IT9022152A1

IT9022152A1 - Metodo di modulazione di impulsi della sorgente luminosa di citometri di flusso.

Info

Publication number: IT9022152A1
Application number: IT022152A
Authority: IT
Inventors: Otto I Soresen; Harald Steen
Original assignee: Skatron As
Priority date: 1989-11-24
Filing date: 1990-11-22
Publication date: 1992-05-23
Also published as: NO894680D0; DE4037376A1; NO894680L; BE1004550A3; NL9002563A; GB2238612A; GB2238612B; FR2655147B1; US5185265A; IT9022152A0; DE4037376C2; FR2655147A1; GB9024443D0; IT1252081B

Description

METODO DI MODULAZIONE DI IMPULSI DELLA SORGENTE LUMINOSA DI ECCITAZIONE DI CITOMETRI DI FLUSSO"

Un etometro di flusso è uno strumento per misurare la fluorescenza e la dispersione luminosa di cellule biologiche ed altre particelle microscopiche. Portate da un flusso laminare d'acqua con una sezione trasversale dell'ordine di 100 um, le cellule passano una per una attraverso il fuoco di una sorgente intensa di luce di eccitazione. Quando una cellula passa attraverso questo fuoco essa emette un corto impulso di fluorescenza nonché un impulso di luce dispersa. Cosi si può misurare il contenuto cellulare di un costituente quale il DNA che è stato marcato con un colorante fluorescente, nonché la sua dimensione che viene determinata dall'intensità di dispersione della luce. La sorgente della luce di eccitazione pué essere un laser ad onda continua o qualche altra sorgente luminosa ad alta intensità avente un'intensità costante, come una lampada ad arco ad alta pressione contenente mercurio o xeno. Per mezzo di specchi dicroici la fluorescenza può essere divisa in componenti spettrali diversi che vengono misurati da rilevatori separati. La luce dispersa può essere misurata mediante rilevatori separati ad angoli di dispersione differenti per fornire informazioni non soltanto sulla dimensione delle cellule ma anche sulle caratteristiche strutturali delle cellule stesse.

La sensibilità di fluorescenza o limite di rilevamento di fluorescenza di un etometro di flusso viene definita come la quantità più piccola di materiale fluorescente per cellula che può essere rilevata dallo strumento. Parimenti la sensibilità di dispérsione luminosa o limite di rilevamento della dispersione luminosa, viene definita come la cellula più piccola di una data composizione che può essere rilevata. Il limite di rilevamento viene determinato dalla dimensione del segnale nonché del livello di fondo o rumore sul quale il segnale è sovrapposto. Questo rumore ha due sorgenti principali diverse: (a) rumore elettrico proveniente dall'elettronica usata per amplificare e trasmettere gli impulsi dai rilevatori di luce, e (b) rumore ottico che è dovuto al fondo costante di luce provocato da filtri imperfetti e dalla fluorescenza proveniente dalle lenti ed altri componenti ottici. Mentre il rumore elettrico nei citometri di flusso può essere ridotto ad un livello insignificante, vi è un limite principale al rumore ottico. Cosi anche se il consumo di energia di una sorgente luminosa è perfettamente costante, il numero di fotoni n emessi entro un dato periodo di tempo fluttuerà con una deviazione standard s data dall'equazione 1:

s = nV2 (1)

e la variazione standard relativa cv nella misurazione di s viene data dall'equazione 2

cv = n 1/2 (2)

Questa fluttuazione dell'intensità della luce che verrà indicata con rumore ottico è una conseguenza della natura stocastica del processo di immissione della luce ed è vera per tutte le sorgenti luminose incluse la cellula fluorescente e le varie sorgenti di fondo ottico nel citometro di flusso. Il rumore ottico così pone un limite principale a qualsiasi misurazione di intensità luminosa. Soltanto aumentando n, vale a dire aumentando l'intensità della luce od aumentando il periodo di osservazione, si può ridurre questo limite. Nel citometro di flusso il periodo di osservazione è limitato dal tempo di passaggio della cellule attraverso il fuoco di eccitazione.

Poiché il segnale aumenta in proporzione all'intensità di eccitazione, mentre il rumore ottico secondo l'equazione 1 aumenta in proporzione alla radice quadrata dell'intensità, il rapporto tra segnale e rumore aumenterà in proprorzione alla radice quadrata dell'intensità di eccitazione ed il limite di rilevamento diminuirà nella stessa proporzione. La presente invenzione è un metodo per aumentare l'intensità di eccitazione nei ettometri di flusso ed aumentare cosi la sensibilità e ridurre il limite di rilevamento.

Il metodo secondo la presente invenzione è caratterizzato dal fatto che il segnale prodotto da una cellula che entra nel fuoco di eccitazione di un citometro di flusso fa scattare un impulso di energia elettrica proveniente da una sorgente di energia secondaria alla sorgente della luce di eccitazione per aumentare in modo transitorio l'intensità di eccitazione durante il tempo in cui la cellula passa attraverso detto fuoco di eccitazione, e cosi produrre un aumento nella sensibilità di misurazione di detto citometro di flusso.

Ulteriori particolarità caratterizzanti dell'invenzione appariranno dalle annesse rivendicazioni brevettuali e dalla descrizione che segue con riferimento alle Figure dei disegni annessi che illustrano una forma di realizzazione preferita e non limitativa dell'invenzione stessa.

La Figura 1 illustra il dispositivo per citometro di flusso utilizzato col metodo secondo la presente invenzione, e

la Figura 2 illustra tipiche forme d’onda di segnale del dispositivo per citometro di flusso.

Il citometro di. flusso viene illustrato schematicamente in Figura 1. La configurazione ottica dei diversi ettometri di flusso pub differire in modo notevole. La Figura 1 comprende le caratteristiche generali che sono richieste per la presente invenzione. La luce proveniente dalla sorgente 1 di luce di eccitazione viene concentrata su un'apertura 6 mediante una lente collettrice 3 e nuovamente nel fuoco 2 di eccitazione attraverso il quale sta fluendo la corrente di cellule, per mezzo di adatte lenti 4 e 5. Un filtro di interferenza 7 seleziona la banda di lunghezza d'onda particolare che è richiesta per eccitare la fluorescenza delle cellule. La fluorescenza e la dispersione della luce prodotte dalle cellule, quando esse passano attraverso il fuoco 2 di eccitazione vengono raccolte da una lente B che forma un'immagine delle cellule su un'apertura 9. Dietro detta apertura 9 vi 3⁄4 uno specchio dicroico 10 e un filtro passabanda 11 che separano la luce dispersa dalla fluorescenza, che è sempre di una lunghezza d'onda superiore, nonché specchi dicroici 13 e filtri passabanda 14 che separano le varie componenti spettrali della fluorescenza, in modo tale che le componenti di detta luce dispersa e di detta fluorescenza possono essere misurate da separati rilevatori di luce 12, 15. Il segnale proveniente da ciascun rilevatore viene fatto passare attraverso amplificatori di impulso 16 in circuiti 20 di mantenimento di picco. Il segnale da ciascun circuito di mantenimento di picco viene digitalizzato in convertitori 21 analogico digitali che lo inviano in un calcolatore 28. Il calcolatore memorizza i dati e li presenta come istogrammi. Il segnale proveniente da uno dei rilevatori, preferibilmente dal rilevatore 12 di dispersione di luce, viene fatto passare attraverso un discriminatore 19 di altezza di impulso.

Si deve ora far riferimento anche alla Figura 2. Tipicamente ciascuna cellula passa attraverso il fuoco di eccitazione nel corso di alcuni microsecondi; Quando una cellula entra nel fuoco 2 di eccitazione il segnale proveniente dal rilevatore di luce 12 inizierà ad aumentare. Quando questo segnale ha passato un dato livello Vg che viene indicato come il livello di scatto, un impulso elettrivo Vt viene rilasciato da detto discriminatore 19 di altezza di impulso. Questo impulso V viene fatto passare ad un'alimentazione di energia secondaria 18 ove esso fa scattare un impulso elettrico alla sorgente di luce 1, in modo tale che l'intensità della sorgente luminosa aumenta rapidamente in modo da esporre la cellula a questa intensità aumentata. L'alimentazione di energia secondaria 18 è collegata alla sorgente luminosa 1 in parallelo con l'alimentazione di energia primaria 22 che alimenta l'energia costante di funzionamento a detta sorgente luminosa.

In Figura 2 viene illustrato il corso nel tempo del segnale V (Figura 2a), l'impulso (Figura 2b) che fa scattare l'alimentazione di energia secondaria 18, l'impulso di energia elettrica i (Figura 2c) dall'alimentazione di energia secondaria 18, e l'impulso di luce I (Figura 2d) che si aggiunge all'intensità di luce costante I . L'impulso di scatto V^_ ha una durata che è circa la stessa del tempo necessario perchè la cellula passi attraverso il fuoco 2 di eccitazione.

L'alimentazione di energia secondaria 18 ha un circuito di sgancio che eroga un impulso di tensione V (Figuyra 2e) al circuito 20 di mantenimento di picco dei convertitori 21 analogico digitali e cosi fa scattare la registrazione del segnale da parte dei vari rilevatori 15. Quindi la cellula viene misurata con una sensibilità notevolmente maggiore rispetto a quando la sorgente luminosa 1 opera ad intensità costante come avviene negli altri citometri di flusso.

Allo scopo di evitare il sovraccarico della sorgente luminosa 1 provocato da un regime eccessivo di cellule che passano attraverso il fuoco 2 di eccitazione e che fanno scattare la pulsazione di detta sorgente luminosa 1, l'alimentazione di energia secondaria 18 presenta un limite inferiore per il tempo tra due impulsi consecutivi inviati alla sorgente 1 della luce di eccitazione, e perciò un limite massimo per il regime di tali impulsi. Questo limite viene predisposto in modo da evitare che l'energia elettrica media che viene alimentata a detta sorgente di luce 1 non superi il massimo consensito. Per esempio il tempo necessario perchè una cellula passi attraverso il fuoco di eccitazione 1 pub essere di 10 usec. Se la durata degli impulsi di energia elettrica alla sorgente di luce di eccitazione 1 è la stessa e la dimensione di questi impulsi è 10 volte l'energia costante di funzionamento di detta sorgente di luce di eccitazione, un tempo minimo tra due impulsi di un millisecondo implica che la potenza media alla sorgente luminosa non supererà la potenza costante di funzionamento per più del 10%. Quindi se la potenza costante di funzionamento viene predisposta al 10% di meno del valore massimo consensito, il consumo medio di energia della sorgente luminosa di eccitazione non supererà questo massimo. Questo regime di misurazione, vale a dire di 1000 cellule al secondo, è pienamente sufficiente nella maggior parte di applicazioni di citometrì di flusso.

La sorgente di luce secondaria 18 è anche dotata di un circuito di scatto 23 che emette impulsi di energia alla lampa ad un regime costante indipendente da qualsiasi impulso di scatto proveniente dal discriminatore 17. Quindi il segnale provocato soltanto dagli impulsi luminosi pub essere misurato indipendentemente.

L'aumento della uscita delia sorgente di luce di eccitazione 1, prodotto dall'impulso di energia proveniente dall'alimentazione di energia secondaria 18, provoca anche un aumento transitorio del fondo ottico ai rilevatori 15 che si aggiunge al segnale proveniente dalla cellula stessa. Allo scopo di correggere questo aumento, uno specchio semitrasparente 24 devia una piccola parte della luce di eccitazione, vale a dire dell'ordine di alcuni punti percentuali, su un rilevatore 25. Il segnale proveniente da questo rilevatore 25, che è proporzionale al fondo ottico, viene fatto passare attraverso uh amplificatore elettrico 17, un circuito 26 di mantenimento di picco e un convertitore 27 da analogico a digitale al calcolatore 2B. Nel programma di detto calcolatore il segnale proveniente dal rilevatore 25 viene sottratto dai segnali provenienti dai rilevatori 15 dopo la moltiplicazione per un fattore costante, in modo tale che il segnale risultante viene corretto per l'aumento transitorio nel fondo attico.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Metodo per aumentare l'intensità di eccitazione di citometri di flusso, caratterizzato dal fatto che il segnale prodotto da una cellula che entra nel fuoco(2) di eccitazione di un citometro di flusso fa scattare l'impulso di energia elettrica proveniente da una sorgente secondaria (ΐθ) di energia alla sorgente (l) della luce di eccitazione per aumentare in modo transitorio l'intensità di eccitazione durante il tempo in cui la cellula passa attraverso detto fuoco di eccitazione, e così produrre un aumento della sensibilità di misurazione di detto citometro di flusso.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che: (a) la sorgente della luce (1) di eccitazione viene azionata ad una potenza costante erogata da un'alimentazione di energia <' >elettrica (22); (b) la parte iniziale del segnale proveniente da uno dei rilevatori (12) di detto citometro di flusso rilascia un impulso di scatto da un discriminatore (19) di altezza di impulso, che fa sì che un'alimentazione secondaria di energia elettrica della sorgente (1) di luce di eccitazione eroghi un impulso di energia elettrica avente una durata simile al tempo necessario perchè la cellula passi attraverso il fuoco(2)di eccitazione, verso detta sorgente (1) di luce di eccitazione; e (c) quando l'alimentazione di energia secondaria (18) eroga l'impulso di energia elettrica a detta sorgente (1) della luce di eccitazione, essa eroga un impulso di tensione simultaneao a circuiti (20) di mantenimento di picco in modo da far scattare la misurazione dei segnali. provenienti dai rilevatori (12 e 15) di fluorescenza e di dispersione della luce.
3. Metodo della rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che uno specchio semitrasparente (24) devia una piccola frazione della luce di eccitazione su un rilevatore di luce (25), il segnale proveniente da quest'ultimo viene fatto passare a detto calcolatore (28) ed usato in esso per correggere i segnali provenienti dai rilevatori (12, 15) per l'aumento transitorio nel fondo ottico risultante dall'aumento transitorio dell'intensità di luce proveniente da detta sorgente (1) della luce di eccitazione.
4. Metodo della rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta alimentazione (18) di energia secondaria presenta un limite inferiore per il tempo che passa tra impulsi a detta sorgente (1) di luce di eccitazione in modo da evitare che l'alimentazione media di energia a detta sorgente di luce (1) superi il massimo ammissibile.