JP2000007571A - 白血球の分離、濃縮方法 - Google Patents
白血球の分離、濃縮方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 赤血球の混入や汚染を極力防止することがで
き、移植される造血幹細胞数を厳密に把握することので
きる、無菌操作の可能な白血球の分離、濃縮方法を提供
する。 【解決手段】 親バッグに採取された血液母液を、親バ
ッグへの子バッグの取付部を下にして軽遠心または吊り
下げ静置し、上層の白血球層と下層の赤血球層に分離す
る。下層の赤血球を１つの子バッグに移注してこの子バ
ッグを親バッグから分離する。次に、この親バッグを子
バッグとの取付部を上にして軽遠心し、白血球層を上層
の血漿層と下層の白血球濃厚液層に分離し、上層の血漿
を子バッグにゆっくり移注して、白血球濃厚液を収容し
た親バッグに所定量の凍害防止剤を無菌的に添加した
後、白血球濃厚液を凍結バッグに移注する。
き、移植される造血幹細胞数を厳密に把握することので
きる、無菌操作の可能な白血球の分離、濃縮方法を提供
する。 【解決手段】 親バッグに採取された血液母液を、親バ
ッグへの子バッグの取付部を下にして軽遠心または吊り
下げ静置し、上層の白血球層と下層の赤血球層に分離す
る。下層の赤血球を１つの子バッグに移注してこの子バ
ッグを親バッグから分離する。次に、この親バッグを子
バッグとの取付部を上にして軽遠心し、白血球層を上層
の血漿層と下層の白血球濃厚液層に分離し、上層の血漿
を子バッグにゆっくり移注して、白血球濃厚液を収容し
た親バッグに所定量の凍害防止剤を無菌的に添加した
後、白血球濃厚液を凍結バッグに移注する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血液成分を含有す
る血液母液から白血球を分離し、濃縮する方法に関し、
特に臍帯血、骨髄液、造血幹細胞および／または造血前
駆細胞を含む白血球を、末梢血等から安全かつ無菌的
に、効率よく、迅速に、そして経済的に採血し、分離
し、濃縮する方法に関する。
る血液母液から白血球を分離し、濃縮する方法に関し、
特に臍帯血、骨髄液、造血幹細胞および／または造血前
駆細胞を含む白血球を、末梢血等から安全かつ無菌的
に、効率よく、迅速に、そして経済的に採血し、分離
し、濃縮する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、臍帯血移植、骨髄移植或いは末梢
血幹細胞移植による造血幹細胞移植が、再生不良性貧血
や白血病などの血液疾患や、乳癌、精巣癌などの固形
癌、或いは、リューマチなどの自己免疫疾患の根治療法
として注目されつつある。造血幹細胞移植を行うに当た
っては、臍帯血、骨髄或いは末梢血等の血液母液から、
造血幹細胞や造血前駆細胞を含む白血球を安全かつ無菌
的に、効率良く、迅速に、そして、経済的に採取し、分
離し、濃縮して、移植に備えておく必要がある。また、
血液母液の処理工程においては、移植される造血幹細胞
数を厳密に把握するために、バッグ間で移注される血液
成分の容量を把握しつつ処理作業を行う必要があるが、
さらに、煩雑な作業を極力排除して作業効率を向上させ
るとともに、煩雑な作業に起因する製剤の汚染やコスト
アップを防止する必要がある。
血幹細胞移植による造血幹細胞移植が、再生不良性貧血
や白血病などの血液疾患や、乳癌、精巣癌などの固形
癌、或いは、リューマチなどの自己免疫疾患の根治療法
として注目されつつある。造血幹細胞移植を行うに当た
っては、臍帯血、骨髄或いは末梢血等の血液母液から、
造血幹細胞や造血前駆細胞を含む白血球を安全かつ無菌
的に、効率良く、迅速に、そして、経済的に採取し、分
離し、濃縮して、移植に備えておく必要がある。また、
血液母液の処理工程においては、移植される造血幹細胞
数を厳密に把握するために、バッグ間で移注される血液
成分の容量を把握しつつ処理作業を行う必要があるが、
さらに、煩雑な作業を極力排除して作業効率を向上させ
るとともに、煩雑な作業に起因する製剤の汚染やコスト
アップを防止する必要がある。
【０００３】白血球を採血し、分離し、濃縮して凍結保
存する方法としては、従来、血液母液を汚染させないよ
う厳重な注意の下に、注射器を用いて採血し、これを清
潔な試験管に移し、これに赤血球沈降剤を添加して、軽
遠心を行った後、上清のみを清潔な試験管に移し、凍害
防止剤を添加して凍結保存する方法（試験管法）や、血
液母液を採血バッグに採取し、赤血球沈降剤を添加して
軽遠心を行った後、採血バッグのポートに白血球バッグ
の接続チューブのプラスチック針を接続して、採血バッ
グ中の濃縮された白血球層を白血球バッグに移注し、さ
らに遠心分離して上清を除去することによって、白血球
層を適切な液量まで濃縮し、これに凍害防止などの処置
を施して凍結保存する方法（バッグ法、ＷＯ９６／１７
５１４号公報）などが知られている。
存する方法としては、従来、血液母液を汚染させないよ
う厳重な注意の下に、注射器を用いて採血し、これを清
潔な試験管に移し、これに赤血球沈降剤を添加して、軽
遠心を行った後、上清のみを清潔な試験管に移し、凍害
防止剤を添加して凍結保存する方法（試験管法）や、血
液母液を採血バッグに採取し、赤血球沈降剤を添加して
軽遠心を行った後、採血バッグのポートに白血球バッグ
の接続チューブのプラスチック針を接続して、採血バッ
グ中の濃縮された白血球層を白血球バッグに移注し、さ
らに遠心分離して上清を除去することによって、白血球
層を適切な液量まで濃縮し、これに凍害防止などの処置
を施して凍結保存する方法（バッグ法、ＷＯ９６／１７
５１４号公報）などが知られている。
【０００４】一般に、造血幹細胞製剤等の生物製剤を製
造する場合、生物製剤を滅菌することが極めて難しいこ
とから、細菌による汚染を防ぐために、全ての製造工程
をクローズドシステムにすることが必要とされる。しか
しながら、上記の方法は、試験管法では、血液母液等を
注射器から試験管に移注する時、試験管を密封して凍結
保存する時に、また、バッグ法では、血液等を採血バッ
グから他のバッグに移注する時に、血液等が直接外気に
触れる工程を含んでおり、環境中に存在する細菌等によ
り汚染される可能性があり、血液母液処理法としては、
決して満足できるものではない。従って、汚染の虞のな
い造血幹細胞製剤を製造するために、完全な無菌操作を
前提に、血液母液の新しい処理方法の開発が望まれてい
る。
造する場合、生物製剤を滅菌することが極めて難しいこ
とから、細菌による汚染を防ぐために、全ての製造工程
をクローズドシステムにすることが必要とされる。しか
しながら、上記の方法は、試験管法では、血液母液等を
注射器から試験管に移注する時、試験管を密封して凍結
保存する時に、また、バッグ法では、血液等を採血バッ
グから他のバッグに移注する時に、血液等が直接外気に
触れる工程を含んでおり、環境中に存在する細菌等によ
り汚染される可能性があり、血液母液処理法としては、
決して満足できるものではない。従って、汚染の虞のな
い造血幹細胞製剤を製造するために、完全な無菌操作を
前提に、血液母液の新しい処理方法の開発が望まれてい
る。
【０００５】また、臍帯血移植時には、副作用の原因と
なることが懸念される赤血球の混入を無くするか、また
は、極力少なくすることが要求される。そこで、血液母
液に、収容した親バッグを遠心分離後、底に開口した連
結チューブから赤血球を抜く方法（いわゆるトップ＆ボ
トム法、特公昭６３−２０１４４公報参照）を適用する
ことが考えられる。この方法では、白血球層と赤血球層
の界面を乱すことなく赤血球を除くことができるので赤
血球の混入を少なくすることが出来る。また、無菌操作
も、移植される造血幹細胞数を厳密に把握することも可
能である。しかしながら、上記トップ＆ボトム法を単純
に血液母液に適用したところ、理由は明らかでないが、
赤血球の混入に関して必ずしも満足すべき結果が得られ
なかった。
なることが懸念される赤血球の混入を無くするか、また
は、極力少なくすることが要求される。そこで、血液母
液に、収容した親バッグを遠心分離後、底に開口した連
結チューブから赤血球を抜く方法（いわゆるトップ＆ボ
トム法、特公昭６３−２０１４４公報参照）を適用する
ことが考えられる。この方法では、白血球層と赤血球層
の界面を乱すことなく赤血球を除くことができるので赤
血球の混入を少なくすることが出来る。また、無菌操作
も、移植される造血幹細胞数を厳密に把握することも可
能である。しかしながら、上記トップ＆ボトム法を単純
に血液母液に適用したところ、理由は明らかでないが、
赤血球の混入に関して必ずしも満足すべき結果が得られ
なかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、如上の事情
に鑑みてなされたもので、赤血球の混入や汚染を極力防
止することができ、移植される造血幹細胞数を厳密に把
握することのできる、無菌操作の可能な白血球の分離、
濃縮方法を提供することを目的とする。
に鑑みてなされたもので、赤血球の混入や汚染を極力防
止することができ、移植される造血幹細胞数を厳密に把
握することのできる、無菌操作の可能な白血球の分離、
濃縮方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意検討の
結果、軽遠心により分画された白血球層をさらに軽遠心
して、血漿層と白血球濃厚液層に分画することにより上
記の課題が解決されることを見出し、本発明を完成し
た。すなわち、本発明は、採血チューブを備えた親バッ
グに連結チューブを介して凍結バッグと複数の子バッグ
が連結されてなる血液母液処理バッグを使用する白血球
の分離、濃縮方法であって、（ａ）採血チューブを通し
て親バッグに血液母液を採取する。（ｂ）親バッグを子
バッグと連結する連結チューブの取付部を下にして軽遠
心または吊り下げ静置し、血液母液を上層の白血球層と
下層の赤血球層に分離する。（ｃ）下層の赤血球を取付
部を下にした連結チューブを経由して１つの子バッグに
移注する。（ｄ）赤血球の移注された子バッグを、連結
チューブを溶断して親バッグから分離する。（ｅ）赤血
球の除かれた親バッグを子バッグと連結する連結チュー
ブの取付部を上にして軽遠心し、白血球層を上層の血漿
層と下層の白血球濃厚液層に分離する。（ｆ）上層の血
漿を、親バッグの容量が所定量になるまで子バッグにゆ
っくり移注する。（ｇ）白血球濃厚液を収容した親バッ
グに所定量の凍害防止剤を無菌的に添加する。（ｈ）凍
結防止剤を含む白血球濃厚液を、落差を利用して凍結バ
ッグに移注し、連結チューブを溶断して、凍結バッグを
親バッグから分離する。の各工程を含んでなる。尚、工
程（ｂ）の前に、血液母液の採取された親バッグに所定
量の赤血球沈降剤を添加してもよい。
結果、軽遠心により分画された白血球層をさらに軽遠心
して、血漿層と白血球濃厚液層に分画することにより上
記の課題が解決されることを見出し、本発明を完成し
た。すなわち、本発明は、採血チューブを備えた親バッ
グに連結チューブを介して凍結バッグと複数の子バッグ
が連結されてなる血液母液処理バッグを使用する白血球
の分離、濃縮方法であって、（ａ）採血チューブを通し
て親バッグに血液母液を採取する。（ｂ）親バッグを子
バッグと連結する連結チューブの取付部を下にして軽遠
心または吊り下げ静置し、血液母液を上層の白血球層と
下層の赤血球層に分離する。（ｃ）下層の赤血球を取付
部を下にした連結チューブを経由して１つの子バッグに
移注する。（ｄ）赤血球の移注された子バッグを、連結
チューブを溶断して親バッグから分離する。（ｅ）赤血
球の除かれた親バッグを子バッグと連結する連結チュー
ブの取付部を上にして軽遠心し、白血球層を上層の血漿
層と下層の白血球濃厚液層に分離する。（ｆ）上層の血
漿を、親バッグの容量が所定量になるまで子バッグにゆ
っくり移注する。（ｇ）白血球濃厚液を収容した親バッ
グに所定量の凍害防止剤を無菌的に添加する。（ｈ）凍
結防止剤を含む白血球濃厚液を、落差を利用して凍結バ
ッグに移注し、連結チューブを溶断して、凍結バッグを
親バッグから分離する。の各工程を含んでなる。尚、工
程（ｂ）の前に、血液母液の採取された親バッグに所定
量の赤血球沈降剤を添加してもよい。
【０００８】
【発明の実施の形態】次に本発明の実施例について図面
に基づいて説明する。図１および図２は本発明で使用す
る血液母液処理バッグの例を示す説明図である。図１に
示す血液母液処理バッグは、血液抗凝固剤を含む親バッ
グ１に、先端に採血針２１を備えた採血チューブ２およ
び、子バッグ３、４、凍結バッグ５を接続したもので、
採血チューブ２および、子バッグ３、４、凍結バッグ５
が全て天面で接続されている。ここで６１、６３、６
４、６５は連結チューブ、７３、７４、７５はクラン
プ、８は赤血球沈降剤を添加するためのポートである。
また、図２に示す血液母液処理バッグは、図１において
子バッグ３および凍結バッグ５が底面で接続されたもの
である。
に基づいて説明する。図１および図２は本発明で使用す
る血液母液処理バッグの例を示す説明図である。図１に
示す血液母液処理バッグは、血液抗凝固剤を含む親バッ
グ１に、先端に採血針２１を備えた採血チューブ２およ
び、子バッグ３、４、凍結バッグ５を接続したもので、
採血チューブ２および、子バッグ３、４、凍結バッグ５
が全て天面で接続されている。ここで６１、６３、６
４、６５は連結チューブ、７３、７４、７５はクラン
プ、８は赤血球沈降剤を添加するためのポートである。
また、図２に示す血液母液処理バッグは、図１において
子バッグ３および凍結バッグ５が底面で接続されたもの
である。
【０００９】図１に示す血液母液処理バッグを使用する
場合について説明する。先ず、親バッグ１（容量２００
ｍｌ、血液凝固剤としてＣＰＤ液２８ｍｌ収容）に採血
チューブ２を通して血液母液を採取する（工程ａ）。血
液母液を採取後、必要に応じて、親バッグ１にポート８
を通して所定量の赤血球沈降剤（例えばＤＭＳＯ５ｍ
ｌ）を加えてもよく、また、ポート８から検査試料を採
取してもよい。次に、この親バッグ１を、子バッグ３、
４（容量１５０ｍｌ）と連結する連結チューブ６１の取
り付け部を下にして、すなわち、底部が上になるように
倒立させて軽遠心する（工程ｂ）。これにより、比重の
大きい赤血球層が親バッグ１の下層に沈降し、白血球層
と赤血球層の間に明確な界面が形成され、血液母液が上
層の白血球層と下層の赤血球層に分離される。尚、赤血
球沈降剤を加えた場合、赤血球は短時間で沈降するが、
充分な時間が許される場合は、赤血球沈降剤を加えなく
ても、さらには軽遠心をしないで吊り下げ静置しただけ
でも、赤血球が沈降して、血液母液を白血球層と赤血球
層に分離することができる。
場合について説明する。先ず、親バッグ１（容量２００
ｍｌ、血液凝固剤としてＣＰＤ液２８ｍｌ収容）に採血
チューブ２を通して血液母液を採取する（工程ａ）。血
液母液を採取後、必要に応じて、親バッグ１にポート８
を通して所定量の赤血球沈降剤（例えばＤＭＳＯ５ｍ
ｌ）を加えてもよく、また、ポート８から検査試料を採
取してもよい。次に、この親バッグ１を、子バッグ３、
４（容量１５０ｍｌ）と連結する連結チューブ６１の取
り付け部を下にして、すなわち、底部が上になるように
倒立させて軽遠心する（工程ｂ）。これにより、比重の
大きい赤血球層が親バッグ１の下層に沈降し、白血球層
と赤血球層の間に明確な界面が形成され、血液母液が上
層の白血球層と下層の赤血球層に分離される。尚、赤血
球沈降剤を加えた場合、赤血球は短時間で沈降するが、
充分な時間が許される場合は、赤血球沈降剤を加えなく
ても、さらには軽遠心をしないで吊り下げ静置しただけ
でも、赤血球が沈降して、血液母液を白血球層と赤血球
層に分離することができる。
【００１０】次に、この親バッグ１を倒立させたまま、
落差または分離スタンド（図示していない）を利用し
て、下層の赤血球を連結チューブ６１、６４を経由して
子バッグ４に移注する（工程ｃ）。この際、上清の白血
球が混入しないように注意しつつ、静かに、ゆっくり移
注する必要がある。この移注操作は、連結チューブ６１
の親バッグ１への取付部が下になっているので、下層の
赤血球を落差を利用して子バッグ４に移注させた時に、
白血球層と赤血球層の界面が水平を保ったまま乱れるこ
となく下降する。従って、上層の白血球が赤血球層に混
入することがないので、下層の赤血球の殆どを子バッグ
４に移送することができる。下層の赤血球の移注された
子バッグ４は、これに繋がる連結チューブ６４を、例え
ばチューブシーラー（図示していない）等を用いて溶断
して親バッグ１から分離し（工程ｄ）、廃棄する。
落差または分離スタンド（図示していない）を利用し
て、下層の赤血球を連結チューブ６１、６４を経由して
子バッグ４に移注する（工程ｃ）。この際、上清の白血
球が混入しないように注意しつつ、静かに、ゆっくり移
注する必要がある。この移注操作は、連結チューブ６１
の親バッグ１への取付部が下になっているので、下層の
赤血球を落差を利用して子バッグ４に移注させた時に、
白血球層と赤血球層の界面が水平を保ったまま乱れるこ
となく下降する。従って、上層の白血球が赤血球層に混
入することがないので、下層の赤血球の殆どを子バッグ
４に移送することができる。下層の赤血球の移注された
子バッグ４は、これに繋がる連結チューブ６４を、例え
ばチューブシーラー（図示していない）等を用いて溶断
して親バッグ１から分離し（工程ｄ）、廃棄する。
【００１１】次に赤血球が除かれ白血球層が残っている
親バッグ１を、子バッグ３と連結する連結チューブ６１
の取り付け部を上にして、すなわち、底部が下になるよ
うに正立させて軽遠心する（工程ｅ）。これにより、目
的の白血球が一層凝縮されて親バッグ１の下層に沈降
し、上清は白血球を含まない血漿層になる。この上清の
血漿層を分離スタンド（図示していない）を用いて、親
バッグ１の重量を観察しながら（通常、親バッグ１を電
子天秤に載せて重量を観察する）、落差により親バッグ
１の容量が所定量になるまで子バッグ３に静かにゆっく
り移注する（工程ｆ）。ここで、造血幹細胞製剤の品質
管理の最重要管理項目は、製剤中の白血球数の管理であ
り、そのため白血球の正確な容量管理が要求される。従
って、本発明では、一旦子バッグ３に移注された血漿を
適当量親バッグ１に無菌的、かつ正確に戻すことができ
るように、血液母液処理バッグは親バッグ１と子バッグ
３が連結チューブ６１、６３で一体に接続されている。
親バッグ１中の白血球数は、正確に所定容量に調整され
た白血球濃厚液の容量と、別途サンプリング白血球濃厚
液の検査結果から、正確に算出することができる。ま
た、工程ｆにおいては、白血球が親バッグ１の底に沈降
していることから、血漿の子バッグ３への移注の際に発
生する白血球の損失を極めて少なくすることができる。
親バッグ１を、子バッグ３と連結する連結チューブ６１
の取り付け部を上にして、すなわち、底部が下になるよ
うに正立させて軽遠心する（工程ｅ）。これにより、目
的の白血球が一層凝縮されて親バッグ１の下層に沈降
し、上清は白血球を含まない血漿層になる。この上清の
血漿層を分離スタンド（図示していない）を用いて、親
バッグ１の重量を観察しながら（通常、親バッグ１を電
子天秤に載せて重量を観察する）、落差により親バッグ
１の容量が所定量になるまで子バッグ３に静かにゆっく
り移注する（工程ｆ）。ここで、造血幹細胞製剤の品質
管理の最重要管理項目は、製剤中の白血球数の管理であ
り、そのため白血球の正確な容量管理が要求される。従
って、本発明では、一旦子バッグ３に移注された血漿を
適当量親バッグ１に無菌的、かつ正確に戻すことができ
るように、血液母液処理バッグは親バッグ１と子バッグ
３が連結チューブ６１、６３で一体に接続されている。
親バッグ１中の白血球数は、正確に所定容量に調整され
た白血球濃厚液の容量と、別途サンプリング白血球濃厚
液の検査結果から、正確に算出することができる。ま
た、工程ｆにおいては、白血球が親バッグ１の底に沈降
していることから、血漿の子バッグ３への移注の際に発
生する白血球の損失を極めて少なくすることができる。
【００１２】次に、この白血球濃厚液を収容した親バッ
グ１に、ポート８を通して無菌的に所定量の凍害防止剤
を添加する（工程ｇ）。添加される凍害防止剤の量は、
例えばＤＭＳＯとデキストラン４０を１：１の比率で混
合した凍害防止剤の場合、白血球濃厚液２０ｍｌに対し
て５ｍｌである。所定の容量に濃縮され、血液凝固剤お
よび凍害防止剤を含んだ白血球濃厚液は、落差を利用し
て凍結バッグ５に移注し、全て移注し終わったら連結チ
ューブ６５を溶断して凍結バッグ５を親バッグ１から分
離する（工程ｈ）。得られた造血幹細胞製剤は、常法に
従って液体窒素中に凍結保存される。尚、図２に示す血
液母液処理バッグを使用する場合については、工程ｂを
除いて、図１に示す血液母液処理バッグを使用する場合
と同様の操作を行えばよい。すなわち、図２に示す血液
母液処理バッグを使用する場合には、工程ｂでは、血液
母液処理バッグを倒立させる必要がなく、底を下にして
正立した状態で軽遠心を行う。
グ１に、ポート８を通して無菌的に所定量の凍害防止剤
を添加する（工程ｇ）。添加される凍害防止剤の量は、
例えばＤＭＳＯとデキストラン４０を１：１の比率で混
合した凍害防止剤の場合、白血球濃厚液２０ｍｌに対し
て５ｍｌである。所定の容量に濃縮され、血液凝固剤お
よび凍害防止剤を含んだ白血球濃厚液は、落差を利用し
て凍結バッグ５に移注し、全て移注し終わったら連結チ
ューブ６５を溶断して凍結バッグ５を親バッグ１から分
離する（工程ｈ）。得られた造血幹細胞製剤は、常法に
従って液体窒素中に凍結保存される。尚、図２に示す血
液母液処理バッグを使用する場合については、工程ｂを
除いて、図１に示す血液母液処理バッグを使用する場合
と同様の操作を行えばよい。すなわち、図２に示す血液
母液処理バッグを使用する場合には、工程ｂでは、血液
母液処理バッグを倒立させる必要がなく、底を下にして
正立した状態で軽遠心を行う。
【００１３】〔実施例１〜２〕出産後に娩出された胎盤
および臍帯を滅菌済みトレーに入れて、これを清潔な臍
帯血採血室に移した後、胎盤保持具と胎盤シーツを用い
て臍帯側を下向きにしてスタンドに吊るし、臍帯の表面
を良く消毒してから、図１（実施例１）および図２（実
施例２）に示すような血液母液処理バッグを用いて、そ
れぞれ本発明の方法に従い血液母液から白血球を分離、
濃縮した後、白血球の収容された凍結バッグ５を常法に
従って液体窒素中で凍結保存した。こうして得られた造
血幹細胞製剤を各６単位ずつ用意し、それぞれ３７℃の
温水中で解凍して、無菌性および品質（有核細胞回収
率、造血前駆細胞回収率および色）の検査を行ったとこ
ろ、表１のような結果が得られた。なお、本試験におい
ては、親バッグ１に血液母液を採血後、採血量の２０％
に相当するＨＥＳ４０（６％ヒドロキシエチル澱粉、菱
山製薬（株）製）を、３０ｍｌシリンジを用いてポート
８から親バッグ１に添加している。また、工程ｂおよび
工程ｅにおける遠心は、それぞれ遠心力７０Ｇで５分
間、および遠心力４００Ｇで５分間行った。また、無菌
性の検査は血液検査用ボトル（ベクトン・ディキンソン
社製）を用いて、３５℃の好気的雰囲気および２５℃の
嫌気的条件下で２週間培養して行った。有核細胞数は自
動血球数測定機（コールター社製）を用いて測定し、造
血前駆細胞数はメチルセルローズ培地を用いて温度３７
℃、ＣＯ2 濃度５％の雰囲気で２週間培養し、顕微鏡下
で観察計数した。赤血球混入の程度は製剤の赤色化（濃
淡）の程度を目視で比較することにより判定した。
および臍帯を滅菌済みトレーに入れて、これを清潔な臍
帯血採血室に移した後、胎盤保持具と胎盤シーツを用い
て臍帯側を下向きにしてスタンドに吊るし、臍帯の表面
を良く消毒してから、図１（実施例１）および図２（実
施例２）に示すような血液母液処理バッグを用いて、そ
れぞれ本発明の方法に従い血液母液から白血球を分離、
濃縮した後、白血球の収容された凍結バッグ５を常法に
従って液体窒素中で凍結保存した。こうして得られた造
血幹細胞製剤を各６単位ずつ用意し、それぞれ３７℃の
温水中で解凍して、無菌性および品質（有核細胞回収
率、造血前駆細胞回収率および色）の検査を行ったとこ
ろ、表１のような結果が得られた。なお、本試験におい
ては、親バッグ１に血液母液を採血後、採血量の２０％
に相当するＨＥＳ４０（６％ヒドロキシエチル澱粉、菱
山製薬（株）製）を、３０ｍｌシリンジを用いてポート
８から親バッグ１に添加している。また、工程ｂおよび
工程ｅにおける遠心は、それぞれ遠心力７０Ｇで５分
間、および遠心力４００Ｇで５分間行った。また、無菌
性の検査は血液検査用ボトル（ベクトン・ディキンソン
社製）を用いて、３５℃の好気的雰囲気および２５℃の
嫌気的条件下で２週間培養して行った。有核細胞数は自
動血球数測定機（コールター社製）を用いて測定し、造
血前駆細胞数はメチルセルローズ培地を用いて温度３７
℃、ＣＯ2 濃度５％の雰囲気で２週間培養し、顕微鏡下
で観察計数した。赤血球混入の程度は製剤の赤色化（濃
淡）の程度を目視で比較することにより判定した。
【００１４】〔比較例１〜３〕出産後に娩出された胎盤
および臍帯を滅菌済みトレーに入れて、これを清潔な臍
帯血採血室に移した後、胎盤保持具と胎盤シーツを用い
て臍帯側を下向きにしてスタンドに吊るし、臍帯の表面
を良く消毒してから、従来のバッグ法（比較例１）およ
び試験管法（比較例２）に従い、また図２に示すような
血液母液処理バッグにバッグ法を適用して（比較例
３）、それぞれ血液母液から白血球を分離、濃縮した
後、白血球の収容された凍結バッグ５を常法に従って液
体窒素中で凍結保存した。こうして得られた造血幹細胞
製剤を各６単位ずつ用意し、それぞれ３７℃の温水中で
解凍して、試験例１と同様の検査を行ったところ、表１
のような結果が得られた。表から、本発明による造血幹
細胞の品質が、従来法と比較して、無菌性、有核細胞回
収率、造血前駆細胞回収率に優れ、赤血球の混入が少な
いのがわかる。
および臍帯を滅菌済みトレーに入れて、これを清潔な臍
帯血採血室に移した後、胎盤保持具と胎盤シーツを用い
て臍帯側を下向きにしてスタンドに吊るし、臍帯の表面
を良く消毒してから、従来のバッグ法（比較例１）およ
び試験管法（比較例２）に従い、また図２に示すような
血液母液処理バッグにバッグ法を適用して（比較例
３）、それぞれ血液母液から白血球を分離、濃縮した
後、白血球の収容された凍結バッグ５を常法に従って液
体窒素中で凍結保存した。こうして得られた造血幹細胞
製剤を各６単位ずつ用意し、それぞれ３７℃の温水中で
解凍して、試験例１と同様の検査を行ったところ、表１
のような結果が得られた。表から、本発明による造血幹
細胞の品質が、従来法と比較して、無菌性、有核細胞回
収率、造血前駆細胞回収率に優れ、赤血球の混入が少な
いのがわかる。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【発明の効果】以上説明してきたことから明らかなよう
に、本発明の方法を採用することにより、血液母液から
白血球製剤を安全かつ無菌的に効率よく分離し濃縮し
て、造血幹細胞製剤として凍結保存することができる。
また、製剤に含まれる造血幹細胞数を精度良く管理する
ことができ、さらに製剤中への赤血球の混入を極力防止
することができる。
に、本発明の方法を採用することにより、血液母液から
白血球製剤を安全かつ無菌的に効率よく分離し濃縮し
て、造血幹細胞製剤として凍結保存することができる。
また、製剤に含まれる造血幹細胞数を精度良く管理する
ことができ、さらに製剤中への赤血球の混入を極力防止
することができる。
【図１】本発明で使用する血液母液処理バッグの一例を
示す説明図である。
示す説明図である。
【図２】本発明で使用する血液母液処理バッグの他の例
を示す説明図である。
を示す説明図である。
１ 親バッグ ２ 採血チューブ ２１ 採血針 ３、４ 子バッグ ５ 凍結バッグ ６１、６３、６４、６５ 連結チューブ ７３、７４、７５ クランプ ８ ポート
Claims (2)
- 【請求項１】 採血チューブを備えた親バッグに連結チ
ューブを介して凍結バッグと複数の子バッグが連結され
てなる血液母液処理バッグを使用する、下記（ａ）〜
（ｈ）の工程を含んでなる白血球の分離、濃縮方法。 （ａ）採血チューブを通して親バッグに血液母液を採取
する。 （ｂ）親バッグを子バッグと連結する連結チューブの取
付部を下にして軽遠心または吊り下げ静置し、血液母液
を上層の白血球層と下層の赤血球層に分離する。 （ｃ）下層の赤血球を取付部を下にした連結チューブを
経由して１つの子バッグに移注する。 （ｄ）赤血球の移注された子バッグを、連結チューブを
溶断して親バッグから分離する。 （ｅ）赤血球の除かれた親バッグを子バッグと連結する
連結チューブの取付部を上にして軽遠心し、白血球層を
上層の血漿層と下層の白血球濃厚液層に分離する。 （ｆ）上層の血漿を、親バッグの容量が所定量になるま
で子バッグにゆっくり移注する。 （ｇ）白血球濃厚液を収容した親バッグに所定量の凍害
防止剤を無菌的に添加する。 （ｈ）凍結防止剤を含む白血球濃厚液を凍結バッグに移
注し、連結チューブを溶断して、凍結バッグを親バッグ
から分離する。 - 【請求項２】 工程（ｂ）の前に、血液母液の採取され
た親バッグに所定量の赤血球沈降剤を添加する工程を含
む請求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17819798A JP4061715B2 (ja) | 1998-06-25 | 1998-06-25 | 白血球の分離、濃縮方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17819798A JP4061715B2 (ja) | 1998-06-25 | 1998-06-25 | 白血球の分離、濃縮方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000007571A true JP2000007571A (ja) | 2000-01-11 |
| JP4061715B2 JP4061715B2 (ja) | 2008-03-19 |
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ID=16044290
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17819798A Expired - Fee Related JP4061715B2 (ja) | 1998-06-25 | 1998-06-25 | 白血球の分離、濃縮方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4061715B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005512089A (ja) * | 2001-12-05 | 2005-04-28 | ガンブロ、 インコーポレイテッド | 血液成分の分離方法及び装置 |
| JP2006094934A (ja) * | 2004-09-28 | 2006-04-13 | Asahi Kasei Medical Co Ltd | 血液浄化装置のプライミング方法および血液浄化装置 |
| JP2006109978A (ja) * | 2004-10-13 | 2006-04-27 | Terumo Corp | 血液成分採取装置 |
| JP2010193879A (ja) * | 2009-01-27 | 2010-09-09 | Jms Co Ltd | 臍帯血造血幹細胞の増殖制御方法およびその用途 |
| JP4846782B2 (ja) * | 2005-03-23 | 2011-12-28 | ビオセフ エス・アー | 再生医療のための、成人幹細胞を含む細胞サブセットを採集、加工及び移植するための統合システム |
| CN111548992A (zh) * | 2020-05-28 | 2020-08-18 | 章毅 | 规模化制备血液中免疫细胞的方法及其装置 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102009022793A1 (de) * | 2009-05-27 | 2010-12-02 | Justus-Liebig-Universität Giessen | Vorrichtung und Verfahren zur Herstellung von Blutprodukten |
-
1998
- 1998-06-25 JP JP17819798A patent/JP4061715B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP4594029B2 (ja) * | 2004-10-13 | 2010-12-08 | テルモ株式会社 | 血液成分採取装置 |
| JP4846782B2 (ja) * | 2005-03-23 | 2011-12-28 | ビオセフ エス・アー | 再生医療のための、成人幹細胞を含む細胞サブセットを採集、加工及び移植するための統合システム |
| JP2010193879A (ja) * | 2009-01-27 | 2010-09-09 | Jms Co Ltd | 臍帯血造血幹細胞の増殖制御方法およびその用途 |
| CN111548992A (zh) * | 2020-05-28 | 2020-08-18 | 章毅 | 规模化制备血液中免疫细胞的方法及其装置 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4061715B2 (ja) | 2008-03-19 |
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