ITPD930141A1

ITPD930141A1 - Composizioni farmaceutiche comprendenti 8-cloro-3-(betadietilaminoet cumarina base e relativi sali, atte al trattamento di condizioni patologiche caratterizzate da elevata produzione di ossido di azoto

Info

Publication number: ITPD930141A1
Application number: IT000141A
Authority: IT
Inventors: Rosa Massimo Di; Edward Joseph Hornby; Marco Prosdocimi; Cirillo Rocco
Original assignee: Fidia Spa
Priority date: 1993-06-21
Filing date: 1993-06-21
Publication date: 1994-12-21
Also published as: WO1995000142A1; IT1265665B1; AU7186794A; ITPD930141A0

Description

Descrizione di una invenzione industriale dai titolo ?COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE COMPRENDENTI 8-CLORO-3 (3-DIETILAMINOETIL)-4-METIL-7-ETOSSICARBONILMETOSSI CUMARINA BASE E RELATIVI SALI, ATTE AL TRATTAMENTO DI CONDIZIONI PATOLOGICHE CARATTERIZZATE DA ELEVATA PRODUZIONE DI OSSIDO DI AZOTO"

RIASSUNTO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce all'impiego dei cloricromene (8-cloro-3-(8-dietilaminoetil)-4-metil-7-etossicarbonilmetossi cumarina) base e relativi sali per la preparazione di composizioni farmaceutiche atte al trattamento di patologie caratterizzate da elevata produzione di ossido di azoto (NO) quali, in particolare, tutte quelle patologie in cui sia pregevole un'attivit? antiinfiammatoria e/o immunosoppressiva di suddetto farmaco, o pi? in generale in tutte quelle situazioni patologiche di vasodilatazione e/o danno tissutale conseguente ad iperproduzione di NO.

TECNICA ANTERIORE

1. Il cloricromene

E' noto che il cloricromene ? stato ottenuto per la prima volta allo stato puro, mediante processi altamente selettivi, messi a punto dalla stessa Richiedente (US 4,296,039, US 4,452,811). in particolare ? descritto che la selettiva alogenazione con un atomo di cloro in posizione 8 deila molecola cumarinica ha il pregio di conferire spiccate propriet? vasodilatatorie coronariche, nonch? attivit? antiaritmica (US 4,349,566) ed antiaggregante piastrinica (US 4,302,741) a suddetto prodotto.

Gli effetti dei cloricromene, sia in vitro che in vivo, sono stati ampiamente evidenziati in diversi modelli sperimentali. In particolare ? stato dimostrato che il prodotto presenta una serie di importanti effetti a livello piastrinico che si traducono in una prevenzione deU'attivazione e dell'aggregazione piastrinica indotta da diversi stimoli, quali acido arachidonico, collagene, ADP, adrenalina o platelet activating factor (PAF) o da una combinazione di stimoli (Galli C. et al.: "Effects of 8-monochloro-3-B-diethylaminoethyl-4-methyl-7-ethoxy carbonyl methoxy coumarin (AD6) on aggregation, arachidonic acid metabolism and thromboxane B2 formation in human platelets. Pharmacol. Res. Comun. 1980: 12: 329 -337; Prosdocimi M. et al.: Action of AD6 (8-monochloro-3-betadiethylaminoethyl-4-methyl-7-ethoxy-carbonyl-methoxy coumarin) on human platelets in vitro. Naunyn Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1986: 332: 305-310; Travagli R. A. et al.: ?Molecular aspects of cloricromene (AD6) distribution in human platelets and its pharmacological effects. Thromb. Res. 1989: 54: 327-338). Inoltre ? stato evidenziato che la potente azione inibitoria di AD6 a livello della produzione di acido arachidonico, precursore della sintesi del trombossano, avviene verosimilmente mediante un?azione bloccante a livello della fosfolipasi A2 (Pomellati S. et al.: ?The coumarin derivative AD6 inhibits th? release of arachidonic acid by interfering with phospholipase A2 activity in human platelets stimulated with thrombin. Agents Actions 1990: 29: 364-373). Recentemente ? stato dimostrato che il cloricromene ? anche in grado di inibire l'adesione di cellule polimortonucleate a cellule endoteliali (Bellocchi et al: In vitro inhibition of human polymorphonucear celi function by cloricromene. Naunyn-Schmiedeberg?s Arch. Pharmacol. 1989: 339: 697-703). Inoltre, il prodotto pu? avere positivi effetti a livello delle interazioni biochimiche fra piastrine e leucociti polimorfonucleati (Zatta A. et al. Polymorphonuclear leukocyte-dependent modulation of piatele? function: effect of cloricromene. Eur. J. Pharmacol. 1991 : 198: 9 7 -100), che sono note essere rilevanti negli stati trombotici ed ischemici. Parallelamente ? stata ampiamente dimostrata l?efficacia del cloricromene in differenti modelli sperimentali in vivo. In particolare ? stato dimostrato che il prodotto riduce la formazione del trombo laddove viene indotta una stenosi critica arteriosa (Prosdocimi M.: ?Stenosis and vascular damage as an experimental model of arterial thrombosis: a rote for prostanoids. In: Samuelsson B. et al. eds. Prostanoids and Drugs. Plenum Publishing Corporation, 1989: 1 13-119; Prosdocimi M. et al.: Inhibition by AD6 (monochloro-3-beta-diethylamino-ethyl-4-methyl-7-ethoxycarbonylmethoxy coumarin) of piatele! aggregation in dog stenosed coronary artery. Thromb. Res. 1985: 39: 399-409;).

Pertanto dall?analisi delle attuali conoscenze sul cloricromene, non ? stata mai proposta la possibilit? di impiegare terapeuticamente tale composto i n condizioni patologiche di vasodilatazione e danno tissutale indotto da ossido di azoto NO, quali ad esempio infiammazione polmonare, edema; eritema, dermatite, psoriasi, ulcerazioni cutanee; artrosi, artrite reumatoide ed altre malattie autoimmuni; shock ipotensivo, shock settico, shock ipovolemico; vasculiti, come ad esempio infiammazioni conseguenti a trombo-flebiti, emorroidi; colite ulcerosa o, pi? in generale, in quelle situazioni patologiche di vasodilatazione e/o danno tissutale in cui sia presente una iperproduzione di ossido di azoto.

2. Ruolo biologico dell?ossido di azoto (NOI

La scoperta delia formazione di ossido di azoto nei tessuti dei mammiferi, e la comprensione dei suo ruolo biologico ? stato oggetto di notevoli studi nell?arco degli ultimi anni. L'ossido di azoto ? un potente vasodilatatore, sintetizzato nella parete dei vasi da due distinte NO sintetasi che utilizzano L -arginine come substrato. Uno di questi due enzimi ? sempre presente nell?endotelio vascolare sia animale che umano in due isoforme, ove sintetizza basse concentrazioni di NO che attivano la guanilato ciclasi presente nella muscolatura liscia vascolare; tale enzima ? responsabile del mantenimento del tono vascolare e opera il controllo fisiologico della pressione sanguigna (Vatlance P. et ai; ?Effects of endothelium-derived nitric oxide on peripheral arteriolar tone in man." Lancet 1989: 997-1000). La seconda NO sintetasi ? indotta nell'endotelio vascolare degli animali, nelle cellule muscolari lisce vascolari umane, nei macrofagi ed i n altre cellule umane ad opera di endotossine batteriche e di alcune citochine. Studi in vitro hanno rilevato che l'induzione di tale enzima produce una prolungata e massiccia sintesi di NO, che porta ad una costante vasodilatazione e ad una iporeattivit? ai vasocostrittori correlate al danno indotto da NO. In queste condizioni, ? stata dimostrata l'efficacia di trattamenti con prodotti analoghi della L-arginina, quali in particolare delia NG-monomethyl-L-arginina (L-NMMA) che inibisce entrambi i tipi di NO sintetasi e pu? essere selettiva per le forme di danno tissutale indotto (Gross S.S., Stiihr D.J., Aisaki K., Jaffe E.A., Levi R. and Criffith O.W. (1990) ?Macrophage and endothelial nitric oxide synthesis: celi type seiective Inhibition by N<G>-aminoarginine, N<Q>-nitroarginine and N<G>-methylarginine?, Biochem. Biophys. Res. Comm., 170: 96-103). Interessanti risultati sono stati ottenuti anche utilizzando i glucoco dico idi (Rees 0. 0. et al: ?Dexamethasone prevents th? induction by endotoxin of a nitric oxide synthase and th? associated effects on vascuiar tone: an insight into endotoxin shock". Biochem. Biophys. Res. Comm. 173: 541 -547, 1 990) .

E' inoltre da considerare che l'enzima NO sintetasi ? stato identificato anche in altri sistemi quali ad es. nel sistema nervoso, sia centrale che periferico, sensorio e motorio (Schmidt H. H. et al: "Enzymatic formation of nitrogen oxides from L-arginine in bovine brain cytosol?. Biochem. Biophys. Res. Comm. 165, 284-291 , 1989; Murphy S. et al: ?Evidence for an astrocytederived vasorelaxing factor with properties similar to nitric oxide?. J. Neurochem. 55: 349-351. 1990) nel sistema visivo, a livello della retina (Ross, C. a. et al: ?Messenger Molecules in th? Cerebellum". Trends Neurosci. 13, 216-222, 1990) ove potrebbe spiegare la patogenesi d? alcune malattie a carico di tale distretto anatomico (Lolley R. N. et al: ?Cyclic GMP accumulation causes degeneration of photoreceptor celisi simulation of an inherited disease?. Science 196: 664-666, 1977).

Si deve pertanto considerare, alla luce della riscontrata induzione di tale enzima, non solo in cellule appartenenti al sistema reticolo endoteliale, ma anche in svariate aitre cellule e tessuti, che ii release di NO pu? avere importanti conseguenze biologiche, determinando situazioni patologiche di vasodilatazione e di danno tissutale.

Inoltre anche situazioni di immunit? non specifica sarebbero collegate all'induzione di NO sintetasi. NO generato immunologicamente, oltre ad essere citostatico o citotossico per microorganismi patogeni e cellule tumorali, potrebbe anche avere effetti avversi su cellule ospiti indotte ad esprimere NO sintetasi o in cellule adiacenti. Infatti macrofagi, epatociti e cellule di adenocarcinoma in cui ? stato indotto NO, hanno manifestato segni di tossicit? ad esso correlato (Albina J. E. et al: ?Regulatlon of macrophage physiology by L-arginine: role of th? oxidative L-arginine deiminase pathway." J. Imunol. 143: 3641 -3646, 1989; Billiar T. R. et al: ?An L -arginine dependent mechanism mediates Kupffer celi inhibition of hepatocyte protein synthesis in vitro" J. Eng. Med. 189: 1 467 - 1 472 , 1989; O?Connor K. J. et al: ?Glucocorticoids inhibit th? induction of nitric oxide synthase and th? related celi damage in adenocarcinoma ceils.? Biochim. Biophys. Acta, submitted 1991 ).

Le consequenze biologiche di questi cambiamenti, cos? come le circostanze in cui ii release di NO porta a disfunzioni e/o morte cellulare, devono essere ancora chiaramente comprese. Tuttavia condizioni di danno tissutale locale o sistemico, associato a situazioni immunologiche, potrebbero essersi verificate in stretta relazione con il release di NO. L'ossido di azoto oltre ai suoi effetti sulla vitalit? e sulla proliferazione cellulare, potrebbe anche giocare un ruolo nella normale regolazione della risposta cellulare a mitogeni. Al. momento attuale non ? noto se NO, formato dall?enzima inducibile, contribuisca anche ad azioni citotossiche di altre cellule che giocano un ruolo neH?immunit? specifica,<' >tuttavia ? stata dimostrata l'induzione della sintesi di NO in linfociti T (Kir K. S. J. et al: ?cloned murine T-lymphocytes synthesize a molecule with th? biologica! characteristics of nitric oxide". Bioch. Biophys. Res. Comm. 173, 600-665, 1990).

Pertanto dalle evidenze soprariassunte, emerge l?importante ruolo dell'ossido di azoto, ed in particolare dell'induzione dell'enzima IO sintetasi, in svariati tipi cellulari e quindi l'importante ruolo di NO in relazione a cambiamenti patologici riscontrabili in diversi tessuti.

Fra gli agenti farmacologici, per i quali ? stata finora dimostrata un'azione inibitoria sull?induzione dell'NO sintetasi, sono da segnalare in particolare i glucocorticoidi: la scoperta che tali agenti inibiscono l'induzione di detto enzima rivela la potenziale importanza di NO in svariate condizioni, quali ad esempio infiammazione polmonare, edema; eritema, dermatite, psoriasi, ulcerazioni cutanee; artrosi, artrite reumatoide ed altre malattie autoimmuni; shock ipotensivo, shock settico, shock ipovolemico; vasculiti, come ad esempio infiammazioni conseguenti a trombo-flebiti, emorroidi; colite ulcerosa o, pi? in generale, in quelle situazioni patologiche di vasodilatazione e/o danno tissutale in cui sia presente una iperproduzione di ossido di azoto.

Dalle indicazioni sopracitate, anche se a titolo puramente esemplificativo, risulta molto chiaramente il notevole valore terapeutico di farmaci efficaci nel ridurre l?iperproduzione di NO ed, in particolare, nell'inibire l?espressione dell?enzima NO sintetasi di tipo inducibile.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Ora noi abbiamo sorprendentemente trovato, e costituisce oggetto della presente invenzione, che il cioricromene (8-cloro-3-(G-dietilaminoetil)-4-metil-7-etossicarbonilmetossi cumarina cloroidrato) ? un efficace inibitore delia NO sintetasi e pu? pertanto essere pregevolmente impiegato per la preparazione di composizioni farmaceutiche atte al trattamento di patologie caratterizzate da iperproduzione di ossido di azoto (NO), quali ad esempio. infiammazione polmonare, edema; eritema,, dermatite, psoriasi, ulcerazioni cutanee; artrosi, artrite reumatoide ed altre malattie autoimmuni; shock ipotensivo, shock settico, shock ipovolemico; vasculiti, come ad esempio infiammazioni conseguenti a trombo-flebiti, emorroidi; colite ulcerosa o, pi? in generale, in quelle situazioni patologiche di vasodilatazione e/o danno tessutale in cui sia presente una iperproduzione di ossido di azoto.

L'oggetto della presente invenzione risulter? dalla descrizione degii esperimenti che abbiamo eseguito impiegando il cioricromene nei seguenti modelli sperimentali:

1 . Anelli di aorta isolata da ratti in cui ? stata misurata la perdita del tono indotto da lipopolisaccaride (LPS);

2. Colture di macrofagi di topo trattate con LPS.

3. Dermatite essudativa da croton oil nel topo

4. Granuloma pouch da croton oil nel ratto

5. Peritonite da acido acetico nel ratto

6. Edema della zampa da serotonina nel ratto

? ; ,?<'>?:

7. Writhing test da fenilchinone nel topo

MATERIALI E METODI

1 .1 Aorta isolata

Ratti maschi Wistar (dei peso di circa 280-320 gr) venivano sottoposti ad

anestesia eterea e trattati per via endovenosa con 4 mg/kg di lipopolisaccaride (LPS) di Salmonella Thyphi.

Il cloricromene veniva somministrato in unico bolo (2 mg/kg) per via

endovenosa 30 minuti prima dell?iniezione con LPS; i ratti di controllo

ricevevano una soluzione di NaCI (0,9% in 1 ml/kg) mentre i ratti ?naive"

non ricevevano n? LPS n? clor?cromene.

L'aorta toracica veniva quindi rimossa, a distanza di 3 hr dalia somministrazione di LPS, e posta in soluzione di Krebs bicarbonato pH 7,4, avente la

seguente composizione (mM): NaCI 118.4; KCI 4.7; MgSCU 1.2; CaCl2 1.3;

KH2PO4 1.2; NaHC03 25.0 e glucosio 11 .7. Ciascuna aorta, previa opportuna

rimozione del tessuto adiposo e connettivo circostante, veniva tagliata in

anelli di circa 2 mm di lunghezza. Gli anelli venivano quindi posti in

bagnetti da 10 mi contenenti soluzione Krebs in cui veniva fatto gorgogliare

carbossigeno (95% di 02 e 5 C02) alla temperatura di 37?C. Gli anelli

venivano collegati ad un registratore mediante trasduttori isometrici: il

"tono" veniva equilibrato con una tensione di circa 1 gr per 90-120

minuti. La tensione isometrica veniva monitorata continuamente usando un

trasduttore di forza collegato ad un registratore (Ugo Basile, Comerio,

Varese). Gli esperimenti sono stati tutti condotti in presenza di 10 ?? di

indometacina.

Successivamente gli anelli venivano contratti con fenilefrina (PE, 300 ??)

e la perdita spontanea del tono vascolare veniva monitorata per 4 ore.

In un diverso set di esperimenti gli anelli di aorta venivano contratti con concentrazioni crescenti di PE (1 nM - 10 ??) al fine di ottenere curve cumulative dose/risposta.

1 risultati (media ? errore standard medio S.E.M.) erano espressi come g. di tensione/mg di tessuto.

2.1 Colture cellulari

Colture di macrofagi murini (linea cellulare J774 - American Tissue Culture Catalogue T1 B67) venivano coltivate in fiaschette Techne, centrifugate a 25 rpm ed incubate a 37?C in terreno di coltura ?Dulbecco ?s modified Eagle?s medium" supplementato con 10% di siero bovino fetale, 2% di glutamina, penicillina (100 U/ml) e streptomicina (100 pg/ml). Le cellule venivano piastrate in piastre di coltura da 24 pozzetti (Falcon) alla densit? di 2.5x105 cellule e lasciate ad aderire a 37?C in 5% C02-95% 02 per 2 ore. Il terreno veniva quindi sostituito con terreno fresco e le cellule venivano attivate con LPS (100 ng/ml) ed incubate con il farmaco in esame. Il cloricromene ? stato testato alle seguenti concentrazioni: 2-20 e 200 ??.

E? stata quindi misurata la produzione di NO mediante determinazione della quantit? di nitriti (?02?). presente nel terreno di coltura, secondo il metodo di Griess (Di Rosa M. et al: ?Glucocorticoids inhibit th? induction of nitric oxide synthase in macrophages.? Biochem. Biophys. Res. Commun. 1 72: 1246, 1990).

I risultati sono espressi come nmoli di N02 rilasciato da 106 cellule in 24 ore. L'analisi statistica, per entrambe le due prove, ? stata effettuato mediante il test di Student a 2 code.

3.1 . Attivit? antiinfiammatoria di AD6 (somministrazione sistemica i.o.

e localel nella dermatite essudativa da croton oil nel tooo

Il test consiste nell'induzione di una dermatite essudativa nel padiglione auricolare del topo mediante instillazione di un irritante cutaneo, l'olio di croton, responsabile di una tipica reazione infiammatoria ?vascolare<1>? caratterizzata da iperemia ed edema. La reazione infiammatoria, a lenta evoluzione e lunga durata, interessa gli strati profondi del derma dove si estende gradualmente dal sito di applicazione a tutto il padiglione auricolare, raggiungendo la massima intensit? alla 6? ora. il meccanismo patogene? responsabile dei fenomeni vascolari ed essudativi riconosce l'intervento di numerosi fattori (attivazione della Proteinkinasi-C, del sistema chininico e del complemento; liberazione di enzimi lisosomiali, autacoidi vasoattivi, prostaglandine e fattori chemiotattici; infiltrazione cellulare; modificazione del collageno). Topi del peso di 28-30 gr. sono stati suddivisi in gruppi di 6 elementi. E? stato utilizzato il metodo descritto da Tubaro et al. (Agent and Actions, 17, 197, 1985). La dermatite ? stata indotta nel topo in anestesia da pentobarbital (37 mg/kg i.p.) mediante instillazione nella superficie interna dell?orecchio destro di una soluzione contenente 35 pg di croton oil in 15 ?? di acetone. A distanza di 6 h, i topi sono stati sacrificati in etere per procedere al taglio del padiglione auricolare edematoso (dx) e di quello sano controlaterale. E' stata studiata l'attivit? di AD6 sia per somministrazione sistemica (i.p. in 10 mi/kg di satina), che per applicazione locale (veicolando il prodotto direttamente nella soluzione croton/acetone). Gli effetti del trattamento sono stati valutati in base all'incremento del peso dell?orecchio trattato rispetto al controlaterale 6 h dopo l'installazione del flogogeno, assumendo quale indice di attivit? antiinfiammatoria l?inibizione percentuale rispetto ai controlli.

Confronti tra medie sono stati eseguiti mediante il test ?t" di Student.

Sulla curva dose-effetto riferita all?inibizione % dell?edema ? stata calcolata la DE40 secondo il metodo di Litchfield e Wilcoxon (J. Pharmac. Exp. Therap., 96, 99, 1949).

4.1 . Attivit? cronica antiinfiammatoria di AD6 ( somministrazione i.p nel granuloma pouch da croton-oil nel ratto

Il test consiste nell'Induzione di una reazione infiammatoria sub-acuta localizzata nel tessuto sottocutaneo del dorso di ratto, mediante inoculazione di aria seguita da una soluzione di croton-oil in acetone. Il modello sperimentale permette di seguire due distinti aspetti di un processo infiammatorio estremamente comune nella patologia umana, e cio? l'essudazione e la formazione di tessuto granulomatoso, rappresentato da una sacca granulomatosa piena di essudato.

Il meccanismo patogenetico ? correlato alla'azione irritante specifica del croton-oil (esteri del forbolo) che causa attivazione della Proteinkinasi-C, del complemento e del chininogeno piasmatico, con conseguente formazione di chinine (bradichinina), notevole essudazione e migrazione leucocitaria. E? stato utilizzato il metodo di Seyle (J. Amer. Med. Ass., 152, 1 207, 1953) modificato da Finney & Somers (J. Pharm. Pharmac. 10, 613, 1958) che consiste nell'iniezione s.c. di 25 mi di aria, seguita da 0.5 mi di una soluzione di croton-oil al 2% in olio di semi. Ratti (Sprague-Dawley) del peso di 130-140 gr venivano suddivisi in gruppi omogenei di 6 elementi. AD6 e PBZ (fenilbutazone) sono stati veicolati in 10 ml/kg di salina. Il trattamento intraperitoneale ? stato eseguito per 5 giorni consecutivi come sotto descritto:

-controllo-salina 10 ml/kg/die

AD6 0.05-0.1 mg/kg/die

PBZ 50-100 mg/kg/die

Al termina del trattamento, 24 h dopo l<?>ultima somministrazione, g li animali sono stati sacrificati mediante inalazione eterea e si ? proceduto al prelievo dell'essudato contenuto nella sacca ed all?esame, con lente di ingradimento, del tessuto di granulazione costituente la parete della sacca. Come farmaco di confronto ? stato impiegato il fenilbutazone (PBZ), quale antiinfiammatorio non steroideo particolarmente attivo in questo modello sperimentale.

5.1 . Attivit? antiinfiammatoria di AD6Jsomministrazione os_^ i.v.i nella peritonite da acido acetico nel ratto

E? stata indagata l'attivit? antiinfiammatoria di AD6 mediante il test della peritonite da acido acetico nel ratto, modello di flogosi acuta di tipo esudativo essenzialmente correlato ad irritazione locale, attivazione delle protessi e liberazione di kinine e prostaglandine.

E? stato determinato l?andamento dose-effetto ed il time-course di AD6 per via orale ed endovenosa.

E' stato utilizzato il metodo descritto da Arrigoni-Martelli (Boll. Chim. Farm. 107, 29, 1968) che, in base alla misurazione del volume di essudato peritoneale, permette di valutare la capacit? protettiva di un farmaco sullo sviluppo della reazione infiammatoria acuta indotta nel ratto dall'iniezione i.p. di acido acetico (10 mg/kg di una soluzione allo 0.5%).

30 minuti dopo l'iniezione dall?acido acetico gli animali sono stati Sacrificati mediante inalazione eterea e si ? proceduto, dopo laparotomia, alla misurazione dei versamento peritoneale raccolto mediante pipette Pasteur.

Ratti (Sprague-Dawley) maschi dei peso di 200-300 gr, sono stati suddivisi in gruppi omogenei di 5 animali ciascuno.

AD6, in soluzione fisiologica salina, ? stato somministrato per via orale (gavage) ed endovenosa nei seguenti volumi:

- 10 ml/kg (os)

- 1 ml/kg (i.v.)

Il trattamento ? stato eseguito al tempo di picco (definito nell'ambito delle prove relative alla cinetica dell'effetto antalgico) e cio?:

A) Somministrazione orale (1 h prima del test)

- Controlli Salina 10 mi/kg

- AD6 0.05 - 0.075 - 0.1 - 0.2 mg/kg

B) Somministrazione i.v. (5 minuti prima del test

- Controlli Salina 1 ml/kg

- AD6 0.025 - 0.5 - 0.075 - 0.1 - 0.2 - 0.4 mg/kg

- Proendotel 0.05 - 0.1 - 0.2 mg/kg

6.1. Edema delia zampa da serotonina nel ratto

Ratti (Sprague-Dawley) maschi del peso di 140-160 gr. sono stati suddivisi in gruppi omogenei di 5 elementi ciascuno,

il test consiste nell'induzione di una reazione edematosa localizzata mediante inoculazione subplantare di serotonina. La reazione, a rapida evoluzione, ? correlata ad aumento della permeabilit? capillare, essenzialmente dovuto all'azione vasomotoria diretta della serotonina e ad attivazione del clTinindgend<_>plasmatico (con formazione di bradichinina).

L?edema~?<' >stato indotto nella zampa posteriore destra del ratto mediante iniezione di 0.1 mi di una soluzione allo 0.05% di serotonina creatininsolfato.

La misurazione del volume della zampa ? stata eseguita mediante pletismografo a mercurio, prima dell'iniezione del flogogeno e dopo 45 minuti. Lo sviluppo dell'edema ? stato valutato In base all'incremento dei volume della zampa rispetto al valore basale.

Il trattamento farmacologico ? stato eseguito per via intraperitoneaie (10 minuti prima del test) e i.v. (5 minuti prima del test).

Come farmaci di confronto, nelle prove eseguite per via i.p., sono stati utilizzati fenilbutazone (PBZ) e ciproeptadina (CVP)

7.1 . Attivit? antalgica di AD6 nel test del writhino da fenilchinone nel topo Topi Swiss maschi del peso di 28-30 gr. sono stati suddivisi in gruppi omogenei di 6 animali/dose.

E? stato utilizzato il metodo descritto da Siegmund et al. (Proc. Soc. Exp. Biol., 95, 729, 1957) che si basa sulla capacit? di un farmaco di antagonizzare la sindrome provocata nel topo dall'iniezione endoperitoneale di 0.25 mi di una soluzione allo 0.02% di fenilchinone in alcool etilico al 5%. La sintomatologia dolorosa ? caratterizzata da contrazioni intermittenti aH'addome con stiramenti del tronco (writhes) che iniziano mediamente dopo 3 minuti dall'iniezione dell?algogeno e durano per circa 120 minuti. In pratica il rilievo di tale sintomatologia viene eseguito contando il numero di writhes esibiti da ciascun animale in 5 minuti (dal 5? al 10? minuto successivo all'Iniezione del fenilchinone), quando cio? la reazione dolorosa ? pi? intensa e gli stiramenti addominali pi? ravvicinati e costanti.

AD6, in soluzione fisiologica salina, ? stato somministrato per via orale (gavage), intraperitoneale ed endovenosa nei seguenti volumi:

- 10 ml/kg (os e i.p.)

- 1 ml/kg (i.v.)

Il trattamento ? stato eseguito ai tempo di picco (definito nell'ambito delle prove relative alla cinetica dell'effetto antalgico, ved; par. 2), e cio?:

A) somministrazione orale (1 h prima dei test)

- controlli salina 10 ml/kg

- AD6 0.025 - 0.25 - 0.75 - 0.1 - 0.2 mg/kg

B ) somministrazione i.p. (5 minuti prima del test)

- controlli salina 10 ml/kg

- AD6 0.01 - 0.25 - 0.05 - 0.75 - 0.1 - 0.2 mg/kg

C) somministrazione i.v. (5 minuti prima del test)

- controlli salina 1 ml/kg

- AD6 0.0005 - 0.001 - 0.005 - 0.01 - 0.02 - 0.1 mg/kg STUDIO FARMACOCINETICO SU BASE FARMACODINAMICA

Lo studio ? stato eseguito utilizzando il test dei writhing da fenilchinone nel topo (ved. par. 1).

Topi Swiss maschi dei peso di 28-30 gr. sono stati suddivisi in gruppi omogeni di 6 animali ciascuno.

AD6 ? stato somministrato per via orale, intraperitoneale ed endoveneosa a vari intervalli di tempo prima dell?iniezione i.p. deli'algogeno.

Alle diverse vie di somministrazione ? stata impiegata la dose corrispondente all'effetto massimo:

0.1 mg/kg per via os e i.p.

0.01 mg/kg per via i.v.

E? stato valutato il time-course dell?effetto antalgico del prodotto (Tab. 10-1 1 - 1 2) .

RISULTATI

In sintesi, dall?insieme delle prove sperimentali, emerge che:

1 .2. Effetto-sulla reattivit? e tono vascolare

Il trattamento con LPS induce una perdita nel tempo del tono vascolare di anelli di aorta precontratti con PE. Tale rilassamento si manifesta in misura significativamente superiore rispetto alla aorte provenienti da animali non trattati con LPS.

Il trattamento farmacologico con cloricromene (2 mg/kg ev. in unico bolo) attenua significativamente ['aumentato rilassamento e la ridotta sensitivit? a PE in ratti trattati con LPS. Negli animali in cui ? stato somministrato il cloricromene, la vasocostrizione indotta da concentrazioni crescenti di PE e la massima forza di contrazione raggiungibile sono significativamente pi? elevate (Fig. 1) e pi? prolungate nei tempo (Fig. 2) rispetto ai gruppi di controllo trattati con LPS e salina (NaCI 0.9%).

2.2. Effetto sulla_formazione di NOo- in colture di macrofagi

Il trattamento con LPS induce un aumento significativo della produzione di nitriti (NO2-).

Il co-trattamento con clorlcromene inibisce la produzione di NO2': l?effetto ? concentrazione-dipendente, raggiungendo una inibizione di circa il 48% in presenza di 200 ?? di cloricromene (Fig. 3).

3.2. Effetto sulla dermatite essudativa da croton-oil nel tooo

AD6 esercita una spiccata azione protettiva, dose-dipendente, nei confronti della dermatite essudativa indotta dairinstillazione di croton-oil nell?orecchio del topo.

L'effetto ? ben apprezzabile e statisticamente significativo sia dopo applicazione locale del prodotto (insieme all'irritante) che dopo somministrazione intraperitoneale (Tabelle 1-2 - Figure 4-5).

4.2. Effetto nel granuloma pouch da croton-oil nel ratto

AD6, per somministrazione i.p. alle dosi di 0.05 - 0.1 mg/kg/die per 5 giorni, esplica una significativa azione antiessudativa/antigranulomatosa in questo modello sperimentale.

L'effetto ottenuto alla dose di 0.1 mg/kg ? sovrapponibile a quello dato dal fenilbutazone a 50 mg/kg (Tabella 3 - Figura 5A).

5.2. Effetto nella peritonite da acido acetico, nel ratto

Somministrato per via orale e i.v., AD6 esercita una attivit? antiinfiammatoria che si manifesta esclusivamente a bassi dosaggi, entro un range da 0.025 a 0.1 mg/kg.

Per le diverse vie di somministrazione l?effetto massimo (rilevato al tempo di picco) ? raggiunto alla dose di 0.1 mg/kg con i seguenti valori:

per os - 33% (tempo di picco: 1 ora)

per i.v. - 45% (tempo di picco 5 minuti)

(Tab. 4-4A-4B - Fig. 6-7-8)

6.2. Effetto sull?edema della zamoa da serotonina nel ratto Somministrato per via i.p., AD6 inibisce lo sviluppo dell'edema da serotonina in maniera modesta, ma statisticamente significativa, nel range di dosi comprese tra 0.05 e 0.1 mg/kg. L'effetto si riduce con l'ulteriore incremento della dose. L?inibizione raggiunta alla dose massima attiva (0.1 mg/kg) ? stata del 39% rispetto ai controlli.

li fenilbutazone (PBZ)(100 mg/kg) si ? dimostrato del tutto privo di effetti in questo modello sperimentale, mentre la ciproeptadina (CYP) ha esercitato la propria spiccata azione antiserotoninica, determinando alla dose di 0.5 mg/kg una inibizione dell'edema pari al 78%.

Per via i.v. l<'>attivit? antiedemigena di AD6 ? inferiore a quella osservata dopo trattamento i.p.

Il range di dosi attive ? compreso tra 0.01 e 0.05 mg/kg (massima risposta -25%)(Tabelle 5-6 - Figura 8A).

7.2. Effetto antalgico di AD6

Dopo somministrazione orale ed intraperitoneale, AD6 esplica una discreta attivit? antalgica al PQ-writhing test, per dosi comprese tra 0.01 e 0.1 mg/kg (Tab. 7-8, Fig. 12-13).

L?effetto, raggiunto il picco alla dose di 0.1 mg/kg, si riduce nettamente con l'incremento della dose (curva a campana).

Dopo somministrazione i.v., AD6 esplica una spiccata attivit? antalgica per dosi di oltre 10 volte inferiori a quelle attive per via orale e i.p. (Tab. 9, Fig. 14).

Per questa via di somministrazione il picco di attivit?, nettamente superiore a quello dato per os. e i.p., ? raggiunto alla dose di 0.01 mg/kg. Ulteriori incrementi di dose riducono l'effetto, ma in maniera pi? graduale e meno accentuata rispetto a quanto osservato per os. e i.p.

Dosi ed attivit? massime alle diverse vie di somministrazione:

- 0.1 mg/kg p.o. -52% (tempo di picco: 1 ora)

- 0.1 mg/kg i.p. -64% (tempo di picco: 5 minuti)

- 0.01 mg/kg i.v. -78% (tempo di picco: 5 minuti) Somministrazione orale

La determinazione dei time-course dell'effetto antalgico di AD6 (0.1 mg/kg) evidenzia un picco di attivit? dopo 1 ora, che si mantiene quasi in plateau fino alla 3? ora, seguito da un decremento relativamente rapido, con dimezzamento dell'effetto intorno alla 5? ora (Tab. 10, Fig. 9).

Somministrazione i.p.

Per questa via di somministrazione l'attivit? di AD6 (0.1 mg/kg) si manifesta molto rapidamente (picco dopo 5 minuti) e tende a ridursi con un andamento biesponenziale: piuttosto rapido entro la 1? ora e pi? lento nei tempi successivi. Il tempo di dimezzamento dell'effetto ? di circa 2 ore (Tab.

11 , Fig. 10).

Somministrazione i.v.

Per questa via di somministrazione l?attivit? di AD6 (0.01 mg/kg) si manifesta motto rapidamente (picco dopo 5 minuti) e si mantiene a valori prossimi al picco per circa 30 minuti.

Successivamente l?effetto si riduce in maniera graduale, con tempo di dimezzamento di circa 2 ore (Tab. 12, Fig. 11).

Esempio 2: un flacone liofilizzato contiene:

Principio attivo:

Claims

RIVENDICAZIONI Essendo l'invenzione cos? descritta, ? chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell?invenzione, e tutte quelle modificazioni che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell?ambito delle seguenti rivendicazioni: 1 . Impiego dell?8-cloro-3-(l3-dietiiaminoetil)-4-metil-7-etossicarbonilmetossi cumarina base e relativi sali come principio attivo per la preparazione di composizioni farmaceutiche atte al trattamento terapeutico di patologie caratterizzate da elevata produzione di ossido di azoto.
2. Impiego deH'8-cloro-3-(B-dietilaminoetil)-4-metil-7-etossicarbonilmetossi cumarina base e relativi sali come principio attivo per la preparazione di composizioni farmaceutiche atte al trattamento terapeutico di situazioni patologiche, secondo la rivendicazione 1 , caratterizzate da vasodilatazione e/o danno tissutale.
3. impiego dell? 8-cloro-3-{8-dietilaminoetii)-4-metil-7-etossicarbonilmetossi cumarina base e relativi sali come principio attivo per la preparazione di composizioni farmaceutiche atte al trattamento terapeutico, secondo le rivendicazioni 1 -2, in cui le patologie da trattare sono ad esempio correlate ad infiammazione polmonare, edema, eritema, dermatite, psoriasi, ulcerazioni cutanee, artrosi, artrite reumatoide ed altre malattie autoimmuni, shock ipotensivo, shock settico, shock ipovolemico, vascuiiti, come ad esempio infiammazioni conseguenti a trombo-flebiti, emorroidi, colite ulcerosa.
4. Impiego di composizioni farmaceutiche secondo le rivendicazioni 1-3, caratterizzate dal fatto di contenere una dose farmacologicamente efficace di detto principio attivo in combinazione con eccipienti e diluenti farmacologicamente accettabili.
5. Composizioni farmaceutiche secondo le rivendicazioni 1 -4, contenenti una dose farmacologicamente efficace deir8-cloro-3-(B-dletilaminoetil)-4-metil-7-etossicarbonilmetossi cumarina base o di un relativo sale in combinazione con eccipienti e diluenti farmacologicamente accettabili, atte al trattamento terapeutico di patologie caratterizzate da elevata produzione di ossido di azoto.
6. Composizioni farmaceutiche secondo le rivendicazioni 1 -5, contenenti una dose farmacologicamente efficace deH?8-cloro-3-(B-dietilaminoetil)-4-metil-7-etossicarbonilmetossi cumarina base o di un relativo sale, atte al trattamento terapeutico di situazioni patologiche caratterizzate da vasodilatazione e/o danno tissutale.
7. Composizioni farmaceutiche secondo le rivendicazioni 1-6, contenenti una dose farmacologicamente efficace deH'8-cloro-3-(8-dietilaminoetil)-4-metil-7-etossicarbonilmetossi cumarina base o di un relativo sale, atte ai trattamento terapeutico di situazioni patologiche quali ad esempio quelle correlate ad infiammazione polmonare, edema, eritema, dermatite, psoriasi, ulcerazioni cutanee, artrosi, artrite reumatoide ed altre malattie autoimmuni, shock ipotensivo, shock settico, shock ipovolemico, vasculiti, come ad esempio infiammazioni conseguenti a trombo-flebiti, emorroidi, colite ulcerosa.
8. Composizioni farmaceutiche, secondo le rivendicazioni 5-7, caratterizzate dal fatto di essere preparate in formulazioni per la somministrazione orale.
9. Composizioni farmaceutiche, secondo le rivendicazioni 5-7, caratterizzate dal fatto di essere preparate in formulazioni per la somministrazione parenterate.
1 0. Composizioni farmaceutiche, secondo le rivendicazioni 5-7, caratterizzate dal fatto di essere preparate in formulazioni per la somministrazione topica.
1 1 . Metodo terapeutico per il trattamento di patologie caratterizzate da elevata produzione di ossido di azoto, consistente nella somministrazione di una dose farmacologicamente accettabile dell'8-c!oro-3-(B-dietilaminoetil)-4-metil-7-etossicarbonilmetossicu marina base o di un relativo sale, da solo o in associazione con altri farmaci.
1 2. Metodo terapeutico per il trattamento di patologie caratterizzate da vasodilatazione e/o danno tissutale, consistente nella somministrazione di una dose farmacologicamente accettabile deU?8-cloro-3-{B-dietilaminoetil)-4-metil-7-etossicarboniimetossi cumartna base o di un relativo sale, da solo o in associazione con altri farmaci.
13. Metodo terapeutico secondo le rivenicazioni 11 -12 per il trattamento di situazioni patologiche quali ad esempio quelle correlate ad infiammazioni polmonari, edema; eritema, dermatite, psoriasi, ulcerazioni cutanee; artrosi, artrite reumatoide ed altre malattie autoimmuni, shock ipotensivo, shock settico, shock ipovolemico, vasculiti, come ad esempio infiammazioni conseguenti a trombo-flebiti, emorroidi, coliti ulcerose, consistente nella somministrazione di una dose farmacologicamente accettabile dell?8-cloro-3-(8-dietilaminoetil)-4-metil-7-etossicarbonilmetossi cumarina base o di un relativo sale, da solo o in associazione con altri farmaci.
14. Metodo terapeutico, secondo le rivendicazioni 10-13, caratterizzato dal fatto che detta somministrazione ? effettuata per via orale.
15. Metodo terapeutico, secondo le rivendicazioni 10-13, caratterizzato dai fatto che detta somministrazione ? effettuata per via parenterale.
1 6. Metodo terapeutico, secondo le rivendicazioni 10-13, caratterizzato dal fatto che detta somministrazione ? effettuata per via endovenosa.
17. Metodo terapeutico, secondo le rivendicazioni 10-13, caratterizzato dal fatto che detta somministrazione ? effettuata per via topica.