CN111548992A - 规模化制备血液中免疫细胞的方法及其装置 - Google Patents

Abstract

一种规模化制备血液中免疫细胞的方法，先向采血袋中加入PBS并混匀，得稀释的血液；接着，控制稀释的血液从采血袋缓慢流入分离袋中，确保稀释的血液层位于分离液上层。待稀释的血液完全转入分离袋中后，将采血袋弃去；将分离袋置于离心机中离心；最后，从离心机中取出分离袋，置于压浆板上，使得分离袋上层的血浆压至血浆收集袋中，再将白膜层压至密闭容器，即从血液中分离得PBMC。本发明提供的方法，可以在无菌的全密闭容器中操作，对环境的无菌要求低，可显著降低制取的成本，提高了制取的便捷性，有利于从血液中规模化制取免疫细胞。

Description

规模化制备血液中免疫细胞的方法及其装置

技术领域

本发明涉及一种制取生物材料的方法，尤其涉及一种从血液中分离细胞的方法，以及装置。

背景技术

外周单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)制备，又称免疫细胞制备，是指从人外周血中采集一定量的血液(如：100ml)，利用淋巴细胞分离液和离心机等手段，采用密度梯度离心法去除血液样本中的红细胞和粒细胞等，分离获得PBMC的方法。随着人们对健康重视程度的增加，免疫细胞存储被称为是“预留健康细胞，为生命备份”的健康事业。

为了制取PBMC，目前通常的方法是：先用采血袋采集血液样本后，再将采集的血液分装到50ml离心管中(常见血液采集量为100ml，需要分装3～5个离心管)，接着根据实验需要，用缓冲液稀释血液样本，再将稀释后血液样本小心添加到含淋巴细胞分离液的离心管中(一般100ml血液需要分装到5～10个离心管中)，经差速离心后，从底部到往上依次形成红细胞和粒细胞富集层、分离液富集层、白膜层和血浆富集层等分层，最后收集“白膜层”细胞，即PBMC所在的分层，再进行后续的细胞清洗、计数、扩增培养和冻存等操作。在此过程中，一方面，血袋中的血必须先转移到离心管中分装，稀释后再转移并分装到含分离液的离心管中，才可以进行差速离心。经过多次分装，生物样品暴露频次增加，染菌几率大大提高，制备潜在污染风险高。另一方面，吸取分离液时要十分小心、慢速吸取，不能破坏分离层液面，对操作人员的实验技能要求高。100ml血完成白膜层收集要从7个离心管中分别吸取，不仅制备耗时长，也使得生物样品的染菌几率大大提高，不利于后续的细胞存储和使用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种从血液中制备免疫细胞的方法，降低生物样品染菌的风险，利于细胞的存储和使用。

本发明的另一个目的在于提供一种从血液中制备免疫细胞的方法，实现从血液中规模化制备免疫细胞，提高免疫细胞制取的效率。

本发明的再一个目的在于提供一种从血液中制备免疫细胞的方法，使得从血液中制取免疫细胞实现标准化。

本发明的又一个目的在于提供一种从血液中制备免疫细胞的方法，提高从血液中制取免疫细胞的自动化水平。

本发明的第五个目的在于提供一种装置，以实施从血液中制备免疫细胞的方法，提高从血液中制取免疫细胞的自动化水平。

本发明的第六个目的在于提供一种装置，以实施从血液中制备免疫细胞的方法，实现从血液中制取免疫细胞的标准化。

本发明提供一种从血液中制备免疫细胞的方法，包括：

先向采血袋中加入磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH7.4)并混匀，得稀释的血液；

接着，控制稀释的血液从采血袋缓慢流入分离袋中，确保稀释的血液层位于分离液上层。待稀释的血液完全转入分离袋中后，将采血袋(联合采血针)弃去(如：热合分离)；

然后，将分离袋置于离心机中离心(如：15℃～22℃，速度650g～850g，时间25min～35min)；

最后，从离心机中取出分离袋，置于压浆板(参见ZL2010206719788)上，使得分离袋上层的血浆压至血浆收集袋中，再将白膜层压至密闭容器(如：离心管)，即从血液中分离得PBMC。

本发明的方法，通常采用与血液等体积的PBS制得稀释的血液。

本发明的方法，准备分离袋时，需竖直放置分离袋，由加液口向分离袋中加入淋巴细胞分离液(用量与稀释的血液保持等体积)，使分离液沉于分离袋底部，结束后封闭加液口。

本发明的方法，还采用限流阀和管夹对流体的流速和方向进行控制。比如：将限流阀调整到最小流量位置，打开管夹，通过限流阀控制稀释的血液从采血袋缓慢流入分离袋中，确保血液层位于分离液上层。另如：关闭所有管夹和拧紧限流阀后，将分离袋置于离心机中。又如：打开分离袋与血浆收集袋之间的管夹，用限流阀控制流速，并将上层血浆压至血浆收集袋中，完成后关闭管夹，拧紧限流阀。

本发明的方法制得的PBMC后，还需要经过清洗和细胞计数后，加入适量冻存液后进行分装冻存。步骤列举如下：

按白膜层∶PBS(v∶v)＝1∶3稀释并混匀后离心，离心条件为：15℃～22℃，30g～400g，时间5min～10min；

之后，弃PBS上清，在加入5ml～10ml PBS，混匀后离心，离心条件为：15℃～20℃，速度300g～400g，时间5min～10min；

离心后，弃PBS上清，用适量PBS充分重悬并混匀所有细胞，进行细胞计数；

最后，再次离心后，根据细胞计数结果，加入适量冻存液，将细胞分装冻存。

本发明的方法，可以在无菌的全密闭容器中操作，对环境的无菌要求低，可显著降低制取的成本，提高了制取的便捷性，有利于从血液中规模化制取免疫细胞，不仅提高免疫细胞的制取效率，也提高了其它血液制品的制取效率和安全性，比如：血浆收集袋中的血浆可用于传染病检测等后续实验项目，或者制成血液制品。

本发明的方法器材简单，操作简便，易于实现血液制品的标准化，比如：PBMC和血浆制品，以及自动化。

一种从血液中制备免疫细胞的标准化实施方式，包括：

步骤1：无菌采集外周血血液样本；

步骤2：将采血针进行热合剪断处理，取无菌注射器，采血针沿行管向采血袋中加入PBS(用量通常与血液等体积)，混匀，制得稀释的血液；

步骤3：将限流阀调整到最小流量位置，打开卡扣，通过限流阀控制血液从采血袋缓慢流入分离袋中，确保血液层位于分离液上层。待血液样本完全转入分离袋中后，将采血袋联合采血针热合弃去。分离袋可预先准备，先竖直放置，向分离袋中加入与稀释的血液等体积的淋巴细胞分离液，使分离液沉于分离袋底部，进针处热合封闭处理；

步骤4：关闭所有卡扣，拧紧限流阀，将分离袋置于离心机中离心，条件为：温度15℃～22℃，速度650g～850g，时间25min～35min，调节离心机加、减速为低档；

步骤5：从离心机中小心取出分离袋，小心置于压浆板上，打开分离袋与血浆收集袋之间的卡扣，用限流阀控制流速，将上层血浆压至血浆收集袋中，完成后关闭卡扣，拧紧限流阀；

步骤6：打开分离袋与离心管之间的卡扣，用限流阀控制流速，将白膜层压至离心管，关闭卡扣和限流阀；

步骤7：将离心管热合离断，或根据白膜层体积适量分装到离心管中，按白膜层∶PBS(v∶v)＝1∶3稀释，混匀，离心(15℃～22℃，30g～400g，时间5min～10min)；

步骤8：弃PBS上清，加入PBS混匀，或将各个离心管中的细胞混合后，离心(15℃～20℃，速度300g～400g，时间5min～10min)；

步骤9：弃PBS上清，用适量PBS充分重悬并混匀所有细胞，进行细胞计数；

步骤10：将离心管进行离心(15℃～20℃，速度300g～400g，时间5min～10min)，根据细胞计数结果，加入适量冻存液，将细胞分装冻存。

为了实施上述方法，本发明还提供一种装置，包括

第一容器，其用于采集并收集外周血血液，包括第一本体、采血器和采血管路；

第二容器，其用于对所采集的外周血血液实施分离，包括第二本体、第一连接管路、第二连接管路和第三连接管路，第一连接管路与第一连接口连接；

第三容器，其与第二连接管路相连，用于收集来自于第二本体的血浆；

第四容器，其与第三连接管路相连，用于收集来自于第二本体的PBMC；

管夹，用于截断各个管路。

本发明的装置，第一连接管路、第二连接管路和第三连接管路上至少设置一个管夹。

一种管夹的具体实施方式，包括第一夹板、第二夹板、铰接件和扣件，第一夹板一端和第二夹板一端与铰接件相连，使得第一夹板绕铰接件枢轴转动，第二夹板绕铰接件枢轴转动。扣件一端与第一夹板另一端相连，第一夹板和第二夹板相合，而扣件另一端扣于第二夹板的另一端。

另一种管夹的具体实施方式，还包括挂钩，设置于第二夹板两侧，挂设于管路上，以免管夹从管路上滑脱。

为了在制取过程中，控制流体的流速，本发明的装置还包括若干限流阀。第一连接管路、第二连接管路和第三连接管路上至少设置一个限流阀。

一种限流阀的具体实施方式，包括阀体和阀件，阀体套设于管路外，转动阀件对管路施以作用力，使得管路的截面积减小，达到控制流体流速的目的。

本发明的装置，还包括压浆板，作用于第二本体，使得第二本体内分层的各类血液制品转移到第三容器和第四容器中。

附图说明

图1为用于实施本发明从血液中制备免疫细胞的方法的装置一实施例的结构示意图；

图2为用于本发明装置的管夹一实施例的结构示意图；

图3为用于本发明装置的限流阀一实施例的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

图1为用于实施本发明从血液中制备免疫细胞的方法的装置一实施例的结构示意图。如图1所示，本发明的装置，包括第一容器100、第二容器200、第三容器300和第四容器500。

第一容器100用于采集并收集外周血血液，包括第一本体110、采血器120和采血管路130。采血管路130两端分别与采血器120和第一本体110相连。将采血器120刺入生物体，而外周血血液经采血管路130流入第一本体110内，实现血液的采集和存储。第一连接管路220的两端分别与第一本体110和第二本体240连通，使得第一本体110内的生物样本沿第一连接管路210转移至第二本体240内，进而使得所采集的外周血血液中的各种物质实现分离，比如：形成红细胞和粒细胞富集层、分离液富集层、白膜层和血浆富集层等分层。

第二容器200包括第一连接管路210、第二连接管路220、第三连接管路230、第二本体240和加液口250。第二连接管路220两端分别与第二本体240和第三容器300连通，将压浆板对第二本体240施以作用力，使得第二本体240内的血浆富集层转移至第三容器300内。

第三连接管路230两端分别与第二本体240和第四容器400连通，将压浆板对第二本体240施以作用力，使得第二本体240内的白膜层(即PBMC)转移至第四容器400内。

为了防止液体在各个容器间发生如：倒流等情形，还在第一连接管路、第二连接管路和第三连接管路上设置管夹500，用于截断各个管路。图2为用于本发明装置的管夹一实施例的结构示意图，如图2所示，本实施例的管夹500包括第一夹板510、第二夹板520、铰接件530和扣件540，第一夹板510一端和第二夹板520一端与铰接件530相连，使得第一夹板510绕铰接件530枢轴转动，第二夹板520绕铰接件530枢轴转动。扣件540一端与第一夹板510另一端相连，第一夹板510和第二夹板520相合，而扣件540另一端扣于第二夹板520的另一端。

为了对流体的流速进行控制，还在第一连接管路、第二连接管路和第三连接管路上设置限流阀600。图3为用于本发明装置的限流阀一实施例的结构示意图，如图3所示，限流阀600包括阀体610和阀件620，阀体610套设于管路外，转动阀件620对管路施以作用力，使得管路的截面积减小，达到控制流体流速的目的。

采用本实施例提供的装置，就能实现血液制品如：PBMC和血浆制品等标准化制取，在配合相应的设备，还能提高自动化水平。具体的实施方式如：

步骤1：无菌采集外周血血液样本。

步骤2：将采血针进行热合剪断处理，取50ml无菌注射器，采血针沿行管向采血袋中加入血液等体积PBS，混匀，得稀释的血液。

步骤3：竖直放置分离袋，向分离袋中加入等体积的淋巴细胞分离液，使分离液沉于分离袋底部，进针处热合封闭处理，将限流阀调整到最小流量位置，打开卡扣，通过限流阀控制血液从采血袋缓慢流入分离袋中，确保血液层位于分离液上层。待血液样本完全转入分离袋中后，将采血袋联合采血针热合弃去。

步骤4：关闭所有卡扣，拧紧限流阀，将分离袋置于离心机吊杯中，并用洁净配平用的三联带塞满吊杯空间，固定分离袋相对位置。离心条件：离心温度(15-22)℃，离心速度(650-850)g，离心时间(25-35)min，调节离心机加、减速为低档。

步骤5：从吊杯中小心取出分离袋，小心置于压浆板上，打开分离袋与血浆收集袋之间的卡扣，用限流阀控制流速，将上层血浆小心压至血浆收集袋中，完成后关闭卡扣，拧紧限流阀。血浆收集袋中的血浆可用于传染病检测等后续实验项目。

步骤6：打开分离袋与离心管之间的卡扣，用限流阀控制流速，将白膜层小心压至离心管，关闭卡扣和限流阀。

步骤7：将离心管热合离断，根据白膜层体积适量分装到新的50ml离心管中；按白膜层∶PBS(v∶v)＝1∶3稀释，混匀，离心。离心条件：离心温度(15-22)℃，离心速度(300-400)g，离心时间(5-10)min。

步骤8：弃PBS上清，每管加入(5-10)ml PBS，混匀，将各管细胞混合，用PBS定容至50ml，离心。离心条件：离心温度(15-20)℃，离心速度(300-400)g，离心时间(5-10)min。

步骤9：弃PBS上清，用适量PBS充分重悬并混匀所有细胞，进行细胞计数。

步骤10：将离心管进行离心。离心条件：离心温度(15-20)℃，离心速度(300-400)

g，离心时间(5-10)min。根据细胞计数结果，加入适量冻存液，将细胞分装冻存。

制得的生物样品鉴定系PBMC。

本实施例的技术方案，可以用无菌注射器直接在采集袋(第一容器100)稀释血液样本，分离袋中预先含有分离液，可以直接离心，无须分装，样本从采集到完成离心分层全程密闭操作、全程无暴露。

再结合压浆夹，使得从100ml血液样本中收集白膜层一次压浆即可完成，提高制备效率，一次处理样本可增大，每例样本可以一次性完成，无需分成多管操作。压浆过程使白膜层在压力作用下液面高度增加，使得白膜层可视性增强，便于白膜层收集的实验操作。

Claims (12)

1.一种从血液中制备免疫细胞的方法，其特征在于包括：

先向采血袋中加入磷酸缓冲盐溶液并混匀，得稀释的血液；

接着，控制稀释的血液从采血袋缓慢流入分离袋中，确保稀释的血液层位于分离液上层。待稀释的血液完全转入分离袋中后，将采血袋弃去；

然后，将分离袋置于离心机中离心；

最后，从离心机中取出分离袋，置于压浆板上，使得分离袋上层的血浆压至血浆收集袋中，再将白膜层压至密闭容器，即从血液中分离得PBMC。

2.根据权利要求1所述的从血液中制备免疫细胞的方法，其特征在于所述的离心条件为：15℃～22℃，速度650g～850g，时间25min～35min。

3.根据权利要求1所述的从血液中制备免疫细胞的方法，其特征在于采用与血液等体积的磷酸缓冲盐溶液制得稀释的血液。

4.根据权利要求1所述的从血液中制备免疫细胞的方法，其特征在于准备分离袋时，需竖直放置所述的分离袋，由加液口向所述的分离袋中加入淋巴细胞分离液，使所述的淋巴细胞分离液沉于分离袋底部，结束后封闭所述的加液口。

5.根据权利要求4所述的从血液中制备免疫细胞的方法，其特征在于所述的淋巴细胞分离液用量与稀释的血液保持等体积。

6.根据权利要求4所述的从血液中制备免疫细胞的方法，其特征在于制得的PBMC后，还需要经过清洗和细胞计数后，加入适量冻存液后进行分装冻存。

7.一种用于从血液中制备免疫细胞的装置，其特征在于包括：

第一容器，其用于采集并收集外周血血液，包括第一本体、采血器和采血管路；

第二容器，其用于对所采集的外周血血液实施分离，包括第二本体、第一连接管路、第二连接管路和第三连接管路，所述的第一连接管路与所述的第一连接口连接；

第三容器，其与所述的第二连接管路相连，用于收集来自于所述第二本体的血浆；

第四容器，其与所述的第三连接管路相连，用于收集来自于所述第二本体的PBMC；

管夹，用于截断各个管路。

8.根据权利要求7所述的用于从血液中制备免疫细胞的装置，其特征在于所述的第一连接管路、所述的第二连接管路和所述的第三连接管路上至少设置一个所述的管夹。

9.根据权利要求7所述的用于从血液中制备免疫细胞的装置，其特征在于所述的管夹包括第一夹板、第二夹板、铰接件和扣件，所述的第一夹板一端和所述的第二夹板一端与所述的铰接件相连，使得所述的第一夹板绕所述的铰接件枢轴转动，所述的第二夹板绕所述的铰接件枢轴转动，所述的扣件一端与所述的第一夹板另一端相连，所述的第一夹板和所述的第二夹板相合，而所述的扣件另一端扣于所述第二夹板的另一端。

10.根据权利要求7所述的用于从血液中制备免疫细胞的装置，其特征在于还包括限流阀，其包括阀体和阀件，所述的阀体套设于管路外，转动所述的阀件对管路施以作用力，使得管路的截面积减小，达到控制流体流速的目的。

11.根据权利要求7所述的用于从血液中制备免疫细胞的装置，其特征在于还包括压浆板，作用于所述的第二本体，使得所述的第二本体内分层的各类血液制品转移到所述的第三容器和所述的第四容器中。

12.根据权利要求7所述的用于从血液中制备免疫细胞的装置，其特征在于还包括挂钩，设置于所述的第二夹板两侧，挂设于管路上。

Images