の例はペプチド阻害
剤およびＰＰ２ａのような非活性化ホスファターゼであ
る。その他の例はホスファターゼ（例えばＭＡＰキナー
ゼの場合のＰＰ−２ａ）によるキナーゼの非活性化であ
る。医薬組成物は、それを必要とする患者に、その症例
に精通している医師が適当と考える経路および用量で投
与されるだろう。製剤上許容される担体および／または
希釈剤は当分野で公知であり、投与経路または患者の特
定の症状に応じて処方される。
【００４４】好ましい態様において、本発明はアルツハ
イマー病の治療用医薬組成物に関する。また、この医薬
組成物は該症例を取り扱う医師が適当と考える経路およ
び用量でそれを必要とする患者に投与される。
【００４５】本発明の他の好ましい態様において、医薬
組成物は特異的阻害剤として本発明のエピトープを含む
オリゴ−またはポリペプチドを少なくとも１種含有す
る。「本発明のエピトープを含むオリゴ−またはポリペ
プチド」という用語は、対応する抗体によって特異的に
認識される本発明のエピトープをその二次元または三次
元構造において再構成するペプチドを意味する。さら
に、該オリゴ−またはポリペプチドは該エピトープを提
示するアミノ酸のみから成っていても、追加のアミノ酸
を含んでいてもよい。このようなオリゴ−またはポリペ
プチドの構築は当分野で公知である。
【００４６】本発明のその他の目的は、本発明のエピト
ープを特異的に認識する抗体である。この抗体は血清に
由来するものであっても、モノクローナル抗体であって
もよい。所望のエピトープに対するモノクローナルおよ
びポリクローナル抗体の生産は当分野で公知である（例
えば、Harlow and Lane, Antibodies, A LaboratoryMan
ual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Ha
rbor, 1988 を参照されたい）。さらに、抗体は天然の
ものであっても、当分野で十分に理解されている技術に
より誘導されるキメラ抗体のような遺伝子工学的手法に
より得られた抗体であってもよい。さらに、抗体はＦａ
ｂフラグメントのような特定のエピトープに結合する能
力を保持している抗体のフラグメントであってもよい。
【００４７】好ましい態様において、本発明の抗体は本
発明のプロテインキナーゼを認識する。ここで用いる
「本発明のプロテインキナーゼを認識する」という用語
は、該抗体が同じ生物学的環境に存在する異なるプロテ
インキナーゼのような他の物質と交差反応しないか、ま
たは有意には交差反応しないことを意味する。さらに、
それは該抗体がin vitro系で試験するとき異なるプロテ
インキナーゼと交差反応しないか、または有意には交差
反応しないことを意味する。
【００４８】別の好ましい態様において、本発明の抗体
はモノクローナル抗体である。
【００４９】本発明のその他の目的は、アルツハイマー
病を検出および／または監視するための診断用組成物を
提供することにあり、該組成物は − 本発明のエピトープ； − 本発明のキナーゼ；および／または − 本発明の抗体； を含有する。
【００５０】本発明の診断用組成物は、例えば試験サン
プル中の本発明キナーゼの１種または高レベルの該キナ
ーゼを特異的に認識する本発明の抗体を含有しうる。別
の態様では、診断用組成物は本発明のエピトープの１つ
に対する本発明の抗体を含有しうる。かくして、本発明
のエピトープを認識する抗体でサンプルを処理すること
によりサンプルのアルツハイマーに関連した病状を検出
することができる。抗体−エピトープ（ハプテン）複合
体は、当分野で知られた方法により標識された本発明抗
体に対する第２抗体を用いて視覚化しうる（例えば、Ha
rlow and Lane,前掲を参照されたい）。本発明のさらに
別の態様において、診断用組成物は本発明のエピトープ
と本発明の抗体から構成されていてもよい。基準サンプ
ルとして用いられる本発明エピトープへの該抗体の結合
に関連してサンプルへの該抗体の結合が生じる場合、該
抗体でサンプルを処理することにより対応する患者の病
状について診断をくだすことができるだろう。さらに別
の態様では、診断用組成物は本発明のエピトープ、本発
明のキナーゼ、それに本発明の抗体を含有する。本発明
エピトープのリン酸化と対比してサンプルのリン酸化に
関してキナーゼ活性をモニターすることができる。定量
されたキナーゼ活性から、サンプル中に含まれるタウタ
ンパク質のリン酸化状態を知り、それから患者の病状を
推定することができる。キナーゼ活性は、例えば同一反
応中に基質類似体（酵素的変換の際に肉眼で検出可能な
もの）を加えることによって推定しうる。このような基
質類似体は当分野で広く用いられている。これとは別
に、本発明のキナーゼで処理した後に、リン酸化エピト
ープに対する本発明抗体を利用しかつ内部標準として診
断用組成物により提供される抗体−エピトープ複合体の
量を使用することにより、あるいはキナーゼによってタ
ウタンパク質に組み込まれたリン酸の量を、例えば当分
野で公知の放射性トレーサー法を使って測定することに
より、サンプル中のリン酸化タウタンパク質の量を検出
することができる。当業者は本発明の上記物質を適宜に
組み合わせた他の試験系をデザインする立場にある。考
えうる全ての組合せは本発明の保護の範囲内に含まれる
ことを理解すべきである。
【００５１】本発明の他の目的はアルツハイマー病を診
断および／または監視するためのinvitro法を提供する
ことにあり、該方法は − 本発明のエピトープを含むリン酸化されたアルツハ
イマータウタンパク質の存在について； − 本発明のプロテインキナーゼの存在について； − ホスファターゼＰＰ２ａ、ＰＰ１および／またはカ
ルシニューリン(calcineurin) の存在について； 患者の脳脊髄液単離物を検定するか、あるいは神経組織
の生検を実施することから成っている。「患者の脳脊髄
液単離物」は標準医学的手法により得られる。
【００５２】生検に適する神経組織の例は嗅上皮であ
る。当業者は、例えば上記の診断用組成物に関連して示
した診断手段(tool)を用いてこの方法を実施することが
できる。
【００５３】本発明の好ましい方法では、アルツハイマ
ータウタンパク質およびタウタンパク質のセリン残基 2
62のリン酸化が本発明の抗体を用いて検出される。この
抗体は本発明のエピトープに対する抗体であることが好
ましい。
【００５４】本発明の別の好ましい態様において、プロ
テインキナーゼは本発明のエピトープを含むオリゴ−ま
たはポリペプチドを用いて、および／または本発明の抗
体を用いて検出される。
【００５５】本発明のさらに他の目的は、正常タウタン
パク質のリン酸化を可能にする条件下で正常タウタンパ
ク質を本発明のプロテインキナーゼで処理することから
なる、正常タウタンパク質をアルツハイマータウタンパ
ク質に変換するためのin vitro法を提供することにあ
る。「アルツハイマータウタンパク質」という用語は、
異常にリン酸化されており（例えば、ser-pro またはth
r-pro モチーフで）かつアルツハイマー特異的抗体によ
り認識されるタウタンパク質を指す。
【００５６】「正常タウタンパク質のリン酸化を可能に
する条件」という用語は、プロテインキナーゼの活性、
好ましくは最適活性を可能にする条件を指す。この活性
はser-pro および／またはthr-pro モチーフでの基質の
リン酸化をもたらす。その後、リン酸化された基質はア
ルツハイマー特異的抗体により認識される。
【００５７】正常のタウタンパク質は天然または組換え
源から得られる。しかしながら、本発明の方法を実施す
るためには組換え物質を使用することが有利である。本
発明の方法は様々な目的のために十分量のアルツハイマ
ータウタンパク質を提供する。つまり、本発明の方法を
用いると、アルツハイマー状態のタンパク質の生成を研
究するためのin vitroモデルが確立される（上記参
照）。さらに、正常タウタンパク質のアルツハイマータ
ウタンパク質への変換を阻止する阻害剤についても試験
することができる。これらの「阻害剤」は、例えばエピ
トープをブロックすることによりリン酸化されるエピト
ープに特異的であるか、または、それらがプロテインキ
ナーゼの生物学的活性を妨害するという条件でプロテイ
ンキナーゼの種々のドメインに向けられたものであり得
る。他のタイプの阻害はタウまたはそのキナーゼに対す
るホスファターゼの拮抗作用である。さらに、本発明の
方法により生成されたアルツハイマータウタンパク質は
微小管構造への結合実験にも使うことができ、かくして
アルツハイマー病の根底にある分子レベルの解明に貢献
するだろう。当業者は様々な目的のために本発明の方法
を如何に利用するかについて理解しており、これらは全
て本発明の保護の範囲内に入るものである。
【００５８】本発明は、さらに、本発明のエピトープを
用いてアルツハイマータウタンパク質に特異的な抗体、
またはアルツハイマー病の発症に特有なタウタンパク質
に対する抗体を産生することに関する。この抗体を得る
ための方法は当分野で公知であり、標準方法を使ってポ
リクローナルまたはモノクローナル抗体をつくることが
できる（例えば、Harlow and Lane,前掲を参照された
い）。抗体産生のためにオリゴ−またはポリペプチドを
用いる場合は、該エピトープへの免疫反応を引き出し、
あるいは増強しうる適当なキャリアー分子（例えば、ウ
シ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシア
ニン）にエピトープ含有ペプチドを結合させることが望
ましい。ハプテン（エピトープを含むか、それと同一で
ある）とキャリアーとの結合方法も当分野で公知である
（Harlow and Lane,前掲）。また、所望の抗体を産生さ
せるのに適した動物もこのために使用しうることを理解
すべきである。
【００５９】その他の面において、本発明は、タウタン
パク質二量体からのアルツハイマーの対になったラセン
状フィラメントの生成を阻止する阻害剤を含有するアル
ツハイマー病の治療または予防用の医薬組成物に関す
る。
【００６０】本発明によると、タウタンパク質はそのＣ
末端ドメインに存在する反復単位の集合（アセンブリ
ー）によりアンチパラレル二量体を形成することがわか
った。タウタンパク質の二量体化は生理学的プロセスで
あるようだが、ＰＨＦのような高次構造の形成はアセン
ブリー過程での規制解除によるものと考えられる。その
結果として、多数のタウ二量体からＰＨＦが形成され、
その際の二量体の架橋は分子間ジスルフィド結合を介し
て起こる。
【００６１】アセンブリー過程の規制解除とそれに続く
タウ二量体からのＰＨＦの形成はタウタンパク質の異常
なリン酸化によると思われる。その理由は、本発明によ
り判明したことだが、反復単位だけからなる末端切断型
のタウタンパク質はＰＨＦを形成する能力があるのに対
して、Ｎ末端およびＣ末端からなるタウタンパク質また
はタウ様タンパク質はその能力がないからである。
【００６２】それ故、本発明の組成物において有用な阻
害剤は、それが妨害する分子機構とは無関係に、タウ二
量体からのＰＨＦの形成を阻止しうる阻害剤である。か
かる阻害剤は、例えばタウ二量体の分子間架橋の形成ま
たは会合を妨げる化合物としての、タウタンパク質の異
常なリン酸化に関与するプロテインキナーゼの阻害剤で
ありうる。
【００６３】本発明の更なる目的は、アルツハイマーの
対になったラセン状フィラメントを溶解するのに効果的
な薬剤の試験方法を提供することにあり、この方法は次
の工程を含んでいる： （ａ）タウ由来の配列を含むポリペプチドから適当な条
件下でアルツハイマーＰＨＦ（対になったラセン状フィ
ラメント）を形成させる； （ｂ）アルツハイマーＰＨＦを試験すべき薬剤とインキ
ュベートする；そして （ｃ）アルツハイマー様ＰＨＦの溶解に関して工程
（ｂ）のインキュベーションの結果を検討する。
【００６４】ここで用いる「アルツハイマーの対になっ
たラセン状フィラメントを溶解するのに効果的」という
用語は部分的に溶解されたＰＨＦをも含むものである。
本発明の目的のためには、試験される薬剤はＰＨＦの退
縮または分解に効果的で、治療において補助的役割を果
たすだけで十分であるが、薬剤によるＰＨＦの全溶解が
好ましい。
【００６５】「タウ由来の配列を含むポリペプチド」と
いう用語は、該配列の長さ、または突然変異、欠失、挿
入にかかわりなくＰＨＦを形成することができるタウタ
ンパク質由来の配列、あるいは該ポリペプチドのＰＨＦ
形成能が完全なままであるという条件で異種配列を含む
ポリペプチドを指す。
【００６６】アルツハイマーＰＨＦの形成に関連する用
語「適当な条件」とはＰＨＦの形成を可能にする条件の
ことである。該条件は、天然のタウタンパク質を用いる
場合にはＭＡＰキナーゼの利用可能性を含む。
【００６７】好ましい態様において、上記方法の工程
（ａ）に適用される条件は０．３〜０．５Ｍのトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ５．０〜５．５で、追加の塩類を含まない
環境である。
【００６８】本発明のさらに他の目的は、アルツハイマ
ーＰＨＦの形成を防止または軽減するのに効果的な薬剤
の試験方法を提供することにあり、この方法は次の工程
を含んでいる： （ａ）試験すべき薬剤とタウ由来の配列を含むポリペプ
チドとを該薬剤の非存在下でアルツハイマーＰＨＦの形
成を可能にする条件下でインキュベートする；そして （ｂ）インキュベーション混合物中のアルツハイマーＰ
ＨＦの有無に関して工程（ａ）のインキュベーションの
結果を検討する。
【００６９】「該薬剤の非存在下でアルツハイマーＰＨ
Ｆの形成を可能にする条件」という用語は、該薬剤がイ
ンキュベーション混合物中に含まれないという前提のも
とにＰＨＦの形成を可能にする条件を意味する。かかる
条件の好ましい例は０．３〜０．５Ｍのトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ５．０〜５．５で、追加の塩類を含まない環境
である。
【００７０】ここで用いる「アルツハイマーＰＨＦの有
無」という用語は、該薬剤を使用しなかった対照実験と
比べて、ほんの限られた量のＰＨＦが形成された場合の
結果をも含めるものとする。
【００７１】上記方法の好ましい態様において、該ポリ
ペプチドは本質的にタウタンパク質のＣ末端部分からの
反復単位を含む。
【００７２】本発明によると、タウタンパク質のＣ末端
ドメインに含まれる反復単位は、生理学的条件下での該
タンパク質の二量体化と、その後のアルツハイマー様Ｐ
ＨＦをもたらすオリゴマー化に関与していることがわか
った。用語「アルツハイマー様ＰＨＦ」はここでは、Ｐ
ＨＦ中に通常存在するタウタンパク質の非反復単位部分
が該ポリペプチドにより生成されたＰＨＦには無いこと
を単に示すために、「アルツハイマーＰＨＦ」に対立す
るものとして用いられる。
【００７３】従って、本質的に反復単位のみを含むポリ
ペプチドはＰＨＦの形成とＰＨＦの微細構造を研究する
ための理想的なin vitro系を提供する。
【００７４】特に好ましい態様において、該ポリペプチ
ドは主にＫ１１および／またはＫ１２のようなタウの反
復領域から成っている。
【００７５】Ｋ１１およびＫ１２は、本質的にタウタン
パク質のみに由来する反復単位から成るので、上記の試
験目的には理想的に適っている。本発明の方法では、Ｋ
１１およびＫ１２を単独で使用しても、組み合わせて使
用してもよい。
【００７６】更なる面において、本発明はアルツハイマ
ーＰＨＦを溶解するのに効果的な薬剤の試験方法に関
し、該方法は次の工程を含んでいる： （ａ）タウタンパク質を発現または過剰発現する細胞
に、適当な調節領域の制御下にあるＭＡＰキナーゼをコ
ードする機能遺伝子を導入する； （ｂ）リン酸化タウタンパク質を形成させ、そしてアル
ツハイマーＰＨＦを形成させる； （ｃ）該アルツハイマーＰＨＦを単離する； （ｄ）試験すべき薬剤を該ＰＨＦに適当な条件下で加え
る；そして （ｅ）該ＰＨＦに及ぼす該薬剤の効果を調べる。
【００７７】上記の工程（ａ）で用いる「タウタンパク
質を発現する細胞」という用語は、タウを内因的に発現
する細胞または機能タウ遺伝子が導入されていてタウを
発現する能力を有する細胞を指す。後者の場合、当業者
は、ＭＡＰキナーゼをコードする遺伝子とタウをコード
する遺伝子の導入順序が本発明方法の目的にとって意味
のあるものではないことに気づくであろう。
【００７８】上記の工程（ｄ）における用語「適当な条
件下」とは、ＰＨＦを溶解するのに該薬剤を効果的にさ
せる条件のことであり、特に最適条件を指す。
【００７９】この方法は、in vitro状況の類似したイメ
ージを提示する連続増殖細胞系の使用を土台にした系が
リン酸化タウタンパク質の十分な供給量を提供するの
で、特に有利である。
【００８０】好ましい態様では、タウタンパク質を発現
する細胞は神経芽細胞腫または有色細胞腫の細胞もしく
は神経細胞の一次培養物である。かかる細胞または細胞
系は当分野で公知である。好ましい例は神経芽細胞腫の
細胞系Ｎ２１およびＰＣ１２である。
【００８１】これらの細胞系はタウを内因的に発現する
ので特に好適である。
【００８２】本発明の更なる目的は、有効成分としてま
たは有効成分の１つとしてＰＰ２ａおよび／またはＰＰ
−１および／またはカルシニューリンホスファターゼを
含有するアルツハイマー病の治療用医薬組成物である。
【００８３】図は下記のものを示す。 図１ａ：タウのアミノ酸配列（イソフォームｈｔａｕ４
０、Goedert ら、1989）。ＳＰ、ＴＰ、ＩＧＳ及びＣＧ
Ｓのモチーフは目立つように印を付けてある。 図１ｂ：（ａ）はタウイソフォームのＳＤＳゲルで、
（ｂ）は（ａ）及びＰＨＦタウのＡＴ８抗体を用いたイ
ムノブロットである。 （ａ）ＳＤＳゲル。レーン１はマーカータンパク質であ
る。レーン２はウシ脳由来のタウで、リン酸化の程度が
様々な数個のイソフォームを示している。レーン３はア
ルカリホスファターゼで脱リン酸化した後のウシ脳タウ
である。すべてのイソフォームが、より低いＭr にシフ
トしていることに注目されたい。レーン４及び５は、脱
リン酸化前及び後の正常なヒト脳のタウである。レーン
６〜１１は、細菌によって発現させたヒトタウイソフォ
ームｈｔａｕ２３、２４、３７、３４、３９、及び４０
（Goedert ら、1989，同頁参照）である。これらのイソ
フォームは、それぞれＣ末端側半分に存在する３１個の
アミノ酸残基からなる内部反復単位を３つまたは４つ含
む（３つ：ｈｔａｕ２３，３７，３９；４つ：ｈｔａｕ
２４，３４，４０）。Ｎ末端付近には、２９個のアミノ
酸残基からなる挿入配列が０、１つまたは２つ存在し得
る（０：ｈｔａｕ２３，２４；１つ：ｈｔａｕ３７，３
４；２つ：ｈｔａｕ３９，４０）。 （ｂ）ＡＴ８抗体を用いたイムノブロット。レーン１は
ＰＨＦタウで、６０〜７０ｋＤの範囲に４〜６個のイソ
フォームを示している。これらのイソフォームはすべて
ＡＴ８に対して強く反応する。レーン２〜１１は（ａ）
で用いたのと同じ調製物である。ウシのタウイソフォー
ムも、正常なヒトのそれも全く反応を示していない。 図２：細菌によって発現させたヒトタウの、脳のキナー
ゼを用いたリン酸化。（ａ）はＳＤＳゲルで、（ｂ）は
ＡＴ８を用いたイムノブロットである。 （ａ）レーン１及び２はｈｔａｕ２３の、抽出物リン酸
化前及び後のＳＤＳゲルである（Ｍr の上向きシフトに
注意）。レーン３〜１０は他のイソフォーム（ｈｔａｕ
２４，３４，３９，４０）の類似ペーを示す。 （ｂ）はＡＴ８抗体を用いた（ａ）のイムノブロットで
ある。ＡＴ８抗体はリン酸化後のすべてのイソフォーム
と反応する（偶数レーン；ここに図示していないがｈｔ
ａｕ３７を含む）。 図３：構築体Ｋ３Ｍ、Ｋ１０、Ｋ１９及びＫ１７の図。
Ｋ１９（９９個のアミノ酸残基）は、ｈｔａｕ２３のＱ
２４４−Ｅ３７２配列及びＮ末端メチオニン残基を含
む。これは、反復単位のうち３つを含む（反復単位１、
３及び４；反復単位２はｈｔａｕ２３には存在しない。
Ｋ１０（１６８個のアミノ酸残基）は，ｈｔａｕ２３の
Ｃ末端まで伸びている点を除いては、Ｋ１９と似てい
る。Ｋ１７（１４５個のアミノ酸残基）は、Ｓ１９８−
Ｅ３７２配列（キモトリプシン開裂部位から始まり、第
２の反復単位は含まず、第４の反復単位の終りまで伸び
ているアッセンブリードメインとＮ末端メチオニン残
基）を含む。Ｋ３Ｍ（３３５個のアミノ酸残基）は、ウ
シｔａｕ４Ｎ末端の１５４個のアミノ酸残基とｈｔａｕ
２３（第２反復単位を含まない）のＲ２２１−Ｌ４４１
配列を含む。Ｋ１７には、ペプチドＳ１９８−Ｔ２２０
の位置が示してある。構築体の比較により、ＡＴ８の抗
原決定基はこの領域にあるにちがいない（図４参照）。 図４：ｈｔａｕ４０ならびに構築体Ｋ１０、Ｋ１７、Ｋ
３ＭおよびＫ１９のリン酸化。 （ａ）ＳＤＳゲル。奇数レーンは、リン酸化前のｈｔａ
ｕ４０、Ｋ１０、Ｋ１７及びＫ３Ｍで、偶数レーンはリ
ン酸化後のそれらである。レーン４には２本のバンドが
見られるが、これはＫ１０が完全にリン酸化されていな
いためである。 （ｂ）ＡＴ８を用いた（ａ）のイムノブロット。抗体
は、両方ともリン酸化された状態であるｈｔａｕ４０
（レーン２）とＫ１７（レーン６）とのみ反応する。し
かし、リン酸化されておりかつＭr シフトを示すにもか
かわらず、構築体Ｋ１０（レーン４）またはＫ３Ｍ（レ
ーン８）とは反応しない。 （ｃ）キナーゼとインキュベートする前および後の構築
体Ｋ１９。レーン１及び２はＳＤＳゲルを示す。Ｍr シ
フトもリン酸化も見られず、それはオートラジオグラフ
ィーによって確認された（図示していない）。レーン３
及び４はＡＴ８を用いたイムノブロットであるが、反応
は全く見られない。これにより、抗原決定基は反復領域
には存在しないことが確認された。 図５：トリプシンペプチドＳ１９５−Ｒ２０９の図。こ
の１５個のアミノ酸残基よりなるペプチド（セリン残基
５個とトレオニン残基１個を含む）のＳ１９９とＳ２０
２（配列決定により確定した）を２個の放射性リン酸で
標識した。 図６：ｈｔａｕ２３のＤ−変異体（Ｓ１９９とＳ２０２
をアスパルギン酸（Ｄ）に変えたもの）のリン酸化及び
抗体応。レーン１及び２は、抽出物リン酸化前及び後の
ｈｔａｕ２３のＳＤＳゲルを示す。レーン３及び４は、
抽出物リン酸化前及び後のＤ−変異体のＳＤＳゲルを示
す。Ｄ−変異体はｈｔａｕ２３に較べ少し上まで走って
いることに注意されたい（レーン１及び３）。しかし、
リン酸化後は両方の蛋白質はゲル中で同じ位置をしめる
（レーン２及び４）。レーン５〜８は、ＡＴ８を用いた
レーン１〜４のイムノブロットを示す。抗体は抽出物リ
ン酸化後のｈｔａｕ２３のみと反応を示す（レーン
６）。しかし、未リン酸化のｈｔａｕ２３とも反応しな
いし（レーン５）、Ｍr の増大シフト及びオートラジオ
グラフィー（図示していない）によって示されるように
リン酸化されていたにもかかわらずＤ−変異体とも反応
しない（レーン７、８）。レーン９〜１２は、ＴＡＵ１
を用いたレーン１〜４のイムノブロットである。この抗
体は、リン酸化前のｈｔａｕ２３（レーン９）のみと反
応し、リン酸化したｈｔａｕ２３（レーン１０）ともＤ
−変異体（レーン１１、１２）とも反応しない。アスパ
ラギン酸はリン酸化セリンによく似ているようであり、
したがって抗原決定基をマスクする。レーン１０におけ
るｈｔａｕ２３とＴＡＵ１のマイナーな反応は、このタ
ンパク質が完全にリン酸化されていないことを示してい
る。 図７：細菌によって発現させたヒトイソフォームｈｔａ
ｕ２３の脳キナーゼ活性によるリン酸化の経時変化、な
らびに対応オートラジオグラム （ａ）キナーゼと共に０〜２４時間インキュベートした
後のｈｔａｕ２３のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動。未リン酸化タンパク質はＭr0＝４８ｋＤの単一
バンドを示す（レーン１）。レーン３〜１４は、リン酸
化が、明確に示される中間諸段階をそなえた、より高い
Ｍr への漸進的シフトをもたらすことを示している。偶
数レーン（図７ｂの下に４、６、..と番号をふってあ
る）は、１０μＭオカダ酸（okadaic acid）（ＯＡ）の
存在下で観察した（図７ａの下に「＋」印を付けてあ
る）。奇数レーン（３、５、..「−」印を付けてある）
では、オカダ酸は使っていない。第１段階は約２時間か
かり（新しいＭr1＝５２ｋＤへのシフト）、第２段階は
約１０時間で完了し（Ｍr2＝５４ｋＤ）、第３段階は約
２４時間で完了する（Ｍr3＝５６ｋＤ）。それに続く２
４時間の間には、これ以上のシフトは観察されない。レ
ーン２は、この文脈の中では重要でない変異体を示す。
（ｂ）は（ａ）のオートラジオグラムを示す。この実験
で取り込まれたリン酸（mol Pi/mol タンパク質）の量
は次の通りである。（−ＯＡ／＋ＯＡ）：３０ｍｉｎ
（０．５／１．０），６０ｍｉｎ（０．７／１．４），
１２０ｍｉｎ（１．０／２．０），１０ｈｒ（２．０／
３．０），２４ｈｒ（３．２／４．０）。 図８：（ａ）は図７ａのそれと同様な、ｈｔａｕ２３の
リン酸化の経時変化を示すＳＤＳゲルであるが、全レー
ンに１０μＭオカダ酸が存在している。（ｂ）はモノク
ロ−ナル抗体ＳＭＩ３４を用いた（ａ）のイムノブロッ
トである。この抗体はリン酸化の第２及び第３段階での
みタンパク質を認識するが、第一段階では認識しない。 図９：リン酸化前および後のタウイソフォームの微小管
への結合。 （ａ）結合実験のＳＤＳゲルで、タウイソフォームｈｔ
ａｕ４０の場合を例としてあげてある［ｈｔａｕ４０の
バンドはチューブリン（Ｔ）のそれと明確に分離される
ため、煮沸ステップによりチューブリン除去しなくても
両成分を同時に示すことができる］。一番上の行は、２
４時間リン酸化した、またはしていない（Ｐｉが＋また
は−）ペレット（Ｐ）または上清（Ｓ）を示す。レーン
１〜４は２０μＭタウタンパク質（合計濃度）で、レー
ン１および２はリン酸化されており、レーン３および４
はリン酸化されていない。レーン１と２を比較すると、
リン酸化したタンパク質のほとんどは遊離しており
（Ｓ），また他方では小部分のみが微小管と結合してい
る（Ｐ）ことがわかる。レーン３および４は、未リン酸
化の状態ではタンパク質の約半分が結合しており、残り
の半分が遊離していることを示している。（ここでも図
７と同様に、リン酸化したタンパク質のバンド、レーン
１および２、は未リン酸化のもの、レーン３および４、
よりゲル中で高いことに注意されたい。）レーン５〜８
は、１５μＭのｈｔａｕ４０を用いた同様の実験であ
る。レーン９および１０は、１０μＭのリン酸化タンパ
ク質の場合を示す。レーン１１〜１５は、ｈｔａｕ４０
のあらかじめ分かっている量（それぞれ１５、１０、
７．５、５および２．５μＭ）を用いての濃度補正のた
めのものである。（ｂ）はｈｔａｕ２３の、（ｃ）はｈ
ｔａｕ３４の、リン酸化前（丸印）および２４時間リン
酸化後（三角印）の微小管への結合曲線を示す。これら
の曲線は、図３ａと同様のＳＤＳゲルから得た。重合し
たチューブリンは３０μＭである。それぞれの解離定数
Ｋd および化学量数は図に示す通りである。どの場合に
おいても、最も劇的な影響は結合部位数に対するもの
で、これはリン酸化によって約３分の１に減少し、約
０．５（つまり、チューブリン二量体各２個に対しタウ
１個）から約０．１６（チューブリン二量体６個に対し
タウ１個）なる。未リン酸化４−反復イソフォーム（ｈ
ｔａｕ３４など）の結合は特に密であることに注意され
たい（Ｋd が約１−２μＭ）。 図１０：ｈｔａｕ４０の図で、キナーゼ活性によりリン
酸化された７個のＳｅｒ−Ｐｒｏモチーフの位置を示
す。１〜４と標識されたボックスは微小管結合に関与す
る内部反復単位である。いくつかのイソフォームでは２
番目のものは存在しない（例：ｈｔａｕ２３）。Ｎ末端
近くの斜線を施した２個のボックスは、ｈｔａｕ２３と
ｈｔａｕ２４には存在しない挿入配列で、このためこれ
らの分子はＳｅｒ−Ｐｒｏモチーフを６個のみ含む。下
記の放射性トリプシンペプチドが発見された： 24- 49: KDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESpPLQ 191-209: SGDRSGYSSpPGSpPGTPGSR 231-240: TPPKSpPSSAK 396-406: SPVVSGDTSpPR 386-406: TDHGAEIVYKSpPVVSGDTSpPR 407-428: HLSNVSSTGSIDMVDSpPQLATL 260-266: IGSpTENL 図１１：ｈｔａｕ３４のリン酸化前（丸印）および９０
分間リン酸化後（三角印）の微小管への結合。結合能の
減少は２４時間リン酸化後のそれと非常によく似ている
（図９ｂと比較）。 図１２：アルツハイマー患者および正常なヒトの脳のタ
ウタンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動、ならびに抗体ＳＭＩ３３，ＳＭＩ３１およびＳＭＩ
３４を用いたそれらのイムノブロット。 （ａ）レーン１は、正常なヒト対照脳からのタウタンパ
ク質のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で、Ｍr ５５
〜６５ｋＤの間に５〜６本のバンドが見られる（レーン
３のＰＨＦタウより幾分低い）。レーン２は、キナーゼ
活性によりリン酸化した後の正常なヒトタウを示し、す
べてのバンドが上向きにシフトしている。レーン３およ
び４は、リン酸化に関係なくすべてのタウイソフォーム
を認識する抗体５Ｅ２［Kosik et al., Neuron 1 (198
8), 817-825］を用いたＰＨＦタウのイムノブロットで
ある。レーン３はアルツハイマー患者の脳から単離され
たままのＰＨＦタウを示し、レーン４はアルカリホスフ
ァターゼによる脱リン酸化後のそれを示す。脱リン酸化
タンパク質のバンドがゲル上で下向きにシフトしている
ことに注意されたい。 （ｂ）ＳＭＩ３３を用いた（ａ）のイムノブロット。こ
の抗体は正常なヒトタウ（レーン１）および脱リン酸化
後のＰＨＦタウ（レーン４）を認識する。 （ｃ）ＳＭＩ３１を用いた（ａ）のイムノブロット。こ
の抗体は、リン酸化後の正常ヒトタウと自然なリン酸化
状態にあるＰＨＦタウ（レーン２および３）を認識する
ことに注意されたい。 （ｄ）ＳＭＩ３４を用いた（ａ）のイムノブロット。こ
の抗体は、リン酸化後の正常ヒトタウ（レーン２）とＰ
ＨＦタウ（レーン３）を認識する。 図１３：細菌によって発現させたヒトイソフォームｈｔ
ａｕ２３のリン酸化の経時変化（前に掲げた図と同様の
もの）、ならびに抗体ＳＭＩ３３、ＳＭＩ３１、ＳＭＩ
３４、ＴＡＵ１およびＡＴ８を用いたイムノブロット。 （ａ）リン酸化時間０〜２４時間までのＳＤＳゲルで、
連続的なＭr のシフトを示す。 （ｂ〜ｆ）ＳＭＩ３１、ＳＭＩ３４、ＳＭＩ３３、ＴＡ
Ｕ１およびＡＴ８を用いたイムノブロット。抗体ＳＭＩ
３３およびＴＡＵ１は、第１段階の終りまで（２時間）
完全にｈｔａｕ２３を認識するが、抗原決定基は第２段
階でブロックされてしまう。抗体ＳＭＩ３１，ＳＭＩ３
４およびＡＴ８は、このタンパク質をリン酸化の第２段
階および第３段階でのみ認識するという点で、相補的で
ある。 （ｇ〜ｈ）ＳＭＩ３１同様リン酸化の第２段階以降この
タンパク質を認識するＳＭＩ３５およびＳＭＩ３１０を
用いたｈｔａｕ３４のイムノブロット。 図１４：タウおよび構築体のＳＤＳゲル、ならびに抗体
ＳＭＩ３３、ＳＭＩ３１およびＳＭＩ３４を用いたイム
ノブロット。 （ａ）ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動。レーン１お
よび２はキナーゼによる２４時間のリン酸化前および後
の構築体Ｋ１０を示す。レーン３および４は、リン酸化
前および後の構築体Ｋ１７を示す。レーン５および６
は、リン酸化前および後の構築体Ｋ１９を示す。Ｋ１９
以外の構築体はすべてリン酸化の結果シフトを示す。Ｋ
１０については、３本のバンドのシフトが観察され、Ｋ
１７についてはシフトしたバンドは１本のみである。 （ｂ）ＳＭＩ３３を用いた（ａ）のイムノブロット。こ
の抗体は、未リン酸化形態のＫ１７（レーン３）のみを
認識し、抗原決定基が反復単位の前にあることを示唆し
ている。 （ｃ）ＳＭＩＦ３４を用いた（ａ）のイムノブロット。
この抗体はリン酸化形態のＫ１０およびＫ１７を認識す
る（一番上のバンドのみ、レーン２および４）。この抗
体はＫ１９（反復領域）を認識しないが、Ｎ末端側およ
びＣ末端側の両方にその反復単位の配列を要求する。し
たがって、抗原決定基は非連続的（コンホメーション依
存性）である。 （ｄ）ＳＭＩＦ３１を用いた（ａ）のイムノブロット。
この抗体はリン酸化されたＫ１０（レーン２）の一番上
のバンドのみを認識し、抗原決定基が反復領域の後にあ
ることを示唆している。 図１５：ｈｔａｕ４０およびｈｔａｕ２３の点変異体の
図。 図１６：ｈｔａｕ４０および図１５に示されたその点変
異体のＳＤＳゲル、ならびに抗体ＳＭＩ３３、ＳＭＩ３
１およびＳＭＩ３４を用いたイムノブロット。 （ａ）レーン１〜８は、ｈｔａｕ４０とその変異体ＫＡ
Ｐ２３５、ＫＡＰ３９６およびＫＡＰ２３５／３９６の
未リン酸化形態およびリン酸化形態（＋）におけるＳＤ
Ｓゲルである。どの場合においても、リン酸化はＳＤＳ
ゲルにおける上向きの移動をもたらす。 （ｂ）ＳＭＩ３３を用いた（ａ）のイムノブロット。抗
体応答はＳ２３５が変異を起こしていると、脱リン酸化
状態でもリン酸化状態でも（レーン３＋４、７＋８）、
著しく減少する。これは、（脱リン酸化した）第１のＫ
ＳＰモチーフがＳＭＩ３３の抗原決定基の一部であるこ
とを示している。Ｓ３９６をアラニンに変異させてもそ
の変異体の挙動は親分子と同様である。つまり、脱リン
酸化状態では強い抗体応答を示し、リン酸化状態では全
く反応しない。従ってＳ３９６はＳＭＩ３３の抗原決定
基に寄与していない。 （ｃ）ＳＭＩ３１を用いた（ａ）のイムノブロット。こ
の抗体は、リン酸化形態のｈｔａｕ４０とすべての変異
体を認識する（レーン２、４、６および８）。これは、
２個のＫＳＰモチーフのリン酸化が、抗原決定基の主要
な決定要素ではないことを示している。 （ｄ）ＳＭＩ３４を用いた（ａ）のイムノブロット。反
応はＳＭＩ３１に似ているがより明白であり、ここでも
２個のＫＳＰモチーフが主要決定要素ではないことを示
している。 図１７：タウの欠失変異体およびそれらの抗体応答。
（ａ）２個の反復単位のみをもつ構築体（Ｋ５〜Ｋ７）
または１個のそれのみをもつ構築体（Ｋ１３〜Ｋ１５）
のリン酸化前および後のＳＤＳゲル。（ｂ）ＳＭＩ３４
を用いた（ａ）のイムノブロット。この抗体はリン酸化
されたタンパク質をすべて認識することに注意されたい
（Ｋ７は弱く認識するのみであるが）。（ｃ）ＳＭＩ３
１を用いた（ａ）のイムノブロット。この抗体は、リン
酸化された２−反復分子（Ｋ５−Ｋ７）を認識するが、
１−反復分子（Ｋ１３〜Ｋ１５）は認識しない。レーン
７および８は対照としてのｈｔａｕ４０を示す。（ｄ）
は構築体Ｋ２、Ｋ３ＭおよびＫ４のリン酸化前および後
のＳＤＳゲルである。（ｅ）ＳＭＩ３４を用いた（ｄ）
のイムノブロットで、この抗体はリン酸化されたＫ４の
みを認識する。（ｆ）ＳＭＩ３１を用いた（ｄ）のイム
ノブロットで、リン酸化されたＫ２のみを認識する。 図１８：ｈｔａｕ４０と本研究に使用した種々の変異体
の図。 図１９：タウの二量体化ならびにオリゴマー化の研究に
使用されたタウイソフォームおよび構築物の図。 （ａ）Ｔ８Ｒ１−１。５５３個のアミノ酸残基からな
り、分子量５７７４３で、ｈｔａｕ４０由来（下記参
照）。これはＮ末端近くに２つの挿入配列（それぞれ２
９個のアミノ酸からなる、斜線部分）、および４つの反
復単位（１〜４）が小さいスペーサーをはさんで繰り返
す反復領域を含む。 （ｂ）Ｔ８Ｒ−２。５１１個のアミノ酸残基よりなり、
分子量５３４５９。これはＮ末端部の挿入配列を欠く
が、重複する４つの反復単位を有する。 （ｃ）Ｔ７Ｒ−２。４８０個のアミノ酸残基よりなり、
分子量５０２１２。Ｔ８Ｒ−２に類似しているが、最初
の反復領域に第２の反復単位を持たない。 （ｄ）ｈｔａｕ４０。４４１個のアミノ酸残基よりな
り、分子量４５８５０で、ヒトタウイソフォーム６種の
うち最大のもので（Goedert et al.）、Ｎ末端部挿入配
列２つと、４つの反復単位からなる反復領域を含む。 （ｅ）ｈｔａｕ２３。３５２個のアミノ酸残基よりな
り、分子量３６７６０で、ヒトタウイソフォームのうち
最小のもので、Ｎ末端部挿入配列をもたず、反復単位の
うち３つのみを含む。 （ｆ）Ｋ１１。１５２個のアミノ酸残基よりなり、分子
量１６３２６で、４つの反復単位よりなる反復領域に短
い尾がついたもの。（ｇ）Ｋ１２。１２１個のアミノ酸
残基よりなり、分子量１３０７９で、３つの 反復単位よりなる反復領域に短い尾がついたもの。 図２０：タウ構築体および架橋生成物のＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動（４−２０％）ならびにゲルクロマ
トグラフィー。ゲルａおよびｃは還元条件下で走らせ
（サンプル緩衝液中3mM DTT)、ゲルｂは非還元条件下で
走らせた（だたしレーン１のみはサンプル緩衝液中に3m
M DTT 含有）。 （ａ）構築体Ｔ８Ｒ−１，ｈｔａｕ２３、およびＫ１
２。分子量マーカーを左側に示す。 （ｂ）構築体Ｋ１２および架橋生成物。架橋はＤＴＴの
不在下で自然に起こる。これはＤＴＴで防止するか、ま
たはＰＤＭあるいはＭＢＳを加えて誘導することができ
る。凝集産物は右側に明示してある（単量体、二量体、
三量体、四量体、等）。 （ｃ）ＰＤＭで架橋したＫ１２をスーパーローズ(Super
ose)１２でゲル瀘過し、銀染色したＳＤＳゲル。二量体
（一番上のバンド）は単量体の前に溶出する。画分１６
および１７は電子顕微鏡検査に使用した。 （ｄ）ＰＤＭで架橋した構築体Ｋ１２の単量体および二
量体の、Superose12ゲル瀘過の溶出プロフィール。標準
タンパク質の溶出位置は、有効水和ストークス半径に対
して対数目盛りでプロットしてある（縦軸）。 （ｅ）構築体Ｋ１２の円二色性スペクトル（40mM HEPE
S，ｐＨ７．２中８ｍｇ／ｍｌ、行路長０．０１ｍ
ｍ）。重要なαヘリックス構造またはβシート構造は見
られない。他の構築体および全長タウからも同様なスペ
クトルが得られる。 図２１：構築体Ｋ１２から合成した対らせん状フィラメ
ント。 （ａ）Ｋ１２から合成したＰＨＦのもつれ（約７０−７
５ｎｍの交差周期（period）を矢印で示してある）。こ
の構築体は前に記述した方法によって発現させ、精製し
た（Steiner et al.）。それを０．５Ｍ トリス−塩酸
で、ｐＨ５．０〜５．５の間で透析した。その溶液を２
％酢酸ウラニルでネガティブ染色した。 （ｂ）および（ｃ）構築体Ｋ１２から合成した対らせん
状フィラメントの単繊維。交差反復（矢印）および長さ
約１００ｎｍの棒状の粒子（ｃの中央部）に注意された
い。横線＝１００ｎｍ。 図２２：ＰＤＭで架橋したＫ１２二量体から合成し、１
％リンタングステン酸でネガティブ染色した対らせん状
フィラメント（顕微鏡写真はM. Knielより提供され
た）。横線＝１００ｎｍ。 図２３：アルツハイマー患者脳の対らせん状フィラメン
ト（顕微鏡写真はDr. Lichtenberg-Kraag より提供され
た）。（ａ）Wischik らに従って調製し、１％リンタン
グステン酸で染色した、神経原繊維もつれ由来のＰＨ
Ｆ。この調製物は、まだプロナーゼ感受性ファッジーコ
ートを保持している均一な長いフィラメントを含有す
る。交差反復は７５〜８０ｎｍで、幅は最小約１０ｎｍ
から最大２２ｎｍまで変動する。 （ｂ）Greenberg およびDavis に従って調製したＰＨ
Ｆ。この調製物は上記（ａ）よりも長さの短い可溶性フ
ィラメントとなり、またより不均質である。（１）は反
復が７２ｎｍ，幅が８〜１８ｎｍまで変動する対らせん
状フィラメントである。（２）は幅８ｎｍの直線フィラ
メントである。（３）は特に大きい直径（２５ｎｍま
で）をもつねじれたフィラメントである。（４）は大き
い直径（１８ｎｍ）をもつ直線フィラメントである。
（５）は長さが約１交差周期に等しい約８０ｎｍであ
る、ねじれた棒状粒子である。多くの場合、粒子はフィ
ラメントが途中で切れたもののようである。例えば、
（４）で印を付けた２本の棒、（３）のねじれたフィラ
メント及びその右の短い切株状のもの、または粒子の上
の２本の真っ直ぐな棒（３）がそうである。横線＝１０
０ｎｍ。 図２４：グリセロール吹き付け及び金属影つけによって
調製したタウイソフォームｈｔａｕ２３および構築体Ｔ
８Ｒ−１の電子顕微鏡写真。 （ａ）ｈｔａｕ２３の単量体、（ｂ）ｈｔａｕ２３の二
量体、（ｃ）Ｔ８Ｒ−１の単量体、（ｄ）Ｔ８Ｒ−１を
折りたたんだ形態（ヘアピン型の折り目が分子内の逆平
行会合を示している）、（ｅ）Ｔ８Ｒ−１の二量体。長
さについては、表１及び図２５参照。説明図を右側に示
した。横棒＝５０ｎｍ。 図２５：タウ構築体および二量体の長さを示す棒グラ
フ。 図２６：構築体Ｋ１１およびＫ１２の電子顕微鏡写真。 （ａ）Ｋ１１の単量体、（ｂ）Ｋ１１の二量体、（ｃ）
２個の二量体の縦会合によって形成されるＫ１１の四量
体、（ｄ）Ｋ１２の単量体、（ｅ）Ｋ１２の二量体、
（ｆ）Ｋ１２の四量体。横棒＝５０ｎｍ。 図２７：（ａ）ＰＤＭで架橋したＫ１２二量体（例えば
Ｃｙｓ３２２からＣｙｓ３２２へ）； （ｂ）ＭＢＳで架橋したＫ１２単量体（例えばＣｙｓ３
２２から近くのＬｙｓへ）。横棒＝５０ｎｍ。 図２８：ｈｔａｕ２３，Ｋ１２およびこれらの架橋生成
物の抗体標識。 （ａ）ｈｔａｕ２３の二量体で抗体を片方の端にもつも
の（左側の写真）、および抗体を両端にもち（右側の写
真）ｈｔａｕ２３の逆平行二量体化を示しているもの； （ｂ）Ｋ１２の二量体で抗体を片方の端にもつもの（左
側の写真）、両端にもつもの（中央の写真）、および自
由端に抗体をもち（右側の写真）このタイプの会合が抗
原決定基をブロックすることを示しているＫ１２の四量
体と推定されるもの； （ｃ）ＰＤＭで架橋したＫ１２の二量体で、抗体を片方
の端にもつもの（左側の写真）、両端にもつもの（中央
の写真）、および四量体で自由端に抗体をもつの（右側
の写真）； （ｄ）ＭＢＳで架橋したＫ１２の二量体で、抗体を片方
の端にもつもの（左側の写真）、両端にもつもの（中央
の写真）、および四量体で自由端に抗体をもつもの（右
側の写真）。横棒＝５０ｎｍ。 図２９：ｈｔａｕ４０のＧＳＫ３によるリン酸化の経
過、ならびに免疫応答。 （１）キナーゼと共に０〜２４時間３７℃でインキュベ
ートした後のｈｔａｕ４０のＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動。レーン１のマイナーな低い方のバンドは
断片である。脳抽出物およびＭＡＰキナーゼの影響に類
似した、より高いＭr への漸進的シフトに注意された
い。 （２）オートラジオグフィー。 （３）約２時間後（Ｓ１９９とＳ２０２のリン酸化後）
には反応性がなくなる抗体ＴＡＵ１を用いたイムノブロ
ット。 （５）ＳＭＩ３４（コンホメーション感受性およびリン
酸化セリンに反応する）を用いたイムノブロット。 （６）ＳＭＩ３１（抗原決定基はリン酸化Ｓ３９６およ
びＳ４０４を含む）を用いたイムノブロット。 （７）脱リン酸化Ｓ２３５を要求する抗体ＳＭＩ３３を
用いたイムノブロット。ＭＡＰキナーゼまたは脳抽出物
によるリン酸化に関して幾分かの相違がある。ＳＭＩ３
３の染色は長時間持続し、Ｓｅｒ２３５がＧＳＫ３によ
って緩慢にしかリン酸化されないことを示している。Ｓ
ＭＩ３１の染色は、ＡＴ８またはＳＭＩ３４のそれの前
に、非常に迅速に出現し、Ｓ３９６およびＳ４０４はＧ
ＳＫ３の最も早期の標的に入っていることを示してい
る。 図３０：ＧＳＫ３を用いたリン酸化による移動度シフ
ト：ｈｔａｕ２３とその変異体／Ａ４０４の比較。上の
図はＳＤＳゲルで、下の図はオートラジオグラフィーで
ある。レーン１〜３は、それぞれ未リン酸化、２時間リ
ン酸化および２０時間リン酸化のｈｔａｕ２３である。
明瞭な変化とリン酸の明白な取り込みに注意されたい。
レーン４〜６は、それぞれ未リン酸化、２時間リン酸化
および２０時間リン酸化の変異体Ｓｅｒ４０４−Ａｌａ
である。２時間後のシフトはｈｔａｕ２３のそれよりは
るかに小さく、リン酸化の度合いははるかに低い。これ
は最初の強烈なシフトとリン酸化が、ＭＡＰキナーゼお
よび脳抽出物のキナーゼ活性を用いる場合と同様、Ｓｅ
ｒ４０４で起こることを示している。 図３１：タウ構築物の図。上の図は、ｈｔａｕ２３の誘
導体ですべてのＳｅｒ−ＰｒｏまたはＴｈｒ−Ｐｒｏモ
チーフをＡｌａ−Ｐｒｏに変えたＡＰ１７を示す。真中
の図は、Ｓｅｒ−ＰｒｏモチーフのみをＡｌａ−Ｐｒｏ
に変えたＡＰ１１を示す。下の図は、タウの４個の反復
単位のみからなるＫ１８を示す（ｈｔａｕ４０から誘
導）。 図３２：ＭＡＰキナーゼおよびＧＳＫ３とブタ脳微小管
との共重合。（ａ）微小管精製段階のＳＤＳゲル。Ｅｘ
＝脳抽出物、最初のコールドスピンを行なった後の上
清。Ｓ＝最初のホットスピンの上清。チューブリンとＭ
ＡＰは３７℃に加熱した後は微小管に組み入れられな
い。Ｐ＝再溶解した微小管のペレット。他のレーン
（Ｓ，Ｐ）は、温度変化によるアッセンブリーとディア
ッセンブリーの更なる２周期を示す（最後の微小管ペレ
ットは濃縮した）。（ｂ）抗ＭＡＰキナーゼを用いたイ
ムノブロットで、主にｐ４２イソフォームと、ｐ４４イ
ソフォームのいくつかを示している。（ｃ）抗ＧＳＫＢ
３βを用いたイムノブロット；この抗体はＧＳＫＢ３α
と交差反応を示すことに注意されたい。（ｄ）抗ＧＳＫ
Ｂ３αを用いたイムノブロット。これらのブロットは、
両方のキナーゼおよびそれらのイソフォームが微小管ア
ッセンブリーの周期を重ねるにつれて共に精製されるこ
とを示している。 図３３：（ａ）正常な脳抽出物およびアルツハイマー脳
抽出物におけるＧＳＫ３αおよびβの同定。Ｍ＝マーカ
ー、レーン１は正常な脳抽出物のＳＤＳゲル、レーン２
は抗ＧＳＫ３αを用いたイムノブロット、レーン３は抗
ＧＳＫ３β（αに対し幾分交差反応性あり）を用いたイ
ムノブロット。レーン４および５はアルツハイマー脳抽
出物による同じイムノブロット。 図３４：ｈｔａｕ２３の微小管（２０μＭタキソールの
存在下で１０μＭチューブリンより作製した）への結合
曲線。一番上の曲線（四角印）は未リン酸化ｈｔａｕ２
３を示す。真中の曲線（丸印）はＧＳＫ３でリン酸化し
たｈｔａｕ２３で、修飾されていないタウタンパク質に
匹敵する化学量論を示している（チューブリン二量体１
個あたり０．６個を飽和）。下の曲線（三角印）は、脳
キナーゼ活性によりリン酸化された対照ｈｔａｕ２３
で、化学量論の顕著な低下を示している。実線は、別々
の結合部位を想定して最善に調整した曲線を示す。 図３５：（ａ）この発明に使用したｈｔａｕ２３とその
点変異体の図。（ｂ）ｈｔａｕ２３とその点変異体の、
未リン酸化状態および脳抽出物によりリン酸化された状
態での、微小管への結合曲線。一番上の曲線と一番下の
曲線はそれぞれ野生型ｈｔａｕ２３の未リン酸化のもの
とリン酸化されたものを示し、他の曲線はすべてリン酸
化後のタンパク質を示す。変異体は（上から順に）、Ｓ
ｅｒ２６２−Ａｌａ，Ｓｅｒ２３５−Ａｓｐ／Ｓｅｒ３
９６−Ａｓｐ、Ｓｅｒ４０４−Ａｌａ，Ｓｅｒ２０２−
Ａｌａである。Ｓｅｒ２６２の変異は、タウ−微小管相
互作用のリン酸化に対する感受性をほとんど排除する。
これらの曲線は、定量的ＳＤＳゲルから濃度計によって
誘導した（実施例６参照）。重合したチューブリンは３
０μＭである。それぞれの化学量論ｎ（＝タウ／チュー
ブリン二量体）および結合定数Ｋd （μＭ）は：野生型
ｈｔａｕ２３未リン酸化（ｎ＝０．４９，Ｋd＝２．
５）；Ａ２６２リン酸化（ｎ＝０．４５，Ｋd ＝５．
３）；Ｄ２３５／Ｄ３９６リン酸化（ｎ＝０．３２，Ｋ
d ＝７．４）；Ａ４０４リン酸化（ｎ＝０．３２，Ｋd
＝９．３）；Ａ２０２リン酸化（ｎ＝０．３１，Ｋd ＝
９．４）；野生型ｈｔａｕ２３リン酸化（ｎ＝０．１
６，Ｋd ＝４．９）。 図３６：ｈｔａｕ４０の微小管への結合曲線。一番上の
曲線は未リン酸化ｈｔａｕ４０（三角印）、真中の曲線
はＭＡＰキナーゼによりリン酸化されたｈｔａｕ４０
（丸印）、一番下の曲線は脳抽出物によりリン酸化され
たｈｔａｕ４０（四角印）を示す。それぞれの解離定数
Ｋd および化学量論は図に示す通りである。 図３７：（ａ）全変異体ＡＰ１８の図。すべてのＳｅｒ
−ＰｒｏおよびＴｈｒ−ＰｒｏをＡｌａ−Ｐｒｏに置き
換えた。更にＳｅｒ２６２および３５６をＡｌａに変異
させた。変異体ＡＰ１７では、Ｓｅｒ２６２および３５
６は変化しないで残っている。 （ｂ）ｈｔａｕ２３ならびに「全」変異体ＡＰ１７およ
びＡＰ１８の、脳抽出物によってリン酸化されていな
い、またはされた状態での、微小管への結合曲線。一番
上の曲線は未リン酸化ｈｔａｕ２３（黒三角）を、真中
の曲線はリン酸化ＡＰ１８（丸印）を、下部の２本の曲
線はリン酸化ＡＰ１７（白抜き四角）およびｈｔａｕ２
３（白抜き三角）を表す。ＡＰ１７とＡＰ１８の挙動の
違いは、ＡＰ１７におけるＳｅｒ２６２のリン酸化によ
るものである。それぞれの化学量論および結合定数は：
野生型ｈｔａｕ２３、未リン酸化（ｎ＝０．４９，Ｋd
＝２．５）；ＡＰ１８リン酸化（ｎ＝０．４８，Ｋd ＝
６．１）；ＡＰ１７リン酸化（ｎ＝０．１８，Ｋd ＝
６．６）；野生型ｈｔａｕ２３リン酸化（ｎ＝０．１
６，Ｋd ＝４．９）。 図３８：クロマトグラフ法によるブタ脳由来キナーゼの
調製。 （ａ）モノ（Mono)Q HR 10/10 FPLC。組換え体ｈｔａｕ
３４および構築体ＡＰ１７のリン酸化は、縦軸にタウ１
モルあたりに取り込まれたリン酸のモル数として示して
ある。タウの微小管への結合を低下させる画分は、画分
１２、２０および３０のあたりで溶出し、画分２０から
３０の間のピークが最も効力がある。（ｂ）Mono Qカラ
ムから溶出した画分２８〜３２をスーパーデックス（Su
perdex)G-75 ハイロード(HiLoad)16/60 カラムでゲル瀘
過した。カラムは黒い四角印が示すように、標準タンパ
ク質によって校正した：リボヌクレアーゼ、１４ｋＤａ
ｌ；キモトリプシノーゲンＡ、２５ｋＤａｌ；オボアル
ブミン、４３ｋＤａｌ；ウシ血清アルブミン、６７ｋＤ
ａｌ。分子量は右縦軸に対数目盛りで示してある。ｈｔ
ａｕ３４および構築体Ｋ１８のリン酸化は左縦軸に示
す。最高の活性は分子量約３５ｋＤａｌで溶出する。
（ｃ）ゲル瀘過カラムからの画分１７〜２３をプール
し、再度Mono Q HR 5/5 カラムによるクロマトグラフィ
ーにかけた。画分１０は結合試験に使用した。（ｄ）主
要精製段階を示すＳＤＳゲル。Ｍはマーカーたんぱく
質、レーン１は全脳抽出物、レーン２はMono Q HR 10/1
0 FPLCの画分３０、レーン３はSuperdexゲル瀘過の画分
２２、レーン４〜５はMono Q HR 5/5 FPLCの画分１０お
よび９を表す。レーン５は、精製された３５ｋＤａｌバ
ンドと４１ｋＤａｌの痕跡を示す。 図３９：キナーゼ活性のＳＤＳゲルおよびゲル内アッセ
イ（詳細は実施例１１参照）。（ａ）Ｍｏｎｏ Ｑカラ
ムによる２回目のクロマトグラフィー（図３８ｃ参照）
の画分９〜１１（レーン１〜３）を７〜１５％シルバー
で染色したＳＤＳゲル。（ｂ）ゲル内実験のオートラジ
オグラム。タウ構築体Ｋ９（タウの４個の反復単位プラ
スＣ末端尾からなる）をゲルに入れ、そこに画分９〜１
１よりそれぞれ５μｌの試料を加えた（レーン１〜
３）。（ｃ）対照ゲルのオートラジオグラム。このゲル
はタウ蛋白質を全く含まず、Mono Q画分の自己リン酸化
は全く見られない。再生したタンパク質はゲル外へ拡散
する傾向があるので、これらのゲルから特定のキナーゼ
活性の量を計ることは難しいことに注意されたい。３５
ｋＤａｌのバンドについては特にそうである。 図４０：３５ｋＤａｌキナーゼによるタウのリン酸化が
ゲル変化ならびに微小管結合に及ぼす影響。 （ａ）数個のキナーゼによってリン酸化されたｈｔａｕ
２３および構築体のＳＤＳゲル。Ｍはマーカータンパク
質。レーン１および２は、それぞれ３５ｋＤａｌキナー
ゼによってリン酸化されていないｈｔａｕ２３とリン酸
化されたそれを表す。レーン３および４は点変異体ｈｔ
ａｕ２３（Ｓｅｒ４０９−Ａｌａ）を用いた同じ実験を
表す（変化なし）。レーン５および６は点変異体ｈｔａ
ｕ２３（Ｓｅｒ４１６−Ａｌａ）を表す（タンパク質の
一部のみがリン酸化されているが、その他はレーン２の
変化と同じ）。レーン７および８は点変異体ｈｔａｕ２
３（Ｓｅｒ４０４−Ａｌａ）を表す（レーン２および６
と同じ変化）。変異体は３５ｋＤａｌキナーゼがＳｅｒ
４０９をリン酸化することによって変化を引き起こすこ
とを示している。Ｓｅｒ４０４はＭＡＰキナーゼの標的
で、Ｓｅｒ４１６はＣａＭキナーゼの（Steiner et al.
同頁）、Ｓｅｒ４０９とＳｅｒ４１６はＰＫＡの標的
で、それらの各々はシフトを引き起こすことに注意され
たい。レーン９〜１１は、異なるキナーゼ（ＣａＭキナ
ーゼ、ＰＫＡおよびＭＡＰキナーゼ）によってｈｔａｕ
２３に引き起こされた変化を示す。ＰＫＡによって引き
起こされた変化（レーン１０）は、３５ｋＤａｌキナー
ゼによるそれと全く同じである。また、ＭＡＰキナーゼ
はそれらより遥かに大きく最大の、タウのアルツハイマ
ー様状態に典型的なシフトをもたらす。右側の横線は変
化のレベルを示す。下から上に向かって、未リン酸化ｈ
ｔａｕ２３（対照）、ＣａＭキナーゼシフトレベル、Ｐ
ＫＡシフトレベル、ＭＡＰキナーゼシフトレベルであ
る。すべてのシフト部位はＣ末端の近くである。 （ｂ）ｈｔａｕ２３および変異体Ｓｅｒ２６２−Ａｌａ
の、３５ｋＤａｌキナーゼによってリン酸化されていな
い状態またはリン酸化された状態での（Mono Q画分１
０、２０時間）、微小管への結合曲線。上の曲線は未リ
ン酸化ｈｔａｕ２３（白抜き丸、ｎ＝０．４９，Ｋd ＝
２．５μＭ）；真中の曲線はリン酸化された変異体（四
角印、ｎ＝０．４４，Ｋd ＝１１．６μＭ）；下の曲線
はリン酸化されたｈｔａｕ２３（黒丸、ｎ＝０．２１，
Ｋd ＝８．８μＭ）を表す。Ｓｅｒ２６２が存在しない
と化学量論の減少は０．０５であり、Ｓｅｒ２６２がリ
ン酸化されているとその減少は０．２８である。 図４１：ｈｔａｕ４０の図で、微小管と結合する第１反
復単位および微小管結合に重要なＳｅｒ２６２を目立た
せてある。 図４２：１．32Ｐで標識したｈｔａｕ４０（「ｈｔ４０
32Ｐ」）の異なるＰＰａｓｅｓを用いた脱リン酸化。７
〜１５％ＳＤＳ勾配ゲルのオートラジオグラ。 図１：７〜１５％ ＳＤＳ勾配ゲルのオートラジオグ
ラ。 Ａ．ＰＰ２ａ Ｈ−イソフォーム（10μg/ml)による
脱リン酸化 レーン１：脱リン酸化前のｈｔ４０Ｐ レーン２：１０分脱リン酸化 レーン３：３０分脱リン酸化 レーン４：１２０分脱リン酸化 Ｂ．ＰＰ２ａ Ｍ−イソフォーム（10μg/ml)による
脱リン酸化 レーン１−４：上記Ａ参照。 Ｃ．ＰＰ２ａ Ｌ−イソフォーム（10μg/ml)による
脱リン酸化 レーン１−４：上記Ａ参照。 Ｄ．ＰＰ１の触媒サブユニット（５００Ｕ／ｍｌ）に
よる脱リン酸化 レーン１−４：上記Ａ参照。 図４３：２．ＰＰ２ａ−Ｈによる脱リン酸化：リン酸化
依存性抗体の抗原決定基の消失。
【００８４】Ａ．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動（７−１５％） レーン１：脱リン酸化前のｈｔ４０Ｐ レーン２：１０分脱リン酸化 レーン３：３０分脱リン酸化 レーン４：１２０分脱リン酸化 レーン５：５時間脱リン酸化 レーン６：１６時間脱リン酸化 Ｂ．オートラジオグラ Ｃ．ＡＴ８によるイムノブロット Ｄ．Ｔａｕ−１Ａによるイムノブロット Ｅ．ＳＭＩ−３３によるイムノブロット 図４４：ＰＰ２ａ−Ｈによる脱リン酸化の速度論 ａ．異なる濃度のＰＰ２ａを用いたｈｔ４０Ｐの脱リン
酸化の経時変化 ｂ．ｈｔ４０Ｐ濃度の変動：ミカエリス・メンテン(Mic
haelis-Menten)の図 図４５：タウタンパク質の２個のＩＧＳモチーフおよび
２個のＣＧＳモチーフ（セリン２６２、２９３、３２
４、３５６）をリン酸化する７０ｋＤａｌキナーゼの調
製。このキナーゼはタウの微小管への親和性を激しく減
少させる。 （ａ）エス−セファロース(S-Sepharose）を用いたクロ
マトグラフィー。キナーゼ活性は２５０ｍＭＮａＣｌで
溶出する。 （ｂ）ヘパリンアガロースを用いたクロマトグラフィ
ー。キナーゼ活性は２５０ｍＭＮａＣｌで溶出する。 （ｃ）スーパーデックス(Superdex)Ｇ−７５によるゲル
瀘過。キナーゼ活性は７０ｋＤａｌで溶出する。 図４６：ｃｄｋ２／サイクリンＡによるｈｔａｕ４０の
リン酸化の経時変化。レーン１〜９はそれぞれ０、１
０、３０、９０分、３、６、１０、２４時間、および０
分に対応する（０分のレーンは対照である）。 （ａ）リン酸化によるタンパク質の変化を示すＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動。 （ｂ）リン酸取り込みの増加を示すオートラジオグラ
ム。 （ｃ）未リン酸化Ｓｅｒ１９９およびＳｅｒ２０２のみ
を認識するＴＡＵ−１抗体を用いたイムノブロット。 （ｄ）アルツハイマータウのほかに、リン酸化された上
記のセリン２個も認識するＡＴ８抗体を用いたイムノブ
ロット。
【００８５】
【実施例】実施例１ タウタンパクの調製正常な脳からのタウの調製 ：ヒト、ウシ、またはブタの
脳からのタウの調製、脱リン酸化および再リン酸化は基
本的にMagestedt et al., J. Cell. Biol. 109(1989),
1643-1651 によった。アルツハイマー脳からのタウの調製 ：神経病理学的にア
ルツハイマー病であることが確認されたヒトの脳の組織
はさまざまな供給源から得られた。剖検は死後１時間か
ら25時間の間に行われた。脳組織は−70℃で保存した。
ＰＨＦからのタウはGreenberg & Davies, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87(1990), 5827-5821の方法に従って調
製した。実施例２ ブタ脳抽出液のタウリン酸化活性（プロテイ
ンキナーゼ) の性質と部分的精製 ブタの脳抽出液の上清を硫安沈澱によって分画した。キ
ナーゼ活性の主画分は40％飽和で沈澱した。この分画を
ゲルろ過によって脱塩し、５倍に希釈し活性化緩衝液(2
5mM トリス、2mM EGTA、２mM DTT、40mM p−ニトロフェ
ニルホスフェート、10μM オカダ酸、２mM MgATP、プロ
テアーゼ阻害剤) 中、37℃で２時間インキュベートし
た。このインキュベーション中、抗ホスホチロシンｍＡ
ｂを用いたウェスタンブロットによって示されるよう
に、44kDタンパクのチロシン残基のリン酸化が生ずる。
この44kDタンパクは第２ｍＡｂを用いてＭＡＰ２キナー
ゼであることが同定された。
【００８６】この粗酵素活性をさらにイオン交換クロマ
トグラフィー (Mono Q FPLC 、Pharmacia)で精製した。
ウェスタンブロットで示される活性化ＭＡＰキナーゼを
含む画分は、最も顕著なタウリン酸化活性をもつ（ピー
クＩ) 。２番目のタウリン酸化活性（ピークII) は同様
のＳＤＳ−ゲルシフトおよびタウのアルツハイマー特異
的抗体反応性をもたらさない。実施例３ アルツハイマータウタンパク特異的エピトー
プを決定するための組換えタウポリペプチドをコードす
る遺伝子をもったプラスドの構築タウ構築物のクローニングと発現 ：プラスミドの調製と
クローニングはSambrooket al. (Molecular Clonig Lab
oratory Handbook, 2nd edition, Cold SpringHarbor L
aboratory, Cold Spring Habor, 1989) に従って行っ
た。ポリメラーゼ連鎖反応 (RCR, Saiki et al., Scien
ce 239(1988), 487-491)による増幅は、メーカー (Perk
in Elmer Cetus) 指定の方法で、Taq ポリメラーゼを用
いておこなった。タウ遺伝子とその構築物はｐＥＴ−３
ｂ (Rosenberg et al., Gene 56(1987), 125-135) をタ
ウ遺伝子の操作に便利なように、 PstＩ、HindIII、 Nh
eＩおよびEcoRＶ制限部位を除去して改変した誘導体で
ある、発現ベクターpNG2を用いて発現させた。発現のた
めにはＢＬ21（ＤＥ３) E.coli系 (Studier et al.,Met
h. Enzym. 185(1990) 60-89) を用いた。大部分の構築
物は、 352残基とＣ末端の微小管結合領域 (Goedert et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988),4051-405
5) の３つの内部反復をもつ、ヒトのイソフォームｈtau
23から出発して得たものである。ここで用いられてい
る残基番号は、ヒトのイソフォーム中で最大 (441 残
基、Goedert et al., 同上) のｈtau 40の配列によって
いる。種々のコンストラクトの分離にはタンパクの熱安
定性が用いられた。これらはHagestedt et al., J. Cel
l. Biol. 109(1989), 1643-1651 によって述べられた方
法に従って FPLC Mono S (Pharmacia)クロマトグラフィ
ーによって分離した。Ｋ10 ：これは 168残基（第２反復単位のＶ275-Ｓ305 を
欠く、Ｑ244-Ｌ441 と開始メチオニン) より成る、ｈta
u 23イソフォームのカルボキシ末端部分をもつ。Ｋ10タ
ウカセットはpNG2／ｈtau 23ベクター中、 NdeＩ-PstＩ
断片を欠失させ、これを化学合成したヘキサマー、5'Ｔ
ＡＴＧＣＡ3'によって置き換えることによってつくりだ
された。再連結反応後、 NdeＩエンドヌクレアーゼサイ
トは元の配列に戻るが PstＩサイトは損傷をうける。コ
ンストラクトＫ11およびＫ12はｈtau 23およびｈtau 24
遺伝子から得られた断片の組合せによって作られた。Ｋ
11は４つの反復単位および 152アミノ酸 (Ｑ244-Ｙ394
と開始メチオニン) よりなるタウ誘導体である。Ｋ12は
３つの反復単位と 121アミノ酸 (ｈtau の残基番号で第
２反復単位Ｖ275-Ｓ305 を欠く、Ｑ244-Ｙ394 と開始メ
チオニン) よりなる tau誘導体である。h tau 23および
ｈtau 40はそれぞれ 352および 441アミノ酸より成るヒ
トtau イソフォームである（８）。Ｋ17 ：Ｋ17 tauカセット(145残基) はＫ16の短かい誘導
体である。これは２段階でつくられた。最初のＫ16はヒ
トｈtau 24遺伝子を操作するためにＰＣＲを用いて構築
された。増幅した断片の両端への5'制限サイトの“add
on (付加) ”を行い、ＰＣＲ産物のクローニングベクタ
ーへの挿入の便を計った。開始プライマー(ＪＢ50) は
ＧＧＣＧ (“Ｇ／Ｃクランプ”) という配列、 NdeＩヌ
クレアーゼの認識サイトＣＡＴＡＴＧ（ユニバーサルＡ
ＴＧ開始コドンを含む) をもち、これにアミノ酸Ｓ198-
Ｔ205 の情報コードが続いている。終止プライマー（Ｊ
Ｂ51) は“Ｇ／Ｃクランプ”およびBamHIの認識配列Ｇ
ＧＡＴＣＣをもち、これに終止アンチコドンとＣ末端ア
ミノ酸Ｐ364-Ｅ372 に対するアンチコーディング配列が
続いている。Ｋ16 tauカセットは、ｈtau 40 (Ｓ198-Ｅ
372)からの 175残基と開始メチオニンとの 176残基より
成る。この断片はＳ198 と、Ｅ372 で終わる４反復単位
の配列があとにつづく最初の反復単位のはじめの残基と
の間の46残基より成る、アセンブリードメインの一部を
あらわしている。第２段階として、新らしく作られたta
u Ｋ16カセットからのBstXI-BstXI 断片と、３つだけの
反復単位を含むｈtau 23遺伝子から得られた、同様のBs
tXI-BstXI 断片とを交換し、新らしいタウカセットＫ17
が得られる。このようにしてＫ17は、第２のタウ反復単
位を欠いているがＫ16と同様のプロジェクション(proje
ction)ドメインを有する。Ｋ３Ｍ(355残基) はウシのTa
u 4(プラスミドpETNde 43-12由来、Himmler et al., Mo
l. Cell. Biol. 9(1989), 1381-1388)からのアミノ末端
の 145残基と、ヒトｈtau 23 (プラスミドpUC18/ｈtau
23由来、Goedert et al., 1988, 前掲) からのカルボキ
シ側の190残基からできたキメラである。この分子は３
つの反復単位と、それぞれ29残基より成る２つのアミノ
末端挿入部をもっている。Ｋ３ＭはpETNde 42-12から X
maＩ-BclＩ切断を切り出し、これをｈtau 23遺伝子に由
来する同様の XmaＩ-BclＩ断片で置き換えることによっ
てつくられた。この操作によって64残基 (b Tau 4 の X
maＩ-XmaＩ断片) が除かれ、カルボキシル末端の３反復
単位が４反復単位で置き換えられた。Ｋ19はｈtau 23の
３反復単位を含み、99残基より成る (反復単位２を欠く
Ｑ244-Ｅ372 プラス開始メチオニン) 。Ｋ19分子はＫ17
を用い、 144塩基の長さの NdeＩ-PstＩ断片を合成ヘキ
サマー5'ＴＡＴＧＣＡ3'で置き換えることによってつく
った。この改変によって分子の先頭の NdeＩサイトは無
傷で残され、 PstＩサイトは除かれる。ｈtau 23のＤ−変異体の構築 ：ｈtau 23においてＳ199
とＳ202 をＤで置き換えるために、アミノ酸Ｇ164-Ｐ21
9 をコードする二重鎖ＤＮＡカセットをデザインした。
このＤＮＡ断片は８オリゴヌクレオチド (長さ30−60ヌ
クレオチド) から組立てられ、 SfiＩおよび XmaＩ粘着
末端をもつ。組立てられたカセットを、もとから存在す
る SfiＩ-XmaＩ断片を除去し、直線化した pNG2/ｈtau
23ベクターに挿入することによって必要とする遺伝子が
得られる。ｈtau 23/Ａ404 の構築 ：ｈtau 23/Ａ404 は、セリンリ
ン酸化サイトを除くためにSer404がAla に置き換えられ
た変異ｈtau 23分子である。ｈtau 23遺伝子の操作上の
便宜のために、人工的な NcoＩ制限サイトを1161位 (ｈ
tau 40の番号づけ) に導入した。この変異はＰＣＲ−Ｓ
ＯＥ (オーバーラップ エクステンション(overlap ext
ension)によるスプライシング、Higuchi et al., Nucl.
Acids. Res. 16(1988) 7351-7367) を用いて導入し
た。新らしい NcoＩサイトはタウタンパクのアミノ酸配
列に影響しない。 404位へのAla の導入は、 NcoＩと N
heＩ制限サイトの間の120bp ＤＮＡ断片をもつ合成ＤＮ
Ａカセットを用いた。このＤＮＡ断片は４オリゴヌクレ
オチド (54から66ヌクレオチドの長さ) から組立てら
れ、 NcoＩおよび NheＩ粘着末端をもつ。組立てられた
カセットを、もともと存在していた NcoＩ-NheＩ断片を
除いた、直線化した pNG2/ｈtau 23/NcoＩベクターに挿
入するとｈtau 23/Ａ404 遺伝子が得られる。Ｋ２(204
残基) はウシ Tau４のアミノ末端からの36残基とｈtau
23のカルボキシル側の 168残基より成るキメラであり、
３つの反復単位をもつ。Ｋ４−Ｋ７はただ２つだけの反
復単位をもつｈtau 23の欠失変異体であり、Ｋ４は反復
単位No.１および３ (Ｄ345-Ａ426 の切り出された 270
残基) をもち、Ｋ５は反復単位No.１および３ (Ｄ345-
Ｔ386 の切り出された 310残基) をもち、Ｋ６は反復単
位No.３および４ (Ｔ245-Ｋ275 の切り出された 322残
基) をもち、Ｋ７は反復単位No.１および４ (Ｖ306-Ｑ3
36 の切り出された 321残基) をもつ。反復単位No.２は
ｈtau 23には常に存在していないことに注意されたい。
Ｋ13−Ｋ15はｈtau 23の欠失変異体であり、ただ１つの
反復単位しかもたず、Ｋ13は反復単位No.４（Ｔ245-Ｑ3
36 の切り出された 291残基) をもち、Ｋ14は反復単位N
o.３ (Ｔ245-Ｓ305 およびＤ345-Ｄ387 の切り出された
279残基) をもち、Ｋ15は反復単位No.１ (Ｄ345-Ｄ387
の切り出された 278残基) をもつ。実施例４ タウタンパク中のアルツハイマー特異的エピ
トープの決定 アルツハイマー脳からのＰＨＦに対する一群の抗体を反
応性についてくわしく調べ、そのうちの一つ（ＡＴ８）
がＰＨＦタウに特異的であることがわかった。図１は抗
体ＡＴ８の異なるタウに対する反応性を示したものであ
る。アルツハイマーＰＨＦ由来のタウの場合、抗体はす
べてのイソフォームを認識する（図１ｂ、レーン１）。
正常なウシまたはヒトの脳から得たタウのイソフォーム
の混合物をテストすれば（図１ａ、レーン２−５のごと
く、リン酸化は混合状態にあることがわかっている）、
ＡＴ８抗体（図１ｂ）との反応性が検出できる。同じこ
とは、大腸菌で発現させたヒトの異なる６個体のイソフ
ォームを用いてもなりたつ（非リン酸化、図１ａおよび
１ｂ、レーン６−１１）。ＡＴ８はたしかにアルツハイ
マータウに特異的であり、とりわけこれは正常なタウに
は存在せず、ＰＨＦにのみ存在するリン酸化エピトープ
と反応することが結論される。さらに、ＡＴ８の反応
性、リン酸化、および電気泳動移動度の間には相関が存
在している。ＳＤＳゲル中で上方へのシフトを生じるア
ルツハイマー様のリン酸化の存在があるように思われ
る。
【００８７】この挙動の原因となるキナーゼと、対応す
るリン酸化のサイトを同定するために、ブタの脳の抽出
物を実施例２に述べた方法で調製した。大腸菌で発現さ
せた６つのヒトのイソフォームをホスファターゼの阻害
剤であるオカダ酸の存在下で、この活性を測る標準手法
に従ってリン酸化した。図２ａは、各々のイソフォーム
が、ゲル中での電気泳動移動度にかなり大きな変化があ
り (上方へのシフト)、ＡＴ８抗体と強い免疫反応性を
もつことを示す（図２ｂ）。これらの結果は、このキナ
ーゼによるタウのリン酸化は、アルツハイマー状態の場
合のリン酸化と類似のものであることを示している。さ
らに、すべてのイソフォームは同じような影響をうけて
いることから、リン酸化部位はすべてのイソフォームに
ついて共通の領域にある筈である。
【００８８】上記共通領域を同定するための戦略は、そ
のサイトの範囲を狭めるために、まず実施例３で述べた
ように遺伝子操作によってつくった変異体を用い、つい
で直接の塩基配列解析によって決定することである。図
３は用いたいくつかの変異体Ｋ19、Ｋ10、Ｋ17およびＫ
３Ｍ（実施例３参照）について調べたものである。Ｋ19
を除くと、これらすべての変異体はキナーゼ活性により
リン酸化され、ＳＤＳゲル中で上方へのＭシフトを示す
（図４ａ）。Ｋ19は31または32残基の３反復単位のみを
含む構築物である。これはキナーゼ活性によってリン酸
化されず、従ってＳＤＳゲル中でMrシフトを示さない
(図４ｃ) 。
【００８９】このことは、リン酸化サイトは反復領域の
外にあることを意味する。リン酸化は反復領域のどちら
側でも起り得て、ゲル中での上方シフトを誘起する。反
復単位の後側のリン酸化の方がシフトは大きい。ＡＴ８
抗体は非リン酸化型のいずれをも (期待されたように)
認識しない。リン酸化後これはコンストラクトＫ17 (図
４ｂ、レーン６) とのみ反応し、Ｋ10ともＫ３Ｍとも反
応しない（図４ｂ、レーン４および８）。言いかえれ
ば、Ｋ17はエピトープを保持しているがＫ10およびＫ３
Ｍはこれを失った。図３を参照することによって、エピ
トープは偽反復(pseudo-repeats)領域にも、これまでに
CaMキナーゼサイトが見つかっているＣ−末端尾部にも
なく (Ｋ10およびＫ19に反応性がないために) 、むしろ
Ｓ198 とＴ220 ( 図３、ペプチドＰ) の間、すなわち、
タウの“アセンブリー”ドメインのおもなキモトリプシ
ン切断サイトの後の領域( Ｙ197 のうしろ) にあるべき
であることが結論される。
【００９０】次いで、放射性標識をおこなった、内部４
反復単位をもつイソフォーム (Goedert et al., 1989,
前出) 、ｈtau 34の、トリプシンによる全消化を行っ
た。生じたペプチドはＨＰＬＣにより分離し、配列決定
をおこなった。そのうちの一つが注目する領域Ｓ195-Ｒ
209 にあった (図５) 。このペプチドはＳ199 およびＳ
202 に２つのリン酸をもっていた。ともに後に続くのは
プロリンであり、抽出物中に存在する活性ある酵素はプ
ロリン依存キナーゼであることを示唆している。
【００９１】これらの結果は、リン酸化感受性のＡＴ８
エピトープが残基200 の近傍にあるらしいことを示唆す
る。これはＳ199 およびＳ202 がともにＤに変えられた
ｈtau 22 の変異体( Ｎ末端挿入部なし、３反復単位)
をつくることによって検証した。この選択を行なったの
は、この残基でのキナーゼによるリン酸化を排除するた
めと、マイナス電荷を与えることによって、リン酸化の
状態に近い状態をつくりだす。ＳＤＳゲル上、この変異
体は高いＭへのわずかな上方シフトをみせた（図６、レ
ーン４）。イムノブロットは親タンパクｈtau 23のみが
リン酸化後に抗体と反応する (図６、レーン６) が、リ
ン酸化されていないｈtau 23 (期待されるごとく) と
も、リン酸化の有無に拘らず変異体とも反応しない (レ
ーン７, ８) ことを示している。
【００９２】ＡＴ８のエピトープはＳ199-Ｓ202 の領域
中に存在すること、およびこれがこれら２つのセリンの
リン酸化に依存していることが結論される。これらは脳
抽出物中に存在するプロリン依存キナーゼによってリン
酸化され得て、これがこのタンパクをアルツハイマー様
の状態に変える。この領域はこれまでに知られているあ
らゆる変異体タウに完全に保持されており、なぜすべて
がリン酸化および抗体に対して同じように反応するかを
説明している。実施例５ プロテインキナーゼ活性の特性決定 タウタンパクのリン酸化はつぎのように行った。タウタ
ンパク (0.5mg/ml) を２mM MgCl2、１mM DTT、5mM EGT
A、1.5mM PMSF、２mM ATP、20μg/mlプロテアーゼ阻害
剤混合物 (ペプスタチン、ロイペプチン、アルファマク
ログロブリン、アプロチニン) を含む40mMのHEPES 中、
１mMのオカダ酸の存在または非存在下で、脳の抽出物と
36℃でさまざまな時間 (24時間まで）インキュベートし
た。その後500mM のＤＴＴを加え反応液を10分間煮沸
し、15000gで15分４℃で遠心した。上清をリアセンブリ
ーバッファー (RB, 100mM Na-PIPES pH6.9、1mM EGTA、
１mM GTP、１mM MgSO4、１mM DTT) に対して透析し、結
合実験に用いた。
【００９３】放射性標識化は10mCi/ml、3000Ci/mmol の
ガンマー［32Ｐ］ＡＴＰ (NEN Dupont) を用いておこな
い、ＳＤＳゲルのオートラジオグラフィーのためには15
−30Ci/molに希釈した。タンパクへのりんのとり込みは
つぎのようにおこなった。１μg のリン酸化タンパクを
ＳＤＳ−ゲルにかけ、バンドを切り出してセレンコフモ
ードを用いてシンチレーションカウンターで計測した。
カウンターは既知の32Ｐ標品 (セレンコフモードで検出
効率約50％) によってキャリブレート (補正)した。補
正した値は、リン酸化反応に用いた放射性ＡＴＰの既知
の比活性に基づいて、１モルのタウあたりのPiのモルに
換算した。
【００９４】このキナーゼについて特記すべき点は、こ
れが３つのはっきり区別できるステージ (図７ａおよび
ｈtau 23については８ａ参照) にあるすべてのイソフォ
ームのタウのMrをシフトさせることである。リン酸化反
応の最初の２時間で、タウタンパクはMr0 ＝48kDタンパ
クからMr1 が約52kDの、よりゆっくり移動する分子種へ
変換される。この最初のステージが完了するとともに、
約６.10 時間で完了する第二のステージに入る (Mr2 ＝
54kD) 。第三のステージの完了にはおよそ24時間かかり
(Mr3 ＝56kD) 、その後はそれ以上のシフトは生じな
い。
【００９５】最初のステージが続く間、タウのタブレッ
トの各バンドはリン酸をとり込む (たとえばオカダ酸の
存在下で30分間に１分子あたり約0.５Piのレベル、図７
ｂ、レーン４参照) 。これは少なくとも２つのはっきり
区別できるリン酸化のサイトがなければならないことを
意味し、１つはシフトをひき起こす原因となり (“シフ
トサイト”、上のバンド) 、もう一つはMrに何も影響を
与えない (下のバンド) 。下のバンドは次第に消え、２
時間経つとそれぞれのタウ分子は２分子ずつのPiをも
つ。言いかえると、上のバンドは他のサイトのリン酸化
の如何にかかわらず、“シフトサイト”がリン酸化され
たタウ分子を含む一方、下のバンドはシフトサイトがリ
ン酸化されていない分子種のみを含む。オカダ酸 (Ｏ
Ａ) の効果は主に下のバンドについてのみみられ、ホス
ファターゼはおもにノンシフトサイトに働らくことを示
している。これらの考察は最初のステージのリン酸化に
あてはまる。第２ステージおよび第３ステージではさら
にシフトが生ずるが、シフトサイトおよびノンシフト部
位の詳細な分析は、バンドの位置が重なり合うために可
能ではない。全体として、各ステージでさらに２つのリ
ン酸のとり込みが生じ得、ｈtau 23については最大６、
ｈtau 34については７がとり込まれることになる。これ
らの数値はオカダ酸存在下で得られたものであり、その
非存在下では通常約１−２Piの小さな値となる。精製し
たキナーゼを用いるとこの値は12−14Piとなる。
【００９６】最初のステージで主なシフトが生ずること
から、また大きなシフトがアルツハイマータウの特徴で
あることから、最初のステージのリン酸化がアルツハイ
マー状態をひき起こすと考えられる。これはアルツハイ
マー特異抗体を用いて、標準のイムノブロット法によっ
てたしかめることができた。図８ａは上と同様のリン酸
化実験を示すものであり（すべて10μM オカダ酸存在
下）、図８ｂはアルツハイマーのもつれのリン酸化エピ
トープと反応するモノクローナル抗体ＳＭＩ34 (Sternb
erger et al.前出) を用いたイムノブロットである。こ
の抗体はキナーゼによってリン酸化された、バクテリア
で発現させたタウを認識するが、第２ステージから先だ
けである。同様の挙動は調べた他のアルツハイマー特異
抗体についてもみられた。これらの研究から得られる結
果は、主なリン酸化依存Mrシフト (ステージ１) はアル
ツハイマー様の抗体反応を生ずるシフト (ステージ２,
３)とははっきり区別できるということである。実施例６ 微小管結合実験におけるタウタンパク質 タウタンパクのリン酸化異常とアルツハイマー病との関
連について、もう一つの興味ある点は、リン酸化がタウ
の微小管に対する親和性に影響を与えるかどうかという
ことである。これは微小管結合実験によってしらべた。
すなわち、ＰＣチューブリンを37℃で1mM ＧＴＰおよび
20μM のタキソール存在下にインキュベートした。10分
後、さまざまの濃度のタウタンパクを加え、さらに10分
間インキュベートした。この懸濁液を43,000ｇで35分
間、37℃で遠心した。生じたペレットをＣＢバッファー
(50mM PIPES、pH６9 、１mM EGTA 、0.2mM MgCl2 、５
mM DTT、500mM NaCl) に再懸濁化した。ｈtau 23および
ｈtau 34の場合には、ペレットと上清は10分間煮沸し、
43,000ｇで４℃、10分間再び遠心した (この工程は、こ
れを行なわない場合にＳＤＳゲル上でタウのイソフォー
ムと重なり合ってしまうチューブリン成分をとり除く役
目を果たす) 。ペレットおよび上清 (それぞれ結合およ
び遊離タウを含む) をSDS-PAGE (７−15％アクリルアミ
ドの勾配) にかけ、クーマシーブリリアントブルーＲ25
0 で染色した。ゲルをEpson GT6000スキャナーを用い40
0dpiでスキャンし、GelScan (G. Spieker, Aachen)のプ
ログラムを用いてPC368AT で定量した。ゲル上のタンパ
ク濃度はつねに直線性の範囲 (1.5 O.D.まで) にあっ
た。光学強度は検量線を用いて濃度に変換し、結合等式
に用いた。
【００９７】
【数１】
【００９８】ここで解離定数Kdおよびダイマーあたりの
結合サイトの数ｎは数値を代入して得られた。［Mt］は
微小管へと重合化したチューブリンダイマーの濃度 (通
常30μM ) をあらわす。
【００９９】完全にリン酸化したタンパク (ステージ
３、24時間) については、２チューブリンダイマーあた
り約１タウから、６チューブリンダイマーあたり１タウ
へと、ｈtau 23の結合能力の劇的な低下がみられた。言
葉を変えれば、リン酸化していないタウは微小管上を密
にかたく覆う一方、リン酸化タウは微小管表面を、あた
かもこれがより広い拡がりをもつごとく、より疎に覆
う。図９ｃはｈtau 24を用いた同じ実験を示す。結果は
同様である。すなわち、結合能力の３倍低下がみられ
る。ｈtau 34などの４つの反復単位をもつタウのイソフ
ォームは、リン酸化されていない状態で、とくに強く微
小管に結合 (Kdおよそ１−２μM ) する。
【０１００】主なMrのシフト (実施例５参照) が最初の
２時間に生ずることから、どの残基が最初のステージで
リン酸化されるか、またどのようにそれが微小管との結
合に影響するかを見出すことは興味深い。さきに述べた
ように、この期間に約２つのリン酸がとり込まれ、その
１つがMr0 からMr1 へのシフトの原因となる。図10は90
分間のリン酸化の後のｈtau 34の結合を示したものであ
る。明らかに目につく結果は、限られたリン酸化が、十
分なリン酸化と同程度に有効に、親和性を低下させるこ
とである。これは微小管への親和性の低下がアルツハイ
マー様の免疫反応性に先行することを意味する (図８)
。
【０１０１】90分後のトリプシン分解ペプチドの分析
は、セリン202, 235, 404 および262にリン酸をもつ、
４つの放射活性のピークを示した。このうちの３つは反
復領域ではなく、この領域をほとんど対称的にはさむ位
置を占める (図11) ＳＰサイトにある。４番目 (Ｓ262)
は最初の反復単位の非ＳＰサイトにある。Ｓ396 がリン
酸化された残基ではない点はとくに注目に値する。これ
はLee et al.(1991 、前出) がさきにＰＨＦから得たタ
ウのＳ396 (XSPモチーフの中心) がリン酸化されている
ことを示している事実に照らすと意外である。したがっ
てＳ396 は、第２および第３ステージでのリン酸化の過
程で、免疫反応性の獲得と平行しつつリン酸化されるこ
とになる筈である (図８ｂ) 。
【０１０２】どのサイトが最初のMrシフトの原因となる
かを見出すために、常法にしたがって点変異を導入し
た。Ser404をAla に変えると第一ステージでのMrシフト
は失なわれるが、Ser199, 202, 235または396 が変異し
た場合にはシフトバンドの消失はない。これはSer404の
リン酸化が図７ａまたは８ａの上のバンドに存在する１
つのPiの説明となることを意味する。２時間目以降に存
在する追加のおよそ１Piは、202, 235, 404 のセリン間
に分布する。
【０１０３】タウの“シフトサイト”Ｓ404 の結果は明
確であるが、微小管結合の低下の原因となる要素はもっ
と複雑である。Ｓ404-Ａ変異体の微小管との結合は親の
ｈtau 34の場合と似ている。90分のリン酸化後の化学量
論量の低下は約２倍で、親分子についてみられる３倍よ
りも若干小さい。もしＳ404 が微小管との結合能の低下
をもたらすリン酸化の唯一の残基であるとすれば、この
変異で低下することを我々は期待しないであろう。変異
での低下がみられた事実は、他の要素もまた関与してい
ることを意味している。これらの要素はおそらく、１よ
り多いPiの、反復領域 (たとえば202, 235, 262)の前ま
たは始まりの部分にある他のサイトの１つまたはそれ以
上のサイトへの取り込みと関係しているのであろう。し
かし、これらの残基はそれ自体では親和性の完全な低下
をもたらすものとはなりえない。事実、202 または235
における点変異は404 の場合と同様の影響を示し、すな
わち結合能の部分的な低下しかもたらさない。異なるリ
ン酸化サイトは協調的に働き、新しいコンホメーション
を生みだすというのが一つの可能な説明である。実施例７ ステージ特異的抗体によって決定されるリン
酸化の経時的変化 リン酸化エピトープに対するニューロフィラメント特異
的抗体ＳＭＩ31, ＳＭＩ34, ＳＭＩ35およびＳＭＩ310
と非リン酸化エピトープに対するＳＭＩ33［Sternberge
r et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 4274
-4276 ］をタウタンパクのステージ特異的リン酸化を検
出するために用いた。ＳＭＩ33はヒトの正常な脳のタウ
を認識する (図12、レーン１) が、脱リン酸化されない
限りはＰＨＦタウを認識しない (レーン４) 。これは、
ＳＭＩ33のエピトープがアルツハイマー状態では、正常
な脳のタウでは生じていないような、ある種のリン酸化
によって特異的にブロックされていることを示唆してい
る。ＳＭＩ31およびＳＭＩ34はともに、ＳＭＩ34とは相
補的な反応をみせる。つまり、ＰＨＦタウのみが認識さ
れる (図12ｃおよび12ｄ、レーン３) が、これが脱リン
酸化された場合 (レーン４) にも、対照の正常なタウ
(レーン１) の場合にも認識されない。
【０１０４】リン酸化の時間経過に従ってさまざまな抗
体をテストすると、ＳＭＩ33がリン酸化の第二ステージ
で反応性を失なうことが示される (図７) 。
【０１０５】ＳＭＩ31抗体に対しては、非リン酸化タン
パク (０時間) または、第一ステージ間には反応性が観
察されないが、第二ステージでは反応性が徐々にあらわ
れ、第三ステージを通じて反応性が維持される。同様の
時間経過が抗体ＳＭＩ34 (図13ｃおよび図12ｄレーン３
を比較せよ) 、ＳＭＩ35、およびＳＭＩ310(図13ｇ,ｈ)
についてもみられる。比較のため、ＡＴ８ (図13ｆ)
、リン酸化感受性アルツハイマーもつれ（tangle) 抗
体 (Binder et al., J. Cell. Biol. 101(1985),1371-1
379) 、および脱リン酸化タウに対する抗体ＴＡＵ１を
用いたブロットを示した。ＡＴ８はＳＭＩ31, ＳＭＩ3
4, ＳＭＩ35およびＳＭＩ310 と同様に反応する一方、
ＴＡＵ１の反応のしかたはＳＭＩ33に似ている。ブロッ
トで著しく目につく点は、それぞれの場合に於て抗体と
の反応性を決定するのは、ステージ２のリン酸化だとい
うことである。
【０１０６】これらの実験結果は、抗体が脱リン酸化ま
たはリン酸化した形をとっているタウの同一の領域と反
応すると仮定することによって説明しうるが、この仮定
は後に示すように単純に過ぎる。他の２つの点を指摘し
なければならない。１つは最大のゲルシフト (ステージ
１) がアルツハイマー様の免疫反応性 (ステージ２で現
れる) を起こすものではないことである。すなわち、ア
ルツハイマー状態ではつねにゲルシフトを示すとはい
え、タウのすべてのゲルシフトはアルツハイマー状態の
診断的特徴とはならない。第２に、ゲルシフト、リン酸
化、およびいくつかの異なる抗体との免疫反応性の間に
は驚くほど正確な関係があることである。
【０１０７】ニューロフィラメントのおもなリン酸化モ
チーフは、Ｓがリン酸の受容体である、ＫＳＰＶのタイ
プの反復配列である (たとえばGeisler et al., FEBS L
ett,221(1987) 403-407参照) 。タウはＳ396 を中心と
してそのようなモチーフを１つもち、またＳ235 を中心
とするもう１つのＫＳＰモチーフをもつ。２つのＫＳＰ
サイトは反復領域の一方の側にあり、タウのすべてのイ
ソフォームで保持されている。類推によってこれらのサ
イトはニューロフィラメントに対してつくられたＳＭＩ
抗体との反応に関与していることが想像されるであろ
う。我々はこれを、セリンの１つまたは２つを変異させ
ること、より小さなタウのコンストラクトを作ること、
トリプシン消化ペプチドの直接の配列決定を行うことと
いう３つの方法で検証した。
【０１０８】Ｋ10, Ｋ17およびＫ19のコンストラクト
を、キナーゼによるリン酸化の前後でしらべた (図14
ａ) 。Ｋ10およびＫ17はMrシフトを示したがＫ19は示さ
なかった。本実験ではＫ10およびＫ17の高いMr型への変
換はごく一部に限られており、リン酸化の効率は良くな
かったことに注意すべきである。Ｋ10は３つのシフトし
たバンドをもち、Ｃ末端領域には３つのリン酸化サイト
があることを示す。Ｋ17のシフトバンドはただ１つであ
り、反復領域前の領域にただ１つのシフト惹起サイトし
かもたないことになる。図14ｂ−ｄはＳＭＩ33, ＳＭＩ
31およびＳＭＩ34によるイムノブロットを示す。ＳＭＩ
35およびＳＭＩ310 に対するデータはＳＭＩ31の場合と
同様である (図示せず) 。抗体ＳＭＩ33は脱リン酸化し
た状態のＫ17とのみ反応し、Ｋ10およびＫ19とは反応し
ない (図14、レーン３) 。このことは、このエピトープ
は他のコンストラクトに含まれる配列の外側で反復領域
の前方、Ｓ198 とＱ244 の領域にあることを示唆する。
これはエピトープが最初のＫＳＰにあることと一致をみ
せる。抗体ＳＭＩ31はリン酸化型のＫ10と反応するが、
Ｋ17ともＫ19とも反応しない (図14) 。さきに用いたも
のと同じ論法によって、このエピトープはＴ373-Ｌ441
の領域にあることになり、第２のＫＳＰサイトと一致を
みせる。最後にＳＭＩ34はｈtau 23、Ｋ10およびＫ17を
ラベルするが、Ｋ19をラベルしない (図14ｃ) 。後者の
性質は反復領域がエピトープであるということに反する
が、Ｋ10およびＫ17と反応する能力を保つことは互いに
相容れない。我々の解釈は、ＳＭＩ34は反復領域の両側
の末尾に依存し、少なくとも一方の末尾が存在するとき
にだけ完全に安定化されるようになる、コンホーメーシ
ョン的なエピトープをもつというものである。しかし、
おのおのの場合におけるリン酸化に対する依存性は完全
な分子の場合と同一である。
【０１０９】２つのＫＳＰモチーフがキナーゼでリン酸
化されることが考えられるので、この直接の証明を試み
た。放射性標識したｈtau 34のトリプシン消化ペプチド
をＨＰＬＣで同定し、タンパクの配列とリン酸化残基を
決定した。この領域には２つの主なリン酸化したトリプ
シン消化ペプチドがある。それはＳ235 がリン酸化し
た、第１のＫＳＰモチーフを含むペプチド１ (Ｔ231-Ｋ
240, TPPKSpPSSAK) と、Ｓ396 とＳ404 がリン酸化し
た、第２のＫＳＰモチーフを含むペプチド２ (Ｔ386-Ｒ
406, TDHGAEIVYKSpPVVSGDTSpPR) である。さきに発表さ
れているＣａＭキナーゼの唯一のリン酸化サイト、Ｓ41
6 (Steiner et al., EMBO J. 9(1990), 3539-3544 、ｈ
tau 23の以前に用いられた番号づけではＳ405)はここで
用いられたキナーゼによってはリン酸化されない。
【０１１０】次いでリン酸化残基235 および396(図15)
の点変異を行い、ゲルシフトおよび抗体との反応性を解
析した (図16) 。親タンパクhtau 40 とそのＫＡＰ変異
体はほぼ同一のMr値をもち、リン酸化後のシフト量も同
一である (図16、レーン１−８) 。Ｓ235 がＡに変異し
たときに、ＳＭＩ33の反応性は著しく低下し (図16、レ
ーン３, ７) 、リン酸化ののちに完全に消失する (図1
6、レーン２, ４, ６,８) 。これはＳＭＩ33のエピトー
プが第１のＫＳＰサイトのあたりにあるが、他のサイト
でのリン酸化も影響をもつ (おそらくコンホーメーショ
ンを介して) ことも意味する。Ｓ396 ( 第２のＫＳＰサ
イト) の変異はＳＭＩ33の結合にたいして認めるべき影
響を及ぼさない (図16ｂ、レーン５, ６) 。
【０１１１】上に述べたように、ＳＭＩ31のエピトープ
は反復領域の後のサイトのリン酸化に依存している。Ｓ
396 がAla に変異したときに、抗体は依然としてリン酸
化に依存した様式で反応するので、このセリンはそれ自
体ではエピトープには関与しない (図16ｃ、レーン６)
。Ｓ404 のAla への変異も同じ結果を生む。しかし、
両方のセリンを変異した場合にはリン酸化によって抗体
は反応するに至らない (データ示さず) 。このことはエ
ピトープが２つのリン酸化セリンを含むことを意味す
る。この抗体の結合には立体構造上の成分が関与する。
１つだけの反復単位(Ｋ13−Ｋ15) をもつコンストラク
トは抗体に認識されない (図17、レーン10,12, 14) 。
【０１１２】ＳＭＩ34は、その反応性が反復領域の前後
のリン酸化サイトに依存しているためにもっとも複雑な
挙動を示す。この抗体はすべてのＫＡＰ変異体を認識す
るので、Ｓ235 およびＳ396 は大きな役割を果たすこと
ができない。しかし、ＳＭＩ34がリン酸化Ｋ17, Ｋ10を
認識するがＫ19を認識しない事実 (図17) は、反復の前
および／または後の領域は、エピトープの形成のために
反復領域と協同して働らかなければならないことを示唆
する。ひとつの可能性はエピトープが切れ目なく連続し
たものではなく、別の可能性は反復単位の数とコンホー
メーションによるかもしれないということであろう。こ
れらの可能性を検証するために、異なる組合わせの２つ
の反復単位をもつコンストラクト (Ｋ５, Ｋ６, Ｋ７、
図18) 、および１つだけの反復単位をもつコンストラク
ト (Ｋ13, Ｋ14, Ｋ15) を得た。これらのすべてはリン
酸化によってシフトを示し、またすべてがＳＭＩ34によ
って認識された (第３の反復単位を欠く場合、反応の程
度は弱くなり、この反復単位がコンホーメーションには
とくに重要であることを示す、図17、レーン６) 。これ
は、ＳＭＩ34のエピトープが反復単位の数には依存しな
いことを意味する。しかし、反復領域の直前の領域の性
質が重要であり、とくに電荷の影響をうけやすい。これ
は電荷をもった配列が反復領域の近傍に導入され、ＳＭ
Ｉ34との反応性を失なうに至ったＫ２またはＫ３Ｍのよ
うなコンストラクトから推論される。言葉を換えれば、
電荷をもった配列はリン酸化自体とは独立にエピトープ
をマスクする能力をもつようにみえる (図17、レーン
２, ４) 。コンストラクトと抗体の間の相互作用を表１
にまとめた。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】実施例８ タウコンストラクトのクローニングと発現 ：プラスミド
の調製とクローニングの手順は、Sambrook et al. に従
って行った。ＰＣＲ増幅はメーカー指定の条件に従い
(Perkin Elmer Cetus) ＴａｑポリメラーゼおよびＤＮ
ＡＴＲＩＯ−サーモブロック (Biometra) を用いて行っ
た。
【０１１５】タウｃＤＮＡクローンとそのコンストラク
トは発現ベクターｐＮＧ２ (ｐＥＴ−３ｂの誘導体、St
udier et al.当研究室に於て、tau クローンの操作の便
宜のために PstＩ、HindIII、 NheＩおよびEcoRＶ制限
サイトを除去するという改変をおこなった) 、または発
現ベクターｐＥＴ−３ａにサブクローニングを行った。
発現のためには、ＢＬ21 (ＤＥ３) E.coli系を用いた
(Studier et al.) 。すべての残基番号はヒトのイソフ
ォームで最大のｈtau 40(441残基、Goedevt et al.) の
ものを用いた。コンストラクトの単離のためにはタンパ
クの熱安定性を用いた。コンストラクトはFPLC Mono S
(Pharmacia) クロマトグラフィー (詳細はHagestedt et
al. 参照) によって分離した。Ｔ８Ｒ−１の構築 ：これは８反復単位をもつタウの誘導
体である。これはウシのイソフォームタウ (Himmler et
al.) をもとにしてつくられた。２つのプラスミド、ｐ
ＥＴＮｄｅ43-12(ｂtau 4 遺伝子を含む) およびｐＥＴ
−ＫＯ (おもに４反復単位とベクター由来のリーディン
グ配列および付随配列より成るＫＯを含む、Steiner et
al.) をＴ８Ｒ−１の構築のために用いた。ｂtau 4 由
来の NdeＩ-RsaＩＤＮＡ断片を、ＫＯの修復した XmaＩ
-BamHI断片とつないで 553アミノ酸より成るキメラ分子
をつくる。Ｔ８Ｒ−１遺伝子は Met１-Val 393を人工的
に導入したセリン残基を介してGly248-Tyr394 タウ断片
とつなぎ、バクテリオファージＴ７配列由来の23残基の
末尾部がこれにつづく配列をコードする (ｈtau 40の残
基番号づけ) 。Ｔ７Ｒ−２およびＴ８Ｒ−２の構築 ：Ｔ７Ｒ−２は７反
復単位、Ｔ８Ｒ−２は８反復単位を含むタウの誘導体で
ある。いずれの分子もヒトのイソフォームｈtau23およ
びｈtau 24 (Goedert et al.) をもとにして構築した。
Ｔ７Ｒ−２およびＴ８Ｒ−２分子の操作のために、ＰＣ
Ｒ反復カセットＡ１ (４反復単位をコードする) 、Ａ２
(４反復配列およびその後のタウ配列を含む、tau 24分
子の全カルボキシ側部分をコードする) 、Ａ３ (３反復
単位をコードする) を調製した。Ｔ８Ｒ−２分子はＡ１
およびＡ２をｈtau 23から単離した NdeＩ-PstＩＤＮＡ
断片と結び付けてつくった。このタウ誘導体は 511アミ
ノ酸より成り、ｈtau 24のＮ末端の最初の 311残基 (Me
t 1-Lys 369 、４反復単位を含む) にGly-Thr 連結が続
き、次いでｈtau 24のＣ末端の 198残基 (Gln 244-Leu
441 、さらに４反復単位) が続く。Ｔ７Ｒ−２遺伝子
は、Ａ１カセットの代りにＡ３カセットを用いた点を除
けばＴ８Ｒ−２と同様につくられた。Ｔ７Ｒ−２タンパ
クは 480アミノ酸より成り、ｈtau 23のＮ末端の最初の
280残基(Met 1-Lys 369、３反復単位を含む) にGly-Th
r 連結が続き、ｈtau 24のＣ末端の 198残基 (Gln 244-
Leu 441 、４反復単位を含む、ｈtau 40の残基番号づ
け) が続く。実施例９ タウタンパクのコンホーメーションとそのよ
り高次の構造 ａ タウコンストラクトのコンホーメーションと二量体
化 図19はこの実施例で用いたコンストラクトのタイプを示
している。３タイプの分子を用いた。（）ｈtau 23（最
小のイソフォーム、 352残基) からｈtau 40 (最大のイ
ソフォーム、4413残基、Goedert et al.参照) にまたが
る、脳に存在するイソフォームのタウ。これらは主とし
てＣ末端領域の内部反復単位の数 (３または４) および
Ｎ末端近傍の挿入の数 (０, １または２) に違いをも
つ。内部反復単位は微小管との結合およびＰＨＦの形成
に関与している。したがって、反復領域の構造にたいす
る情報を生むことが期待されるコンストラクトに注意の
焦点が当てられる。 () 反復単位数が、たとえば７, ８
に増加した (Ｔ７, Ｔ８) 、遺伝子操作によるコンスト
ラクト。 () 基本的に反復単位を１つだけ (たとえばＫ
11, Ｋ12) もつようなコンストラクト。
【０１１６】図20のＳＤＳゲルはこのようなタンパクの
いつくかを示している。大多数のタウコンストラクトは
その実際の分子量から期待されるよりも大きなMr値をも
つ (図20ａ) 。目立つ特徴はダイマーおよびオリゴマー
を形成する傾向をもつことである。これはある種のコン
ストラクト、たとえばＫ12について特に顕著である (図
20ｂ) 、ダイマーの形成はタンパクをある時間放置する
ことによってすでに観察される (図20ｂ、レーン２)
が、これはおそらくダイマーがジスルフィド架橋によっ
て固定されることによると考えられ、ＤＴＴによってこ
の現象は阻害される (レーン１) 。これを検証するため
に、とくにシステインを重点的に架橋する架橋剤ＰＤＭ
を用いた。これはＤＴＴを用いなかった場合と基本的に
同じ産物を生成した (レーン３) 。コンストラクトＫ12
(２−５mg/ml)に対する化学的架橋化の実験を、0.5mM
ＤＴＴを含む40mMのＨＥＰＥＳ (pH７５) 中で37℃30分
間インキュベートし、次いでＤＭＳＯ中のＰＤＭ (sigm
a)またはＭＢＳ (Pierce) の新鮮なストック溶液から加
えた０７mMのＰＤＭまたは１５mMのＭＢＳと室温で30分
間反応させる。反応は5mM ＤＴＴまたは５mMのＤＴＴお
よび５mMのエタノールアミンをそれぞれ加えることによ
って停止させる。最終的に、システインとリジンを結び
つけるＭＢＳによってダイマーおよびさらにオリゴマー
が形成されうる(レーン４) 。架橋された分子種は、Sup
erose 12 カラムのクロマトグラフィーで分離でき (図2
0ｃ) ダイマーの均一な集団についての研究を可能にさ
せる。この目的のために共有結合で架橋されたダイマー
はモノマーから、Pharmacia Superose 12 FPLCカラムを
用い、これを0.5M NaSCN, 0.5M LiCl および2mM ＤＴＴ
を含む50mM Tris-HCl pH７６で平衡し、0.3ml/mlの流速
で溶出することによって分離された。カラムのフラクシ
ョンはプールし、セントリコン３ミクロコンセントレー
ター (Amicon) で遠心することによって濃縮し、SDS-PA
GEで分析した。カラムはPharmacia 低分子量ゲルろ過キ
ャリブレーションキットを用いてタンパクのキャリブレ
ーションを行った。キャリブレーションタンパクの有効
水和ストークス半径 (ｒ) はキットの説明書からとり、
分配係数 (σ) は溶出容積から求め、等式σ＝−A log
r ＋Ｂにあてはめ、それによってタウコンストラクトの
モノマーおよびダイマーに対するストークス半径が得ら
れる。軸比はペリン(Perrin)の方法にしたがって計算し
た (詳細についてはCantor & Schimmel, Biophysical c
hemisyry, PartII：Techniques for the study of biol
ogical structure and function. Freeman & Co, Sanfr
ancisco, 1980 参照) 。溶出プロフィール(elution pro
file) ( 図20ｄ) はＫ12のモノマーに対してはストーク
ス半径２５nmを、ダイマーに対しては３０nmを与える。
分子量は13および26kDをそれぞれ与えると、軸比は10お
よび８が得られ、電子顕微鏡で観察される桿状の形状と
一致をみせる (同じ長さの長だ円体では実際より低く見
積る６８および８５nmとなる：後出) 。
【０１１７】他のタウ種は同様の架橋結果を示すが、そ
れらはつぎの理由によって多少より複雑である。タウは
システインの反復単位２および３のみにもっている (Cy
s 291 およびCys 322 残基) 。反復単位２はたとえばｈ
tau 23またはコンストラクトＫ12のように、ある種のイ
ソフォームでは欠いており、これらはただひとつ、Cys
322 のみをもつ。ＰＤＭのようなCys-Cys 架橋剤を用い
ると、これらの分子はダイマーのみを形成し、それ以上
大きな集合体を形成しない (図20ｂ、レーン３) 。これ
とは対照的に、２つのシステインをもつ２価の分子 (た
とえばｈtau 40, Ｋ11) は分子内架橋、ダイマーおよび
より高次の集合体、オリゴマーを形成することができ
る。この多様性は、タウには多くのリジンが含まれるた
めに、Ｋ12をＭＳＢで架橋化したときにみられるもの
(図20ｂ、レーン４) と似ている。
【０１１８】いくつかのタウコンストラクトの溶液中で
のコンホーメーションを、常法の分析超遠心およびＣＤ
分光分析によって調べた。例えば、ｈtau 40の沈降恒数
２６Ｓが、脳からのタウ混合物を用いて得られた。ｈta
u 40の分子量 (45.8kDal) をもつ球状の粒子については
沈降恒数は約４２Ｓであることが期待される。低い実測
価はｈtau 40は、流体力学的軸比約15をもつ、ひき伸ば
された構造をもつことを示している。ｈtau 40コンスト
ラクトＫ12のＣＤスペクトル (図20ｅ) は区別がつかな
い。どちらも２次的な構造をほとんど示さない。このこ
とはタウのＮ末端、Ｃ末端領域のいずれもが、αヘリッ
クスまたはβシートなどの内的な規則性を欠いているこ
とを意味する。 ｂ 合成ＰＨＦ 脳組織から分離されたタウは繊維状の構造に自己集合す
ることができる (たとえば Montejo de Garcini & Avil
a, J. Biochem. 102(1987), 1415-1421; Lichtenberg-K
raag & Mandelkow, J. Struct. Biol. 105(1990) 46-53
参照) 。この性質は、タウがアルツハイマー病の神経現
線維変化の主成分の一つであるという事実に照らして特
に興味がある。初期の研究において、in vitroで生じた
フィラメントとアルツハイマーＰＨＦとの関係は、とく
にこのタンパクが不均一であることから、いまだにはっ
きりしていない。したがって組換えタウコンストラクト
が自己集合の能力をもつかどうかを調べることが望まれ
た。これはpH、塩、バッファーの種類、等の条件をさま
ざまに変えたもとで行った。代表例をあげると、タウコ
ンストラクトまたは化学架橋をおこなったダイマーを、
さまざまなバッファー (たとえば約50−500mM MES, Tri
s-HCl, Tris-マレエート, pH値５−９, ５−30mM MgCl
2, CaCl2, AlCl3) に対し、４℃で12−14時間透析を行
った。溶液を短時間遠心し(Heraeus Biofuge A, 10,000
g １分) 、ペレットを４℃で数日保存したのちこれをネ
ガティブ染色 (２％ウラニルアセテートまたは１％ホス
ホタングステン酸) 電子顕微鏡標品にした。あるいは溶
液をVan Bruggen et al., J. Microsc. 141(1986),11−
20の方法にしたがって金格子上での格子透析(grid dial
ysis) のために用いた。調べたコンストラクトのうち、
Ｋ11とＫ12のみがＰＨＦと似たフィラメントをつくっ
た。至適条件は０３−０５M Tris-HCl、pH５０−５５お
よび何も塩を添加しないものだった。Ｋ12コンストラク
トについて得られた結果を図21に示した。pH範囲５５−
５５では盛んなフィラメント形成があった。その長さは
さまざまだったが、 200−1000nmのものが多かった。大
部分は滑らかな形状を示したが、他は軸方向に沿って約
70−75nmの周期で (矢印) 規則的な太さの変化があっ
た。最小の直径は約８nmで最大は約15nmだった。短か
い、ほぼ80−150nm の長さの桿状の粒子も同時に観察さ
れ、これはちょうどフィラメントの１つまたは２つの交
差周期を表わす (図21、中央) ものとみられた。タンパ
クサブユニットの配置を示してくれるような軸方向の微
細構造については信頼性をもって見分けることはできな
かった。したがって、これはネガティブ染色の解像力の
限界以下であり、および／またはコントラストが欠けて
いることを示す。概してフィラメントは互いに親和性を
もつが如く、束になって集団となる (図21ａ) 。類似の
ＰＨＦ様のフィラメントはＰＤＭで架橋化を行ったＫ12
ダイマーについてもみられる (図22) 。これはダイマー
はフィラメント形成の中間段階である可能性を示すもの
である。これらの多くの特徴は、比較のために図23に示
した、アルツハイマー病の脳から分離したＰＨＦの特徴
に似ている。この出現はある程度分離の手続きに左右さ
れる。図５ａはWischik et al., J. Cell. Biol. 100(1
985), 1905-1912 の方法に従って神経原線維変化から調
製した「不溶性」フィラメントを示す。これらのフィラ
メントは長く、直線的で、はっきりした約75nmの反復単
位があるという特徴をもつ、均一の超微細構造をもつ。
対照的に、このフィラメントをGreenberg & Davies, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 83(1990), 5827-5831の方法
に従ってサルコシルで“可溶化”すると、これはより短
く、より不均一である (図23ｂ) 。とくにこの標品は非
常に短かい粒子 (約１〜２交差周期に対応する長さ) お
よび捩れた外観をもたない (直線的なフィラメントの名
残り）滑らかなフィラメントとを含んでいる。反復領域
についての合成ＰＨＦ (たとえばＫ11、Ｋ12、Ｋ12ダイ
マー、図21, 22) と、アルツハイマー脳の可溶画分のＰ
ＨＦとの間には３つの基準に照らして驚くべき類似性が
認められる。 () フィラメントは図23ａの不溶性ＰＨＦ
よりも短かい。 () これらは周期性がより不均一で、あ
るものは捩れた外見をまったくもたない (直線的フィラ
メント) 。 () これらは１交差周期にまで及ぶ、きわめ
て短かい桿状の粒子を含む。
【０１１９】これまでのところ、合成ＰＨＦ様の繊維
は、基本的に反復領域 (３または４反復単位図19) を含
むＫ12およびＫ11のようなコンストラクトのみについて
観察されているが、より大きなタウのイソフォームには
観察されていない。これらのデータはすべて、リーート
領域がアルツハイマー神経原線維変化のものに酷似した
ＰＨＦへと自己集合する能力をもつ基本単位であるとい
う仮定と一致をみせる。これはまた、アルツハイマーＰ
ＨＦのプロナーゼ耐性のコア部分が反復領域を含むとい
う、いくつかの研究室での実験結果 (たとえば Goedert
et al. 前出、Jakes et al., EMBO J. 10(1991), 2725
-2729)とも一致する。またフィラメント形成コンストラ
クトはリン酸化されず、真のアルツハイマーのＰＨＦの
場合とはちがって、これは自己集合に役割を果たしてい
ないことが言える。 ｃ タウモノマーとダイマーの電子顕微鏡観察 合成ＰＨＦを用いた結果は、反復領域はタウ分子の相互
作用に特別の役割をもつことを示した。したがって、異
なるコンストラクトの性質を、電子顕微鏡を用いてより
詳しく明らかにすることが望まれた。選んだ方法は、グ
リセロールスプレーと結びつけた。きわめて低角度の金
属シャドウイングである。この方法はこれなしにはコン
トラストが小さくて見ることのできない粒子を見えるよ
うにする。スプレーは Tyler & Branton, J. Ultrastru
et. Res. 71(1980), 95-102 の方法に従って行った。試
料をスプレーバッファー(50mM アンモニウムアセテート
pH8.0、150mM NaCl、１mM MgCl2、0.1mM EGTA) を用い
て１：10に希釈し、これを70％グリセロール溶液にして
雲母の新鮮な割断面上に噴霧する。噴霧された標本は２
時間真空乾燥し、ＢＡＥＯ80Ｔシャドウイングユニット
(Balzers Union)を用いて白金／炭素 (厚さ約１５nm、
シャドウイング角度４°) 、続いて20−30nm炭素でシャ
ドウイングを行う。最後にレプリカは２度蒸溜した水に
浮かせて拾いあげ、 600メッシュの銅格子(copper grid
s)で上にすくいとる。
【０１２０】ｈtau 23分子(352残基、図24ａ) は桿状
で、平均の長さ35±７nmをもつ (長さは表２および図25
にまとめた)。
【０１２１】
【表２】
【０１２２】この値はHirokawa et al. J. Cell. Biol.
107(1988), 1449-1459 によって報告されたものより小
さいが、これは実験方法の違いに由来するものかもしれ
ない(凍結に対してグリセロールスプレー、すべてのイ
ソフォームの混合物に対して最小のイソフォーム) の金
属シャドーをかけたｈtau 23分子の見かけ上の幅は約３
−５nmであり、コントラストは小さく、対照サンプル
(１重および２重鎖ＤＮＡ、α−ヘリックスのタンパク)
よりも小さい。電子顕微鏡写真を詳しく検討すると、
コントラストが高まっていて、若干大きな直径 (５−７
nm) をもち、２つの部分に開裂している場合があり、長
さがモノマー (約40nm) と同様あるいはわずかに長い粒
子の集団があることがわかる。これらの粒子はダイマー
を形成している、 (ほぼ) 並置したモノマーである (図
24ｂ) として説明され、これは架橋化ダイマーおよび後
述する抗体修飾の結果と一致する。
【０１２３】明らかにコンストラクトＴ８Ｒ−１につい
ては長い粒子が得られ、その平均の長さは58±15nmで、
ｈtau 23よりも23nm長い (図24ｃ, 25ｂ) 。このコンス
トラクトは８反復単位 (基本的な４反復単位の重複、図
19) をもち、ｈtau 23よりも５反復単位多く、これに加
えてＮ末端近傍に２つの29-merの挿入がある。Ｔ８Ｒ−
２はＮ末端の挿入をもたないにも拘らず、同様の長さ
(61±17nm) をもつ。コンストラクトＴ７Ｒ−２も、反
復単位が７つ (３＋４) だけであるのとＮ末端の挿入が
ないのに拘らず、同様の長さ、60±16nmをもつ。一見こ
れらの結果は辻褄が合わないようにみえる。しかし、よ
り大きなコンストラクトはより長くなる一方で配列のあ
る部分は長さに影響を与えない。以下の結果を予想する
ことによって、この矛盾は統一的な仮説によって説明す
ることができる。すなわちタウコンストラクトの長さは
主として反復領域によって決定される。これに対してＮ
−末端領域およびＣ末端末尾は大きな影響を与えない。
反復領域それ自体は長さが第２の反復単位とはほぼ関係
なしに決まる、だいたい20−25nmの一つの単位と考える
べきである。この仮説はＮ末端の挿入は長さにはごくわ
ずかの影響しか与えないことを内容として含む。それは
３または４反復単位をもつコンストラクトはほぼ同一の
長さをもつこと (たとえばＴ７Ｒ対Ｔ８Ｒ) 、および１
反復領域の追加は20−25nmの長さの増加をもたらすこと
(ｈtau 23対Ｔ７ＲまたはＶ８Ｒの場合のように) を予
測する。
【０１２４】Ｔ８Ｒおよび他のコンストラクトはまたあ
たかも２つの“単位” (この場合それぞれ４反復単位)
が相互作用するごとく、ヘアピン型 (図24ｄ) に巻きこ
んだ粒子を形成する。これは逆平行的な配置をとってい
ることを示唆し、以下に示す抗体のデータを支持する。
幅およびコンストラストがｈtau 23に類似のダイマーで
あることを物語るＴ８Ｒ粒子もまた観察された (図24
ｅ) 。
【０１２５】既述の場合のように、上に述べた (図26)
Ｋ11およびＫ12によって形成されるＰＨＦ様の繊維を形
成する、反復領域コンストラクトは桿状である。厚さま
たはコントラスト、およびダイマーとの比較という基準
を用いると、Ｋ11は平均の長さ26±５nmのコントラスト
の低いモノマー集団と、約32±６nm (図26ｂ) のよりコ
ントラストのはっきりとしたダイマー集団をみせる。こ
れは２つの分子がほぼその全体の長さに沿って並び合っ
ていることを意味している。Ｋ12については、25±４nm
のモノマー (図26ｄ) 、約30±４nmのダイマー (図26
ｅ) が見出される。モノマーは、残基数が３分の１であ
るのに拘らず、長さはｈtau 23の70−75％である (図25
ｃ, ｅ) 。どちらのコンストラクトもより長い粒子が見
出され、これらは会合してテトラマーとなったダイマー
であるとして説明される (図26ｃ,ｆ) 。
【０１２６】これまで、モノマーと、ダイマーの分類は
粒子の幅とコントラストをモデル構造と比較することに
よって判断した。しかし、共有結合で架橋したダイマー
をゲルクロマトグラフィーで単離し、これを電子顕微鏡
その他の方法で直接に研究することが可能である。一例
として、ただ一つのCys 322 を介してＰＤＭによって架
橋したＫ12のダイマーを示した (図27ａ) 。電子顕微鏡
下では、そのコントラストは上に述べたダイマーと似て
いる。しかしもっと重要な点は、これらはモノマーより
ほんの僅かしか長くないということである (29±６nm、
図27ａ、図25ｅ, ｇ) 。これはＰＤＭダイマーがほとん
ど重なり合って並ぶ２分子から形成されることを意味す
る。ＭＢＳによって誘導されるＫ12のダイマー (34±６
nm) もまた、これがおそらくさまざまな種類のCys-Lys
結合が形成される可能性があるところから、ＰＤＭにつ
いて得られるものよりも若干長くなる傾向をもつ (５nm
ほど) 点を除けば、似ている。
【０１２７】これらをつき合わせると、Ｋ11およびＫ12
(および反復領域を必ず含む他のコンストラクト) から
得られた結果は、反復領域は、それが３または４反復単
位をもつかどうかとは無関係に、ほぼ均一な長さの折畳
み単位を形成するという仮説を支持している。
【０１２８】調べたすべてのコンストラクトについて、
グリセロールスプレー実験は繊維状構造を形成するある
種の傾向を示す。ほとんどの場合、その構造は直径がほ
ぼ均一であり、ＰＨＦとはこれといって明らかな関係を
示さない。はっきり別の自己集合の結果を生じたもので
あろう。 ｄ ダイマーの逆平行配置 上のデータから、タウおよびそのコンストラクトは横に
並んでダイマー化する傾向をもつことは明らかである。
これは極性についての疑問を提出する。これら粒子は並
行または逆平行のどちらなのであろうか。最初のヒント
は８反復単位コンストラクト (たとえば (図24ｄ) につ
いて観察されるヘアピン型の折畳みから得られ、これは
構成する２分子が逆平行の配置をとっていることを示唆
する。これに対する直接の証明は、エピトープが最後の
反復単位にあり、したがって配列上Ｃ末端に近いモノク
ローナル抗体 (Dingus et al., J. Biol. Chem. 266(19
91), 18854-18860) によって標識することによって得ら
れる。図28ａ (左) は１分子の抗体が結合したｈtau 23
の粒子を示す。抗体は一方の端の近くに結合し、桿状体
の物理的な一端がＣ末端とおよそ一致していることを示
す。観察される桿状部分の長さは抗体で標識されないｈ
tau 23のそれと類似している。見かけの幅から言えばそ
れはモノマーあるいはダイマーでありうる。同じ視野中
に２重に標識された粒子が見つかる (図28ａ右) 。抗体
は反対側に結合し、ダイマーの２つのサブユニットは逆
の極性をもつことが証明される。
【０１２９】Ｋ12コンストラクトについても同一の像が
得られる。すなわち、一端に抗体のついた桿状の突出部
(図28ｂ左) 、およびダンプベル(dump bell) 、つまり
逆平行のダイマー (図28ｂ中央) である。最後に２つの
抗体と２つの突出部をもち、中央に捩れのある粒子 (２
つの“サクランボ”、図28ｂ右) がみつかる。それぞれ
の腕の長さは一単位の突出部の長さと同じであるので、
この粒子は図26ｃおよびｆのテトラマーと同じものであ
るように思われる。中央でのダイマーの相互作用は、相
互作用がなければ期待される抗体の結合を妨害している
とみられる。
【０１３０】Ｋ12コンストラクトのＰＤＭダイマー (Cy
s 322-Cys 322 架橋で形成される）を図28ｃに示す。１
つの抗体で標識されたものを左、化学架橋したダイマー
は逆平行のモノマーより成ることを示す、２個の抗体で
標識されたものを中央にあげた。仮定のテトラマーは右
に示す。ＭＢＳ架橋のダイマーについても基本的に同じ
データが得られた (Cys 322 と近隣のLys 、図28ｄ) 。
【０１３１】この実施例で述べた知識に基づいて、既に
述べたように、アルツハイマーＰＨＦの形成の低下また
は抑止に有効な薬剤を試験法が開発できる可能性がある
ように、アルツハイマーＰＨＦの解消に有効な薬剤のin
vitroの試験法を開発しうるであろう。実施例10 タウタンパクのリン酸化に対する、グリコー
ゲンシンターゼキナーゼ−３ (ＧＳＫ−３) およびｃｄ
ｋ２−サイクリンＡの影響 実施例４および５に述べた実験をＧＳＫ３ (ホスファタ
ーゼ活性化因子ＦA とも呼ばれる。Vandenheede et a
l., J. Biol. Chem.255(1980) 11768-11774) をリン酸
化酵素として用いて繰り返した。
【０１３２】ＧＳＫ３ (イソフォームαおよびβ) をウ
シの脳から、２つのイソフォームを分離する Mono S ク
ロマトグラフィーのステップを追加して、Vandenheede
et al.前出の方法に従って精製した。ここに述べた実験
の大部分は、ＴＳＫビーズ上のＧＳＫ−α (Van Lint e
t al., Analyt. Biochem. 1993印刷中による) の免疫沈
澱を用いて行ったがβサブユニットを用いた対照実験も
同様の挙動を示した。
【０１３３】ＧＳＫ３のイソフォームαおよびβに対す
るポリクローナルな抗ペプチド抗体を、ウサギを用いて
得、ペプチドカラムの親和クロマトグラフィーによって
精製した。ＧＳＫ３の免疫沈澱は、20mM Tris-HCl, 1％
ＮＰ−40, 1mM ＰＭＳＦ，２μg/mlアプロチニン, １μ
g/mlロイペプチンおよび０２μg/mlのペプスタチン中の
ＰＣ−１２細胞質液から得た。 100μl の細胞質液を１
μl のα−またはβ−ＧＳＫ抗体 (１mg/ml)または対照
のウサギ抗体と４℃で４時間インキュベートし、５μl
のＴＳＫ−プロテインＡビーズを加えてさらに１時間イ
ンキュベートを行い、最後にビーズを10mg/ml ＢＳＡを
含む 20mM Tris-HCl, 0.5M LiCl を含むトリスバッファ
ー、および10mM MgCl2および1mM ＤＴＴを含む 20mM Ｈ
ＥＰＥＳpH ７２で洗った。リン酸化の測定では、２μl
のペレットを40mMＨＥＰＥＳ pH7.2，10mM MgCl2, 2mM
ＡＴＰ、2mM ＥＧＴＡ, 0.5mM ＤＴＴおよび1mM ＰＭ
ＳＦ中に溶かした基質 (３μM ) の８μl とインキュベ
ートを行った。 ａ ＧＳＫ３によって誘導されるリン酸化の時間経過と
抗体反応性 図29はＧＳＫ３によるｈtau 40のリン酸化の時間経過、
および対応するオートラジオグラムおよびイムノブロッ
トを示す。多くの点で、示す挙動は脳のキナーゼ活性ま
たは精製したＭＡＰキナーゼによって得られるものに似
ている。すなわちリン酸化は３つの主なステージでゲル
シフトをもたらす。ほぼ４Piをとり込む。抗体ＡＴ８、
ＳＭＩ34、ＳＭＩ31との反応性をひきだすが、ＴＡＵ１
およびＳＭＩ33との反応性を低下させる。 ｂ ＧＳＫ３によるタウのリン酸化サト おもなリン酸化サイトは抗体エピトープおよび点変異に
よって決定できる (図29) 。ＴＡＵ１はSer 199 および
Ser 202 がリン酸化していないことを必要とし、ＡＴ８
はそのいずれもがリン酸化していることを必要とする。
このために、どちらか一方のセリンがリン酸化されてい
るときには、これらの抗体はいずれも反応しない。これ
は、Ser 199 およびSer 202 のいずれもがステージ２の
間にリン酸化をうけることを意味する (図29、パネル
３, ４) 。同様に、抗体ＳＭＩ31はSer 396 およびSer
404 の両方のリン酸化を必要とし、これは、両セリンが
ともにすみやかにステージ１でリン酸化されることを意
味する (図29、パネル６) 。ＳＭＩ33はSer 235 がリン
酸化していない時のみ反応するので、反応性の漸次的な
喪失はこの残基のリン酸化がごくゆっくりしたものであ
ることを意味する (パネル７) 。これらの残基を合計す
ると５Pi分となるが、オートラジオグラフィーで観察さ
れるのは約４Piであり、これはこれらセリンのすべてが
100％リン酸化されるものではないことを物語る。ＭＡ
Ｐキナーゼの場合にくらべると、免疫的な反応には時間
経過において微妙な違いがある。たとえば、ＳＭＩ31の
反応性はＡＴ８およびＳＭＩ34に先だって早く始まる一
方、ＳＭＩ33の反応性は長い時間領域にわたって維持さ
れ、ＧＳＫ３の反応様式はＭＡＰキナーゼのそれとは同
一ではないことを示している。
【０１３４】点変異を用いてさらに情報を得ることがで
きる。実施例５および６に示したように、脳抽出液由来
のキナーゼ活性およびＭＡＰキナーゼによってひき起こ
される最初の大きなシフトの変化は、Ser 404 のリン酸
化によっている。図30 (レーン１−３) に示されるよう
にＧＳＫ３についても同じことがいえる。Ser 404 をAl
a に変異させると、最初のすみやかなシフトは消失し、
初期のリン酸化は低いレベルに低下する (図30、レーン
２および３を比較せよ) 。
【０１３５】イムノブロットからもう一つ結論されるこ
とは、Thr-Pro にも働らくＭＡＰキナーゼとは違って、
ＧＳＫ３はSer-Pro モチーフに対する選択性が強いこと
である。これは約４Piのとり込みがリン酸化されたエピ
トープを説明するのに必要であるところから言える。こ
れを検証するために、すべての６つのSer-Pro がAla-Pr
o で置き換えられた (図31、中) ｈtau 23の誘導体、構
築物ＡＰ11をつくった。ＡＰ11は１分子あたり＜0.1 Pi
という、ごく限られたリン酸化しか示さず、Thr-Pro モ
チーフは大部分がリン酸化されていないままであること
を確認できる。同じ結果はコンストラクトＡＰ17 (すべ
ての６つのSer-Pro および８つのThr-Pro がAla-Pro に
よって置き換えられた、図31、上) についても得られ
る。４反復単位のみを含むもう一つのコンストラクトＫ
18 (図31、下)もまたリン酸化されず、微小管の結合領
域内には大きなリン酸化サイトがないことを示す。かく
して、ＧＳＫ３およびＭＡＰキナーゼはともにプロリン
依存であるという点で似ているがＭＡＰキナーゼはThr-
Pro モチーフについても活性がある。 ｃ ＧＳＫ３およびＭＡＰキナーゼは微小管およびＰＨ
Ｆと結合する。
【０１３６】タウが微小管結合タンパクであることを考
えれば、タウをリン酸化するキナーゼもその近傍に局在
していることが期待され得る。したがって、ＭＡＰキナ
ーゼまたはＧＳＫ３が、会合と解離のサイクルを繰り返
しを通して共精製されるというふつうの基準に照らし
て、微小管結合タンパクであるかどうかをしらべた。実
際にその通りであった。図32ｂは、ＭＡＰキナーゼのイ
ソフォームｐ42およびｐ44のいずれもがブタ脳の微小管
と共純化されることを示す。図32ｃ, ｄはＧＳＫ３αお
よびβについても同様であることを示す。微小管結合Ｍ
ＡＰキナーゼは、Tyr がリン酸化されていない (イムノ
ブロットによる。データ示さず) ことから、活性化され
ていない状態にあるのは興味深い。
【０１３７】この結果を考慮すると、キナーゼがアルツ
ハイマーＰＨＦとも結合しているかどうかを検討するの
は興味ある問題である。図33ａのイムノブロットは、Ｇ
ＳＫ３は正常およびアルツハイマー脳にほぼ等量存在し
ており、この点でＭＡＰキナーゼの場合と似ている。さ
らに、キナーゼは、２つの異なる方法、Wischik et a
l., J. Cell. Biol.100(1985), 1905-1912(図33ｂ、レ
ーン１) および Wolozinet al., Science232(1986)、64
8-650(レーン２)に従って単離したＰＨＦと直接に共純
化される。ＧＳＫ３が微小管およびＰＨＦと結合し、タ
ウをリン酸化するという事実は、キナーゼがタウと微小
管の相互作用に影響を与える可能性があることを示唆す
る。これはタウリン酸化の病理的な効果についての一般
的な考え方と一致するものであろう。驚くべきことに、
結合に対する影響はなかった。図34はリン酸なし、およ
びＧＳＫ３および脳抽出物のキナーゼ活性によるリン酸
のある条件で、ｈtau 23の微小管との結合を示す。後者
の場合、親和性の強い減少がみられるが、ＧＳＫ３自体
による影響はごくわずかである。 ｄ ｃｄｋ２−サイクリンＡによるタウのリン酸化 プロテインキナーゼｃｄｋ２−サイクリンＡ（プロリン
依存ser/thr キナーゼ、Hunter前出参照) は、リン酸
化、ゲルシフト、および抗体との反応性から判断する
と、アルツハイマー様の状態をひき起こす。キナーゼｃ
ｄｋ２はｈtau 40に３５Piをとり込み、ゲル上でＭＡＰ
キナーゼおよびＧＳＫ３と同様のシフトを生じさせる。
抗体ＡＴ−８、ＳＭＩ31、ＳＭＩ34はリン酸化されたタ
ウを認識するが、ＴＡＵ−１およびＳＭＩ33は認識せ
ず、この点でもＭＡＰキナーゼおよびＧＳＫ３と似てい
る。すべてのser-pro モチーフ (Ser 199, 202, 235, 3
96, 405,422) はある程度リン酸化される。図46参照。
【０１３８】調製法は次の通りである。ｃｄｋ２／サイ
クリンＡ複合体を過剰生産する細胞をボストンの Dr. P
iwnica Wormsから得た。
【０１３９】サイクリンＡはグルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼと融合させた。このために複合体は下記に
概略を述べたように、グルタチオンアガロースビーズを
用いて容易に精製できる。 グルタチオンビーズにおけるキナーゼアッセイ ３×106 の細胞に、それぞれヒトｐ33cdk2およびヒトサ
イクリンＡ (グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと
融合した) の遺伝子をもつ２種類のウイルスを、それぞ
れ m.o.i.10 で感染させた。感染40時間後、細胞をＰＢ
Ｓで２度洗った。細胞はプレートのまま−70℃で凍らせ
た。 (細胞は実験を行うまで凍結保存した。) 細胞溶解液の調製 細胞を以下のバッファー１mlで溶解する： 50mM Tris pH７４； 250mM NaCl； 50mM NaF； 10mM NaPPi； 0.1％ NP40； 10％ グセロール； プロテアーゼ阻害剤 (0.15ユニット／mlアプロチニン、
2mM PMSF、20μM ロイペプチン)。
【０１４０】プレートを４℃で15分揺らし、溶解液を集
めエッペンドルフチューブに移して10Ｋで４℃10分間の
遠心を行う。溶解液上清を新しいエンペンドルフチュー
ブに移す。 グルタチオン沈澱 100μl(ＰＢＳ中のアガロースの50％スラリー) のグル
タチオンアガロース (Sigma)を溶解液上清に加え、４℃
で約１時間揺動後軽く遠心してビーズのペレットを得
る。ビーズを１mlの上記の溶解バッファーで２度洗い、
次いで不完全キナーゼバッファー (50mM Tris pH７４、
10mM MgCl2) で２度洗う。最終洗浄後、ビーズより残留
バッファーをできる限りとり除く。 キナーゼアッセ 外部基質を加え、次いで下記完全キナーゼバッファーを
加える： 50mM Tris pH７４； 10mM MgCl2； １mM ＤＴＴ； 10μM 非標識ＡＴＰ； ２μl のガンマ32Ｐ−標識ＡＴＰ (ＮＥＮ：3000Ci/m
M)。
【０１４１】これを30℃で適当な時間インキュベートす
る。実施例11 タウタンパクSer 262 の新しいキナーゼによ
るリン酸化とそのタウタンパクの微小管との結合に対す
る影響 これまでのところ、タウタンパクのアルツハイマー様の
状態は、Ser-Pro およびThr-Pro モチーフのリン酸化を
含むこと、そしてこの状態はアルツハイマー特異抗体に
対する反応からして脳の抽出物のキナーゼ活性およびＭ
ＡＰキナーゼによってつくりだすことができることが示
されている。下記に示すように、タウの微小管への結合
の調節の重大なステップは、脳抽出物のキナーゼ活性に
よってリン酸化をうけるが、ＭＡＰキナーゼによっては
リン酸化をうけない残基、Ser 262 で起こる。この残基
をリン酸化し、それによって微小管とタウタンパクの間
の相互作用を強く減少させる、哺乳動物の脳から得られ
る新しいキナーゼをさらに精製する。
【０１４２】タウとタキソールで安定化した微小管の結
合の研究は実施例６で述べたように行った。これはあら
かじめ生じた微小管へのタウの結合の直接の測定値を与
え、解離恒数と結合のストイキオメトリー (ｎ＝結合タ
ウ／チューブリンダイマー)が得られる。ストイキオメ
トリーの低下がもっとも見やすい、再現性のよいパラメ
ーターとなる。リン酸化に際しての野生型のイソフォー
ムタウのストイキオメトリーの低下は、Dn, wt＝ (ｎun
phos−ｎphos)wt を 100％として変異型 Dn, mutのリン
酸化の影響と比較することができる。
【０１４３】脳からキナーゼの調製。 250ｇのブタの脳
組織の抽出物を調製し、この硫安沈澱を実施例２で述べ
たように行った。30％と45％飽和の間で得られた沈澱を
バッファー１ (25mM NaCl 、２mM EGTA 、２mM DTT、１
mM PMSF を含む25mM Tris-HCl pH７４) に均一に分散さ
せ、このバッファー１ｌに対し一夜透析した。透析バッ
ファーの交換は２度行った。全タンパク質の濃度の決定
にPierceＢＣＡアッセイキットを用いて行った。透析し
た溶液の超遠心分離によって上清を得たのち、この一
部、250mg タンパクまでをバッファー１で平衡させた M
ono QHR 10/10 カラム (Pharmacia)に搭載した。 120ml
のバッファー１中の25−500mM NaClの直線グラジェント
を用い、２ml／分の流速で溶出した。各フラクションの
リン酸化能を下記のバクテリアで発現させたタウおよび
タウコンストラクトを用いて検定した。活性のあるピー
クフラクションをプールし、Centriprep 10 ミクロコン
セントレーター (Amicon) を用いて遠心し、10−40倍濃
縮し、50mM NaCl を含むバッファー１で平衡させた Sup
erdex 75 HiLoad 16/60 サイズ排除カラム (Pharmacia)
を用い、同じ溶液で溶出した。活性のあるフラクション
をプールし、Mono Q HR 5/5 カラムを用い、30mlのバッ
ファー１中の０−600mM のNaClのグラジェントによっ
て、０５ml／分の流速で再クロマトグラフィーを行っ
た。活性フラクションをバッファー１に透析し、０℃で
貯蔵した。ゲルロ過カラムはPharmacia 低分子量マーカ
ーセットで検量した。リン酸化アッセイは報告された方
法 (Steineret al. 1990 前出) で行った。
【０１４４】タウリン酸化のゲル内アッセイは Geahlen
et al., Anal. Biochem. 153(1986), 151-158 に従っ
て行った。キナーゼ活性をもつ Mono Q フラクションを
11％SDS-PAGE (0.5mmの厚さのスラブゲル) にかけた。
タウタンパクを重合化の直前に分離ゲルに加えた (最終
濃度０１mg／ml) 。続いて次の処置を行った。(1) ＳＤ
Ｓを除くためにゲルを20％のプロパノールを含む50mM T
ris-HCl pH８０を用い室温で30分間２度洗い、次いで５
mMβ−メルカプトエタノールを含む50mM Tris-HCl pH８
０ (＝バッファーＡ) でさらに室温で30分洗った。(2)
酵素を６Ｍのグアニジン塩酸を２度交換して室温で１時
間変性させた。(3) 酵素を0.04％ Tween40 を含むバッ
ファーＡを５回交換して４℃で約15時間処理して復元し
た。(4)ＡＴＰを含まないリン酸化バッファー(40mM HEP
ES pH７5,５mM EGTA,３mM MgCl2, ０１mM PMSF, 2mM DT
T) で室温で30分間プレインキュベートした。(5) 0.1mM
ＡＴＰと130Ci/Mol ( ガンマー32Ｐ )ＡＴＰの添加によ
るリン酸化は、ゲルをプラスチックバックに封じ、37℃
で20時間回転輪(rotating wheel)でインキュベートする
ことによって行った。(6) 過剰の (ガンマ32Ｐ) ＡＴＰ
の除去。ゲルは１％ピロリン酸ナトリウムを含む５％Ｔ
ＣＡ 300−500ml でインキュベートし、未結合の放射性
が無視できるようになるまで、インキュベーションを５
回くり返した。(7) 染色およびオートラジオグラフィー
は常法に従っておこなった。 ａ Ser 262 のリン酸化はタウの微小管への結合を強く
低下させる。
【０１４５】実施例６で示されたように、タウタンパク
を脳の抽出物のキナーゼ活性でリン酸化すると、ストイ
キオメトリーは典型的にダイマーチューブリンあたり約
０５から約０１−0.15へと、すなわち約３−４倍低下す
る。この例では野生型のタンパクへのこの影響を 100％
とすることにする。リン酸化によって影響をうけるパラ
メーターは、はっきりとした時間経過をもつ。大きなゲ
ルシフトは早く (約２時間までのステージ１のリン酸
化) 起こり、これはSer 404 ( ｈtau 40の番号づけ) と
いう単一のサイトのリン酸化に帰せられる。アルツハイ
マー様の抗体反応の多く、および次のゲルシフトはステ
ージ２で始まる (約６時間まで）。それ以上のリン酸の
とり込みとともにみられるそれ以上のシフトはステージ
3 (24 時間まで) で生ずる。しかし、微小管との結合へ
の影響はステージ１のあとから完全に認めることができ
る。この時点で、タンパクは約２モルのPi (最大約５−
６モルのなかから) を結合する。このなかで約１がSer
404 のリン酸化であり、最初のゲルシフトで同定されう
る。他のリン酸はSer 202 、235 、および 262間に分布
するが、オートラジオグラフィーによる正確な定量およ
びホスホペプチドの配列決定は困難だった。
【０１４６】そこで、この問題にとりくむために特定部
位の突然変異誘発 (site-directedmutagenesis)を行っ
た。問題の Ser残基を Ala (当該残基をリン酸化不能に
する) または Asp (リン酸化した状態のマイナス電荷を
もつ状態をつくりだす (真似る) 、図35ａ参照) で置き
換えた。次いで、これらの変異体をゲルシフト、リン酸
のとり込み、及び微小管結合によって分析した (図35
b)。変異Ser 404-Ala はステージ１でのリン酸化能でそ
のシフトを失なうがしかし、このタンパクのリン酸化は
依然として微小管結合能に対し大きな影響を与えこれを
減少させる (ストイキオメトリーの差異はDn＝0.17、即
ち非変異の対照Dn＝0.33の52％) 。これは、残るSer 20
2 、235 、および 262の一つあるいはそれ以上が、結合
に対するリン酸化の効果の大きな部分に影響を与えてい
ることを示唆する。同様の結果が Ser 202、 235および
396を AlaまたはAsp に変異させたときにも得られ、こ
れらの残基のいずれもが野性型のｈtau 23について観察
されるリン酸化後の低いストイキオメトリーを説明する
ことはできない。しかし、Ser262を変えたとき、微小管
への結合はリン酸化によってほとんど影響を受けなかっ
た (Dn＝0.04) 。言葉を変えると、最初の反復単位中の
Ser 262 のただ１つの変異がタウの微小管結合のリン酸
化に対する感受性をほぼ除去することができる、あるい
は逆に、Ser 262 のリン酸化がタウの微小管への結合を
劇的に低下させる。 ｂ ＭＡＰキナーゼはタウのアルツハイマー様の免疫反
応性をひき起こすが、微小管への結合をそこなわない。
【０１４７】ａ節の結合データは脳の抽出物について得
られたものであるが、抽出物によるリン酸化の性質の大
部分はアフリカツエガエルの卵母細胞またはブタの脳か
ら精製したＭＡＰキナーゼによって誘発させることがで
きる。抽出物およびＭＡＰキナーゼはゲルシフトを誘発
し、リン酸化の時間経過は類似しており、ともに抗体に
対して類似の (ステージ２のリン酸化とともに“アルツ
ハイマー様”の反応が始まることも含め) パターンをひ
き起こす。抽出物について見出される主なリン酸化のサ
イトはSer-Pro モチーフにあり、このすべてはＭＡＰキ
ナーゼによってもリン酸化される。ＭＡＰキナーゼによ
ってThr-Pro モチーフもまたリン酸化され、精製したＭ
ＡＰキナーゼは脳の抽出物よりもプロリン依存の Ser/T
hrキナーゼとして効率がよい。最後にＭＡＰキナーゼは
脳の抽出物のなかの主なリン酸化成分である。
【０１４８】しかし、高度に精製したＭＡＰキナーゼの
タウの微小管の結合への影響を調べると、これは脳の抽
出物 (図36でDn＝0.31) に比較すると驚くほど小さい
(Dn＝0.09) ことがわかった。これは上の実験と一致し
ており、 Ser-ProまたはThr-Pro モチーフのリン酸化そ
れ自体は微小管の結合に関して単なる二義的な重要さし
か持たないことを示唆している。
【０１４９】これはｈtau 23から出発した２つの“全”
変異体、ＡＰ17およびＡＰ18を用いて検証された (図37
ａ) 。ＡＰ18はＡＰ17と似ているが、Ser 262 および 3
56 (抽出物のリン酸化で以前に見つかった、 Proがその
後に続かない２つのセリン)がさらにAla に変えられ
た。ＭＡＰキナーゼが野性型のｈtau 23のすべてのSer-
Pro およびThr-Pro サイトをリン酸化する (典型的には
ｈtau 23あたり最大10−12モルのPi) 一方、ＡＰ17のと
り込みはせいぜい１４Piであり、ＭＡＰキナーゼがSer-
Pro またはThr-Pro に対して高い特異性をもつことを示
している。ＭＡＰキナーゼによるリン酸化とは無関係
に、ＡＰ17は、リン酸化されていない野性型のｈtau 23
と同様のパラメーターをもって微小管をかたく結合す
る。同じ結果がＡＰ18とＭＡＰキナーゼを用いて得られ
る (Piのとり込み１未満) 。
【０１５０】しかしながら、ＡＰ17およびＡＰ18を脳抽
出物の活性でリン酸化した場合には、２つの変異体は劇
的な違いをみせる (図37ｂ) 。ＡＰ18のとり込みは約０
５Piで、リン酸化に際してタウの微小管への結合のスト
イキオメトリーの低下はほんの僅かである (Dn＝0.01)
。ＡＰ17のとり込みは約１３Piであり、しかもリン酸
化に際してのタウの微小管への結合の低下は野生型ｈta
u 23のものと同じである(Dn＝0.31) 。
【０１５１】これらの結果は、脳抽出物がＭＡＰキナー
ゼとはちがう、タウタンパクの最初の反復単位のなかの
Ser 262をリン酸化するあるリン酸化成分をもつように
みえること、またリン酸化をうけると、このただ一つの
セリンがタウと微小管の相互作用に劇的な影響を及ぼす
ことは明らかである。これとは対照的に、ＭＡＰキナー
ゼは、ゲルシフトおよび免疫反応という、タウのアルツ
ハイマー状態の他の指標に影響を与える。 ｃ 脳の35kDalおよび70kDalキナーゼはSer 262 のリン
酸化によって微小管結合を低下させる。
【０１５２】Ser 262 の周辺の配列は既知のキナーゼの
明らかなコンセンサスモチーフと一致せず、既知のキナ
ーゼを調べることはあまり意味がないように思われた。
その代り、脳の抽出物からキナーゼを精製した。活性分
画をタウのリン酸化および微小管結合への影響を基準に
同定した。
【０１５３】最初のステップは Mono Q のイオン交換ク
ロマトグラフィー (図38ａ) であり、キナーゼ活性のお
もな３ピークが得られた。微小管の結合に最大の影響を
与えるフラクションをさらにゲルクロマトグラフィーに
かけた (図38ｂ) 。おもな活性分画はMrが35kDalのあた
りに溶出された。この分画をさらにもう一度イオンクロ
マトグラフィーにかけた。このタンパクはMono Sには結
合せず、酸性の pＩをもつことが示唆されるが、Mono Q
上、一つの大きなピークとして溶出される (図38ｃ) 。
フラクション９の銀染色ゲルは、＞95％の純度の35kDal
のバンドと、41kDalあたり (図38ｄ、レーン５) のマイ
ナーバンド (＜５％) を示す。他のフラクションはもう
一つのバンドを45kDalあたりに持つが、これはキナーゼ
活性を持たなかった (下を見よ) 。
【０１５４】ゲル内のどのバンドがタウをリン酸化する
能力があるかを直接に決めるために、Geahlen et al.,
Anal. Biochem.150(1986), 151-158 の方法に従ってゲ
ル内アッセイを行った。タウタンパクをゲルマトリック
ス内に重合させ、Mono QフラクションをＳＤＳ電気泳動
によってこのゲル上で分離した。結合したタンパクはゲ
ル内で復元させ、放射性のＡＴＰとインキュベートし、
活性をオートラジオグラフィーでアッセイした。図39は
35kDalおよび41kDalバンドはキナーゼ活性をもつが45kD
alバンドはもたないことを示す。
【０１５５】キナーゼによるタウコンストラクトへのリ
ン酸のとり込み量の定量によって次のような結果が得ら
れた。ｈtau 34では３２Pi、ｈtau 40では３４、ｈtau
23では３３であるが、変異体ｈtau 23 (Ser 262 →Ala)
では２８だけだった。全変異体ＡＰ17へのとり込みは３
０Piであり、Ser-Pro またはThr-Pro モチーフはキナー
ゼの標的ではなく、３反復単位コンストラクトＫ18は１
４Piをとり込んだ。
【０１５６】キナーゼでリン酸化されたタウはＳＤＳゲ
ル中で上方にシフトする。図40ａはキナーゼによるタウ
の異なるゲルシフトを比較したものである。35kDalキナ
ーゼによるシフトは、ＰＫＡ (レーン10) によるものと
同様に中間の大きさで (レーン2)、ＣａＭキナーゼ (レ
ーン９) のものより大きいが、アルツハイマー様の免疫
反応をひき起こすＭＡＰキナーゼ (レーン11) のものよ
りは明らかに小さい。変異体Ser 409-Ala(レーン３,
４) はリン酸化によってシフトしないが、他の変異体
(たとえば Ser 416、レーン５, ６またはSer 404 レー
ン７, ８) はシフトし、セリン409 が35kDalキナーゼに
よるリン酸化によってシフトを生ずる残基があることを
示している。この同じシフトがSer 409 をもリン酸化す
るＰＫＡ (レー10) についてもみられる。反復領域内の
リン酸化がシフトを生じさせないので、これらのデータ
はシフトサイト (大部分がＣ−末端末尾にある) は微小
管の結合を制御しているサイト (たとえば Ser 262) と
ははっきり別のサイトであることを確認するものであ
る。
【０１５７】精製したキナーゼのタウの結合に対する影
響 (図40ｂ) は脳の抽出物のそれ (図37ｂ) に似てい
る。たとえばｈtau 23のストイキオメトリーはリン酸化
に際してDn＝0.28だけ低下するが、点変異体 Ser 262-A
laでは0.05だけであり、ふたたび Ser 262の重要性が強
調される。
【０１５８】第一の微小管結合反復単位と微小管結合に
重要であるSer 262 を拡大強調したｈtau 40の図式を図
41に示す。
【０１５９】タウが70kDalキナーゼによってリン酸化さ
れた場合にも、タウの微小管への結合に対して同様の影
響が観察される (図45参照) 。このキナーゼは約３−４
Piをタウの反復領域中のSer 262, 293, 324, 356に特異
的にとり込む。これは次のステップに従って調製され
る。ａ脳抽出物の高速遠心の上清を得る。ｂＱ−セファ
ロースのクロマトグラフィー。ｃ非吸着分画 (flowthro
ugh)のＳ−セファロースによるクロマトグラフィー。キ
ナーゼ活性は 250mM NaCl で溶出される。ｄヘパリンア
ガロースのクロマトグラフィー。キナーゼ活性は250mM
NaClで溶出される。ｅゲルろ過。キナーゼ活性は70kDal
で溶出。ｆ Mono Q のクロマトグラフィー。キナーゼ活
性は150mM NaClで溶出する。実施例12 ホスファターゼＰＰ２ａおよびＰＰ１による
タウタンパクの脱リン酸化 ｈtau 40を本明細書を通して述べられた方法に従って、
ブタＭＡＰキナーゼ (ｐ42) および32Ｐ−ＡＴＰを用い
てリン酸化した。続いてｈtau 40をいくつかのイソフォ
ームのＰＰ２ａ (図42ＡからＣまで) およびＰＰ１ (図
42Ｄ) によって脱リン酸化した。ｈtau 40はすべてのイ
ソフォームのＰＰ２ａおよび、よりゆっくりとではある
がＰＰ１によっても脱リン酸化される。図43は脱リン酸
化に伴って抗体特異的なエピトープも消失することを示
す。図44では脱リン酸化の時間経過およびミカエリスー
メンテン図を示した。
【０１６０】このようにＰＰ２ａおよびＰＰ１はＭＡＰ
キナーゼのアンタゴニストとして働らくので、アルツハ
イマー病の治療のための薬剤組成として用いることがで
きるであろう。
【０１６１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V. <120> Novel Tools for the Diagnosis and Treatment of Alzheimer's disease <130> PA99-177 <150> EP 91 12 0974.0 <151> 1991-12-06 <150> EP 92 11 9551.7 <151> 1992-11-16 <160> 33 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Glu Ser Pro Leu Gln 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Pro Gly Ser Pro Gly Thr 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Pro Lys Ser Pro Ser Ser 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Val Asp Ser Pro Gln Leu 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Pro Leu Gln Thr Pro Thr Glu 1 5 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser 1 5 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Val Val Arg Thr Pro Pro Lys 1 5 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His 1 5 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His 1 5 10 <210> 27 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln 20 25 <210> 28<211> 19<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 2
8 Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Gly Ser Arg <210> 29<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 2
9 Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 1 5 10 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg 1 5 10 <210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ser Pro Arg 20 <210> 32 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser 1 5 10 15 Pro Gln Leu Ala Thr Leu 20 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu 1 5
【図面の簡単な説明】
【図１】タウのアミノ酸配列（イソフォームｈｔａｕ４
０、Goedert ら、1989）（１ａ）、タウイソフォームの
ＳＤＳゲル（１ｂ(a)）、及びＡＴ８抗体を用いたイム
ノブロット（１ｂ(b)）を示す図である。
【図２】細菌によって発現させたヒトタウの、脳のキナ
ーゼを用いたリン酸化を示す図である。
【図３】構築体Ｋ３Ｍ、Ｋ１０、Ｋ１９及びＫ１７を示
す図である。
【図４】ｈｔａｕ４０ならびに構築体Ｋ１０、Ｋ１７、
Ｋ３ＭおよびＫ１９のリン酸化を示す図である。
【図５】トリプシンペプチドＳ１９５−Ｒ２０９を示す
図である。
【図６】ｈｔａｕ２３のＤ−変異体（Ｓ１９９とＳ２０
２をアスパルギン酸（Ｄ）に変えたもの）のリン酸化及
び抗体応を示す図である。
【図７】細菌によって発現させたヒトイソフォームｈｔ
ａｕ２３の脳キナーゼ活性によるリン酸化の経時変化、
ならびに対応オートラジオグラムを示す図である。
【図８】ｈｔａｕ２３のリン酸化の経時変化を示すＳＤ
Ｓゲル（ａ）、及びそのイムノブロット（ｂ）を示す図
である。
【図９】リン酸化前および後のタウイソフォームの微小
管への結合を示す図である。
【図１０】ｈｔａｕ４０の図であって、キナーゼ活性に
よりリン酸化された７個のＳｅｒ−Ｐｒｏモチーフの位
置を示すものである。
【図１１】ｈｔａｕ３４のリン酸化前（丸印）および９
０分間リン酸化後（三角印）の微小管への結合を示す図
である。
【図１２】アルツハイマー患者および正常なヒトの脳の
タウタンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動、ならびに抗体ＳＭＩ３３，ＳＭＩ３１およびＳＭＩ
３４を用いたそれらのイムノブロットを示す図である。
【図１３】細菌によって発現させたヒトイソフォームｈ
ｔａｕ２３のリン酸化の経時変化、ならびに抗体ＳＭＩ
３３、ＳＭＩ３１、ＳＭＩ３４、ＴＡＵ１およびＡＴ８
を用いたイムノブロットを示す図である。
【図１４】タウおよび構築体のＳＤＳゲル、ならびに抗
体ＳＭＩ３３、ＳＭＩ３１およびＳＭＩ３４を用いたイ
ムノブロットを示す図である。
【図１５】ｈｔａｕ４０およびｈｔａｕ２３の点変異体
を示す図である。
【図１６】ｈｔａｕ４０および図１５に示されたその点
変異体のＳＤＳゲル、ならびに抗体ＳＭＩ３３、ＳＭＩ
３１およびＳＭＩ３４を用いたイムノブロットを示す図
である。
【図１７】タウの欠失変異体およびそれらの抗体応答を
示す図である。
【図１８】ｈｔａｕ４０と本研究に使用した種々の変異
体を示す図である。
【図１９】タウの二量体化ならびにオリゴマー化の研究
に使用されたタウイソフォームおよび構築物を示す図で
ある。
【図２０】タウ構築体および架橋生成物のＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動（４−２０％）ならびにゲルクロ
マトグラフィーを示す図である。
【図２１】構築体Ｋ１２から合成した対らせん状フィラ
メントを示す図である。
【図２２】ＰＤＭで架橋したＫ１２二量体から合成し、
１％リンタングステン酸でネガティブ染色した対らせん
状フィラメントを示す図である。
【図２３】アルツハイマー患者脳の対らせん状フィラメ
ントを示す図である。
【図２４】グリセロール吹き付け及び金属影つけによっ
て調製したタウイソフォームｈｔａｕ２３および構築体
Ｔ８Ｒ−１の電子顕微鏡写真である。
【図２５】タウ構築体および二量体の長さを示す棒グラ
フである。
【図２６】構築体Ｋ１１およびＫ１２の電子顕微鏡写真
である。
【図２７】ＰＤＭで架橋したＫ１２二量体（ａ）、及び
ＭＢＳで架橋したＫ１２単量体（ｂ）を示す図である。
【図２８】ｈｔａｕ２３，Ｋ１２およびこれらの架橋生
成物の抗体標識を示す図である。
【図２９】ｈｔａｕ４０のＧＳＫ３によるリン酸化の経
過、ならびに免疫応答を示す図である。
【図３０】ＧＳＫ３を用いたリン酸化による移動度シフ
ト：ｈｔａｕ２３とその変異体／Ａ４０４の比較を示す
図である。
【図３１】タウ構築物を示す図である。
【図３２】ＭＡＰキナーゼおよびＧＳＫ３とブタ脳微小
管との共重合を示す図である。
【図３３】正常な脳抽出物およびアルツハイマー脳抽出
物におけるＧＳＫ３αおよびβの同定を示す図である。
【図３４】ｈｔａｕ２３の微小管（２０μＭタキソール
の存在下で１０μＭチューブリンより作製した）への結
合曲線を示す図である。
【図３５】この発明に使用したｈｔａｕ２３とその点変
異体（ａ）、及びｈｔａｕ２３とその点変異体の、未リ
ン酸化状態および脳抽出物によりリン酸化された状態で
の、微小管への結合曲線（ｂ）を示す図である。
【図３６】ｈｔａｕ４０の微小管への結合曲線を示す図
である。
【図３７】全変異体ＡＰ１８を示す図（ａ）、ならびに
ｈｔａｕ２３および「全」変異体ＡＰ１７およびＡＰ１
８の、脳抽出物によってリン酸化されていない、または
された状態での、微小管への結合曲線を示す図（ｂ）で
ある。
【図３８】クロマトグラフ法によるブタ脳由来キナーゼ
の調製を示す図である。
【図３９】キナーゼ活性のＳＤＳゲルおよびゲル内アッ
セイを示す図である。
【図４０】３５ｋＤａｌキナーゼによるタウのリン酸化
がゲル変化ならびに微小管結合に及ぼす影響を示す図で
ある。
【図４１】ｈｔａｕ４０を示す図である。
【図４２】32Ｐで標識したｈｔａｕ４０（「ｈｔ４０32
Ｐ」）の異なるＰＰａｓｅｓを用いた脱リン酸化を示す
図である。
【図４３】ＰＰ２ａ−Ｈによる脱リン酸化：リン酸化依
存性抗体の抗原決定基の消失を示す図である。
【図４４】ＰＰ２ａ−Ｈによる脱リン酸化の速度論を示
す図である。
【図４５】タウタンパク質の２個のＩＧＳモチーフおよ
び２個のＣＧＳモチーフ（セリン２６２、２９３、３２
４、４０９）をリン酸化する７０ｋＤａｌキナーゼの調
製を示す図である。
【図４６】ｃｄｋ２／サイクリンＡによるｈｔａｕ４０
のリン酸化の経時変化を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１０月１５日（１９９９．１０．
１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正内容】
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡＣ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/573 Ａ 33/573 Ａ６１Ｋ 31/00 ６２６Ｎ // Ａ６１Ｋ 31/00 ６２６ Ｃ１２Ｐ 21/08 38/46 Ａ６１Ｋ 37/52 Ｃ１２Ｐ 21/08 37/54 (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 マンデルコー，エクハルト ドイツ連邦共和国 2000 ハンブルグ 52 バロン−ヴォート−シュトラーセ 212 エイ. (72)発明者 リヒテンベルク−カラーク，ビルギット ドイツ連邦共和国 1000 ベルリン 65 ウェディングシュトラーセ ５ (72)発明者 ビルナット，ジャセク ドイツ連邦共和国 2000 ハンブルグ 11 ツォーハオシュトラーセ 12 (72)発明者 ドレヴェス，ゲラルド ドイツ連邦共和国 2000 ハンブルグ 36 ケーエル．シェーフェルカンプ 40 (72)発明者 スタイナー，バーバラ ドイツ連邦共和国 2000 シェネフェルト パークグルンド 12

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アルツハイマー病の発症のin vitro診断
    法であって、患者の脳脊髄液単離物を検定するか、また
    は神経組織の生検を実施して、タウタンパク質の262位
    のリン酸化セリン残基の存在について該組織を調べるこ
    とからなる方法。
  2. 【請求項２】 アルツハイマー病のin vitro診断および
    ／または監視法であって、患者の脳脊髄液単離物を検定
    するか、または神経組織の生検を実施し、そして − リン酸化されたアルツハイマータウタンパク質の存
    在について； − アミノ酸モチーフのser-pro またはthr-proのリン
    酸化によってタウタンパク質をアルツハイマータウタン
    パク質に特異的に変換することができるプロテインキナ
    ーゼの存在について；または − ホスファターゼＰＰ
    ２ａ、ＰＰ１および／またはカルシニューリンの存在に
    ついて；該組織を調べることからなる方法。
  3. 【請求項３】 前記プロテインキナーゼが次の生化学的
    性質： （ａ）タウタンパク質のser-pro およびthr-proモチー
    フをリン酸化する； （ｂ）４２ｋＤのＭr を有する； （ｃ）ＡＴＰにより活性化され、１．５ｍＭのＫm を有
    する； （ｄ）チロシンのリン酸化により活性化される； （ｅ）抗ＭＡＰキナーゼ抗体によって認識される；そし
    て （ｆ）ホスファターゼＰＰ２ａによって非活性化され
    る；を有するものである請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記のプロテインキナーゼが次の工程： （ａ）ブタ脳を 10 mMトリス-HCl、pH 7.2、5 mM EGTA
    、2 mM DTTおよびプロテアーゼ阻害剤（ロイペプチ
    ン、アプロチニン、ペプスタチンＡ、α２−マクログロ
    ブリン、ＰＭＳＦ）の混合物中でホモジナイズする； （ｂ）このホモジネートを100,000×g 、４℃で３０分
    遠心分離する； （ｃ）遠心分離後上清を取り出す； （ｄ）硫酸アンモニウム沈殿により粗タンパク質を沈殿
    させる；（ｅ）粗調製物をゲル濾過により脱塩する； （ｆ）活性化バッファー中でのインキュベーションによ
    り粗酵素を活性化する； （ｇ）粗調製物をイオン交換クロマトグラフィーにより
    さらに精製する；そして （ｈ）ウエスタンブロット法により酵素を同定する；に
    より得ることができる、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記タウタンパク質のエピトープの組合
    せを含むポリペプチドは、該組合せはリン酸化されたセ
    リン残基 46, 199, 202, 235, 262, 293, 324, 356, 39
    6, 404および／または422 および／またはリン酸化され
    たトレオニン残基 50, 69, 111, 153, 175, 181, 205,
    212, 217および／または231 を含むものであるが、該組
    合せは組合せSer199，Ser 202, Ser 235, Ser 404,およ
    び/またはThr 205ではないものである請求項２に記載の
    方法。
  6. 【請求項６】 前記タウタンパク質のエピトープの組合
    せを含むポリペプチドは、次のアミノ酸配列：KESPLQ,
    YSSPGSP, PGSPGT,YSSPGSPGTPGS,PKSPSS,YKSPVVS, GDTSP
    RH, MVDSPQL, PLQTPTE, LKESPLQTPTED, AKSTPTA, IGDTP
    SL, KIATPRGA, PAKTPPA, APKTPPS, PAKTPPAPKTPPS, SPG
    TPGS, RSRTPSL, SLPTPPT, RSRTPSLPTPPT, VVRTPPK, VVR
    TPPKSPSSA, KIGSTENLK, KCGSKDNIK, KCGSLGNIH, または
    KIGSLDNITHを有するポリペプチドである請求項２に記載
    の方法。
  7. 【請求項７】 アルツハイマータウタンパク質およびタ
    ウタンパク質のセリン残基 262のリン酸化を、請求項５
    または６に記載のタウタンパク質のエピト−プの組合せ
    を含むポリペプチド又は請求項３又は４記載のプロテイ
    ンキナーゼに対する抗体を使って検出する、請求項２に
    記載の方法。
  8. 【請求項８】 請求項５または６に記載のタウタンパク
    質のエピト−プの組合せを含むポリペプチドを用いるこ
    とにより、及び/又はこのポリペプチドに対するモノク
    ローナル抗体、又は請求項３又は４記載のプロテインキ
    ナーゼに対するモノクローナル抗体を用いることによ
    り、プロテインキナーゼを検出する、請求項２に記載の
    方法。
  9. 【請求項９】 正常タウタンパク質を、該正常タウタン
    パク質のリン酸化を可能にする条件下において、アミノ
    酸モチーフのser-pro またはthr-proのリン酸化によっ
    てタウタンパク質をアルツハイマータウタンパク質に特
    異的に変換することができるプロテインキナーゼで処理
    することからなる、タウタンパク質のアルツハイマータ
    ウタンパク質へのin vitro変換法。
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