DE4037376A1

DE4037376A1 - Pulsmodulation fuer die erregungslichtquelle von durchflusszytometern

Info

Publication number: DE4037376A1
Application number: DE4037376A
Authority: DE
Inventors: Harald Steen; Durchmesser Rensen Otto I S
Original assignee: Skatron AS
Current assignee: Skatron AS
Priority date: 1989-11-24
Filing date: 1990-11-23
Publication date: 1991-06-13
Anticipated expiration: 2010-11-24
Also published as: NO894680L; IT9022152A0; GB2238612B; IT9022152A1; DE4037376C2; FR2655147A1; FR2655147B1; BE1004550A3; GB9024443D0; GB2238612A; NL9002563A; NO894680D0; US5185265A; IT1252081B

Description

Ein Durchflußzytometer ist ein Instrument zur Messung der Fluoreszenz und der Lichtstreuung biologischer Zellen und anderer mikroskopisch kleiner Teilchen. In einer laminaren Wasserströmung getragen, und zwar mit einem Querschnitt in der Größenordnung von 100 µm, gehen die Zellen einzeln nacheinander durch den Fokusbereich einer intensiven Erregungslichtquelle. Wenn eine Zelle durch den Fokusbereich hindurchgeht, sendet es einen kurzen Fluoreszenzimpuls und einen Streulichtimpuls aus. Demzufolge kann man den zellularen Gehalt eines Bestandteiles, beispielsweise von DNS (DNA) ermitteln, welcher bzw. welche mit einer fluoreszierenden Farbe markiert worden ist, darüber hinaus kann man seine bzw. ihre Größe feststellen, welche aus der Streulichtintensität ermittelt wird. Bei der Erregungslichtquelle kann es sich um einen kontinuierlichen Wellenlaser (cw) oder irgendeine andere Lichtquelle mit hoher Intensität handeln, welche eine konstante Intensität aufweist, beispielsweise eine Hochdruckbogenlampe, welche entweder Quecksilber oder Xenon enthält. Mit Hilfe dichroitischer Spiegel kann die Fluoreszenz in unterschiedliche Spektralkomponenten aufgespalten werden, welche durch separate Detektoren gemessen werden. Das Streulicht kann durch separate Detektoren an unterschiedlichen Streuwinkeln gemessen werden, um nicht allein Informationen hinsichtlich der Zellgröße, sondern auch im Hinblick auf strukturelle Merkmale der Zellen zu erhalten.

Die Fluoreszenzempfindlichkeit oder die Fluoreszenzfeststellgrenze eines Flußzytometers ist als der kleinste Anteil an Fluoreszenzmaterial pro Zelle festgelegt, der durch das Instrument festgestellt werden kann. In entsprechender Weise ist die Lichtstreuempfindlichkeit oder die Lichtstreu-Feststellgrenze als die kleinste Zelle einer gegebenen Zusammensetzung definiert, die festgestellt werden kann. Die Feststellgrenze ist durch die Größe des Signals, aber auch durch den Hintergrund oder Störpegel festgelegt, auf welchem das Signal superponiert ist. Diese Störungen haben prinzipiell zwei unterschiedliche Ursachen:

a) Elektrische Störungen von der Elektronik, die verwendet wird, um die Impulse von den Lichtdetektoren zu verstärken und weiterzuleiten und
b) optische Störungen, welche durch den konstanten Lichthintergrund erzeugt werden, welcher auf unvollkommene Filter und Fluoreszenz von Linsen und anderen optischen Bauteilen verursacht werden.

Während die elektrischen Störungen in Durchflußzytometern auf einen unbedeutsamen Pegel verringert werden können, besteht eine grundsätzliche Grenze im Hinblick auf optische Störungen. Sogar dann, wenn der Energieverbrauch einer Lichtquelle vollkommen konstant ist, kann die Anzahl der Photonen, n, die innerhalb einer gegebenen Zeitperiode emittiert werden, mit einer Standardabweichung, s, abweichen, und zwar durch die Gleichung 1:

s = n½ (1)

und die relative Standardabweichung, cv, in der Messung von s ist durch die Gleichung 2 gegeben:

cv = n^-½ (2)

Diese Fluktuation der Lichtintensität, welche nachfolgend mit optischer Störung bezeichnet wird, ist eine Folge der stochastischen Natur des Vorganges der Lichtemission und gilt für alle Lichtquellen unter Einschluß der fluoreszierenden Zelle und der verschiedenen Quellen des optischen Hintergrundes in den Durchflußzytometern. Die optische Störung stellt demzufolge eine prinzipielle Begrenzung für irgendwelche Messungen der Lichtintensität dar. Lediglich durch Verringern von n, d. h. entweder durch Erhöhen der Lichtintensität oder durch Erhöhen der Beobachtungszeitspanne, kann diese Grenze verringert werden. Im Durchflußzytometer ist die Beobachtungszeitspanne durch die Durchgangszeit der Zelle durch den Erregungsfokus festgelegt.

Da das Signal proportional zur Erregungsintensität zunimmt, während die optische Störung gemäß der Gleichung 1 proportional zur Quadratwurzel der Intensität zunimmt, wird das Signal-Störungs-Verhältnis proportional zur Quadratwurzel der Erregungsintensität zunehmen, und die Feststellgrenze wird in dem gleichen Ausmaß abnehmen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, um die Erregungsintensität in Durchflußzytometern und um dadurch die Empfindlichkeit zu erhöhen und die Nachweisgrenze herabzusetzen.

Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß durch eine Zelle beim Eintritt in den Erregungsfokus eines Durchflußzytometers erzeugte Signal einen Impuls elektrischer Leistung aus einer zweiten Einspeisung zur Erregung der Lichtquelle triggert, um die Erregungsintensität während derjenigen Zeit, in der die Zelle durch den Erregungsfokus hindurchgeht vorübergehend zu erhöhen und um dadurch eine Erhöhung der Meßempfindlichkeit des Durchflußzytometers zu erhalten.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der Zeichnung beispielsweise erläutert:

Fig. 1 zeigt eine Durchflußzytometervorrichtung, die für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird.

Fig. 2 zeigt typische Signalwellenformen des Durchflußströmungszytometers.

In Fig. 1 ist ein Durchflußzytometer schematisch dargestellt. Der optische Aufbau unterschiedlicher Zytometer kann sich nämlich in beträchtlichem Maße unterscheiden. Fig. 1 zeigt die grundsätzlichen Merkmale, welche für die vorliegende Erfindung wesentlich sind. Licht von der Erregungslichtquelle 1 wird in einer Öffnung 6 mit Hilfe einer Kollektorlinse 3 und vermittels von zweckmäßigen Linsen 4 und 5 in dem Erregungsfokus 2 konzentriert, durch welchen die Strömung der Zellen hindurchgeht. Ein Interferenzfilter 7 wählt das spezielle Wellenlängenband aus, das erforderlich ist, um die Fluoreszenz der Zellen zu erregen. Die Fluoreszenz und das Streulicht, das durch die Zellen erzeugt wird, wenn sie durch den Erregungsfokus 2 hindurchgehen, werden durch eine Linse 8 gesammelt, welche ein Bild der Zellen in einer Öffnung 9 erzeugt. Hinter der Öffnung 9 befinden sich ein dichroitischer Spiegel 10 und ein Bandfilter 11, welcher das Streulicht von der Fluoreszenz trennt, welche immer eine größere Wellenlänge hat.

Dichroitische oder halbdurchlässige Spiegel 13 und Bandfilter 14 trennen die verschiedenen Spektralkomponenten der Fluoreszenz, so daß das Streulicht und die Fluoreszenzkomponenten durch separate Lichtdetektoren 12 und 15 ausgemessen werden können. Das Signal von einem jeden der Detektoren geht durch je einen der Impulsverstärker 16 hindurch zu jeweils einem der Stromkreise 20, um den Spitzenwert festzuhalten. Das Signal von jedem der Stromkreise 20 wird in Analog/Digital-Wandlern 21 digital zerlegt und als Ausgang in einen Computer 28 gegeben. Der Computer 28 speichert die Daten und stellt sie als Histogramm dar. Das Signal von einem der Detektoren, vorzugsweise des Streulichtdetektors 12, geht durch einen Pulshöhen-Diskriminator 19.

Es wird nun auch Bezug genommen auf die Fig. 2. Typischerweise geht jede Zelle durch den Erregungsfokus in dem Verlauf von einigen Mikrosekunden hindurch. Wenn eine Zelle in den Erregungsfokus 2 eintritt, beginnt sich das Signal vom Lichtdetektor 12 zu erhöhen. Wenn dieses Signal V₁ einen gegebenen Pegel V₀ überschreitet, welcher nachfolgend als Triggerpegel bezeichnet wird, wird ein elektrischer Impuls V_t von dem Pulshöhen-Diskriminator 19 freigegeben. Dieser Impuls V_t geht zu einem zweiten Leistungsverstärker 18, wo es einen elektrischen Impuls zur Lichtquelle 1 triggert, so daß die Intensität der Lichtquelle rasch zunimmt, wodurch die Zellen dieser erhöhten Intensität ausgesetzt werden. Die zweite Einspeisung 18 ist mit der Lichtquelle 1 parallel zur ersten Leistungseinspeisung bzw. Energiequelle 22 geschaltet, welche die konstante Betriebsenergie für die Lichtquelle abgibt.

Fig. 2 zeigt den zeitlichen Verlauf des Signals V₁ (Fig. 2 a), des Impulses Vt (Fig. 2b), welcher die sekundäre Leistungseinspeisung 18 triggert, des Impulses der elektrischen Energie i_p (Fig. 2c) von der sekundären Leistungseinspeisung 18 und des Lichtimpulses I (Fig. 2d), welcher der konstanten Lichtintensität I_o hinzugefügt wird. Der Triggerimpuls V_t hat eine Dauer, welche in erster Näherung gleich derjenigen Zeit ist, die für die Zelle erforderlich ist, um durch den Erregungsfokus hindurchzugehen.

Zur sekundären Einspeisung 18 gehört ein Triggerstromkreis, welcher einen Spannungsimpuls V_p (Fig. 2e) zu den Stromkreisen 20 zum Festhalten des Spitzenwertes der Analog/Digital-Wandler 21 gibt und dadurch die Aufzeichnung des Signals von den verschiedenen Detektoren 15 triggert. Demzufolge wird die Zelle mit einer bemerkenswert höheren Intensität ausgemessen, als wenn die Lichtquelle 1 mit konstanter Intensität betrieben wird, wie dies in bekannten Durchflußzytometern der Fall ist.

Um eine Überlastung der Lichtquelle 1 als Folge einer außergewöhnlichen Menge von durch den Erregungsfokus 2 hindurchgehenden Zellen, und der Pulstriggerung der Lichtquelle 1 zu verhindern, unterliegt die Sekundärenergieeinspeisung 18 einer Unterbegrenzung im Hinblick auf die Zeit zwischen zwei aufeinanderfolgenden Impulsen, die an die Lichtquelle 1 gegeben werden, und demzufolge gibt es eine maximale Begrenzung der Anzahl derartiger Impulse. Die Begrenzung ist so getroffen worden, um zu verhindern, daß die mittlere elektrische Leistung, die der Lichtquelle 1 zugeführt wird, nicht das zugelassene Maximum überschreitet. Beispielsweise kann die für eine Zelle erforderliche Zeit, um durch den Erregungsfokus 1 hindurchzugehen, 10 µs betragen. Falls die Dauer der Impulse der elektrischen Einspeisung zur Erregungslichtquelle gleich ist und die Größe dieser Impulse das Zehnfache der Dauerbetriebsleistung der Lichtquelle beträgt, bewirkt eine minimale Zeit zwischen zwei Impulsen von 1 ms, daß die mittlere Leistung der Lichtquelle die Dauerbetriebsleistung um nicht mehr als 10% übersteigt. Falls demzufolge die Dauerbetriebsleistung auf 10% unterhalb des erlaubten Maximums eingestellt wird, wird der mittlere Energieverbrauch der Erregungslichtstromquelle dieses Maximum nicht überschreiten. Diese Meßleistung, d. h. 1000 Zellen pro Sekunde, ist für die meisten Anwendungsfälle von Durchflußzytometern vollkommen ausreichend.

Die sekundäre Lichtquelle 18 ist außerdem mit einem Triggerstromkreis 23 ausgestattet, welcher Leistungsimpulse zu der Lichtquelle mit einer konstanten Rate abgibt, die unabhängig von den Triggerimpulsen des Diskriminators 17 ist. Demzufolge kann das durch die Lichtimpulse bewirkte Signal unabhängig gemessen werden.

Der Anstieg des Ausgangs der Erregungslichtstromquelle 1, der durch die Leistungsimpulse von der sekundären Energieeinspeisung 18 herrührt, bewirkt außerdem eine transiente Erhöhung des optischen Hintergrundes der Detektoren 15, welcher zu dem Signal von der Zelle selbst hinzukommt. Um diese Erhöhung zu korrigieren, zweigt ein halbdurchlässiger Spiegel 24 einen kleinen Anteil des Erregungslichtes ab, und zwar in der Größenordnung von wenigen Prozenten und leitet dieses zu einem Detektor 25. Das Signal von diesem Detektor 25, welches proportional zu dem optischen Hintergrundstörungssignal ist, geht durch einen elektronischen Verstärker 17, einen Stromkreis 26, um den Spitzenwert festzuhalten, und einen Analog/Digital- Wandler 27 hindurch zum Computer 28. Mit Hilfe der Software dieses Computers wird das Signal vom Detektor 25 von den Signalen der Detektoren 15 nach Verstärkung mit einem konstanten Faktor abgezogen, so daß das resultierende Signal im Hinblick auf die transiente Erhöhung im optischen Hintergrundsignal korrigiert ist.

Claims

1. Verfahren zur Erhöhung der Erregungsintensität von Durchflußzytometern, dadurch gekennzeichnet, daß das durch eine Zelle beim Eintritt in den Erregungsfokus (2) eines Durchflußzytometers erzeugte Signal einen Impuls elektrischer Leistung aus einer zweiten Einspeisung (18) zur Erregung der Lichtquelle (1) triggert, um die Erregungsintensität während derjenigen Zeit, in der die Zelle durch den Erregungsfokus hindurchgeht vorübergehend zu erhöhen und um dadurch die Meßempfindlichkeit des Durchflußzytometers zu erhöhen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die Erregungslichtquelle (1) mit einer konstanten Leistung aus einer elektrischen Einspeisung (22) gespeist wird;
b) der Anfangsteil des Signals von einem der Detektoren (12) des Durchflußzytometers einen Triggerimpuls von einem Impulshöhendiskriminator (19) auslöst, welcher bewirkt, daß eine sekundäre Einspeisung der Erregungslichtquelle (1) einen Impuls elektrischer Leistung an die Erregungslichtquelle (1) abgibt, der eine Dauer entsprechend derjenigen Zeit hat, die für den Durchgang der Zelle durch den Erregungsfokus (2) erforderlich ist; und
c) daß, wenn die zweite Leistungseinspeisung (18) elektrische Energieimpulse zur Erregungslichtquelle (1) liefert, ein gleichzeitiger Spannungsimpuls zu den Spitzenwertstromkreisen (20) geliefert wird, um auf diese Art und Weise die Messung von Signalen der Fluoreszenz- und der Streulicht-Detektoren (12 und 15) zu triggern.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein halbtransparenter Spiegel (24) einen kleinen Bruchteil des Erregungslichtes abzweigt und zu einem Lichtdetektor (25) leitet, dessen Signal zum Computer (28) gegeben wird, um dort die Signale von den Detektoren (12 und 15) im Hinblick auf die transiente Erhöhung in dem optischen Hintergrundsignal zu korrigieren, welche aus dem transienten Übergang der Intensität des Lichtes aus der Erregungslichtquelle (1) herrührt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Energieeinspeisung (18) einen unteren Grenzwert für die Zeit zwischen den Impulsen zur Erregungslichtstromquelle (1) hat, um auf diese Art und Weise zu verhindern, daß die mittlere Energieeinspeisung zur Lichtquelle (1) das erlaubte Maximum überschreitet.