JP7376107B2 - フィチン酸エステル誘導体 - Google Patents

Description

本発明は、フィチン酸エステル誘導体およびその利用に関する。

フィチン酸（ｍｙｏ－イノシトール－１，２，３，４，５，６六リン酸、ＩＰ６）はヒト等の哺乳類の細胞内で生合成され、また種子など多くの植物組織にも存在するリンの主要な貯蔵形態である。穀物、豆類などの食物からも摂取される。その一部は吸収され、細胞にもピノサイトーシスなどにより取り込まれる。

高濃度のＩＰ６をがん細胞に加えた場合に、細胞増殖抑制効果を示すことがよく研究され、注目されてきた。特開２００３－２３８４１４は、イノシトールリン酸類（イノシトール６リン酸を含む）を有効成分する抗腫瘍剤を開示している。またＩＰ６は、免疫力上昇、腎結石形成抑制、コレステロール低下、冠動脈疾患や糖尿病の発症リスク軽減などの多彩な活性を持つことが知られる。Ｖｕｃｅｎｉｋ ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｔｒｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，２００６，５５，１０９は、抗酸化、免疫力上昇、抗炎症、Ｐｈａｓｅ Ｉ酵素およびＰｈａｓｅ ＩＩ酵素の修飾、がん遺伝子の制御、抗－血管新生作用、腫瘍転移抑制、アポトーシス誘導、細胞分化上昇、細胞増殖抑制などの多様な作用をＩＰ６が有することを記載している。

ＩＰ６はこのように多くの有用な効果を奏するが、６個のリン酸基に由来する多くの負電荷を持つために細胞膜を通りづらく、細胞のＩＰ６取り込み量には限界がある。またＩＰ６は金属とキレートする性質を持ち体内のミネラルの吸収を妨げることから、大量摂取による副作用が指摘されている。

特表２００９－５４１２２２には、任意の組み合せでのＩＰ－６、その医薬的に許容可能な塩、またはその医薬的に許容可能な誘導体を含む、有効量の医薬組成物を前記哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類における電離放射線暴露の、健康への急性かつ短期的な悪影響を予防または治療する方法（請求項１）を記載している。特表２００９－５４１２２２の段落００１５は、『本出願の対象物であるＩＰ－６ならびにピロリン酸および／またはイノシトールを含むその誘導体に関して、当業者は、「イノシトール６リン酸、ＩＰ－６、およびその類似体は薬物としてのテストに入っている。挑戦の１つは、細胞内への分子の通過を促進するために、保護基でリン酸塩を覆うことである。（２００５年７月１３日のＤＯＥ報告）」と結論付けている。ＩＰ－６ならびにピロリン酸および／またはイノシトールを含むその誘導体は、現在防護剤として効果がない場合があるという考えが示唆される。』と記載している。ＩＰ６を細胞内への分子の通過を促進するために、保護基でリン酸塩を覆うことについて言及している。しかしながら、当該文献には、具体的にどのような保護基でリン酸塩を覆うのか、仮に保護基でリン酸塩を覆った化合物が本当に細胞内への分子の追加が促進されるのか、細胞内に取り込まれた化合物が細胞内でどのような機能を有するかについて全く示唆がない。

ＩＰ６は細胞内への取り込みが悪く、取り込み量に限界がある、との問題があったにもかかわらず、当該問題を解決する具体的な方法は提供されていなかった。

特開２００３－２３８４１４ 特表２００９－５４１２２２

Ｖｕｃｅｎｉｋ ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｔｒｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，２００６，５５，１０９

本発明は、細胞内への取り込みがよく、生体内でＩＰ６と同様の機能を奏するＩＰ６誘導体を提供することを目的とする。本発明はさらに、当該ＩＰ６誘導体を含む医薬組成物および化粧用組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは上記問題解決のため鋭意研究に務めた結果、フィチン酸エステル誘導体を合成し、本発明を想到した。限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
以下の式Ｉの化合物。

［式Ｉ中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２は、各々独立に、Ｈ、式ＩＩ

（式ＩＩ中、－ＣＨ_２－は所望により１若しくは２の置換基により置換されていてもよい）、
式ＩＩＩ

（式ＩＩＩ中、－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_４－は所望により１若しくは複数の置換基により置換されていてもよい）、
および、式ＩＶ

（式ＩＶ中、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－は所望により１若しくは複数の置換基により置換されていてもよい）
からなるグループから選択される、
ただし、Ｒ^１－Ｒ^１２の全てがＨである場合を除く。
［態様２］
式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式ＩＶにおいて、置換若しくは未置換のＣ_１－６アルキル若しくはアリールが、置換若しくは未置換のメチル、置換若しくは未置換のエチルおよび置換若しくは未置換のブチルからなる群から選択される、態様１の化合物。
［態様３］
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２の６個以上がＨではない、態様１または２に記載の化合物。
［態様４］
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２の全てがＨではない、態様１－３のいずれか１項に記載の化合物。
［態様５］
Ｃ_１－６アルキル若しくはアリールが、ハロゲン、Ｃ_１－４アルキル、アミノ基、ニトロ基、フェニル基、ヒドロキシル基、チオール基、Ｃ_１－４アシルおよびアリル基からなる群から選択される置換基で置換されている、態様１－４のいずれか１項に記載の化合物。
［態様６］
式ＩＩ中の－ＣＨ_２－、式ＩＩＩ中の－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_４－、および式ＩＶ中の－ＣＨ_２－ＣＨ_２－の１以上が、ハロゲン、Ｃ_１－４アルキル、アミノ基、ニトロ基、フェニル基、ヒドロキシル基、チオール基、Ｃ_１－４アシルおよびアリル基からなる群から選択される置換基で置換されている、態様１－５のいずれか１項に記載の化合物。
［態様７］
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２の全てが、ブチリルオキシメチルまたはアセトキシメチルである、態様１に記載の化合物。
［態様８］
生体内で加水分解されて、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２の一部または全てがＨになる、態様１－７のいずれか１項に記載の化合物。
［態様９］
態様１－８のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物を含む、医薬組成物。
［態様１０］
細胞増殖抑制、細胞傷害抑制、免疫力上昇、コレステロール低下、腎結石形成抑制、がん転移抑制、および繊維化抑制からなる群から選択される活性を有する、態様９に記載の医薬組成物。
［態様１１］
がん、冠動脈疾患、糖尿病および結石症からなる群から選択される疾患を予防または処置するための態様９または１０に記載の医薬組成物。
［態様１２］
がんが白血病、リンパ腫、骨髄腫からなる群から選択されるがんである、態様１１に記載の医薬組成物。
［態様１３］
経口投与、経皮投与、腹腔内投与または静脈内投与される、態様９－１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［態様１４］
式Ｉの化合物が生体内で加水分解されて、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２の一部または全てがＨになる、態様９－１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［態様１５］
態様１－８のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物の医薬組成物の製造のための使用。
［態様１６］
態様１－８のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物を含む、化粧用組成物。
［態様１７］
美白作用または美肌作用を有する態様１６に記載の化粧用組成物。
［態様１８］
態様１－８のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物を含む、研究用試薬。

フィチン酸エステル誘導体（Ｐｒｏ－ＩＰ６）は、ＩＰ６よりも細胞内に取り込まれやすい。細胞内に取り込まれたＰｒｏ－ＩＰ６は、腫瘍細胞等の悪性細胞等に対し、殺細胞効果、抗腫瘍活性等、ＩＰ６と同様の効果を奏する。Ｐｒｏ－ＩＰ６は、正常細胞に対して毒性を示さない。

図１は、細胞内のＩＰ６メチルエステルをＬＣ／ＭＳにより測定した結果である。縦軸は相対強度、横軸は時間（分）、を示す。 図２は、ＭＴ－２細胞（ＨＴＬＶ形質転換ヒトＴ細胞白血病細胞）を用いたＭＴＴアッセイの結果を示す。縦軸は、ＩＰ６、Ｐｒｏ－ＩＰ６を添加しない場合の細胞生存率を１とした場合の相対細胞細胞生存率を示す。横軸は、ＩＰ６またはＰｒｏ－ＩＰ６の添加濃度を示す。 図３は、Ｍ８１６６細胞（ヒトＴ－リンパ芽球様細胞）を用いたＭＴＴアッセイの結果を示す。縦軸は、ＩＰ６、Ｐｒｏ－ＩＰ６を添加しない場合の細胞生存率を１とした場合の相対細胞細胞生存率を示す。横軸は、ＩＰ６またはＰｒｏ－ＩＰ６の添加濃度を示す。 図４は、ジャーカット細胞（ヒトＴ－リンパ球細胞株）を用いたＭＴＴアッセイの結果を示す。縦軸は、ＩＰ６、Ｐｒｏ－ＩＰ６を添加しない場合の細胞生存率を１とした場合の相対細胞細胞生存率を示す。横軸は、ＩＰ６またはＰｒｏ－ＩＰ６の添加濃度を示す。 図５は、Ｋ５６２細胞（慢性骨髄性白血病細胞）を用いたＭＴＴアッセイの結果を示す。縦軸は、ＩＰ６、Ｐｒｏ－ＩＰ６を添加しない場合の細胞生存率を１とした場合の相対細胞細胞生存率を示す。横軸は、ＩＰ６またはＰｒｏ－ＩＰ６の添加濃度を示す。 図６は、健常者由来のＰＢＭＣ（末梢血単核球細胞）を用いたＭＴＴアッセイの結果を示す。縦軸は、Ｐｒｏ－ＩＰ６を添加しない場合の細胞生存率を１とした場合の相対細胞細胞生存率を示す。横軸は、Ｐｒｏ－ＩＰ６の添加濃度を示す。 図７は、Ｊｕｒｋａｔ細胞をＰｒｏ－ＩＰ６またはＩＰ６で８時間または２４時間処理後、ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）抗体、ａｎｔｉ－ＰＡＲＰ－１抗体、Ｃａｓｐａｓｅ－３抗体、および、ａｎｔｉ－β－アクチン抗体の各種抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。 図８は、ＨＴＬＶ－１感染細胞移植マウスにＰｒｏ－ＩＰ６またはＩＰ６を投与後、移植後１日目－２８日目までの腫瘍体積の変化を示す図である。ＩＰ投与群の２６日目および２７目の腫瘍体積が極端に増殖しているが、これは、いくつかの腫瘍をまとめて計測したかもしれない等、何らかのミスの可能性がある。２８日目の値は、腫瘍を全摘出して測定したものであり、正確である。 図９は、ＨＴＬＶ－１感染細胞移植マウスにＰｒｏ－ＩＰ６またはＩＰ６を投与後、移植後２８日目の腫瘍体積を示す図である。 図１０は、ヒトＴ細胞由来白血病細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞を用い、細胞死判別試験（フローサイトメトリー）を行った結果である。 図１１は、図７は、Ｊｕｒｋａｔ細胞をＰｒｏ－ＩＰ６またはＩＰ６で８時間または２４時間処理後、抗ＴＲＡＦ６抗体（ＣＳＴ）、抗ｐＡＭＰＫ抗体（ＣＳＴ）、および、抗β－アクチン抗体（シグマアルドリッチ）の各種抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。 図１２は、Ｐｒｏ－ＩＰ６を投与した場合と投与しない場合のＨｅｌａ細胞蛍光顕微鏡で３Ｄ撮影した写真図であり、Ｐｒｏ－ＩＰ６のウイルスタンパク質ＧａｇまたはそのＭＡ領域の凝集に対する関与を示す。

１．フィチン酸エステル誘導体
本発明は、フィチン酸（ｍｙｏ－イノシトール－１，２，３，４，５，６リン酸、ＩＰ６）のエステル誘導体に関する。

フィチン酸エステルの誘導体化合物は、以下の式Ｉの構造を有する。

［式Ｉ中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２は、各々独立に、Ｈ、式ＩＩ

（式ＩＩ中、－ＣＨ_２－は所望により１若しくは２の置換基により置換されていてもよい）、
式ＩＩＩ

（式ＩＩＩ中、－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_４－は所望により１若しくは複数の置換基により置換されていてもよい）、
および、式ＩＶ

（式ＩＶ中、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－は所望により１若しくは複数の置換基により置換されていてもよい）
からなるグループから選択される、
ただし、Ｒ^１－Ｒ^１２の全てがＨである場合を除く。Ｒ^１－Ｒ^１２の全てがＨである場合は、フィチン酸（ＩＰ６）に相当する。

式ＩＩ、式ＩＩＩまたは式ＩＶにおいて、置換若しくは未置換のＣ_１－６アルキルのアルキルは、直鎖状であっても枝分かれしていても良く、好ましくは直鎖状である。置換若しくは未置換のＣ_１－６アルキルのアルキルは、非限定的に、メチル、エチル、ブチル、プロピル、イソプロピル、ペンチル、t-ブチル、イソブチルを含む。非限定的に、置換若しくは未置換のＣ_１－６アルキルは、置換若しくは未置換のメチル、置換若しくは未置換のエチルおよび置換若しくは未置換のブチルからなる群から選択されてもよい。

置換若しくは未置換のアリールは、単純芳香環から誘導された芳香族炭化水素基および多環芳香族炭化水素基を含む。アリールは、好ましくは単純芳香環の芳香属炭化水素基、即ち、炭素数が６のＣ_６アリールである。置換若しくは未置換のアリールは、非限定的に、フェニル基、ベンジル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基を含む。

Ｃ_１－６アルキル若しくはアリールが置換されている場合、置換基の数および種類は特に限定されない。Ｃ_１－６アルキル若しくはアリール中で置換可能な全ての部位が置換されていてもよく、あるいは、１箇所のみ置換されてもよく、あるいは、未置換であってもよい。Ｃ_１－６アルキル若しくはアリール中の複数の箇所が、同じ置換基で置換されていても、異なる置換基で置換されていてもよい。

置換基の種類は特に限定されない。非限定的に、ハロゲン、Ｃ_１－４アルキル、アミノ基、ニトロ基、フェニル基、ヒドロキシル基、チオール基、Ｃ_１－４アシル、アリル基等の置換基が含まれる。フェニル基のような大きな置換基であってもよい。一態様において、式Ｉの化合物中のＣ_１－６アルキル若しくはアリールは、ハロゲン、Ｃ_１－４アルキル、アミノ基およびニトロ基からなる群から選択される置換基で置換されている。Ｃ_１－４アルキルのアルキルは、直鎖状であっても枝分かれしていても良く、好ましくは直鎖状である。非限定的に、メチル、エチル、ブチル、プロピル、イソプロピルを含む。

ハロゲンは、非限定的に、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を含む。

Ｃ_１－４アルキルは、直鎖状であっても枝分かれしていても良く、好ましくは直鎖状である。Ｃ_１－４アルキルは、非限定的に、置換若しくは未置換のメチル、エチル、ブチル、プロピル、イソプロピル、t-ブチル、イソブチルである。

アミノ基は、アンモニア、第一級アミンまたは第二級アミンから水素を除去した１価の置換基の総称である。

チオール基は、水素化された硫黄を末端に持つ置換基で、非限定的に、メタンチオール基、エタンチオール基、チオフェノール基を含む。

アシル基は、オキソ酸からヒドロキシル基を取り除いた形の置換基である。Ｃ_１－４アシルは、非限定的に、置換若しくは未置換のホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブタノイル基を含む。

式ＩＩ中の－ＣＨ_２－、式ＩＩＩ中の－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_４－、および式ＩＶ中の－ＣＨ_２－ＣＨ_２－は、所望により１若しくは複数の置換基により置換されていてもよい。一態様において、式ＩＩ中の－ＣＨ_２－、式ＩＩＩ中の－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_４－、および式ＩＶ中の－ＣＨ_２－ＣＨ_２－の１以上が１若しくは複数の置換基により置換されている。置換基の数および種類は特に限定されない。式ＩＩ中の－ＣＨ_２－、式ＩＩＩ中の－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_４－、および式ＩＶ中の－ＣＨ_２－ＣＨ_２－において置換可能な全ての部位が置換されていてもよく、あるいは、１箇所のみ置換されてもよく、あるいは、未置換であってもよい。式ＩＩ中の－ＣＨ_２－、式ＩＩＩ中の－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_４－、および式ＩＶ中の－ＣＨ_２－ＣＨ_２－の複数の箇所が、同じ置換基で置換されていても、異なる置換基で置換されていてもよい。

置換基の種類は特に限定されない。非限定的に、ハロゲン、Ｃ_１－４アルキル、アミノ基、ニトロ基、フェニル基、ヒドロキシル基、チオール基、Ｃ_１－４アシル、アリル基の置換基が含まれる。フェニル基のような大きな置換基であってもよい。

ハロゲン、Ｃ_１－４アルキル、アミノ基、ニトロ基、フェニル基、ヒドロキシル基、チオール基、Ｃ_１－４アシル、アリル基の定義は上述した通りである。

一態様において、式ＩＩ中の－ＣＨ_２－、式ＩＩＩ中の－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_４－、および式ＩＶ中の－ＣＨ_２－ＣＨ_２－の１以上が、ハロゲン、Ｃ_１－４アルキル、アミノ基およびニトロ基からなる群から選択される置換基で置換されている。Ｃ_１－４アルキルのアルキルは、直鎖状であっても枝分かれしていても良く、好ましくは直鎖状である。非限定的に、メチル、エチル、ブチル、プロピル、イソプロピルを含む。

式Ｉの化合物は、Ｒ^１－Ｒ^１２の全てがＨである場合は含まない。好ましくは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２の２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上がＨではない。「Ｈではない」場合とは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２の少なくとも１つの基によりエステル化されていることを意味する。一態様において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２の６個以上がＨではない。

非限定的に、一態様において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２の全てがＨではない。一態様において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２の全てが、ブチリルオキチメチルまたはアセトキシメチルである。

後述に実施例２で実証されたように、式Ｉの化合物（Ｐｒｏ－ＩＰ６）は、細胞内によく取り込まれ、Ｐｒｏ－ＩＰ６からＩＰ６が発生する。さらに、実施例６は、Ｊｕｒｋａｔ細胞内でＰｒｏ－ＩＰ６からＩＰ６が生成し、ＩＰ６と同様の抗腫瘍活性を示すことを示している。一態様において、式Ｉの化合物（Ｐｒｏ－ＩＰ６）は、生体内で加水分解されて、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２の一部または全てがＨになる。

一態様において、式Ｉの化合物は、ｍｙｏ－イノシトール六リン酸ドデカキス（ブチリルオキシメチル）エステルまたはｍｙｏ－イノシトール六リン酸ドデカシス（アセトキシメチル）エステルである。

本明細書において、フィチン酸（ｍｙｏ－イノシトール－１，２，３，４，５，６六リン酸、ＩＰ６）のエステル誘導体、即ち、式Ｉの化合物を総称して、あるいは、式Ｉに含まれる特定の化合物を「Ｐｒｏ－ＩＰ６」と呼称する場合がある。「Ｐｒｏ－ＩＰ６」のＩＰ６のプロドラッグ、との意味を有する。本明細書においては、「プロドラッグ」とは、生体内投与後に代謝される、あるいは化合物の生物学的、医薬的または治療的に活性な型に転換される化合物である。

式Ｉの化合物の合成方法は特に限定されない。リン酸基をエステル化するための公知の方法を用いることが可能である。当業者は式Ｉ中のＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２の種類に応じて適宜適切な方法を使用可能である。一態様として、例えば、先ずカルボン酸からカルボン酸ハロゲンアルキルエステルを合成する。これを、トリエチルアミン等の強塩基性の置換基で活性化されているＩＰ６の塩基性塩に反応させ、ＩＰ６のエステル誘導体を得ることができる。

２．医薬組成物
本発明はまた、上述した式Ｉの化合物を含む医薬組成物に関する。

式Ｉの化合物は、ＩＰ６化合物の有する機能を生体内、細胞内において発揮する。非限定的に、式Ｉの化合物を含む医薬組成物は、細胞増殖抑制、細胞傷害抑制、免疫力上昇、コレステロール低下、腎結石形成抑制、がん転移抑制、および繊維化抑制からなる群から選択される活性を有する。これらはいずれもＩＰ６の活性として公知である。

本明細書において、「細胞増殖抑制」とは、細胞の増殖を止める働きを意味する。がん細胞を含む悪性細胞への「細胞増殖抑制」、「がん転移抑制」作用は、殺細胞効果、抗腫瘍効果をもたらしうる。本明細書の実施例４において、Ｐｒｏ－ＩＰ６が、Ａｋｔのリン酸化の抑制活性、およびアポトーシスの誘導活性を有することが示された。これらの活性は、ＩＰ６の抗腫瘍活性の機序としても報告されている。本明細書において、「アポトーシス誘導活性」とは、アポトーシス実行分子の活性化やその結果としての核凝縮などを特徴とする細胞のアポトーシスを導くことができる活性をいう。

「細胞増殖抑制」、「細胞傷害抑制」、「腎結石形成抑制」、「がん転移抑制」、および「繊維化抑制」とは、各事象がＰｒｏ－ＩＰ６を投与しない場合よりも抑制されることを意味する。非限定的に、好ましくは３％以上、５％以上、８％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上抑制される。

「コレステロール低下」とは、摂取した食品、飲料等中のコレステロールが生体内に摂取される割合が、Ｐｒｏ－ＩＰ６を投与しない場合よりも低下されることを意味する。非限定的に、好ましくは３％以上、５％以上、８％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上抑制される。

「免疫」とは、ヒトや動物が有する、生体内で病原体などの「自分とは異なる異物」（非自己物質）やがん細胞などの異常な細胞を認識して殺滅することにより、生体を病気から保護する多数の機構が集積した、生体の恒常性維持機構の一つである。「免疫力上昇」とは、この非自己物質や異常細胞を排除する能力が、Ｐｒｏ－ＩＰ６を投与しない場合よりも高まることを意味する。免疫力は、例えば、血液検査により、白血球数、Ｔ細胞数（ＣＤ４Ｔ細胞数、ＣＤ８Ｔ細胞数、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比等）、Ｂ細胞数、ＮＫ細胞数などを測定し総合的に解析することにより、調べることが可能である。

式Ｉの化合物を含む医薬組成物は、細胞増殖、細胞傷害、免疫力低下、コレステロール上昇、腎結石形成、がん転移、および繊維化からなる群から選択される状態が関与する疾患を予防または処置するために有用である。一態様において、式Ｉの化合物を含む医薬組成物は、がん、冠動脈疾患、糖尿病および結石症からなる群から選択される疾患を予防または処置するため医薬組成物である。

がんの種類は特に限定されない。一態様において、がんは、白血病、リンパ腫、骨髄腫からなる群から選択されるがんである。その他、肝癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫および肺、結腸、乳房、膀胱、卵巣、精巣、前立腺、睾丸腫瘍、子宮、頚部、膵臓、胃、大腸、小腸、その他の器官の癌を包含する多様なタイプのがんも含まれうる。

「冠動脈疾患」とは、心筋への血液供給が部分的にまたは完全に遮断されることによって生じる疾患の総称である。冠動脈疾患の主な原因は、冠動脈の内壁に蓄積したコレステロール等による動脈硬化により、冠動脈に狭窄または閉塞を生じることによる。冠動脈疾患に含まれる代表的な疾患にとして、狭心症、心筋梗塞（例えば、急性心筋梗塞）がある。

「糖尿病」とは、血糖値やヘモグロビンＡ１ｃ値が一定の基準を超えている状態を指す疾患である。１型糖尿病、２型糖尿病、遺伝子異常による糖尿病（若年発症成人型糖尿病等）、続発性糖尿病、妊娠糖尿病等に分類される。

「結石症」には、腎臓や尿路の結石、肝臓や胆汁輸送経路の結石、唾液腺の唾石症などを含む。ＩＰ６はこれらの結石の治療、予防に有用であることが知られている。

式Ｉの化合物（Ｐｒｏ－ＩＰ６化合物）を、所望により医薬的または薬理学的に許容可能な担体と組み合せて、式Ｉの化合物を含む医薬組成物の形で投与することができる。医薬的または薬理学的に許容可能な担体の種類は１つもそれ以上でもよい。医薬組成物に含まれる式Ｉの化合物の種類は、１つでもそれ以上でもよい。医薬組成物中に含まれる式Ｉの化合物の割合は特に限定さえず、非限定的に、０．０１から約１００の質量パーセントでありうる。「医薬的に」または「薬理学的に許容可能な担体」は、製剤の他の成分と適合し、被験者に有害ではない、任意の担体、希釈剤または賦形剤を意味する。本明細書の開示に基づき、式Ｉの化合物を含む医薬組成物を処方することは本技術分野の範囲内である。

例えば、医薬品の分野の標準的技法に従って、式Ｉの化合物を含む医薬組成物を処方することが可能である。例えば、Ａｌｐｈｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，（１９９０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａを参照。

式Ｉの化合物を含む医薬組成物の投与経路は特に限定されない。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、トローチ、ドリンク剤等に処方して経口投与してもよい。あるいは、パッチ剤等の経皮投与、腹腔内投与、静脈内点滴もしくは注射等による静脈内投与などの非経口投与を用いてもよい。その他、筋肉内注射等による筋肉内投与、経腸投与、局所投与等による投与も可能である。一態様において、式Ｉの化合物を含む医薬組成物は、経口投与、経皮投与、腹腔内投与または静脈内投与される。式Ｉの化合物を含む医薬組成物の処方（製剤）の具体例を以下に示す。

例えば、経口投与用の錠剤、散剤、顆粒剤、トローチ、カプセル剤等は、式Ｉの化合物を含む医薬組成物に、例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤または滑沢剤等の１つ以上の固形不活性成分を添加して圧縮成型し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のためのコーティングを行うことにより製造することができる。

注射剤は、例えば、式Ｉの化合物を含む医薬組成物を、例えば分散剤、保存剤、等張化剤等と共に水性注射剤として、あるいはオリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油等の植物油、プロピレングリコール等に溶解、懸濁あるいは乳化して油性注射剤として成型することにより製造することができる。

外用剤は、例えば、式Ｉの化合物を含む医薬組成物を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造される。例えば、上記固状の組成物は、該医薬組成物をそのまま、あるいは賦形剤、増粘剤などを添加、混合して粉状とすることにより製造される。上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様で、油性あるいは水性懸濁剤とすることにより製造される。半固状の組成物は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれも緩衝剤、防腐剤などを含んでいてもよい。外用剤は、例えば、局所投与用のクリーム、ローション、ゲル、軟膏等が含まれる。

座剤は、例えば式Ｉの化合物を含む医薬組成物を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の組成物とすることにより製造される。このような組成物に用いる油性基剤としては、例えば、高級脂肪酸のグリセリド（例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類等）、中級脂肪酸（例えば、ミグリオール類等）、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油等）等が挙げられる。水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体等が挙げられる。

式Ｉの化合物を含む医薬組成物は、所望により、さらに、１またはそれ以上の他の有効成分を含んでもよい。「他の有効成分」は、式Ｉの化合物と同様に、細胞増殖抑制、細胞傷害抑制、免疫力上昇、コレステロール低下、腎結石形成抑制、がん転移抑制、および繊維化抑制からなる群から選択される活性を有する成分であってもよい。あるいは、これら以外の活性を有する成分であってもよい。

式Ｉの化合物を含む医薬組成物は、所望により、さらに、安定化剤、酸化防止剤および保存料が添加されてもよい。適切な酸化防止剤は、例えば、亜硫酸、アスコルビン酸，クエン酸およびその塩、ならびにナトリウムＥＤＴＡを含む。適切な保存料は、例えば、塩化ベンザルコニウム、メチル－またはプロピル－パラベン、ならびにクロルブタノールを含む。

式Ｉの化合物を含む医薬組成物の投与量および投与期間は、投与対象のサイズ、質量、年齢および性別、治療される疾患の性質および段階、疾患の攻撃性、投与経路、ならびに放射線の特定の毒性を含む個々の患者の特定の状況によって決定される。投与量および投与期間は、また、既知の試験プロトコルを用いて実験的に、または生体内もしくは生体外試験データからの外挿法によって決定されうる。本明細書に記載する濃度範囲は、例示的な目的のみであり、請求される組成物の範囲または実施化を制限するものではない。

例えば、式Ｉの化合物を含む医薬組成物中の投与量は、有効成分である式Ｉの化合物の量で約０．０１から約２０００ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．０５から約１０００ｍｇ／ｋｇ／日である。約１．０から約２００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量が特に好適な用量である。医薬組成物は、１日１回で投与されてもよく、または同時にもしくは時間間隔を置いて投与される何回かの低用量に分割されてもよい。投与量は、多数の投与、例えば、２５ｍｇ／ｋｇの２回投与で与えられてもよい。より高いまたはより低い用量であってもよい。

一態様において、医薬組成物に含まれる式Ｉの化合物（Ｐｒｏ－ＩＰ６）は、生体内で加水分解されて、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２の一部または全てがＨになる。

本発明はまた。式Ｉの化合物の医薬組成物の製造のための使用に関する。

本発明はさらに、式Ｉの化合物を必要とする対象に投与することを含む、細胞増殖抑制、細胞傷害抑制、免疫力上昇、コレステロール低下、腎結石形成抑制、がん転移抑制、および繊維化抑制からなる群から選択される活性を対象に与える方法、に関する。

本発明はさらに、式Ｉの化合物を必要とする対象に投与することを含む、細胞増殖、細胞傷害、免疫力低下、コレステロール上昇、腎結石形成、がん転移、および繊維化からなる群から選択される状態が関与する疾患を予防または処置する方法、に関する。「細胞増殖、細胞傷害、免疫力低下、コレステロール上昇、腎結石形成、がん転移、および繊維化からなる群から選択される状態が関与する疾患」は、例えば、がん、冠動脈疾患、糖尿病、結石症を含む。

本発明はさらにまた、式Ｉの化合物を必要とする対象に投与することを含む、がん、冠動脈疾患、糖尿病および結石症からなる群から選択される疾患を予防または処置する方法、に関する。

実施例３においてＰｒｏ－ＩＰ６は、正常細胞に対して毒性を示さないことが示された。式Ｉの化合物を含む組成物は生体に対して安全に使用でき、医薬組成物または化粧用組成物として有用である。

３．化粧用組成物
本発明は、式Ｉの化合物を含む化粧用組成物に関する。一態様において、化粧用組成物は、美白作用または美肌作用を有する。

化粧用組成物の使用態様および使用量は特に限定されない。例えば、化粧水（ローション）、乳液（スキンミルク）、クリーム、美容液、ジェル、パック、ムースなどのベース化粧品の態様でありうる。

化粧用組成物の組成は特に限定されず、化粧品として許容される成分であればいかなる成分を含むものであってもよい。化粧用組成物は、化粧用組成物で使用している水、多価アルコール、水溶性高分子化合物、油溶性成分（オイル、ワックス）、防腐剤、酸化防止剤、香料等を必要に応じて配合することができる。

化粧用組成物は、保湿機能や粘度調整機能等を発揮するため多価アルコールを含有してもよい。また、多価アルコールの添加により、化粧用組成物の水分活性を下げることができ、微生物の繁殖を抑えることができる。

化粧用組成物は、水溶性高分子化合物を配合してもよい。配合可能な水溶性高分子化合物としては、広く合成高分子、天然高分子、半合成高分子のいずれも用いることができる。特に糖類、タンパク質類およびそれらの複合体が好ましい。

化粧用組成物は、油性媒体に溶解する油溶性成分を含んでもよい。油溶性成分として、通常、紫外線吸収剤、抗酸化剤、抗炎症剤、保湿剤、毛髪保護剤、分散剤、溶剤、美白剤、抗シミ剤、細胞賦活剤、エモリエント剤、角質溶解剤、帯電防止剤、ビタミン類、メタボリックシンドローム改善剤、降圧剤、鎮静剤などとして使用されている他の成分も使用することができ、例えば、オリーブ油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、ヒマシ油などの油脂類、流動パラフィン、パラフィン、ワセリン、セレシン、マイクロクリスタリンワックス、スクワランなどの炭化水素、カルナウバロウ、キャンデリラロウ、ホホバ油、ミツロウ、ラノリンなどのロウ類、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸２－オクチルドデシル、２－エチルヘキサン酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリルなどのエステル類、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸などの脂肪酸類、セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、２－オクチルドデカノールなどの高級アルコール類、メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサンなどのシリコーン油、グリセリンの脂肪酸エステル類、その他、高分子類、油溶性色素類、油溶性蛋白質などを挙げることができる。また、それらの混合物である各種の植物由来油、動物由来油も含まれる。

化粧用組成物は、安定性を保持するために酸化防止剤を配合してもよい。使用可能な酸化防止剤としては、特に限定されないが、例えば、ポリフェノール類からなる化合物群、ラジカル捕捉剤を挙げることができる。

化粧用組成物は、香料を含んでも良い。香料としては、動物系、植物系、鉱物系の天然香料および合成香料のいずれも使用可能である。

本発明はまた、式Ｉの化合物の化粧用組成物の製造のための使用に関する。

４．組成物
本発明はまた、式Ｉの化合物を含む組成物に関する。

式Ｉの化合物を含む組成物は、一態様において、研究用試薬として用いることもできる。組成物は、一態様において、ＩＰ６の細胞内のシグナル伝達を解明するための研究用試薬として用いることができる。

ＩＰ６単独では細胞内への取込がほとんどなされないため、試薬として用いるためには大量に用いる必要がある。しかし、ＩＰ６は負電荷を有し、かつ酸性物質であるため、実験環境及び対象となる細胞に影響を及ぼす可能性がある。本発明による研究用試薬を用いれば、少量で細胞内に導入することが可能であり、かつリン酸基の保護により、実験環境への影響を最小限に留めることができる。すなわち、本発明による細胞への研究用試薬の添加により、効率的にＩＰ６を細胞内に導入することが可能である。

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

実施例１ ｍｙｏ－イノシトール六リン酸ドデカキス（ブチリルオキシメチル）エステルの合成
本実施例では、以下の経路に従って、ｍｙｏ－イノシトール六リン酸ドデカキス（ブチリルオキシメチル）エステルを合成した。合成はまず酪酸を原料とし、２段階で酪酸ブロモメチルエステルを合成した。これとＩＰ６トリエチルアミン塩を反応させ、ＩＰ６のブチリルオキシメチルエステル（Ｐｒｏ－ＩＰ６）を得た。最終的にＨＰＬＣを用いてＰｒｏ－ＩＰ６を精製した。

メチレンジブチレート（１）の合成
酪酸（２．６５ｇ＝２．７５ｍｌ、３０．１ｍｍｏｌ）に２Ｍ ＮａＯＨ水溶液（３０ｍｌ）を加え３０分間撹拌した。その後、テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩（１０．２ｇ、３０．５ｍｍｏｌ）を加え３０分撹拌し、水層をＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍｌ×４）で抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過して２日間４５℃で還流した。ＣＨ_２Ｃｌ_２を溜去することにより結果物を濃縮し、ヘキサン（６０ｍｌ）に溶かし１０％酢酸（５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ×２）、飽和食塩水（５０ｍｌ）で分液して硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後濾液をエバポレーターで濃縮し、無色液体の化合物、メチレンジブチレート（１）（１．３５４ｇ、９６％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３） δ：０．９６（ｔ，６Ｈ，ＣＨ_３），δ：１．６６（ｓｅｘｔ，４Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_３），δ：２．３４（ｔ，４Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３），δ：５．７６（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ_２Ｏ）

酪酸ブロモメチルエステル（２）の合成
化合物（１）（０．４７ｇ，２．５２ｍｍｏｌ）に、ブロモトリメチルシラン（ＴＭＳＢｒ）（０．７７ｇ＝０．６５ｍｌ，５．０３ｍｍｏｌ）、臭化亜鉛（２９．６ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を加えアルゴン下で１日間撹拌した。その後反応液をジエチルエーテル（２０ｍｌ）に溶かし、１Ｍ塩酸（１０ｍｌ）を加えて１０分間撹拌した。さらに水層を取り除いて飽和炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）を加え、３０分間撹拌した。その後水層を取り除き有機層を水（５０ｍｌ×２）、飽和食塩水（５０ｍｌ）で洗浄して硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後クーゲルロール蒸留で最初の５分間の初留（１ｍｍＨｇ，３０℃）をとった後に、１５分間出た本留（１ｍｍＨｇ，５５℃）をとり無色液体の酪酸ブロモメチルエステル（２）（２１．４ｇ，４７％）を得た。なお化合物（２）は分解しやすいためすぐに次の反応に使用した。
^１Ｈ ＮＭＲ （６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３） δ：０．９６（ｔ，３Ｈ，ＣＨ_３），δ：１．６７（ｓｅｘｔ，２Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_３），δ：２．３５（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３），δ：５．８０（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ_２Ｂｒ）

ｍｙｏ－イノシトール六リン酸Ｅｔ _３ Ｎ塩（３）の合成
ｍｙｏ－イノシトール六リン酸Ｎａ塩（シグマアルドリッチより入手）（１．００ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）を陽イオン交換樹脂（和光純薬社製、Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ８（１００－２００ｍｅｓｈ）で精製し、Ｅｔ_３Ｎ（３ｍｌ）を加え無色色個体のｍｙｏ－イノシトール六リン酸Ｅｔ_３Ｎ塩（３）（２．６ｇ，９２％）を得た。

ｍｙｏ－イノシトール六リン酸ドデカキス（ブチリルオキシメチル）エステル（４）の合成
化合物（３）（５０．０ｍｇ，２．６９×１０^－２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍｌ×３回）で共沸してアセトニトリル（５ｍｌ）に溶かし、ＤＩＰＥＡ（０．２ｍｌ）を加えアルゴン下で１６時間撹拌した。その後アセトニトリル（５ｍｌ×３回）で共沸してアセトニトリル（５ｍｌ）に溶かし、化合物（２）（０．２４ｇ，１．３５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．２ｍｌ）を加え３日間アルゴン下で撹拌した。３日間撹拌後、ＨＰＬＣ（ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝９６：４，Ｆ＝３ｍｌ／分，ｒｔ＝６．３分）にて精製を行い無色液体のｍｙｏ－イノシトール六リン酸ドデカキス（ブチリルオキシメチル）エステル（４）（８．２ｍｇ，１６％）を得た。以下、本明細書の実施例において、ｍｙｏ－イノシトール六リン酸ドデカキス（ブチリルオキシメチル）エステル（４）を「Ｐｒｏ－ＩＰ６」の例として使用した。
^１Ｈ ＮＭＲ （６００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＣＮ） δ：０．９８（ｍ，３６Ｈ，ＣＨ_３），δ：１．６６（ｍ，２４Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_３），δ：２．４１（ｍ，２４Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）， δ：４．５５（ｑ，１Ｈ），δ：４．６３（ｄ，２Ｈ），δ：４．７５（ｑ，２Ｈ），δ：５．２９（ｄ，１Ｈ），δ：５．６８（ｍ，２４Ｈ，ＯＣＨ_２Ｏ）．
^１３Ｃ ＮＭＲ （６００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＣＮ） δ：１２．５，１７．４，３４．９，７２．４，７４．５，７５．３，８２．８，１７１．６．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋） ｍ／ｓ 計算値（Ｃ_６６Ｈ_１１４Ｏ_４８Ｐ_６）：１８６０．４９０５． 測定値：１８８３．４７６６

実施例２ 細胞内ＩＰ６の定量
本実施例では、Ｐｒｏ－ＩＰ６のＨｅＬａ細胞内への取り込みを定量した。

ＨｅＬａ細胞（５ｘ１０^５細胞／ウェル、培養液１ｍＬ）を３．５ｃｍディッシュに播種し、２４時間培養した。その後、ＤＭＳＯ（１％、富士フィルム和光純薬株式会社、ＩＰ６（最終濃度：１０μＭ，シグマアルドリッチ）の水溶液（１％）、または、実施例１で合成したＰｒｏ－ＩＰ６（最終濃度：１０μＭ）のＤＭＳＯ溶液（１％）を加え、さらに３０分間培養した。ネガティブコントロールとして、ＩＰ６、Ｐｒｏ－ＩＰ６のいずれも加えずに培養したＨｅｌａ細胞に上記と同量のＤＭＳＯを加えたものを用いた。

その後１ｘＰＢＳ（－）で１回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を剥がして１．５ｍＬチューブに移して、１ｘＰＢＳ（－）で３回洗浄した。沈殿に３５０μｌのＭｅＯＨ（富士フィルム和光純薬株式会社）＋１％ＮＰ－４０（ナカライテスク）を加え、超音波破砕（１０分間）を行った。カラム（Ｏａｓｉｓ ＷＡＸ １ｃｃ，Ｗａｔｅｒｓ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）とＨ_２Ｏ（１ｍＬ）で平衡化した後に、破砕した細胞抽出液を添加した。その後、５０％ＭｅＯＨ（１ｍＬ）でカラムを洗浄し、２ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ（富士フィルム和光純薬株式会社）含有５０％ＭｅＯＨ（２００μＬｘ２）で溶出を行なった。得られた溶出液を濃縮してＭｅＯＨ（５０μＬ）に溶解後、トリメチルシリルジアゾメタン（２００μｌ、東京化成）を加え、アルゴン雰囲気下５０℃で１時間撹拌した。Ｈ_２Ｏ（１００μＬ）を加え反応停止した。トリメチルシリルジアゾメタンがＩＰ６と反応することによりＩＰ６メチルエステルが得られる。

得られたサンプル（ＩＰ６メチルエステル）をＬＣ／ＭＳ［カラム：ＭａｓｔｒｏＣ１８ ２．１ｍｍｘ１００ｍｍ，３ｍ（島津ジーエルシー）、移動相：０．１％ぎ酸溶液（富士フィルム和光純薬株式会社）、アセトニトリル（富士フィルム和光純薬株式会社）］にて測定した［ＬＣ：ＬＣ－２０ＡＤ（島津）、ＭＳ：ａｍａＺｏｎ ｓｐｅｅｄ（ＢＲＵＫＥＲ）］。

代表的なデータを図１に示す。図１に示された通り、ＩＰ６の値はネガティブコントロールとほぼ同様であり、Ｈｅｌａ細胞の細胞内に実質的に取り込まれなかった。これに対し、Ｐｒｏ－ＩＰ６は、ＩＰ６の２００倍以上のＩＰ６メチルエステルが観測された。これはＰｒｏ－ＩＰ６がＨｅｌａ細胞の細胞内によく取り込まれること、そして、細胞内に取り込まれた後に、Ｐｒｏ－ＩＰ６からＩＰ６が発生することが明らかになった。

実施例３ ＭＴＴアッセイ
本実施例では、ＭＴＴアッセイにより、４種類の血液がん細胞株および健常者由来の細胞に対するＰｒｏ－ＩＰ６の殺細胞効果を調べた。ＭＴＴアッセイは、ＭＴＴ（３－（４，５－ジ－メチルチアゾル－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）をホルマザン色素（紫色）へ還元する酵素活性を測定する比色定量法である。ＭＴＴアッセイにより培養細胞の生存率を調べることが可能である。
がん細胞株（１．７４ｘ１０^４細胞／ウェル、培養液２００μＬ）
ＭＴ－２細胞（ＨＴＬＶ形質転換ヒトＴ細胞白血病細胞）
Ｍ８１６６細胞（ヒトＴ－リンパ芽球様細胞）
ジャーカット細胞（ヒトＴ－リンパ球細胞株）
Ｋ５６２細胞（慢性骨髄性白血病細胞）
健常者由来の細胞（５．０ｘ１０^５細胞／ウェル、培養液２００μＬ）
ＰＢＭＣ（末梢血単核球細胞）

上記各種細胞を９６ウェルプレートに播種し、各種がん細胞株は８時間、ＰＭＢＣは１６時間培養した。その後、ＤＭＳＯ（１％、富士フィルム和光純薬株式会社）、ＩＰ６（最終濃度：１μＭまたは１０μＭ、シグマアルトリッチ）の水溶液（１％）、またはＰｒｏ－ＩＰ６（最終濃度：１μＭまたは１０μＭ）のＤＭＳＯ溶液（１％）を加え、８時間または２４時間培養した。ＭＴＴ試薬（同仁化学、１．１ｍｇ／ｍＬ）を各ウェル５０μＬずつ加え、さらに４時間培養した。析出した結晶を回収後、上清を取り除き、ＤＭＳＯ１００μＬを加え完全に溶解した。この溶液の吸光度（５５０ｎｍ）を測定した。

結果を、図２－図６に示す。図２－図５からわかるように、本実施例ではＰｒｏ－ＩＰ６の投与により血液がん細胞株の相対細胞生存率が２５％以上低下し、どの血液がん細胞株においても、Ｐｒｏ－ＩＰ６が殺細胞効果を示した。これに対し、ＩＰ６はほとんど効果を示さなかった。試験したがん細胞株のうちＭ８１６６、Ｊｕｒｋａｔにおいて特に効果が強く、１０μＭでほとんどの細胞が死んだ。

Ｐｒｏ－ＩＰ６は、このようにがん細胞への殺細胞効果を示すのに対し、健常人末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対しては１０μＭでも毒性を示さなかった（図６）。

実施例４ ウェスタンブロッティング（１）
本実施例では、Ｊｕｒｋａｔ細胞、各種抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、Ｐｒｏ－ＩＰ６による細胞死の作用機序を調べた。

Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０^５細胞／ウェル、培養液５００μＬ）を２４ウェルプレートに播種し、終夜培養した。その後、ＤＭＳＯ（１％、富士フィルム和光純薬株式会社）、ＩＰ６（最終濃度：１０μＭ、シグマアルトリッチ）の水溶液（１％）、またはＰｒｏ－ＩＰ６（最終濃度：１μＭまたは１０μＭ）のＤＭＳＯ溶液（１％）を加え、８時間または２４時間培養した。上清を取り除き、１ｘＰＢＳ（－）で１回洗浄した後Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを加えて１時間１００℃で煮沸して細胞を溶解した。これを電気泳動した後に膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）抗体（ＣＳＴ）、ａｎｔｉ－ＰＡＲＰ－１抗体（Ｍｅｒｃｋ）、Ｃａｓｐａｓｅ－３抗体（ＣＳＴ）、または、ａｎｔｉ－β－アクチン抗体（シグマアルトリッチ）を一次抗体として反応させた。検出はＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ ＬＤ（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いて行った。

結果を図７に示す。１μＭと１０μＭのＰｒｏ－ＩＰ６はＡｋｔのリン酸化を抑制することが分かった（図７）。さらに、１０μＭの濃度でＰＡＲＰ－１およびカスパーゼ－３の切断が観察され、アポトーシスの誘導が示された。Ａｋｔのリン酸化の抑制、およびアポトーシスの誘導は、ＩＰ６の抗腫瘍活性の機序としても報告されている。よって、本実施例の結果は、Ｊｕｒｋａｔ細胞内でＰｒｏ－ＩＰ６からＩＰ６が生成し、ＩＰ６と同様の抗腫瘍活性を示すことを示唆している。

実施例５ ＨＴＬＶ－１感染細胞移植マウスに対する効果
本実施例では、Ｐｒｏ－ＩＰ６のＨＴＬＶ－１感染細胞移植マウスに対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を調べた。ＨＴＬＶ－１（ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型）は、主にＣＤ４陽性Ｔリンパ球に感染し、感染細胞ががん化すると治療抵抗性の悪性腫瘍である成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＴＬ）を引き起こす。本実施例ではＡＴＬ細胞株の１つであるＳ１Ｔ細胞を用いた。

（５－１）マウス
５週齢の雌のＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ ｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、日本チャールス・リバー）を用いた。マウスは、滅菌したケージ（日本クレア）に滅菌床敷（ペパークリーン：日本エスエルシー）をいれ、１ケージに５匹で計２ケージ、１０匹飼育した。飼料は、γ線照射飼料を与え、水は、オートクレーブした滅菌水に塩酸を加え、ｐＨ２．５から３．０に維持した塩酸水を自由摂取させた。マウスは入荷後１週間馴化させた。本研究は遺伝子組換え実験安全管理基準および酪農学園大学動物実験指針に従い、遺伝子組換え実験安全管理委員会（承認番号：１５４）および動物実験委員会（承認番号ＶＨ１６Ａ２１）の承認を受けて実施した。

（５－２）投与薬剤
以下の薬剤を用いた。
１）ＤＭＳＯ ネガティブコントロールとして
２）ＩＰ６（７１ｍｇ／ｍｌ Ｈ_２Ｏ中） ＭＷ：６６０ 比較物質
３）ｐｒｏ－ＩＰ６（２００ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯ中） ＭＷ：１８６１ 合成化合物

マウスへの投与薬剤は以下のように調製した。１日の投与量を２０ｍｇ／ｋｇとなるようにした。
１．ＤＭＳＯ２μｌ＋生理食塩水１９８μｌ
２．ＩＰ６２μｌ＋生理食塩水１９６μｌ＋ＤＭＳＯ２μｌ（終濃度７．１ｍｇ／ｋｇ：１１μｍｏｌ／ｋｇ、ＤＭＳＯ１％）
３．ｐｒｏ－ＩＰ６２μｌ＋生理食塩水１９８μｌ（終濃度２０ｍｇ／ｋｇ：１１μｍｏｌ／ｋｇ，ＤＭＳＯ１％）０．２ｍｌ（ＤＭＳＯ１％）

（５－３）移植用細胞
ＡＴＬ細胞株の１つであるＳ１Ｔ細胞を用いた。細胞移植日に、約２．５ＬのＳ１Ｔ細胞培養液（継代後４日目）を用意し、５００ｍｌ遠心チューブ６本に分注した。ＨＩＴＡＣＨＩ－ｈｉｍａｃ－ＳＣＲ２０Ｂにて１５００ｒｐｍ、５分間４℃で培養液を遠心した。上清を廃棄し、１２０ｍｌのダルベッコのＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ：和光純薬）に浮遊させ、５０ｍｌ遠心チューブ４本に細胞を移し、ＴＯＭＹ－ＲＬ－１０１にて１０００ｒｐｍ、５分間４℃で遠心した。上清を廃棄し、再度１２０ｍｌのＤ－ＰＢＳで洗浄後、５ｍｌのＤ－ＰＢＳに浮遊させ細胞数を測定後、０．２ｍｌ：５×１０^７／マウスとなるようにＤ－ＰＢＳを用いて調整した。

（５－４）移植実験プロトコル
１週間馴化させた６週齢のＮＳＧマウス１０匹にＳ１Ｔ細胞株（０．２ｍｌ：５×１０^７／細胞／マウス）を頚部皮下に移植し、ＡＴＬモデルマウスとした。１０匹のＡＴＬモデルマウスを無作為に３群に分けた。対照群３匹、ＩＰ６投与群３匹およびｐｒｏ－ＩＰ６投与群４匹である。

対照群にはＤＭＳＯを、ＩＰ６投与群にはＩＰ６を７．１ｍｇ／ｋｇ、ｐｒｏ－ＩＰ６投与群にはｐｒｏ－ＩＰ６を２０ｍｇ／ｋｇになるように腹腔内に投与した。細胞移植日より２８日間連続投与し、各マウスの体重、腫瘍体積を連日計測した。腫瘍体積は、（短径ｍｍ）^２×（長径ｍｍ）×０．５とし、短径および長径はノギスを用いて測定した。細胞移植後２８日目に全てのマウスをイソフルランの過麻酔により安楽死させた。次いで、腫瘍を全摘出し、それぞれの腫瘍体積、腫瘍重量を計測した。

移植後１日目－２８日目までの腫瘍体積の変化の結果を図８に示す。移植後２８日目の腫瘍体積を図９に示す。図９に示すように、Ｐｒｏ－ＩＰ６投与群では、移植後２８日目に腫瘍体積が対照群と比較して２５％程小さくなっており、Ｐｒｏ－ＩＰ６が抗腫瘍効果を持つことを明らかにされた。なお、ＩＰ投与群では、腫瘍体積は対照群と有意差がなかった。

実施例６ ｍｙｏ－イノシトール六リン酸ドデカシス（アセトキシメチル）エステルの合成
実施例１で合成したｍｙｏ－イノシトール六リン酸Ｅｔ_３Ｎ塩（３）から、以下のように、ｍｙｏ－イノシトール六リン酸ドデカシス（アセトキシメチル）エステルを合成した。

具体的には、化合物（３）（１７６．８ｍｇ、９．４４×１０^－２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍＬ×３回）で共沸後、アセトニトリル（２ｍＬ）に溶かしＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ）を加え、アルゴン下で３０分攪拌し濃縮した。その後アセトニトリル（３．０ｍＬ）に溶かし、酢酸ブロモメチル（１．０ｇ、１８．９ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．４ｍＬ）を加え、３日間アルゴン下で攪拌した。３日間攪拌後、ＨＰＬＣ（ＡＣＮ：Ｈ_２Ｏ＝３０：７０（０分→１０分）、ＡＣＮ：Ｈ_２Ｏ＝９５：５（１０．１分→２０分），Ｆ＝３ｍｌ／分、ｒｔ＝１５．０分）にて精製を行い、無色液体のｍｙｏ－イノシトール六リン酸ドデカシス（アセトキシメチル）エステルを得た。
^１Ｈ ＮＭＲ （６００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＣＮ） δ：２．１４（ｍ，３６Ｈ，ＯＣＯＣＨ _３ ）， δ：４．５５（ｑ，１Ｈ），δ：４．６３（ｔ，２Ｈ）， δ：４．７５（ｑ，２Ｈ）， δ：５．２７（ｄ，１Ｈ）， δ：５．６８（ｍ，２４Ｈ，ＯＣＨ _２ Ｏ）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋） ｍ／ｓ 計算値（Ｃ_４４Ｈ_６６Ｏ_４８Ｐ_６Ｎａ）：１５４７．１０４７． 測定値：１５４７．１０４１

実施例７ 細胞死判別試験（フローサイトメトリー）
本実施例では、ヒトＴ細胞由来白血病細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞を用い、細胞死判別試験（フローサイトメトリー）を行った。

Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０^５細胞／ウェル、培養液５００μＬ）を２４ウェルプレート（Ｉｗａｋｉ）に播種し、終夜培養した。その後、ＤＭＳＯ（１％、富士フィルム和光純薬株式会社）、ＩＰ６（最終濃度：１０μＭ、シグマアルドリッチ）の水溶液（１％）、Ｐｒｏ－ＩＰ６（実施例１で合成したｍｙｏ－イノシトール六リン酸ドデカキス（ブチリルオキシメチル）エステル（４））（最終濃度：１０μＭ）のＤＭＳＯ溶液（１％）を加え、２４時間培養した。上清を取り除き１ｘＰＢＳ（－）で一回洗浄した後、５ｘ結合溶液（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を１００μＬ加え、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）と７－ＡＡＤ（ベクトンディッキンソン）を加えて１５分反応させた。その後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）を使用して測定し、解析はＦｌｏｗＪｏ（ベクトンディッキンソン）を用いて行った。

結果を図１０に示す。Ｐｒｏ－ＩＰ６を加えた場合には、ヒトＴ細胞由来白血病細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞に対するアポトーシス誘導が観察された。

実施例８ ウェスタンブロッティング（２）
本実施例では、実施例４と同様に、Ｊｕｒｋａｔ細胞、各種抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、Ｐｒｏ－ＩＰ６による細胞死の作用機序を調べた。

Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０^５細胞／ウェル、培養液５００μＬ）を２４ウェルプレートに播種し、終夜培養した。その後、ＤＭＳＯ（１％、富士フィルム和光純薬株式会社）、ＩＰ６（最終濃度：１０μＭ、シグマアルトリッチ）の水溶液（１％）、またはＰｒｏ－ＩＰ６（最終濃度：１μＭまたは１０μＭ）のＤＭＳＯ溶液（１％）を加え、８時間または２４時間培養した。上清を取り除き、１ｘＰＢＳ（－）で１回洗浄した後Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを加えて１時間１００℃で煮沸して細胞を溶解した。これを電気泳動した後に膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。

抗ＴＲＡＦ６抗体（ＣＳＴ）、抗ｐＡＭＰＫ抗体（ＣＳＴ）、または、抗β－アクチン抗体（シグマアルドリッチ）を一次抗体として反応させた。検出はＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ ＬＤ（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いて行った。

結果を図１１に示す。Ｐｒｏ－ＩＰ６により、癌細胞生存促進につながるＴＲＡＦ６の発現抑制、がん抑制につながるＡＭＰＫの活性化が観察された。本実施例の結果は、Ｊｕｒｋａｔ細胞内でＰｒｏ－ＩＰ６からＩＰ６が生成し、ＩＰ６と同様の抗腫瘍活性を示すことを示唆している。

実施例９ Ｐｒｏ－ＩＰ６の細胞内におけるウイルスタンパク質Ｇａｇの凝集への関与
本実施例では、蛍光顕微鏡観察により、Ｐｒｏ－ＩＰ６が、細胞内において、ウイルスタンパク質Ｇａｇの凝集に関与することを観察した。

ＨｅＬａ細胞（０．５ｘ１０^５細胞／ウェル、培養液３００μＬ）を８ウェルチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種し、終夜培養した。リポフェクトアミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｐＵＣまたはｐＥＦ－Ｇａｇ（ｐ１７）ｃＦＬＡＧ、ｐＮＬ４－３／Ｇａｇ－Ｖｅｎｕｓを導入し１０時間培養した。その後、ＤＭＳＯ（１％、富士フィルム和光純薬株式会社）またはＰｒｏ－ＩＰ６（最終濃度：１０μＭ）を添加し、さらに４時間培養した。細胞を４％パラホルムアルデヒド（東京化成）で固定化したのち、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色を行い蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ８００（Ｋｅｙｅｎｃｅ）にて観察した。

蛍光顕微鏡の３Ｄ撮影した写真図を図１２に示す（倍率×１０００）。図１２の右下の写真図において、Ｐｒｏ－ＩＰ６を添加した場合、Ｈｅｌａ細胞内において、ウイルスタンパク質ＧａｇまたはＭＡ領域が凝集することが観察された。

式Ｉの化合物は細胞内に有意にとりこまれ、がん細胞等の悪性細胞に対する殺細胞効果、抗腫瘍効果等を含め、フィチン酸（ＩＰ６）と同様の作用効果を奏する。またＰｒｏ－ＩＰ６は、正常細胞に対して毒性を示さない。式Ｉの化合物を含む医薬組成物および化粧用組成物は、ＩＰ６よりも効果の高くかつ生体に安全な組成物として有用である。

Claims (10)

1. 以下の式Ｉの化合物。
   ［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１およびＲ^１２の全てが、ブチリルオキシメチルである。］
2. 請求項１に記載の式Ｉの化合物を含む、医薬組成物。
3. 細胞増殖抑制、細胞傷害抑制、免疫力上昇、コレステロール低下、腎結石形成抑制、がん転移抑制、および繊維化抑制からなる群から選択される活性を有する、請求項２に記載の医薬組成物。
4. がん、冠動脈疾患、糖尿病および結石症からなる群から選択される疾患を予防または処置するための請求項２または３に記載の医薬組成物。
5. がんが白血病、リンパ腫、骨髄腫からなる群から選択されるがんである、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 経口投与、経皮投与、腹腔内投与または静脈内投与される、請求項３－５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
7. 請求項１に記載の式Ｉの化合物の医薬組成物の製造のための使用。
8. 請求項１に記載の式Ｉの化合物を含む、化粧用組成物。
9. 美白作用または美肌作用を有する請求項８に記載の化粧用組成物。
10. 請求項１に記載の式Ｉの化合物を含む、研究用試薬。