IT202000027251A1

IT202000027251A1 - Inibitori della diidroorotato deidrogenasi umana (hdhodh) per l'uso come antivirali

Info

Publication number: IT202000027251A1
Application number: IT102020000027251A
Authority: IT
Inventors: Donatella Boschi; Marta Giorgis; Marco Lucio Lolli; Giovanni Martinelli; Giuseppe Saglio
Original assignee: Donatella Boschi; Marta Giorgis; Marco Lucio Lolli; Giovanni Martinelli; Giuseppe Saglio
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2022-05-13
Also published as: CA3201442A1; MX2023005625A; EP4243818A1; AU2021376883A9; US20240034730A1; JP2023552078A; IL302805A; AU2021376883A1; WO2022101382A1; CN117042775A

Description

Descrizione dell?invenzione industriale intitolata: ?Inibitori della diidroorotato deidrogenasi umana (hDHODH) da utilizzare come antivirali?

DESCRIZIONE

CAMPO DI INNOVAZIONE

La presente invenzione si riferisce a inibitori della diidroorotato deidrogenasi umana (hDHODH) da utilizzare come antivirali. Gli inibitori della hDHODH per l?uso indicato dall?invenzione sono attivi come antivirali innescando nella cellula ospite la ?fame? di pirimidine dovuta all?inibizione della hDHODH. Gli inibitori di hDHODH per l'uso indicato dall'invenzione sono efficaci contro un ampio spettro di virus sia a RNA che a DNA, inclusi, tra l'altro, SARS-CoV-2 e altri importanti patogeni virali umani.

BACKGROUND DELL?INVENZIONE

Gli effetti sociali ed economici a lungo termine della pandemia da COVID-19 non sono prevedibili, comunque le decisioni strategiche prese adesso e nei prossimi mesi saranno tra le pi? importanti prese per generazioni. Dopo molte epidemie di virus a RNA, sia nuovi sia ri-emergenti, come SARS, influenza, MERS, Ebola, and Zika, le azioni strategiche raccomandate per prepararsi al meglio ad altre epidemie di malattie virali, come investimenti su Agenti Antivirali ad Ampio Spettro (AAAS), sono rimaste inadeguate e questo ha portato all?attuale scenario di crisi. Tra gli AAAS, che sono vantaggiosamente in grado di adattarsi rapidamente da un evento pandemico a un altro, gli Host-Targeting Antivirals (HTA) funzionano interferendo con le vie biochimiche cellulari comunemente utilizzate da diversi virus per la replicazione, superando cos? la specificit? del virus e la potenziale mutagenesi virale.

La diidroorotato deidrogenasi umana (hDHODH, EC 1.3.99.11) presente nella membrana mitocondriale interna, ? un enzima flavin dipendente coinvolto nella biosintesi de-novo delle pirimidine. Nella biosintesi de-novo delle pirimidine catalizza la fase velocit? limitante, che converte il diidroorotato (DHO) in orotato (ORO). hDHODH ? gi? stato validato come target terapeutico per il trattamento di malattie autoimmuni, come l'artrite reumatoide e la sclerosi multipla.

Inoltre, l?enzima hDHODH ? stato recentemente identificato come un target rilevante nel trattamento del carcinoma mammario triplo negativo,<1 >di tumori con mutazione PTEN,<2 >tumori guidati da KRAS,<3 >leucemia mieloide acuta (LMA) e infezioni virali.<4 >La connessione con LMA ha aperto la strada a prospettive completamente nuove nel trattamento della malattia e nel campo dell'hDHODH. Presumibilmente, tutte queste diverse neoplasie convergono su un percorso simile di riprogrammazione metabolica per guidare la loro dipendenza dalla sintesi della pirimidina e dalla sensibilit? all'inibizione della DHODH.

Gli inventori hanno recentemente identificato e caratterizzato una nuova classe di inibitori dell?enzima hDHODH <5>, che include, inter alia, il composto 1 (nominato come composto 4 nella ref.<6 >e come composto 1 nella Figura 1 di questo testo) che ha una potenza particolarmente elevata verso l?enzima hDHODH (hDHODH IC501.2 nM) ed eccellenti propriet? drug-like.

RIASSUNTO DELL?INVENZIONE

Gli inventori hanno inaspettatamente scoperto che il composto 1 cos? come i suoi derivati illustrati nelle formule da (I) a (V) di seguito riportate sono anche potenti agenti antivirali ad ampio spettro, includendo anche l?anti-SARS-CoV-2.

La ricerca condotta dai presenti inventori in questo campo ? stata dedicata allo studio dell'uso del composto 1 e dei suoi derivati come agente antivirale ad ampio spettro (AAAS), nonch? a perfezionare le relazioni struttura-attivit? (SAR) di questa classe di inibitori di hDHODH . Come verr? illustrato in dettaglio qui di seguito, gli inibitori di hDHODH testati per l'uso secondo la presente invenzione hanno vantaggiosamente mostrato livelli di potenza simili a brequinar su hDHODH in vitro. In particolare, il composto 1 ? superiore al brequinar in termini di potenza antivirale e profilo di sicurezza, poich? ? in grado di bloccare la replicazione virale a concentrazioni inferiori di una cifra logaritmica di quelle utilizzate con brequinar.

Data la sua abilit? di inibire la replicazione di SARS-CoV-2 con un?EC50 di 74 nM e un SI incredibilmente efficace (Safety Index >6756, CC50 >500 ?M), il composto 1 ha uno dei profili in vitro pi? potenti e sicuri mai ottenuti contro la replicazione di SARS-CoV-2 in cellule E6. Il compost 1 ? stato anche studiato come AAAS contro altri virus ed ha mostrato potenze simili.

Per aprire la strada a future applicazioni precliniche e cliniche, gli inventori hanno anche condotto alcuni studi riguardanti la farmacocinetica, l'emivita per os e i.v., la tossicit? e il metabolismo in vivo, nonch? l'attivit? in vitro contro selezionati virus patogeni di alcuni composti per l'uso secondo l'invenzione. Tali studi sono illustrati di seguito.

I composti sono stati saggiati contro i seguenti virus: Herpes simplex 1 e 2, Influenza Virus e alcuni virus patogeni per il tratto respiratorio come il Virus Respiratorio Sinciziale (RSV), uno delle principali cause dell?ospedalizzazione e della mortalit? infantile, e il ?severe acute respiratory syndrome corona virus 2? (SARS-CoV-2), che appartiene alla stessa famiglia dei virus responsabili della ?severe acute respiratory syndrome? (SARS) e della syndrome ?Middle East respiratory? (MERS).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE

La presente invenzione riguarda una classe di inibitori della hDHODH, basata su un bioisostero non classico del gruppo carbossilico, la 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridina, per l?uso come agenti antivirali, cio? inibitori della replicazione del virus.

Gli inibitori di hDHODH per l?uso secondo l'invenzione sono stati progettati a partire dal brequinar, uno dei pi? potenti inibitori di hDHODH noti attualmente in studi clinici, utilizzando una tecnica innovativa di sostituzione dello scaffold ?scaffold-hopping?.

La 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridina ? un sistema ancora relativamente inesplorato in letteratura. La presente descrizione riporta il suo uso come bioisostero di una funzione carbossilica nella preparazione di due serie di derivati con la tecnica dello scaffold hopping. Nella prima serie, oltre a studiare la sottostruttura stessa (composti 2-5, Figura 1), gli inventori hanno anche studiato l'effetto dell'introduzione di un gruppo cloro e metile nell'anello piridinico al fine di migliorare la sua interazione lipofila con il sottosito 4 di hDHODH (composti 2, 3 e 4, Figura 1) o la sostituzione di una piridina con una porzione piridinica tetraidrogenata come nel composto 5. Anche il secondo anello dello scaffold bifenilico ? stato oggetto di indagine inserendo gruppi polari (composti 6, 8, 9, 14 ) o lipofili (composti 7, 10-13, 15-17).

Nella seconda serie (composti 18, 23, 24, 26-37, Figura 2), gli inventori hanno sostituito il sostituente bifenilico con un difenil etere pi? flessibile al fine di migliorare le sue propriet? farmacocinetiche e fornire composti con propriet? pi? drug-like. La progettazione teorica, la sintesi, le SAR, i saggi biologici, la caratterizzazione fisico-chimica e i profili ADME preliminari dei composti sono presentati e discussi completamente di seguito.

Di conseguenza, un primo aspetto della presente invenzione ? un inibitore di hDHODH basato sullo scaffold della 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridina di Formula (I), (II), (III), (IV) o (V) illustrate di seguito , da utilizzare come agente antivirale.

Formula (I)

Formula (II)

Formula (III)

Formula (IV)

Formula (V)

Nelle formule illustrate sopra da (I) a (V):

R1, R2, R4 e R5 sono indipendentemente selezionati tra un atomo di idrogeno, un atomo di alogeno, un gruppo alchilico C1- C4, un gruppo alchilossi, un gruppo alchiltio, un gruppo aloalchilico C1- C4, un gruppo aloalchilossi C1- C4, un nitro gruppo, un ciano gruppo e un alchilammino gruppo;

R3 ? selezionato tra un facoltativamente sostituito gruppo fenilico, un gruppo eteroarilico, un gruppo piridinilico, un gruppo piperidinilico, un gruppo fenossilico, un gruppo piridinossilico, un gruppo piperidinilossilico, un gruppo feniltio, un gruppo azinilico, un gruppo fenilsulfonilico, un gruppo fenilsulfinilico, un gruppo fenilsulfonilammino, un gruppo alchilico C1- C12, un gruppo alcossilico, un gruppo alchiltio, un gruppo aloalchilico C1- C12 e un gruppo aloachilossilico C1- C12.

Quando R3 ? un gruppo aromatico o alifatico, un possibile sostituente ? per esempio un atomo di alogeno, un gruppo alchilico, un gruppo trifluorometilico, un gruppo trifluorometossi, un nitro gruppo, un ciano gruppo e un alchiammino gruppo.

R7, R8 e R9 sono indipendentemente scelti tra un atomo di idrogeno, un nitro gruppo, un ciano gruppo, un gruppo aloalchilico C1-C4, un gruppo tioalchilico C1-C4, un gruppo amminoalchilico C1-C4, un gruppo alchilico C1-C4 e un gruppo idrossialchilico C1- C4;

R6 ? scelto tra un gruppo alchiossilico C1-C4, un atomo di alogeno, un gruppo acilossilico, un gruppo monofosfato, un gruppo idrossilico, un gruppo tiolico, un gruppo amminico o un suo sale;

X, Y e Z sono indipendentemente scelti tra un atomo di carbonio, un atomo di azoto, un atomo di ossigeno a un atomo di zolfo, con la condizione che quando una tra X, Y o Z ? azoto, ossigeno o zolfo, le altre due posizioni sono atomi di carbonio;

Nella Formula (I), T ? un atomo di carbonio o un atomo di azoto, con la condizione che quando T ? un atomo di azoto, R<5 >della formula (I) non esiste;

Nella Formula (IV), M ? scelto tra un atomo di carbonio sp2, un atomo di azoto sp3, un atomo di azoto sp2, un gruppo carbonilico e un gruppo sulfonilico.

Nella Formula (IV), Q ? scelto tra un atomo di carbonio sp2, un gruppo carbonilico, un gruppo tiocarbonilico, un gruppo sulfonilico, una catena alchilica polialogenata in C2, un gruppo carbonilamminico, un gruppo amminocarbonilico, un atomo di azoto sp2 e un atomo di azoto sp3.

Con la condizione che quando M ? un atomo di carbonio sp2, Q ? un atomo di carbonio sp2; quando M ? un atomo di azoto sp3, Q ? scelto tra un gruppo carbonilico, un gruppo tiocarbonilico, un gruppo sulfonilico, una catena alchilica polialogenata in C2, un gruppo carbonilamminico, un gruppo amminocarbonilico; quando M ? un atomo di azoto sp2, Q ? un atomo di azoto sp2; quando M ? un gruppo carbonilico o un gruppo sulfonilico, Q ? un atomo di azoto sp3;

Nella Formula (V), Het ? scelto tra gli azoli, come imidazolo, pirazolo, ossazolo, tiazolo, triazolo, ossadiazolo, tiadiazolo, tetrazolo.

A seconda dell?incorporazione preferita almeno uno tra R<1>, R<2>, R<4 >e R<5 >? o contiene un atomo di alogeno.

L?atomo di alogeno preferito ? un atomo di fluoro(F).

Nella definizione di R<6>, se R<6 >? OH o un monofosfato, i sali preferiti saranno i sali di Na<+>, K<+>, Ca<2+ >o Cs<2+>.

In tutte le incorporazioni sopra menzionate, il gruppo alchilico preferito C1-C4 come R<7 >e R<8 >? un gruppo metilico mentre sia X, Y e Z sono atomi di carbonio sp2.

La formula (Ia) riportata sotto illustra una delle incorporazioni preferite della Formula (I) nella quale X=Y=Z sono atomi di carbonio sp<2 >e R9 ? un protone:

Formula (Ia)

I composti preferiti che ricadono nelle possibilit? delle Formule (I) e (Ia) sono i composti 1-4, 6-18, 23-24, 26-37 illustrati nelle Figure 1 e 2.

La Figura (IIa) sotto riportata illustra una delle incorporazioni preferite della (II) nella quale X=Y=Z sono atomi di carbonio sp<3 >e R9 ? un protone:

Formula (IIa)

Il composto preferito che ricade nelle possibilit? delle Formule (II) and (IIa) ? il composto 5 illustrato in Figura 1.

Il composto preferito che ricade nelle possibilit? della Formula (III) ? il composto 5 illustrato in Figura 1.

Il composto preferito che ricade nelle possibilit? della Formula (IV) ? il composto 25 illustrato in Figura 2.

Inibitori particolarmente preferiti per l?uso indicato nell?invenzione sono i composti 1 e 17 che hanno le formule di struttura riportate qui sotto:

I composti particolarmente preferiti 1 (MEDS433) e 17 mostrano livelli di potenza simili al brequinar su hDHODH in vitro e sono superiori in termini di potenza antivirale e di selettivit?, bloccano la replicazione virale a concentrazioni che sono di un ordine logaritmico inferiore di quelle utilizzate negli esperimenti con il brequinar.

Un secondo aspetto della presente invenzione ? una composizione farmaceutica antivirale che contenga, come agente antivirale, un inibitore di hDHODH basato sullo scaffold della 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridina di formula da (I) a (V), come definito sopra, e un veicolo, un eccipiente e/o un diluente farmaceuticamente accettabile.

Un terzo aspetto della presente invenzione ? un inibitore dell'hDHODH basato sullo scaffold della 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridina di formula generale da (I) a (V), come definito sopra, per l'uso nel trattamento terapeutico di un'infezione virale patogena in un soggetto.

In tutti gli aspetti della presente invenzione sopramenzionati, il virus ? un virus a DNA o un virus a RNA. Preferibilmente, il virus ? selezionato nel gruppo costituito da Herpesviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae e Coronaviridae. Pi? preferibilmente, il virus ? selezionato dal gruppo costituito da Herpes simplex virus 1 (HSV-1), Herpes simplex virus 2 (HSV-2), Influenza A virus, Influenza B virus, Virus Respiratorio Sinciziale (RSV), Corona Virus 1 relativo a Severa Sindrome respiratoria (SARS-CoV-1), Corona Virus 2 relativo a Severa Sindrome respiratoria (SARS-CoV-2) e Corona Virus relativi a sindrome respiratoria Medio Orientale(MERS-CoV).

La parte sperimentale seguente ? fornita solo a titolo illustrativo e non intende limitare l'ambito dell'invenzione come definito dalle rivendicazioni allegate.

Nella parte sperimentale si fa riferimento alle seguenti figure:

Figure 1A, 1B e Figure 2A, 2B mostrano le strutture dei composti 1 - 37 che sono i composti preferiti per l?uso indicato dall?invenzione.

Figura 3 ? composta da due diagrammi che mostrano che l'attivit? antivirale del composto 1 contro RSV ? revertita dall'uridina e dall'acido orotico.

Figura 4 ? un grafico che mostra che il composto 1 inibisce la replicazione di SARS-CoV-2 nelle cellule Vero E6.

PARTE SPERIMENTALE

Schemi di sintesi:

Schema 1. Metodologie sintetiche per la sintesi dei composti 1, 5, 10-13: i) oxalil cloruro, anidro DMF, anidro THF; ii) AlMe3, anidro toluene, reflusso; iii) H2, Pd/C, 37 % w/w HCl, etanolo; iv) H2, Pd/C, anidro THF, 40 bar, 65 ?C, SynthWAVE.

Schema 2. Metodologie sintetiche per la sintesi dei composti 6 ? 9, 14 -17: i) Cs2CO3, 4-MeOBnBr, anidro DMF; ii) 5M NaOH, etanolo, 75 ?C; iii) atmosfera di azoto, axalil cloruro, anidro DMF, anidro THF; iv) AlMe3, anidro toluene, reflusso; v) a) Pd(Ph3)4, K2CO3, diossano/acqua (9:1 v/v), 1h r.t, b) acido boronico corrispondente, reflusso; vi) atmosfera di azoto, morfolina, Cs2CO3, Pd(OAc)2, BINAP, anidro toluene, tubo sigillato, 110?C; vii) tioanisolo, trifluoroacetico acido, 70 ?C.

Schema 3. Metodologie sintetiche per la sintesi del composto 4: i) Cs2CO3, tert-butossicarbonil anidride, anidro THF, reflusso; ii) a)atmosfera di azoto, litio hesametildisililazide (LiHMDS, 1.0 M, anidro THF), -78 ?C, 1h, b) atmosfera di azoto, hesacloroetano r.t.; iii); trifluoroacetico acido, anidro diclorometano, r.t.; iv) benzil bromuro, Cs2CO3, anidro DMF, r.t.; v) 6 M NaOH, etanolo abs, 75 ?C; vi) atmosfera di azoto, oxalil cloruro, anidro DMF, anidro THF; vii) AlMe3, anidro toluene, reflusso; viii) tioanisolo, trifluoroacetico acido, 70?C.

Schema 4. Metodologie sintetiche per la sintesi dei composti 19 ? 24, 28 ? 30 and 37: i) oxalil cloruro, anidro DMF, anidro THF, atmosfera di azoto; ii) anidro toluene, anidro piridina; iii) H2, Pd/C, anidro THF.

Schema 5. Metodologie sintetiche per la sintesi dei composti 26, 31 ? 36: i) oxalil cloruro, anidro DMF, anidro THF, atmosfera di azoto; ii) anidro toluene, anidra piridina; iii) tioanisolo, trifluoroacetico acido, 70?C.

Schema 6. Metodologie sintetiche per la sintesi del composto 25: i) NaNO2, HNO3, acqua, 0?C, ii)

soluzione acquosa a pH 10 0?C.

Risultati e discussione

Chimica: sintesi dei composti 2 - 37

Per la sintesi dei composti 5 e 10-13, ? stata utilizzata una strategia chimica gi? studiata per il composto principale 1 (vedi Schema 1). Lo schema parte dal building block protetto 40, 2-idrossipirazolo [1,5-a] piridina, quest'ultimo ottenuto da 39 in due fasi<6>. Da 40, il corrispondente cloruro acilico ? stato ottenuto e utilizzato direttamente senza ulteriore purificazione. A causa della loro scarsa reattivit? con il cloruro acilico, ciascuna anilina (41-45) ? stata convertita nella pi? reattiva dimetilalluminio ammide, queste ultime hanno permesso di reagire con il suddetto cloruro acilico ottenendo le ammidi desiderate 46-50 con una resa nell?intervallo del 31-40%. Si noti come, durante la fase di accoppiamento, il gruppo protettore benzilico abbia trasposto dall'ossigeno esociclico all'azoto N1 endociclico il sistema pirazolo [1,5-a] piridina. Durante la sintesi di 1,<6 >la rimozione della porzione benzilossi per il 46 era sempre affetta dalla presenza di una reazione collaterale che portava ad avere tracce del compost ridotto 5. In questa occasione, 5 ? stato ottenuto con una resa del 44% applicando condizioni di idrogenazione catalitica pi? forti (40 bar) e utilizzando un apparecchio SynthWAVE. Al contrario, per evitare tale reazione collaterale, i composti 47-50 sono stati convertiti nei desiderati composti target 10-13 applicando l?idrogenazione catalitica a pressione ambiente in presenza del 37% p / p di HCl.

Per la sintesi dei composti 6 - 9 e 14 - 17, abbiamo progettato un approccio sintetico convergente con accoppiamento Suzuki in fase avanzata del composto 53, come intermedio comune. Anche in questo caso lo schema ? partito dalla 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridina 39, che era protetto con 4-metossibenzil bromuro per fornire i regioisomeri 51a e 51b rispettivamente in rapporto 61 e 27%. Il gruppo protettore 4-metossibenzile pu? essere facilmente rimosso in condizioni acide, applicabile anche a molecole contenenti atomi di zolfo e anello piridinico, entrambi noti per avvelenare il catalizzatore metallico durante l'idrogenazione. L'estere 51a ? stato quindi idrolizzato in condizioni basiche per ottenere il corrispondente acido 52 (resa quantitativa), che ? stato poi utilizzato per la preparazione dell'intermedio comune 53. A partire dall'acido 52, il corrispondente acil cloruro ? stato ottenuto tramite trattamento con ossalil cloruro ed ? stato utilizzato senza alcuna ulteriore purificazione nella reazione con la dimetilalluminio ammide della 2,3,5,6-tetrafluoro-4-bromoanilina che fornisce l'ammide 53 desiderata con una resa del 55%. Anche in questo caso ? stata osservata la trasposizione del gruppo protettore benzilico dall'ossigeno esociclico all'azoto endociclico N1 del sistema pirazolo[1,5-a]piridina. Il composto 53 ? stato utilizzato come elemento costitutivo comune per i composti desiderati 54, 55 - 61. In primo luogo, applicando un accoppiamento con morfolina in condizioni Buchwald-Hartwig<7>, ? stato ottenuto 54 (59% di resa), quindi mediante reazione Suzuki che coinvolge i corrispondenti acidi boronici sono stati ottenuti 55-61 (intervallo di resa: 70-94%). I composti 54 - 61 sono stati quindi convertiti nei target desiderati 6 - 9, 14 - 17 mediante trattamento con acido trifluoroacetico (TFA) in presenza di tioanisolo come scavenger.

Per la sintesi del composto 4, ? stato applicato uno schema sintetico dedicato. In questo caso, il gruppo idrossile di 39 ? stato O-protetto con il gruppo Boc per ottenere 62. Usando litio esametildisililazide su 62, la funzione pirazolo[1,5-a]piridina ? stata selettivamente deprotonata in posizione 7; in seguito, il quenching del sale di litio di 62 con esacloroetano, impiegato come fonte elettrofila di Cl<+>, ha fornito il composto 63 con buona resa<8>. Per passare allo schema di reazione e preparare le fasi seguenti di accoppiamento, il gruppo Boc ? stato idealmente sostituito con un gruppo benzile. Il gruppo Boc ? stato rimosso quantitativamente in condizioni di acido lieve (TFA) ottenendo l'idrossiazolo 64 che ? stato fatto reagire con benzil bromuro per fornire il composto 65 (90% nelle due fasi). Vale la pena notare che in questo caso, a causa della presenza di un cloro in posizione 7, l'isomero endociclico N1 ? stato ottenuto solo in tracce. L'estere 65 ? stato quindi idrolizzato in condizioni basiche per ottenere il corrispondente acido 66 (resa quantitativa) che ? stato utilizzato per la preparazione dell'ammide 67 utilizzando le condizioni sopra descritte che prevedevano l'attivazione del 2,3,5,6-tetrafluoro-4-fenilanilina come dimetilalluminio ammide che fornisce l'ammide 67 desiderata con una resa del 38%. Il composto 67 ? stato quindi convertito nel target desiderato 4 mediante trattamento con TFA in presenza di tioanisolo come scavenger.

La strategia sintetica utilizzata per produrre i 2-arilossipirazolo[1,5-a]piridina building blocks 40 e 52, utili nelle sintesi dei composti target 19 -24, 26 e 28 - 37, ? stata ottenuta utilizzando procedure e condizioni dettagliate nella nostra precedente pubblicazione.<6 >Partendo dall'acido 40, sono stati preparati i composti 68-77, tramite una procedura nota (vedi Schema 4), il corrispondente cloruro acilico ? stato ottenuto tramite trattamento con ossalil cloruro e utilizzato direttamente dopo essiccamento senza ulteriore purificazione. Al contrario del nostro lavoro precedente dedicato all'hDHODH, il cloruro di acile ? stato lasciato reagire direttamente con la corrispondente anilina (78-87) precedentemente sintetizzata. Le ammidi desiderate 68-77 sono state ottenute con rese nell'intervallo di 50-92%. Andando avanti, i composti 68 - 77 sono stati quindi convertiti in composti target desiderati 19 - 24, 28 - 30 e 37 applicando l'idrogenazione catalitica a pressione ambiente. A partire dall'acido 52 sono stati preparati i composti 88-94, (vedi Schema 5), il corrispondente cloruro acilico ? stato ottenuto tramite trattamento con ossalil cloruro e utilizzato direttamente dopo essiccazione senza ulteriore purificazione. Il cloruro acilico ? stato lasciato reagire direttamente con la corrispondente anilina (95 -101) precedentemente sintetizzata. Le amidi desiderate 88 - 94 sono state ottenute con rese nell'intervallo di 61 - 94%. Andando avanti, i composti 88 - 94 sono stati convertiti nei composti desiderati 26, 31 - 36 mediante trattamento con acido trifluoroacetico (TFA) in presenza di tioanisolo come scavenger. Al contrario della strategia applicata nello Schema 1, ? stato utilizzato il gruppo protettivo 4-metossibenzile, perch? pu? essere facilmente rimosso in condizioni acide, applicabile anche a molecole contenenti atomi di zolfo e anello piridinico, entrambi noti per avvelenare il catalizzatore di metalli durante l'idrogenazione nel ultimo passaggio.

La strategia sintetica utilizzata per produrre il composto 25, ? stata ottenuta tramite una diazotizzazione della 2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil]-4-ammina utilizzando nitrito di sodio e acido nitrico e si ? accoppiata con 102 in condizione basiche. Il composto 102 pu? essere assimilato a un fenolo, e l'atomo di C con la pi? alta densit? di elettroni ? solitamente la posizione di accoppiamento preferita del sale di diazonio. A causa dell'influenza diretta dei gruppi idrossilici nei sistemi pirazolo[1,5-a]piridin-2-olo, l'accoppiamento avviene nella posizione 3.

Attivit? inibitoria di hDHODH e SAR. Abbiamo valutato l'attivit? di inibizione dell'hDHODH ricombinante dei composti 4-17 utilizzando, come confronto, due candidati in sperimentazione clinica (brequinar e BAY-2402234) e il composto 1. Mentre BAY-2402234 ? stato acquistato da una fonte commerciale, brequinar ? stato sintetizzato seguendo procedure note. Per completare il quadro e preparare la discussione dei successivi studi cellulari, per ogni composto sono stati misurati anche il LogD<7.4>, la solubilit? in tampone fosfato (PBS) e il legame alle proteine plasmatiche.

Analisi delle SAR dell?anello piridinico (anello A) dello scaffold 2-idrossipirazolo[1,5-a]piridina.

Come riportato nella nostra precedente pubblicazione, <6 >l'interazione tra 1 e la piccola tasca lipofila creata da Val134 e Val143 (sito secondario 4) ? stata esplorata, come possibile fonte di ulteriore modulazione, utilizzando il metodo della Molecular Dynamics (MD) free energy perturbation (FEP), <9>. Dei quattro siti sull'anello A (posizioni 4 - 7), le analisi in-silico hanno suggerito che la posizione 7 ? la favorita per la sostituzione dell'idrogeno. Inoltre, lo studio ha indicato che i derivati del cloro erano generalmente preferiti a quelli metilici. Andando al lavoro sperimentale (Tabella 1), tenendo in considerazione I risultati di MD/FEP, ? stato sintetizzato un derivato con un sostituente cloro in posizione 7 (4, IC50 = 3.4 nM). Se confrontato con l?analogo metilico (2, IC50 = 4.3 nM), il cloro ? meglio tollerato e porta ad un analogo del composto 1 con attivit? comparabile, ma pi? alto LogD<7.4>. Abbiamo quindi considerato anche un analogo ridotto con la 4,5,6,7-tetraidropirazolo[1,5-a]piridina, 5 (IC50 = 5.8 nM), che porta ad una leggera diminuzione di Potenza rispetto al composto 1. Sebbene le modulazioni dell'anello A non abbiano determinato una maggiore attivit? inibitoria rispetto a 1, sono stati osservati LogDs<7.4 >pi? elevati in tutti i composti, ma purtroppo tutti sono stati associati a una ridotta solubilit?. La solubilit? in PBS non ? stata misurata, poich? la concentrazione della frazione solubile era inferiore al valore LOD (6 ?M). In termini di legame alle proteine, non ? stato osservato nessun miglioramento significativo.

Tabella 1: attivit? di inibizione enzimatica dei composti 6 - 17 e relativi LogD<7.4>, solubilit? e legame alle proteine. L?attivit? dei composti ? espresso come valori di IC50 values. Valore del limite di rivelabilit? (LOD): 6 ?M. La notazione ?nd? indica che il composto non ? stato analizzato in quello specifico test.

Analisi delle SAR dell?anello D dello scaffold bifenilico: sostituzione/modulazione del fenile.

Passando all'anello D, abbiamo dedicato i primi quattro composti (6 - 9) allo studio di una sua possibile sostituzione isosterica (Tabella 1). L'incorporazione di una morfolina come sostituente (6, IC50 = 90,9 nM) non ? stata ben tollerata, come ? per l?anello fenilico, e ha portato ad una diminuzione della potenza di circa 50 volte rispetto a 1. L'introduzione di eteroatomi che possono interagire con la sotto-tasca lipofila, formata da Pro69 e Leu68, pu? indurre interazioni repulsive, visto che una diminuzione di potenza si osserva anche per il derivato piridinico 9 (Figura 2). Tuttavia, 6 era il pi? solubile della serie, avendo quasi il doppio della solubilit? del brequinar. La sostituzione dell'anello C con il bioisostero classico tiofene (7, IC50 = 1,35 nM) ha mantenuto il profilo inibitorio. L'intervallo ottimale di logD<7.4 >per un assorbimento ottimale del farmaco, attraverso i meccanismi di permeabilit? passiva o diffusione, ? considerato essere compreso tra 1 e 3.<13 >Nel caso di inibitori di hDHODH, la letteratura indica che un valore di logD<7.4 >superiore a 2.50 ? ottimale per ridurre i problemi di assorbimento. <11 >In termini di attivit?, la sostituzione della posizione fenilica di 1 con l?isostero classico azoto, come in 8 e 9, ha comportato perdite di attivit? (IC50 = 6,23 nM e 150 nM), con la meta sostituzione che ? meglio tollerata. Per comprendere meglio questo risultato, 9 deve essere confrontato con 13 (IC50 = 6,34 nM) in cui ? ancora presente -CF3 nella meta posizione, ma l'azoto viene idealmente rimosso. I due analoghi della piridina, 8 e 9, mostrano una solubilit? migliore di 1, quattro e 1,5 volte rispettivamente. In termini di legame alle proteine, non ? stato osservato nessun miglioramento significativo. Andando avanti, con i composti 10-17 abbiamo studiato le posizioni sull'anello D che sono adatte per la sostituzione. La modalit? di legame di 1 e dei suoi derivati posiziona l'anello D vicino all'ingresso della tasca di legame dell'ubiquinone (Figura 2), esponendo la posizione meta ad un'area vuota del sito di legame, al confine tra la tasca e il vuoto. Con 10-13, abbiamo studiato l'effetto delle sostituzioni lipofile, come F e CF3, nelle posizioni para (10, 12) e meta (11, 13) dell'anello D. Analizzando i risultati (Tabella 1), possiamo osservare come la sostituzione in meta, 11 e 13 con IC50 = 2.03 nM e IC50 = 6.34 nM rispettivamente, sia meglio tollerata che negli isomeri para, 10 e 12 con IC50 = 17.7 nM e IC50 = 71.8 nM. Invece non ? sorpendente trovare che l?attivit? del composto 11 sia nello stesso range di 1, poich? il fluoro ? un classico sostituente bioisosterico del protone, la stessa cosa non si pu? dire per il composto 13, per cui piccoli gruppi lipofili come -CF3, sono risultati ben accetti. Questa sostituzione valida il binding mode di 13 precedentemente previsto, in cui il trifluorometile ? posizionato in un?area vuota del sito di binding. Queste modulazioni hanno portato i composti ad essere pi? lipofili, come previsto, ma sfortunatamente questa propriet? ? associata all'insolubilit? ed i valori ottenuti sono ampiamente al di sotto del limite di riferimento di 6 ?M. Concentrandosi sulla sostituzione della posizione meta, abbiamo ottenuto il composto 14 (IC50 = 2,78 nM), che ? paragonabile a 1 stesso in termini di potenza, ma ? caratterizzato da una migliore solubilit? (circa cinque volte), in quanto l'atomo di ossigeno ? in grado di formare legame a idrogeno con l'acqua e ha un logD<7.4 >paragonabile a quello del brequinar stesso. Modulando idealmente il 14, abbiamo introdotto una sostituzione sull'ossigeno fenolico, ottenendo 15-17. Questa modulazione ha portato a IC50 che sono paragonabili a quella di 1, dimostrando ancora la modalit? di legame prevista ed ? stata associata ad un aumento di LogD<7.4 >per ogni composto. Il composto pi? interessante ? il 17 (IC50 = 5,09 nM), caratterizzato dall'introduzione di un gruppo propossi. Questo ? il composto pi? interessante della serie qui descritta, in quanto ? paragonabile al composto lead 1 in termini di potenza e, sebbene mostri una solubilit? simile, ha un LogD<7.4 >pi? alto (sopra la soglia di 2,5).

Analisi delle SAR dello scaffold bifenilico.

Nonostante la sua potente inibizione di hDHODH valutata in vitro, il profilo di solubilit? del composto 1 ? molto lontano da quello del brequinar e la presenza del sostituente tetrafluorobifenilico ? dannosa per la sua solubilit?. Allo scopo di ottenere uno scaffold alternativo che fornisca un'inibizione di hDHODH paragonabile a quella del composto 1, ? stata sviluppata una nuova serie di inibitori a partire dalla struttura del composto lead 1<86>. Quindici analoghi (composti 19-37) privi dello scaffold bifenilico sono stati quindi disegnati per esplorare nuove possibilit?. (Figure 2A e 2B) L'ispirazione ? stata presa da Das et al.<14 >in cui l'attivit? ?brequinar-like? ? stata replicata da analoghi che includevano un diariletere sostituito. La logica alla base della progettazione del compost 26 deriva dal concetto di isostere. Poich? il composto 18 ha mostrato buone interazioni all'interno della tasca di legame dell'enzima, la struttura generale della molecola ? stata mantenuta, ma per ottenere un composto pi? polare, si ? deciso di sviluppare un composto in cui l'anello D ? stato sostituito da un isostero pi? polare: l?anello piridinico con il ponte dell'ossigeno tra l'anello C e D trasformato in uno di zolfo. 27-35 rappresentano i composti proposti dopo gli studi di SAR sul composto 18 nel tentativo di aumentare la sua affinit? di legame. La presenza di un ulteriore sostituente etereo potrebbe esplorare nel sito di legame una regione che ? rimasta ancora quasi del tutto non sfruttata. L'indagine sulla possibilit? di ulteriori interazioni idrofobiche con alcuni residui amminoacidici lipofili situati nel sito secondario 1 ha condotto allo sviluppo di diaril eteri diversamente sostituiti che potrebbero far guadagnare ai composti potenza e selettivit? per hDHODH. Nella tabella 2 sono presentati i risultati dello studio SAR diretto a modulare 18, composti che differiscono da 1 per la presenza di una frazione arilossi necessaria per interagire con il sottosito 1 hDHODH. La sostituzione della porzione fenossifenile con le porzioni azotate indolo-5-il, N-fenilindolo-5-il, N1-fenilbenzoimidazol-5-il o N1-fenilbenzotriazolile (composti 19-22 rispettivamente) ? dannosa per l'attivit? cos? come la sostituzione di uno dei due fenili con un anello piridinico (composto 23, 24, 26). La rimozione del metile in posizione orto rispetto alla funzione ammidica (composto 27) diminuisce di dieci volte l'attivit? mentre la rimozione del metile in posizione meta (composto 28) ? dannosa ed evidenzia l'importanza di un piccolo sostituente nella posizione meta. Infatti, la sostituzione del sostituente metilico in posizione meta con una catena pi? grande come l?isopropile (composto 30) dimezza l'attivit?. Spostandosi alla posizione orto, sostituenti grandi come l'isopropile (composto 29) aumentano l'attivit?, mentre la sua sostituzione con altre frazioni alchilossiliche annulla l'attivit?. Anche nei composti con il fenossifenile, un sostituente trifluorometilico in posizione para (composto 37) diminuisce l'attivit?.

Tabella 2: Attivit? inibitoria enzimatica dei composti 18 - 37, brequinar, Bay2402234 e 1 con relativo LogD<7.4>. L?attivit? dei composti ? espressa come valore di IC50. Limite di rivelamento (LOD): 6 ?M.

Propriet? fisico-chimiche

La determinazione delle principali propriet? chimico-fisiche che governano il profilo ADME ? stata effettuata per tutti i composti misurandone la lipofilia (logD<7.4>) e la solubilit? a pH fisiologico.

Solubilit? termodinamica. E? stata determinata utilizzando il metodo dello ?shake flask all?equilibrio per la solubilit? termodinamica? in tampone fosfato salino (PBS a pH = 7,4), scelto per la sua capacit? di simulare il pH plasmatico e l'osmolarit?.

Lipofilia. Il metodo dello shake flask ? stato scelto per determinare il logD<7.4>. Inoltre, la lipofilia ? stata stimata in silico, il clogP ? stato calcolato per ogni composto con il software Bio-Loom per Windows, versione 1.5.

Riassumendo i risultati, ? stata osservata un'ottimizzazione in termini di solubilit? per il composto 6 (438 ?M), a causa della eliminazione del secondo anello aromatico e dell'inserimento di un anello morfolinico. Questa sostituzione fornisce alla molecola due importanti contributi polari: un'ammina e un etere. Anche i composti 8 e 14 rappresentano uno sforzo per aumentare la solubilit?, introducendo una piridina e un anello fenolico al posto dell'anello D. Questi composti permettono di passare da 12 ?M del composto 1 a 47 ?M e 55 ?M. Il composto 17, con la sua catena propossi, ha praticamente la stessa poca solubilit? (12,9 ?M) del composto 1, quindi non rappresenta un miglioramento efficace in questo senso.

In generale ? possibile dire che tutte le solubilit? misurate sono molto lontane da quella del brequinar e queste basse solubilit? hanno una spiegazione ragionevole: a pH = 7,4, la parte idrossilica della maggior parte dei composti ? completamente deprotonata (pKa ~ 5-6) e ? stato ipotizzato che tra l'idrogeno ammidico e il gruppo idrossi deprotonato si formi un legame idrogeno intramolecolare rinforzato, formando di conseguenza un anello stabile a sei termini.

In questo modo, l'idrogeno ammidico non sarebbe disponibile per il legame a idrogeno (HBD) con le molecole d'acqua e quindi non contribuirebbe alla solubilit?. Questa ipotesi ? confermata dalla posa cristallografica di queste molecole nell'enzima, in cui si evidenzia l'HB intramolecolare.

Tutti i composti hanno un buon equilibrio lipofilo-idrofilo con valori di logD ottimali per un comportamento farmacocinetico favorevole; le differenze osservate tra clogP e logD7.4 misurato concordano con la grande ionizzazione di questi composti a pH fisiologico.

L'obiettivo per la lipofilia ? un valore compreso tra 1 e 3, cio? un valore ottimale per avere un assorbimento per permeabilit? attraverso la diffusione passiva dopo la somministrazione orale. I composti 6, 8 e 14 che sono caratterizzati da una morfolina, una piridina e un anello fenolico, hanno una lipofilia molto bassa, ma le loro solubilit? sono elevate; di conseguenza queste molecole probabilmente non sono in grado di passare le membrane. Il composto 17 presenta un sostituente propossi che potrebbe contribuire a renderlo in grado di attraversare facilmente i doppi strati dei fosfolipidi. Anche se questo composto sembra avere una buona attitudine a raggiungere il target enzimatico, ? molto insolubile e quindi difficile da usare per i test in vitro. Un buon compromesso risulta essere il composto 26 in cui la presenza della piridina permette di avere una migliore solubilit? e, allo stesso tempo, il tioetere un buon equilibrio lipofilo-idrofilo.

Profilo antivirale dei composti 1, 17 e del brequinar.

Il composto 1 come nuovo potente candidato AAAS.

Avendo in mano un interessante inibitore di hDHODH in fase preclinica, abbiamo analizzato 1 per l'attivit? antivirale contro un ampio panel di virus umani.

Virus dell'herpes simplex. L'incidenza e la gravit? delle infezioni da HSV sono aumentate negli ultimi decenni a causa del crescente numero di pazienti immunocompromessi, con l'infezione da herpes genitale che ? diventata una delle infezioni a trasmissione sessuale (ITS) pi? diffuse al mondo. In assenza di vaccini preventivi efficaci, il controllo delle infezioni da HSV, in particolare l'herpes genitale, rimane quindi una priorit? assoluta. Questi fatti evidenziano la necessit? di sviluppare nuovi agenti anti-HSV, possibilmente dotati di un meccanismo d'azione diverso da quello degli analoghi nucleosidici approvati (ACV, FAM, VCV) il cui uso prolungato pu? portare a fallimenti terapeutici dovuti allo sviluppo di ceppi resistenti agli antivirali. A tal fine, abbiamo testato 1 contro HSV-1 e HSV-2 rispetto a brequinar. Come mostrato nella Tabella 3, 1 ha inibito potentemente la replicazione di HSV-1 e HSV-2 (PRA, cellule Vero) con EC50 di 0,110 e 0,170 ?M, rispettivamente. Degno di nota ? che l'attivit? anti-HSV di 1 era di circa un ordine di grandezza pi? potente rispetto a quella del brequinar e l? EC50 ? risultata persino inferiore a quella del farmaco di riferimento ACV (0,180 ?M). Ulteriori osservazioni preliminari hanno indicato che l'attivit? anti-HSV di 1 fosse associata a un'inibizione della sintesi del DNA virale e dell'espressione della proteina tardiva (Late), mentre le proteine Immediate-Early non erano significativamente ridotte, indicando cos? che 1 agisce in una fase del ciclo di replicazione dell'HSV precedente del Replicazione del DNA virale, in accordo con la sua capacit? di inibire l'attivit? di hDHODH, provocando l'esaurimento delle pirimidine.

Tabella 3: Attivit? contro la replicazione di diversi virus dei composti 1 e 17, come rappresentanti della serie qui presentata, confrontati con il brequinar.

Virus respiratori: Le infezioni virali respiratorie (IVR) sono una preoccupazione sanitaria globale in termini di morbilit? e mortalit?. Il virus dell'influenza, il virus respiratorio sinciziale e il coronavirus sono tra i virus pi? comuni che causano infezioni del tratto respiratorio inferiore.

Virus dell?influenza. Gli Influenza virus A e B sono i principali agenti patogeni umani diffuse in tutto il mondo e responsabili di epidemie e pandemie stagionali. I vaccini stagionali rappresentano la misura pi? efficace per prevenire e controllare le infezioni influenzali. Il trattamento delle infezioni influenzali pu? anche trarre vantaggio dal?utilizzo di due classi di farmaci autorizzati, come gli inibitori della proteina della matrice e gli inibitori della neuraminidasi. Tuttavia, il loro uso ? fortemente limitato dalla selezione di ceppi resistenti. Pertanto, lo sviluppo di composti anti-influenzali alternativi, sia efficaci contro virus antigenicamente diversi sia caratterizzati da nuovi meccanismi d'azione, ? una priorit? urgente. 1 ? stato quindi testato contro un ceppo di riferimento del virus dell'influenza A (A / Puerto Rico / 8/34) e ha mostrato una potente attivit? inibitoria (EC50 0,120 ?M, PRA, cellule MDCK, Tabella 3). Ancora una volta, 1 si ? comportato meglio del brequinar con un valore EC50 di oltre 6 volte inferiore.

Virus Sinciziale respiratorio. Il virus respiratorio sinciziale (VRS) ? la causa pi? importante di infezioni del tratto respiratorio inferiore che portano a bronchiolite grave e polmonite nei neonati e nei bambini piccoli. Tuttavia, non sono ancora disponibili vaccini e il trattamento antivirale ? limitato al palivizumab per il trattamento preventivo e alla ribavirina, un analogo nucleosidico delle purine, che per? ? penalizzato da gravi effetti avversi. Pertanto, vi ? un'urgente necessit? medica di sviluppare nuovi composti in grado di bloccare la replicazione dell'VRS. Pensando a questo, abbiamo testato 1 vs VRS ed ? stata misurata un'attivit? antivirale molto potente (EC50 0,008 ?M) (Tabella 3) in cellule HEp-2 associate a un SI efficace (> 10.000, CC50 84 ?M) con un profilo leggermente superiore a quella del brequinar (EC50 0,015 ?M). Inoltre, per verificare se l'inibizione osservata della replicazione di VRS da parte di 1 fosse il risultato del blocco della biosintesi delle pirimidine, i test antivirali sono stati ripetuti utilizzando un terreno di coltura integrato con uridina. Poich? l'uridina pu? essere convertita in UMP tramite la via di salvataggio (Figura 2), le cellule possono bypassare la richiesta della biosintesi de novo delle pirimidine. Come mostrato nella Figura 3, il supplemento di uridina ha revertito l'azione anti-VRS di 1, confermando cos? che la via delle pirimidine ? influenzata da 1 nelle cellule infettate da VRS. Tuttavia, l'UMP da cui derivano tutte le altre pirimidine pu? essere generato sia dalla via di salvataggio che dalla biosintesi de novo. Per distinguere i due percorsi, abbiamo esaminato gli effetti dell'aggiunta del substrato (acido diidroorotico, DHO) o del prodotto (acido orotico, ORO) dell?enzima hDHODH per verificare la loro capacit? di ripristinare la replicazione dell'VRS. Coerentemente con un ruolo fondamentale dell'inibizione di hDHODH nell'attivit? anti-VRS di 1, l'aggiunta di ORO ma non di DHO ha revertito l'effetto inibitorio di 1 (Figura 3). Considerandole insieme, queste osservazioni preliminari ci suggeriscono il targeting specifico verso l'attivit? dell?enzima hDHODH da parte di 1 come meccanismo della sua attivit? antivirale contro il VRS.

SARS-CoV-2. L'emergere di COVID-19 come emergenza sanitaria globale negli ultimi mesi ci ha spinto a indagare immediatamente sulla sensibilit? di SARS-CoV-2 a 1. Come mostrato nella Tabella 3 e nella Figura 4, abbiamo misurato un potente effetto antivirale (EC50 0,074 ?M) (PRA, cellule Vero E6) contro il virus COVID-19 associato a un profilo molto sicuro (SI> 6756, CC50> 500 ?M). Solo per allocare questi numeri, l'attivit? anti-SARS-CoV-2 di 1 ? un ordine di grandezza pi? potente di quella della migliore terapia disponibile Remdesivir (EC50 0,77 ?M).

Presi nel loro insieme, questi risultati preliminari sostenuti da un forte razionale sullo sviluppo di inibitori di hDHODH come AAAS, validano fortemente la proposta di sviluppare ulteriormente 1 come un efficace agente anti-SARS-CoV-2 e come un AAAS potente e sicuro che potrebbe essere molto prezioso anche in futuri scenari pandemici.

Conclusioni

I presenti inventori hanno identificato una nuova classe di inibitori basati sull'idrossilpirazolo[1,5-a]piridina, un bioisostero non classico dell?acido carbossilico. I composti 1 e 17, i loro pi? potenti inibitori di hDHODH finora scoperti, mostrano livelli di potenza di inibizione di hDHODH simili al brequinar in vitro e sono superiori in termini di potenza antivirale e selettivit? poich? bloccano la replicazione virale a concentrazioni di una cifra logaritmica inferiore rispetto a quelle ottenute negli esperimenti eseguiti con il brequinar.

Poich? i composti 1 e 17 agiscono su di un prodotto genico della cellula (DHODH), ed ? improbabile che i virus possano aggirare la necessit? di nucleotidi pirimidinici, la probabilit? che il loro effetto terapeutico venga compromesso dallo sviluppo di resistenza virale ? bassa. Ci? pu? essere particolarmente importante per i virus a RNA la cui elevata frequenza di mutazione spesso promuove l'elusione degli antivirali ad azione diretta.

La chiave per un trattamento antiCOVID-19 di successo ? non solo avere una potente molecola, ma anche una dose che pu? essere somministrata in sicurezza e che causer? una concentrazione nel sangue adatta ad inibire la replicazione virale o l'infezione.

? evidente che il composto 1 mostra un profilo di tossicit? ottimale e un'attivit? sul bersaglio altamente selettiva, rendendolo quindi un candidato ideale per ulteriori studi in vivo nei modelli di SARS-CoV-2. Il composto 1 ? risultato efficace anche contro altri virus, essendo la sua EC50 sempre inferiore a 170 nM.

Materiali e Metodi

Chimica

Metodi generali

Tutti i reagenti di partenza sono stati acquistati (Sigma Aldrich, Alfa Aesar, FluoroChem), e usati senza ulteriori purificazioni. La cromatografia liquida su piastra (TLC), fu utilizzata per monitorare il processo delle reazioni. I solventi acquistati con un grado di purezza ?analitica? (acetonitrile, diisopropil eter, dietil eter, diclorometano [DCM], dimetilformamide [DMF], etanol 99.8 % v/v, etil acetato [EtOAc], esano, metanolo [MeOH], etere di petrolio b.p. 40 - 60?C, toluene), furono usati tal quali senza ulteriori purificazioni. Quando necessario, i solventi furono essicati su setacci molecolari 4 ?. Il tetraidrofurano (THF), fu distillato su sodio e benzofenone in atmosfera di azoto immediatamente prima dell?uso. La cromatografia liquida su piastra (TLC), fu effettuata su gel di silice in piastre 5 x 20 cm e 0.25 mm di spessore. MgSO4 anidro fu usato come agente anidrificante per le fasi organiche. I composti furono purificati sia con cromatografia flash su gel di silice (Merck Kieselgel 60, 230-400 mesh ASTM) con gli eluentei indicate nelle ricette di ogni composto, sia usando l?apparecchio CombiFlash Rf 200 (Teledine Isco), con un flusso di 5?200 mL/min e 200 psi (con un iniettore automatico), e colonne RediSep Rf Silica (Teledine Isco). I composti sintetizzati nei nostri laboratori mostrarono una purezza che varia dal 90 % al 99 %. Gli esperimenti biologici furono effettuati solo su composti con una purezza di almeno il 95%. La purezza fu rivelata usando due metodi analitici. Le analisi di HPLC furono effettuate su un apparecchio cromatografico UHPLC (Perkin Elmer, Flexar). La colonna fu UHPLC Acquiti CSH Fluoro-Phenil (2.1x100 mm, dimensione particelle 1.7 ?m, Acquas). I composti furono sciolti in acetonitrile e iniettati attraverso una valvola ?loop? di 20 ?l. La fase mobile usata fu acetonitrile / acqua con 0.1 % trifluoroacetico acido (il rapporto tra 60 / 40 e 40 / 60, dipende dal fattore di ritenzione dei composti). Il tempo di ritenzione all?UHPLC fu ottenuto ad una velocit? di flusso di 0.5 mL/min, e l?eluato fu monitorato alla lunghezza d?onda di 215 e 254 nm, riferendosi alla lunghezza d?onda di 360 nm. La solubilit? in PBS al pH 7.4 e la stabilit? nelle condizioni dei saggi cellulari furono effettuate con un HPLC-UV (MERK-HITACHI), fornito di autocampionatore con un volume di iniezione di 60 ?L (MERK-HITACHI AS-2000A), una pompa doppio stadio (MERK-HITACHI L-6200 IP), un rilevatore diode array (MERK-HITACHI L-4250), una colonna Agilent Zorbax SB-Phenil (4.6x250, 5 ?m). Il punto di fusione (m.p.), fu misurato in un apparecchio per capillari (B?chi 540). Il punto di fusione finale fu raggiunto introducendo il campione ad una temperature inferiore di 10? C rispetto al punto di fusione previsto e riscaldando ad una velocit? di 1? C min-

1. Tutti i composti furono routinariamente analizzati con spettroscopia <1>H- e <13>C-NMR e spettrometria di massa. Gli spettri IR furono registrati solo dei solidi sullo spettrofotometro FT-IR (PerkinElmer SPECTRUM BXII, KBr dispersione), dotato dell?accessorio per la riflattanza diffusa DRIFT ACCI. Gli MS furono effettuati sia su un apparecchio Finnigan-Mat TSQ-700 (70 eV, iniezione diretta per ionizzazione chimica [CI]), o su un apparecchio Acquas Micromass ZQ dotato di una sorgente per la ionizzazione di massa elettrosprai ESCi. Gli spettri <1>H- e <13>C-NMR furono effettuati o su uno strumento Bruker Avance 300 o su un JEOL ECZR600. Per definire gli accoppiamenti furono usate le seguenti abbreviazioni: br = segnale allargato, s = singoletto, d = doppietto, dd = doppietto di doppietti, t = tripletto, q = quartetto, m = multipletto. Gli spostamenti chimici (?) sono riportati in parti per millione (ppm). In questo lavoro i protoni ed i carboni sono etichettati (a, b, c, d, e, f, g, h, l, m, n ed o) in accordo allo Schema 2. I valori asteriscati si intendono interscambiabili. Non sono stati riportati spettri dettagliati di <13>C dei derivati bifenilici tetrafluorurati (composti finali 4 ? 17 e i composti finali protetti), poich? sono particolarmente complicati (a causa dell?accoppiamento multiplo tra il C e il F). Per questi spettri furono assegnati solo i picchi di

<13>C dell?eterociclo e dei carboni non aromatici. Per i composti finali 4 ? 17, gli spettri di HRMS furono registrati su uno spettrometro LTQ Orbitrap (Thermo Scientific, Bremen, Germani), fornito di una interfaccia a pressione atmosferica ed una sorgente ionica ESI. I composti 39, 40 and 46<2, 11 >furono preparati in accordo alle procedure descritte in precedenza.

Etil 2-((4-metoxibenzil)oxi)pyrazolo[1,5-a]piridina-3-carboxilato (51a) and etil N-(4-metoxibenzil)-2-oxo-pirazolo[1,5-a]piridina-3-carboxilato (51b). 4-Metoxibenzil bromuro (645 mg, 3,20 mmol, 1,10 eq) ? stato aggiunto goccia a goccia a una miscela di 39 (600 mg, 2,91 mmol) e Cs2CO3 (2,295 g, 7,04 mmol, 2,4 eq) in DMF anidro (15 mL). La miscela di reazione ? stata agitata per una notte a temperatura ambiente, quindi ? stata aggiunta acqua (100 mL).

La miscela ? stata estratta con EtOAc (4 ? 70 mL), lo strato organico combinato ? stato essiccato su Na2SO4 ed evaporato a pressione ridotta per fornire un olio giallo. Quest'ultimo ha mostrato due macchie sulla TLC (eluentee: etere di petrolio / EtOAc 60/40 v / v), attribuite ai due regioisomeri pirazolo [1,5-a] -piridinici. La miscela ? stata separata mediante cromatografia flash (eluentee: etere di petrolio / EtOAc 2/1 v / v, quindi diclorometano / MeOH 95/5 v / v).

51a) Primo isomero eluito. Solido bianco dopo triturazione con esano seguito da acqua (111,3 -112,5 ? C). Resa 61%. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformiod) ? 1.40 (t, J = 7.1 Hz, 3H, -OCH2CH3); 3.81 (s, 3H, -OCH3), 4.36 (q, J = 7.1 Hz, 2H, -OCH2CH3), 5.43 (s, 2H, -OCH2Ar), 6.83 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 6.91 (d, 2H, J = 8.6 Hz, H-n), 7.35 (t, 1H, J = 7.7 Hz, H-c), 7.48 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-m), 8.00 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.29 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d) ? 14.7 (-OCH2CH3), 55.4 (-OCH3), 59.7 (-OCH2CH3), 70.7 (-OCH2Ar), 88.5 (C-f), 112.6 (C-b), 113.9 (C-n), 118.3 (C-d), 127.8 (C-c)*, 128.9 (C-a)*, 129.0 (C-l)*, 129.3(C-m), 142.9 (C-e), 159.5 (C-o), 163.4 (C-g)*, 165.2 (C-h)*. MS (ES+): 327 (M+1).

51b) Secondo isomero eluito. Solido bianco. (158,3 - 159,2 ? C, da etere diisopropilico). Resa 27%.<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) ? 1.28 (t, 3H, J = 7.1 Hz, -OCH2CH3); 3.69 (s, 3H, -OCH3), 4.21 (q, 2H, J = 7.1 Hz, -OCH2CH3), 5.35 (s, 2H, -NCH2Ar), 6.88 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-n), 6.96 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 7.19 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H-m), 7.58 (t, 1H, J = 8.0 Hz, H-c), 7.91 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.45 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6) ? 14.6 (-OCH2CH3), 43.2 (-NCH2Ar), 55.1 (-OCH3), 58.5 (-OCH2CH3), 83.5 (C-f), 112.4 (C-b), 114.3 (C-n), 116.3 (C-d), 125.3 (C-a), 125.7 (C-l), 128.8 (C-m), 132.4 (C-c), 142.8 (C-e), 159.0 (C-o), 160.0 (C-h)*, 163.2 (C-g)*; MS (ES+): 327 (M+1).

Acido 2-((4-metossibenzil)ossi)pirazolo[1,5-a] piridin-3-carbossilico (52). NaOH 6 M (5,0 eq) ? stato aggiunto a una soluzione del composto 51a (785 mg, 2,40 mmol) in EtOH (20 mL). La miscela ? stata agitata per 4 ore a 75 ? C, quindi neutralizzata con HC1 6 M e concentrata a pressione ridotta. La miscela ? stata raffreddata a 0 ? C quindi acidificata con HC1 2 M fino a raggiungere pH 2, ottenendo una sospensione. Quest'ultima ? stata filtrata per ottenere 52 come solido bianco (162,8 - 163,9 ? C dec., Da acqua). Resa 90%.<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) ? 3.76 (s, 3H, -OCH3), 5.34 (s, 2H, -OCH2Ar), 6.96 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H-n), 7.02 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.45 (d, 2H, J = 8.3 Hz, H-m), 7.51 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.92 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.66 (d, 1H, J = 6.7 Hz, H-a), 12.07 (s, 1H, -COOH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6) ? 55.1 (-OCH3), 70.1 (-OCH2Ar), 87.6 (C-f), 113.1 (C-b), 113.8 (C-n), 117.3 (C-d), 128.4 (C-a)*, 128.5 (C-l)*, 129.5 (C-c)*, 129.9 (C-m), 142.3 (C-e), 159.2 (C-o), 163.5 (C-h)*, 164.4 (C-g)*; MS (ES+): 299 (M+1).

N-(4-Bromo-2,3,5,6-tetrafluorofenil)-2-((4-metossibenzil)ossi)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossammide (53). Il cloruro di ossalile (0,54 mL, 6,30 mmol, 3,0 eq) e DMF anidra (1 goccia) sono stati aggiunti a una soluzione raffreddata (0 ? C) di 52 (630 mg, 2,10 mmol) in THF anidro (15 mL) mantenuto sotto atmosfera di azoto; la miscela risultante ? stata agitata per 2 ore a temperatura ambiente. In parallelo una soluzione 2M di AlMe3 in toluene (1,8 mL, 3,57 mmol, 1,7 eq) ? stata aggiunta ad una soluzione di 4-bromo-2,3,5,6-tetrafluoroanilina (769 mg, 3,15 mmol, 1,5 eq) in toluene anidro (10 mL) e in atmosfera di azoto. La sospensione risultante ? stata agitata per 3 ore a temperatura ambiente. La soluzione di cloruro acilico ? stata quindi concentrata a pressione ridotta e il residuo ? stato sciolto in THF anidro (10 mL, questo passaggio ? stato ripetuto tre volte). L'acil cloruro ? stato sciolto in toluene anidro (15 mL) e la soluzione ? stata aggiunta alla sospensione sopra descritta. La miscela di reazione ? stata agitata a 85 ? C per una notte, quindi raffreddata a temperatura ambiente, spenta con metanolo, quindi evaporata. Il residuo ? stato sciolto in EtOAc (80 mL), ? stato quindi aggiunto 0,5 M HCl (50 mL) e le fasi sono state separate. Gli strati organici combinati sono stati lavati con soluzione satura di NaCl, essiccati ed evaporati a pressione ridotta. Il materiale grezzo ? stato purificato usando cromatografia flash (eluentee: etere di petrolio / EtOAc / DCM 2/1/1 v / v / v) per fornire il composto del titolo come solido bianco (177,4 - 178,0 ? C, triturato con etere diisopropilico). Resa 55%.<1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d) ? 3.79 (s, 3H, -OCH3), 5.41 (s, 2H, -NCH2Ar), 6.77 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 6.90 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-n), 7.21 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-m), 7.46 (t, 1H, J = 7.9, Hz, H-c), 7.75 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a), 8.27 (t, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 9.98 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d) ? 45.2 (-NCH2Ar), 55.5 (-OCH3), 87.1 (C-f), 96.4 (t, J = 22.6 Hz, C-s)*, 112.9 (C-b), 115.0 (C-n), 117.0 (t, J = 14.8 Hz, C-p)*, 118.3 (C-d), 123.1 (C-a), 124.2 (C-l), 128.6 (C-m), 131.8 (C-c), 142.5 (C-e), 142.8 (dd, J = 251.6, 14.9 Hz, (C-r)**, 145.2 (dd, J = 246.4, 14.2 Hz, (C-q)**, 160.0 (C-o)***, 161.4 (C-h)***, 162.2 (C-g)***; MS (ES+): 524 / 526 (M+1).

1-(4-Metossibenzil)-2-osso-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-4-morfolinofenil)-1,2-diidropirazolo[1,5-a] piridin-3-carbossammide (54). Ad una soluzione di 53 (420 mg, 0,80 mmol, 1,00 eq) e morfolina (209 mg, 2,40 mmol, 3,00 eq) in toluene (30 mL) ? stato aggiunto Cs2CO3 (782 mg, 2,4 mmol, 3,00 eq). Dopo aver de-gasato con un flusso d?azoto per 10 minuti, sono stati aggiunti Pd(OAc)2 (18 mg, 0,08 mmol, 0,10 eq) e BINAP (100 mg, 0,16 mmol, 0,20 eq) e la miscela ? stata nuovamente de-gasata per 5 minuti. La sospensione risultante ? stata riscaldata a 110 ? C in un pallone mantenuto sotto atmosfera di azoto. Dopo 3,5 h, il riscaldamento ? stato interrotto, la miscela ? stata concentrata a pressione ridotta, quindi ? stata aggiunta acqua. La sospensione risultante ? stata estratta con EtOAc (3 x 50 mL), le frazioni organiche combinate raccolte, essiccate e concentrate a pressione ridotta. Il grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash (eluentee: etere di petrolio / EtOAc / DCM 1/1/1 v / v / v) ottenendo un grezzo solido che ? stato triturato con etere diisopropilico per ottenere il composto del titolo come solido bianco (237,2 ?237,5 ? C dec). Resa: 59%. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d) ? 3.24 ? 3.28 (m, 4H, -NCH2CH2O-), 3.79 (s, 3H, -OCH3), 3.81 ? 3.85 (m, 4H, -NCH2CH2O-), 5.40 (s, 2H, -NCH2Ar), 6.74 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 6.90 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-n), 7.21 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-m), 7.44 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.73 (d, 1H, J = 6.9, Hz, H-a), 8.28 (d, 1H, J = 8.9 Hz, H-d), 9.75 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d) ? 45.1 (-NCH2Ar), 51.5 (-NCH2CH2O-), 55.5 (-OCH3) , 67.5 (-NCH2CH2O-), 87.2 (C-f), 111.3 (t, J = 15.5 Hz, C-p)*, 112.6 (C-b), 114.9 (C-n), 118.3 (C-d), 123.1 (C-a), 124.3 (C-l), 127.8 (t, J = 11.0 Hz, C-s), 128.6 (C-m), 131.6 (C-c), 142.5 (C-e), 143.2 (d, J = 248.2 Hz, C-q)**, 143.5 (d, J = 247.9, Hz, C-r)**, 160.0 (C-o)***, 162.0 (C-h)***, 162.1 (C-g)***; MS (ES+): 553 (M+Na).

Procedura generale: la reazione di Suzuki utilizzata per la produzione dei composti 55 - 61. Pd(PPh3)4 (90 mg, 0.08 mmol, 0.20 eq) ? stato aggiunto ad una soluzione di 53 (200 mg, 0,38 mmol, 1,00 eq) e K2CO3 (158 mg, 1,14 mmol, 3,00 eq) in miscela diossano / acqua (9: 1 v / v). Dopo aver agitato la miscela risultante sotto atmosfera di azoto per 1 ora a r.t. ? stato aggiunto il corrispondente acido boronico (0.760 mmol, 2.0 eq); la miscela di reazione ? stata quindi riscaldata a riflusso in atmosfera di azoto. Dopo 2 ore, ? stata aggiunta una quantit? aggiuntiva di acido boronico (0,38 mmol, 1,0 eq), la miscela di reazione ? stata riscaldata a riflusso per altre 2 ore prima di essere raffreddata a temperatura ambiente e concentrata a pressione ridotta. Il materiale grezzo ? stato ripreso con acqua (100 mL) e la miscela ? stata estratta con EtOAc (3 x 60 mL), gli estratti organici combinati sono stati essiccati su Na2SO4 e concentrati a pressione ridotta. Il grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash (vedere sotto le condizioni).

1-(4-Metossibenzil)-2-osso-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-4-(tiofen-2-il)fenil)-1,2-diidropirazolo[1,5-a] piridin-3-carbossammide (55). Il grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash (eluentee: etere di petrolio / EtOAc 1/1 v / v) ottenendo un composto solido che ? stato ricristallizzato da acetonitrile (8 mL) per ottenere il composto del titolo come solido bianco (197,4 ?198,1 ? C da acetonitrile). Resa: 72%.<1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d) ? 3.79 (s, 3H, -OCH3), 5.41 (s, 2H, -NCH2Ar), 6.76 (t, 1H, J = 6.6 Hz, H-b), 6.90 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-n), 7.16 ? 7.20 (m, 1H, protoni aromatici), 7.21 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-m), 7.45 (t, 1H, J = 7.7 Hz, H-c), 7.54 (d, 1H, J = 5.0 Hz, protoni aromatici), 7.59 (d, 1H, J = 3.2 Hz, protoni aromatici), 7.75 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a), 8.28 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 10.00 (s, 1H, -NH);

<13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d) ? 45.2 (-NCH2Ar), 55.5 (-OCH3), 87.2 (C-f), 112.3 (C-b), 115.0 (C-n), 115.7 (t, J = 16.2 Hz, C-p)*, 118.4 (C-d), 123.1 (C-a), 124.3 (C-l), 127.3 (carbonio del tiofene), 127.9 (carbonio del tiofene), 128.1 (t, J = 3.3 Hz, C-s)*, 128.6 (C-m), 128.5 (carbonio del tiofene), 130.0 (t, J = 5.3 Hz, carbonio del tiofene), 131.7 (C-c), 142.6 (C-e), 142.9 (dd, J = 248.0, 15.8 Hz, C-q)**, 144.0 (d, J = 247.0, Hz, C-r)**, 160.0 (C-o)***, 161.6 (C-h)***, 162.2 (C-g)***. MS (ES+): 528.2 (M+1).

1-(4-Metossibenzil)-2-osso-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-4-(piridin-3-il)fenil)-1,2-diidropirazolo[1,5-a] piridin-3-carbossammide (56). Il grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash (eluentee: da etere di petrolio / EtOAc 6/4 v / fino a 3/7 v / v) ottenendo un grezzo solido. Quest'ultimo ? stato poi triturato con etere diisopropilico per ottenere il composto del titolo come un solido bianco (p.f. 202,6 - 203,8 ? C da triturazione con etere diisopropilico). Resa: 90%.<1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d) ? 3.78 (s, 3H, -OCH3 ), 5.41 (s, 2H, -NCH2Ar), 6.77 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 6.89 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-n), 7.21 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-m), 7.43 ? 7.49 (m, 2H, protoni aromatici and H-c), 7.77 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a), 7.84 (d, 1H, J = 7.8 Hz, protoni aromatici), 8.27 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.69 (d, 1H, J = 2.9 Hz, protoni aromatici), 8.76 (s, 1H, protoni aromatici), 10.06 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d) ? 45.2 (-NCH2Ar), 55.5 (-OCH3), 87.1 (C-f), 112.9 (C-b), 114.0 (t, J = 16.9 Hz, C-p)*, 115.0 (C-n), 117.4 (t, J = 15.8 Hz, C-s)*, 118.3 (C-d), 123.1 (C-a), 123.7 (carbonio piridinico), 124.2 (C-l), 124.3 (carbonio piridinico), 128.6 (C-m), 131.8 (C-c), 137.9 (carbonio piridinico), 142.6 (C-e), 142.9 (d, J = 252.7 Hz, C-q)**, 144.2 (d, J = 249.7 Hz, C-r)**, 149.9 (carbonio piridinico), 150.5 (carbonio piridinico), 160.0 (C-o)***, 161.6 (C-h)***, 162.2 (C-g)***; MS (ES+): 523 (M+1).

1-(4-Metossibenzil)-2-osso-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-4-(2-(trifluorometil)piridin-4-il)fenil)-1,2-diidropirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossammide (57).

Il grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash (eluentee: da etere di petrolio / EtOAc 6/4 v / fino a 3/7 v / v) ottenendo un grezzo solido. Quest'ultimo ? stato quindi triturato con etere diisopropilico e si ? ottenuto il composto del titolo come un solido giallo pallido (p.f.192,7 -193,9 ? C da triturazione con etere diisopropilico). Resa: 70%.<1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d) ? 3.79 (s, 3H, -OCH3 ), 5.42 (s, 2H, -NCH2Ar), 6.79 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 6.90 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-n), 7.22 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-m), 7.48 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.64 (d, 1H, J = 4.9 Hz, protone piridinico), 7.78 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a), 7.84 (s, 1H, protone piridinico), 8.29 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.88 (d, 1H, J = 4.9 Hz, protone piridinico), 10.15 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d) ? 45.3 (-NCH2Ar), 55.5 (-OCH3), 87.1 (C-f), 113.0 (C-b), 113.2 (t, J = 15.6 Hz, C-p)*, 115.0 (C-n), 118.4 (C-d), 118.9 (t, J = 14.7 Hz, C-s)*, 121.5 (q, J = 274.5 Hz, -CF3), 121.7 (q, J = 2.1 Hz, carbonio piridinico), 123.1 (C-a), 124.2 (C-l), 127.6 (carbonio piridinico), 128.6 (C-m), 131.9 (C-c), 137.9 (carbonio piridinico), 142.6 (C-e), 142.8 (d, J = 247.0 Hz, C-q)**, 144.2 (d, J = 245.4 Hz, C-r)**, 149.0 (q, J = 34.9 Hz, carbonio piridinico), 150.6 (carbonio piridinico), 160.1 (C-o)***, 161.4 (C-h)***, 162.3 (C-g)***; MS (ES+): 591.

1-(4-Metossibenzil)-2-osso-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-3'-idrossi-[1,1'-bifenil]-4-il)-1,2-diidropirazolo [1,5-a]piridin-3-carbossammide (58). Il grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash (eluentee: etere di petrolio / EtOAc 1/2 v / v) ottenendo un composto solido. Quest'ultimo ? stato poi triturato con etere diisopropilico, al fine di rimuovere O = PPh3O, ottenendo il composto del titolo come solido bianco (236,9 ?237,4 ? C da etere diisopropilico). Resa: 79%. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) ? 3.71 (s, 3H, -OCH3 ), 5.49 (s, 2H, -NCH2Ar), 6.88 ? 6.97 (m, 5H, protoni aromatici and H-n), 7.07 (t, 1H, J = 7.1Hz, H-b), 7.28 (d, 2H, J = 8.3 Hz, H-m), 7.35 (t, 1H, J = 8.1 Hz, protoni aromatici), 7.67 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 8.03 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.57 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a), 9.78 (br s, 1H, -OH), 10.07 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6) ? 43.8 (-NCH2Ar), 55.1 (-OCH3), 85.5 (C-f), 113.2 (C-b), 114.4 (C-n), 116.2 (C-d), 116.3 (carboni aromatici), 116.6 (t, J = 14.6 Hz, C-p)*, 116.9 (2 carboni, C-s parzialmente sovrapposto ai carboni aromatici)*, 120.7 (carboni aromatici), 125.3 (C-a), 125.4 (C-l), 127.7 (carboni aromatici), 128.8 (C-m), 129.9 (carboni aromatici), 132.9 (C-c), 141.4 (C-e), 142.3 (d, J = 248.9 Hz, C-q)**, 143.3 (d, J = 251.3 Hz, C-r)**, 157.5 (carboni aromatici), 159.1 (C-o)***, 160.7 (C-h)***, 161.7 (C-g)***; MS (ES+): 538 (M+1).

1-(4-Metossibenzil)-2-osso-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-3 '-(trifluorometossi)-[1,1'-bifenil]-4-il)-1,2-diidropirazolo[1,5-a]piridin-3-carbossammide (59)Il grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash (eluentee: etere di petrolio / DCM 2/1 v / v) ottenendo un composto solido. Quest'ultimo ? stato poi triturato con etere diisopropilico ottenendo il composto del titolo come solido bianco (162,7 ? 163,0 ? C da etere diisopropilico). Resa: 82%.<1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d) ? 3.80 (s, 3H, -OCH3), 5.42 (s, 2H, -NCH2Ar), 6.77 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 6.91 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-n), 7.22 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-m), 7.32 (d, 1H, J = 8.1 Hz, protoni aromatici), 7.37 (s, 1H, protoni aromatici), 7.43 (d, 1H, J = 7.7 Hz, protoni aromatici), 7.47 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.53 (t, 1H, J = 8.0 Hz, protoni aromatici), 7.76 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a), 8.31 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 10.03 (s, 1H, -NH);

<13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d) ? 45.2 (-NCH2Ar), 55.4 (-OCH3), 87.1 (C-f), 112.8 (C-b), 115.0 (C-n), 115.9 (t, J = 16.1 Hz, C-p)*, 117.0 (t, J = 15.6 Hz, C-s)*, 118.3 (C-d), 120.6 (q, J = 257.6 Hz, -OCF3), 121.5 (carboni aromatici), 123.0 (carboni aromatici), 123.1 (C-a), 124.2 (C-l), 128.5 (C-m), 128.8 (carboni aromatici), 129.4 (carboni aromatici), 130.1 (carboni aromatici), 131.7 (C-c),, 142.5 (C-e), 142.8 (d, J = 247.5 Hz, C-q)**, 144.0 (d, J = 249.5 Hz, C-r)**, 149.3 (carboni aromatici), 160.0 (C-o)***, 161.6 (C-h)***, 162.2 (C-g)***; MS (ES+): 606.6, 628.6.

1-(4-Metossibenzil)-2-osso-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-3'-metossi-[1,1'-bifenil]-4-il)-1,2diidropirazolo [ 1,5-a]piridin-3-carbossammide (60) Il grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash (eluentee: etere di petrolio / EtOAc / diclorometano 1,5 / 1/2 v / v / v) ottenendo il composto del titolo come solido beige (172,9 ?173,8 ? C da etere diisopropilico). Resa: 94%.<1>H-NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 3.79 (s, 3H, -OCH3), 3.85 (s, 3H, -OCH3), 5.42 (s, 2H, -NCH2Ar), 6.76 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 6.90 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-n), 6.97 ? 7.03 (m, 2H, protoni aromatici), 7.06 (d, 1H, J = 7.5 Hz, protoni aromatici), 7.22 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-m), 7.41 (t, 1H, J = 7.9 Hz, protoni aromatici), 7.45 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.75 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a), 8.29 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 9.99 (s, 1H, -NH); <13>C-NMR (150 MHz, Cloroformio-d): ? 45.2 (-NCH2Ar), 55.5 (2 x -OCH3), 87.2 (C-f), 112.3 (C-b), 114.9 (carboni aromatici), 115.0 (C-n), 115.8 (carboni aromatici), 116.3 (t, J = 15.0 Hz, C-p)*, 117.6 (t, J = 19.6 Hz, C-s)*, 118.4 (C-d), 122.7 (carboni aromatici), 123.1 (C-a), 124.3 (C-l), 128.6 (C-m), 128.8 (carboni aromatici), 129.7 (carboni aromatici), 131.7 (C-c), 142.6 (C-e), 142.9 (d, J = 248.6 Hz, C-q)**,, 144.2 (d, J = 244.2, Hz, C-r)**, 159.7 (carboni aromatici)***, 160.0 (C-o)***161.7 (C-h)****, 162.2 (C-g)****; MS (ES+): 552.5 (M+1).

1-(4-Metossibenzil)-2-osso-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-3'-propossi-[1,1'-bifenil]-4-il)-1,2-diidropirazolo [ 1,5-a] piridin-3-carbossammide (61) Il grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash (eluentee: etere di petrolio / EtOAc 2/3 v / v) per ottenere il composto del titolo come solido beige (168,8 ?169,9 ? C da etere diisopropilico). Resa: 86%. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d) ? 1.06 (t, 3H, J = 7.4 Hz, -OCH2CH2CH3), 1.84 (h, 2H, J = 7.3 Hz, -OCH2CH2CH3), 3.80 (s, 3H, -OCH3), 3.96 (t, 2H, J = 6.6 Hz, -OCH2CH2CH3), 5.42 (s, 2H, -NCH2Ar), 6.76 (t, 1H, J = 7.0 Hz, H-b), 6.91 (d, 2H, J = 8.6 Hz, H-n), 6.99 (dd, 1H, J = 8.4, 2.2 Hz, protoni aromatici), 7.00 (s, 1H, protoni aromatici), 7.04 (d, 1H, J = 7.6 Hz, protoni aromatici), 7.22 (d, 2H, J = 8.6 Hz, H-m), 7.39 (t, 1H, J = 7.9 Hz, protoni aromatici), 7.46 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.75 (d, 1H, J = 7.0 Hz, H-a), 8.31 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 9.98(s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d) ? 10.6 (-OCH2CH2CH3), 22.7 (-OCH2CH2CH3), 45.2 (-NCH2Ar), 55.5 (-OCH3), 69.8 (OCH2CH2CH3), 87.2 (C-f), 112.8 (C-b), 115.0 (C-n), 115.5 (carboni aromatici), 116.2 (t, J = 15.6 Hz, C-p)*, 116.4 (carboni aromatici), 117.7 (t, J = 16.8 Hz, C-s)*, 118.3 (C-d), 122.5 (carboni aromatici), 123.1 (C-a), 124.3 (C-l), 128.6 (C-m), 128.7 (carboni aromatici), 129.7 (carboni aromatici), 131.7 (C-c), 142.5 (C-e), 142.8 (dd, J = 248.5, 15.3 Hz, C-q)**, 144.2 (d, J = 248.5 Hz, C-r)**, 159.2 (carboni aromatici)***, 160.0 (C-o)***161.7 (C-h)****, 162.2 (C-g)****; MS (ES+): 580 (M+1).

Procedura generale per la sintesi delle anilina 42-45. Pd(PPh3)4 (90 mg, 0.08 mmol, 0.20 eq) ? stato aggiunto a una soluzione di 4-bromo-2,3,5,6-tetrafluoroanilina (200 mg, 0,38 mmol, 1.00 eq) e K2CO3 (158 mg, 1.14 mmol, 3.00 eq) in 1,2-dimetossietano (35 mL ). Dopo aver agitato la miscela risultante sotto atmosfera di azoto per 1 ora a r.t. ? stato aggiunto il corrispondente acido boronico (0.760 mmol, 2.0 eq); la miscela di reazione ? stata quindi riscaldata a riflusso in atmosfera di azoto. Dopo 2 ore, ? stata aggiunta una quantit? aggiuntiva di acido boronico (0,38 mmol, 1,0 eq), la miscela di reazione ? stata riscaldata a riflusso per altre 2 ore prima di raffreddare a temperatura ambiente e concentrare a pressione ridotta. Il materiale grezzo ? stato ripreso con acqua (100 mL) e la miscela ? stata estratta con EtOAc (3 x 60 mL), gli strati organici combinati sono stati essiccati su Na2SO4 e concentrati a pressione ridotta. Il grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash (vedere sotto le condizioni).

2,3,4',5,6-pentafluoro-[1,1'-bifenil]-4-anilina (42). Flash cromatografia (eluentee: petroletere / EtOAc 95:5 v/v). Solido bianco (m.p. 134.1 ? 134.7 ?C da triturazione con diisopropil etere). Resa 74%. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 4.05 (s, 2H, -NH2), 7.11 ? 7.17 (m, 2H, protoni aromatici), 7.37 ? 7.42 (m, 2H, protoni aromatici); <13>C NMR (151 MHz, CDCl3): ? 107.3 (t, J = 16.8 Hz), 115.7 (d, J = 21.7 Hz), 124.0 (d, J = 1.7 Hz), 125.6 (t, J = 14.1 Hz), 132.2 (d, J = 7.7 Hz), 136.9 (d, J = 238.0 Hz), 144.1 (d, J = 243.5 Hz), 162.7 (d, J = 248.3 Hz). MS (ES-) 258 (M-1).

2,3,3',5,6-pentafluoro-[1,1'-bifenil]-4-anilina (43). Cromatografia flash (eluente: petroletere/ EtOAc from 95:5 v/v). Solido bianco (m.p. 108.8 ? 109.7 ?C da triturazione con diisopropiletere). Resa 90%. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 4.08 (s, 2H, -NH2), 7.10 (t, 1H, J = 8.4 Hz protoni aromatici), 7.15 (d, 1H, J = 9.7 Hz, protoni aromatici), 7.21 (d, 1H, J = 7.5 Hz, protoni aromatici), 7.38 ? 7.44 (m, 1H, protoni aromatici);

<13>C NMR (151 MHz, CDCl3): ? 107.0 (t, J = 17.6 Hz), 115.3 (d, J = 20.8 Hz), 117.5 (d, J = 22.3 Hz), 125.9 (t, J = 14.2 Hz), 126.2, 130.0 (d, J = 8.3 Hz), 130.1, 136.8 (dd, J = 238.4, 16.2 Hz), 144.1 (d, J = 243.9 Hz), 162.7 (d, J = 245.9 Hz). MS (ES-) 258 (M-1).

2,3,5,6-tetrafluoro-4'-(trifluorometil)-[1,1'-bifenil]-4-anilina (44). Cromatografia flash (eluente: petroletere/ EtOAc from 95:5 v/v). Solido bianco (m.p. 163.9 ? 164.8 ?C da triturazione con diisopropiletere). Resa 60%. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 4.12 (s, 2H, -NH2), 7.56 (d, 2H, J = 8.0 Hz, protoni aromatici), 7.71 (d, 2H, J = 8.2 Hz, protoni aromatici); <13>C NMR (151 MHz, CDCl3): ? 106.8 (t, J = 15.1 Hz), 124.1 (q, J = 271.7 Hz, -CF3), 125.5 (q, J = 6.7 Hz), 126.4 (t, J = 3.8 Hz), 130.4 (q, J = 32.7 Hz), 130.8, 132.0, 136.9 (d, J = 238.7 Hz), 144.2 (d, J = 244.2 Hz). MS (ES-) 308 (M-1).

2,3,5,6-tetrafluoro-3'-(trifluorometil)-[1,1'-bifenil]-4-anilina (45). Cromatografia flash (eluente: petroletere/ EtOAc from 95:5 v/v). Solido giallo pallido (m.p. 46.6 ? 47.0 ?C da triturazione con diisopropiletere). Resa 92%. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 4.11 (s, 2H, -NH2), 7.55 -7.60 (m, 1H, protoni aromatici), 7.61 (d, 1H, J = 7.2 Hz, protoni aromatici), 7.65 (d, 1H, J = 7.4 Hz, protoni aromatici), 7.70 (s, 1H, protoni aromatici); <13>C NMR (151 MHz, CDCl3): ? 106.7 (t, J = 16.6 Hz), 124.1 (q, J = 272.7 Hz, -CF3), 125.2 (q, J = 3.8 Hz), 126.3 (t, J = 14.3 Hz), 127.3, 129.0, 129.1, 131.5 (q, J = 32.7 Hz), 133.8, 136.9 (dd, J = 239.4, 16.5 Hz), 144.2 (d, J = 244.2 Hz). MS (ES-) 308 (M-1).

Procedura generale per la sintesi di pirazolo [1,5-a] piridina ammidi 47 ? 50. Cloruro di ossalile (3,0 mmol) e DMF anidra (1 goccia) sono stati aggiunti a una soluzione raffreddata (0 ? C) dell'acido pirazolo[1,5-a] piridina protetto all? O (1,0 mmol) 40 in THF anidro (20 mL), in atmosfera di azoto. La soluzione ottenuta ? stata agitata a temperatura ambiente per 2 ore. La soluzione ? stata quindi concentrata a pressione ridotta e il residuo sciolto in THF anidro (10 mL, questo passaggio ? stato ripetuto tre volte). Il cloruro acilico risultante ? stato immediatamente utilizzato senza ulteriore purificazione e sciolto in 10 mL di toluene anidro e trasferito alla soluzione descritta in seguito. Trimetilalluminio (2.0 M in esano, 1.5 mmol), ? stato aggiunto a una soluzione della appropriata anilina in toluene anidro (15 mL), sotto atmosfera di azoto. La miscela risultante ? stata agitata per 2 ore a temperatura ambiente producendo una sospensione marrone, quindi ? stata aggiunta quantitativamente la soluzione del cloruro acilico precedentemente descritto in toluene anidro (30 mL). La miscela ? stata riscaldata per una notte a 90 ? C e quindi raffreddata a r.t. La reazione ? stata spenta con HCl 1M. Le fasi sono state separate e la fase acquosa ? stata estratta in modo esaustivo utilizzando EtOAc. Lo strato organico combinato ? stato lavato con NaOH 1M e con una soluzione satura di NaCl, essiccato e il solvente ? stato evaporato a pressione ridotta. Il prodotto grezzo ? stato purificato mediante cromatografia su colonna.

1-Benzil-2-oxo-N-(2,3,4',5,6-pentafluoro-[1,1'-bifenil]-4-il)-1,2-diidropirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (47). 2,3,4',5,6-Pentafluoro-[1,1'-bifenil]-4-anilina fu usata. Cromatografia flash (eluente: petroletere/ EtOAc from 80:20 v/v to 50:50 v/v). Solido grigio (m.p. 234.2 ? 235.4 ?C da triturazione con diisopropiletere). Resa 31%. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 5.48 (s, 2H, -NCH2Ph), 6.77 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 7.19 (t, 2H, J = 8.6 Hz, protoni aromatici), 7.28 (d, 2H, J = 7.4 Hz, protoni aromatici), 7.32 -750 (m, 6H, protoni aromatici), 7.73 (d, 1H, J = 6.9, H-a), 8.30 (d, 1H, J = 8.8, H-d), 9.98 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 45.7 (-NCH2Ph), 87.2 (C-f), 112.9 (C-b), 115.9 (d, J = 21.9 Hz, carboni aromatici), 116.4 (t, J = 17.1 Hz, C-p)*, 116.7 (d, J = 16.7 Hz, C-s)*, 118.4 (C-d), 123.0 (C-a), 123.5 (carboni aromatici), 127.1 (carboni aromatici), 129.0 (carboni aromatici), 129.7 (carboni aromatici), 131.8 (C-c), 132.8 (d, J = 8.4 Hz, carboni aromatici), 132.5 (carboni aromatici), 142.6 (C-e), 142.8 (d, J = 244.1 Hz, C-q)**, 144.2 (d, J = 250.7 Hz, C-r)**, 161.7 (C-g)<***>, 162.2 (C-h)<***>, 163.1 (d, J = 249.5 Hz, -CF); MS (ESI) 510 (M+1).

1-Benzil-2-oxo-N-(2,3,3',5,6-pentafluoro-[1,1'-bifenil]-4-il)-1,2-diidropirazolo[1,5-a]piridine-3-carboxamide (48). 2,3,3',5,6-Pentafluoro-[1,1'-bifenil]-4-anilina fu usata. Cromatografia flash (eluente: petroletere/ EtOAc from 80:20 v/v to 50:50 v/v). Solido giallo pallido (m.p. 195.4 ? 196.3 ?C da triturazione con diisopropiletere). Resa 40 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6):? 5.57 (s, 2H, -NCH2Ph), 7.07 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 7.29 ? 7.45 (m, 7H, protoni aromatici), 7.50 (d, 1H, J = 9.5 Hz, protoni aromatici), 7.62 (dd, 1H, J = 14.3, 7.7 Hz, protoni aromatici), 7.68 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 8.05 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 8.53 (d, 1H, J = 7.0 Hz, H-a), 10.12 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 44.2 (-NCH2Ph), 85.4 (C-f), 113.3 (C-b), 115.4 (t, J = 17.3 Hz, C-p)*, 116.2 (C-d), 116.4 (d, J = 20.8 Hz, carboni aromatici), 117.0 (C-s)*, 117.2 (d, J = 23.1 Hz, carboni aromatici), 125.2 (C-a), 126.5 (C-l), 127.2 (carboni aromatici), 128.2 (C-c), 128.8 (d, J = 9.8 Hz, carboni aromatici), 129.1 (carboni aromatici), 130.9 (d, J = 8.4 Hz, carboni aromatici), 132.9 (carboni aromatici), 133.7 (carboni aromatici), 141.4 (C-e), 142.2 (d, J = 242.5 Hz, C-q)**, 143.3 (d, J = 245.8 Hz, C-r)**, 144.1, 160.6 (C-g)<***>, 161.2 (C-h)<***>, 162.0 (d, J = 244.3 Hz, carboni aromatici); MS (ESI) 508 (M-1).

1-Benzil-2-oxo-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-4'-(trifluorometil)-[1,1'-bifenil]-4-il)-1,2-diidropirazolo[1,5-a]piridine-3-carboxamide (49).2,3,5,6-Tetrafluoro-4'-(trifluorometil)-[1,1'-bifenil]-4-anilina fu usata; Cromatografia flash eluente: da petroletere /EtOAc 80:20 v/v a 50:50 v/v. Solido giallo pallido (m.p. 262.2 ? 263.5 ?C da triturazione con diisopropiletere). Resa 41 %.

<1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 5.49 (s, 2H, -NCH2Ph), 6.78 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 7.29 (d, 2H, J = 7.4 Hz, protoni aromatici), 7.33 - 7.43 (m, 3H, protoni aromatici), 7.48 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.62 (d, 2H, J = 7.9 Hz, protoni aromatici), 7.73 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a), 7.76 (d, 2H, J = 8.1 Hz, protoni aromatici), 8.31 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 10.04 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 45.7 (-NCH2Ph), 87.2 (C-f), 112.9 (C-b), 116.1 (t, J = 16.5 Hz, C-p)*, 117.2 (t, J = 15.6 Hz, C-s)*, 118.4 (C-d), 123.0 (C-a), 124.0 (q, J = 272.5 Hz, -CF3), 125.7 (q, J = 3.8 Hz, carboni aromatici), 127.1 (carboni aromatici), 129.0 (C-c), 129.7 (carboni aromatici), 130.8 (carboni aromatici), 131.1 (q, J = 32.8 Hz, carboni aromatici), 131.4 (carboni aromatici), 131.9 (carboni aromatici), 132.5 (carboni aromatici), 142.6 (C-e), 142.8 (dd, J = 251.8, 17.4 Hz, C-q)**, 144.1 (dd, J = 244.7, 15.4 Hz, C-r)**, 161.6 (C-g)***, 162.2 (C-h)***; MS (ESI) 560 (M+1).

1-Benzil-2-oxo-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-3'-(trifluorometil)-[1,1'-bifenil]-4-il)-1,2-diidropirazolo[1,5-a]piridine-3-carboxamide (50).2,3,5,6-Tetrafluoro-3'-(trifluorometil)-[1,1'-bifenil]-4-anilina fu usata; Cromatografia flash eluente: da petroletere/ EtOAc 80:20 v/v a 50:50 v/v. Solido bianco (m.p. 190.9 ? 191.8 ?C da triturazione con diisopropiletere). Resa 40 %. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 5.49 (s, 2H, -NCH2Ph), 6.78 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 7.29 (d, 2H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.33 ? 7.42 (m, 3H, protoni aromatici), 7.48 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.64 (t, 1H, J = 7.7 Hz, protoni aromatici), 7.68 (d, 1H, J = 7.5 Hz, protoni aromatici), 7.72 (t, 2H, J = 7.6 Hz, protoni aromatici), 7.76 (s, 1H, protoni aromatici), 8.31 (d, 1H, J = 8.8, H-d), 10.04 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, Cloroformiod): ? 45.7 (-NCH2Ph), 87.2 (C-f), 112.9 (C-b), 116.4 (t, J = 16.2 Hz, C-p)*, 117.2 (t, J = 15.2 Hz, C-s)*, 118.5 (C-d), 123.0 (C-a), 124.0 (q, J = 272.1 Hz, -CF3), 125.9 (q, J = 3.9 Hz, carboni aromatici), 127.1 (carboni aromatici), 127.2 (carboni aromatici), 128.5 (carboni aromatici), 129.0 (carboni aromatici), 129.3 (carboni aromatici), 129.7 (carboni aromatici), 131.3 (q, J = 32.4 Hz), 131.8 (C-c), 132.5 (carboni aromatici), 133.7 (carboni aromatici), 142.7 (C-e), 142.8 (d, J = 252.0 Hz, C-q)**, 144.2 (d, J = 248.2 Hz, C-r)**, 161.6 (C-g)<***>, 162.2 (C-h)<***>; MS (ESI) 560 (M+1).

Procedura generale di rimozione di della sottostruttura 4-metossibenzilica per l?ottenimento dei composti 7 ? 9, 15-17. Tioanisolo (220 ?L, 1.87 mmol, da 5.0 eq a 10 equivalenti) fu aggiunto ad una soluzione del corrispondente prodotto di partenza (200 mg, 0.37 mmol, 1.0 eq) in TFA (3 mL). La miscela ? stata riscaldata a 70 ? C per 2 ore, quindi raffreddata a r.t .. La miscela ? stata parzialmente concentrata, e il grezzo ? stato ripreso con acqua ottenendo una sospensione che ? stata filtrata, il solido lavato con una ulteriore quantit? di acqua fredda. Il solido risultante ? stato triturato con diisopropiletere per ottenere i composti del titolo, spesso direttamente in forma pura (vedere i dettagli sopra).

2-Idroxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-4-morfolinofenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (6). Il composto 54 (200 mg, 0,38 mmol, 1,0 eq) ? stato sciolto in una soluzione di tioanisolo (250 ?L, 2,26 mmol, 6,0 eq) in TFA (2 mL). Il residuo ? stato triturato con esano e diisopropiletere, quindi purificato mediante Cromatografia flash (eluente: etere di petrolio / DCM / MeOH 5/4 / 0.4 v / v / v). Il solido grezzo risultante ? stato triturato con diisopropiletere per ottenere il composto del titolo come solido bianco (276,5 ? 277,2 ? C dec. Da diisopropiletere). Resa: 42%. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) ? 3.18 ? 3.25 (m, 4H, -NCH2CH2O-), 3.68 ? 3.75 (m, 4H, -NCH2CH2O-), 7.0 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 7.48 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 7.94 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 8.58 (d, 1H, J = 6.7 Hz, H-a), 8.76 (s, 1H, -NH), 12.83 (v br s, 1H, -OH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6) ? 51.0 (-NCH2CH2O-), 66.7 (-NCH2CH2O-), 88.2 (C-f), 111.5 (t, J = 15.1 Hz, C-p)*, 113.1 (C-b), 116.8 (C-d), 127.5 (t, J = 11.2 Hz, C-s)*, 128.2 (C-a), 129.1 (C-c), 141.7 (C-e), 142.2 (dd, J = 243.5, 6.2 Hz, C-q)**, 143.4 (dd, J = 244.6, 14.4 Hz, C-r)**, 160.8 (C-h)***, 162.7 (C-g)***. MS (ES-): 409 (M-1). ESI?HRMS (m/z): [M-H]<- >calcd for C18H13F4N4O3, 409.0929; obsd, 409.0925.

2-Idroxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-4-(tiofen-2-il)fenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (7). Il solido ? stato cristallizzato tre volte da acetonitrile (20 mL) per ottenere il composto del titolo come solido grigio (278,4 ?279,9 ? C dec. Da acetonitrile). Resa: 23 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) ? 7.03 (t, 1H, J = 6.6 Hz, H-b), 7.31 (t, 1H, J = 4.3 Hz, protoni aromatici), 7.51 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 7.64 (d, 1H, J = 2.8 Hz, protoni aromatici), 7.92 (d, 1H, J = 5.0 Hz, protoni aromatici), 7.97 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.61 (d, 1H, J = 6.7 Hz, H-a), 8.95 (s, 1H, -NH), 12.90 (br s, 1H, -OH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6) ? 88.2 (C-f), 110.9 (t, J = 15.6 Hz, C-p)*, 113.8 (C-b), 17.03 (t, J = 16.5 Hz, C-s)*, 116.8 (C-d), 126.2 (carbonio del tiofene), 127.8 (carbonio del tiofene), 128.4 (C-a), 129.2 (carbonio del tiofene), 129.5 (C-c), 130.7 (t, J = 4.0 Hz, carbonio del tiofene), 141.8 (C-e), 143.0 (dd, J = 246.5, 14.3 Hz, C-q and C-r), 160.4 (C-h)**, 162.7(C-g)**. MS (ES-): 406 (M-1). ESI?HRMS (m/z):

[M-H]<- >calcd for C18H8F4N3O2S, 406.0279; obsd, 406.0275.

2-Idroxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-4-(piridin-3-il)fenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (8). Solido giallo pallido (m.p. 283.4 ? 286.7 ?C dec. da triturazione con diisopropiletere). Resa: 76%.

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) ? 6.98 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.47 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.61 (dd, 1H, J = 7.7, 5.0 Hz, protoni aromatici), 7.95 (d, 1H, J = 8.6 Hz, H-d), 8.05 (d, 1H, J = 7.4 Hz, protoni aromatici), 8.57 (d, 1H, J = 6.5 Hz, H-a), 8.71 (d, 1H, J = 4.1 Hz, protoni aromatici), 8.78 (s, 1H, protoni aromatici), 9.30 (br s, 1H, -NH);

<13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6) ? 88.3 (C-f), 112.9 (C-b), 113.8 (t, J = 17.4 Hz, C-p)*, 116.6 (C-d), 117.9 (t, J = 14.7 Hz, C-s)*, 123.3 (carbonio piridinico), 124.0 (carbonio piridinico), 128.0 (C-a), 128.9 (C-c), 137.9 (carbonio piridinico), 141.7 (C-e), 142.6 (dd, J = 245.2, 15.1 Hz, C-q)**, 143.4 (dd, J = 245.7, 17.2 Hz, C-q)**, 150.2 (carbonio piridinico), 150.3 (carbonio piridinico), 160.6 (C-h)***, 163.9 (C-g)***. MS (ES+): 403 (M+H). ESI?HRMS (m/z): [M+H]<+ >calcd for C19H11F4N4O2, 403.0813; obsd, 403.0810.

2-Idroxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-4-(2-(trifluorometil)piridin-4-il)fenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (9). Solido giallo pallido (m.p. 258.4 ? 259.2 ?C dec. da triturazione con diisopropiletere). Resa: 55%. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) ? 7.01 (t, 1H, J = 6.6 Hz, H-b), 7.49 (t, 1H, J = 7.7 Hz, H-c), 7.96 (d, 1H, J = 8.6 Hz, H-d), 8.00 (d, 1H, J = 3.5 Hz, protoni aromatici), 8.22 (s, 1H, protoni aromatici), 8.59 (d, 1H, J = 6.6 Hz, H-a), 8.99 (d, J = 4.6 Hz, 1H, protoni aromatici), 9.22 (br s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6) ? 88.2 (C-f), 113.1 (C-p* overlapped with C-b), 116.7 (C-d), 118.9 (t, J = 13.5 Hz, C-s)*, 121.5 (q, J = 274,6 Hz, -CF3), 121.8 (carbonio piridinico), 128.2 (C-a), 128.5 (C-c), 129.1 (q, J = 12.5 Hz, carbonio piridinico), 137.3 (carbonio piridinico), 141.7 (C-e), 142.6 (d, J = 246.8 Hz, C-q)**, 143.3 (d, J = 247.0 Hz, C-r)**, 147.1 (q, J = 34.1 Hz, carbonio piridinico), 151.0 (carbonio piridinico), 160.3 (C-h)***, 163.4 (C-g)***. MS (ES+): 470 (M+H). ESI?HRMS (m/z): [M+H]<+ >calcd for C20H10F7N4O2, 471.0686; obsd, 471.0684.

2-Idroxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-3'-idroxi-[1,1'-bifenil]-4-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (14). Solido bianco (275.9 ?276.4 ?C dec. from diisopropiletere). Resa: 58%. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) ? 6.84 ? 6.99 (m, 3H, protoni aromatici), 7.03 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 7.35 (t, 1H, J = 8.2 Hz, protoni aromatici), 7.51 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 7.98 (d, 1H, J = 7.4 Hz, H-d), 8.61 (d, 1H, J = 4.5 Hz, H-a), 8.90 (s, 1H, -Ar-OH), 9.78 (s, 1H, -NH), 12.86 (s, 1H, -OH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6) ? 88.2 (C-f), 113.3 (C-b), 114.7 (t, J = 13.5 Hz, C-p)*, 116.3 (C-d), 116.8 (carboni aromatici), 117.4 (t, J = 16.3 Hz, C-s)*, 120.7 (carboni aromatici), 127.6 (carboni aromatici), 128.4 (C-a), 128.3 (carboni aromatici), 129.1 (C-c), 129.9 (carboni aromatici), 141.7 (C-e), 142.7 (d, J = 248.4 Hz, C-q)**, 143.2 (d, J = 244.8 Hz, C-r)**, 157.5 (carboni aromatici), 160.4 (C-h)***, 162.6 (C-g)***; MS (ES-): 416 (M-1). ESI?HRMS (m/z): [M+H]<+ >calcd for C20H12F4N3O3, 418.0809; obsd, 418.0807.

2-Idroxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-3'-(trifluorometoxi)-[1,1'-bifenil]-4-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (15). Il grezzo ? stato sciolto in metanolo, filtrato da solido insolubile, parzialmente evaporato e precipitato con aggiunta di diisopropiletere. Solido beige (228,1 ?229,5 ? C dec. Da diisopropiletere). Resa: 26%. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) ? 7.03 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.51 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 7.55 (d, 1H, J = 8.0 Hz, protoni aromatici), 7.60 ? 7.67 (m, 2H, protoni aromatici), 7.71 (t, 1H, J = 7.9 Hz, protoni aromatici), 7.98 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 8.61 (d, 1H, J = 6.7 Hz, H-a), 8.97 (s, 1H, -NH), 12.94 (br s, 1H, -OH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6) ? 88.2 (C-f), 113.2 (C-b), 115.5 (t, J = 17.2 Hz, C-p)*, 116.8 (C-d), 117.6 (t, J = 15.1 Hz, C-s)*, 120.1 (q, J = 257.0 Hz, -OCF3), 122.1 (carboni aromatici), 123.0 (carboni aromatici), 128.4 (C-a), 128.8 (carboni aromatici), 129.2 (C-c), 129.5 (carboni aromatici), 130.9 (carboni aromatici), 141.7 (C-e), 142.7 (dd, J = 246.2, 13.6 Hz, C-q)**, 143.3 (d, J = 245.6 Hz, C-r)**, 148.4 (carboni aromatici), 160.3 (C-h)***, 162.7 (C-g)***; MS (ES-): 484 (M-1). ESI?HRMS (m/z): [M+H]<+ >calcd for C21H11F7N3O3, 486.0683; obsd, 486.0681.

2-Idroxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-3'-metoxi-[1,1'-bifenil]-4-il)pirazolo[1,5-a]piridine-3-carboxamide (16). Il residuo ? stato trattato con dietil etere e purificato mediante Cromatografia flash (eluente: DCM / MeOH 97/3 v / v quindi etere di petrolio / diclorometano / metanolo 5/4 / 0,6 v / v / v) per ottenere il composto del titolo come solido bianco (223,6 - 224,1 ? C dec. da diisopropiletere).Resa: 47 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) ? 3.81 (s, 3H, -OCH3), 7.02 (t, 1H, J = 6.6 Hz, H-b), 7.08 ? 7.16 (m, 3H, protoni aromatici), 7.45 ? 7.54 (m, 2H, H-c and protoni aromatici), 7.98 (d, 1H, J = 8.6 Hz, H-d), 8.61 (d, 1H, J = 6.6 Hz, H-a), 8.99 (br s, 1H, -NH); <13>C-NMR (150 MHz, DMSO-d6): ? 55.4 (-OCH3), 88.2 (C-f), 113.2 (C-b), 115.0 (C-d), 115.8 (carboni aromatici), 116.8 (carboni aromatici), 117.0 (t, J = 16.1 Hz, C-s and C-p)*, 122.3 (carboni aromatici), 127.8 (C-a), 128.3 (carboni aromatici), 129.1 (C-c), 130.0 (carboni aromatici), 141.8 (C-e), 142.9 (d, J = 246.3 Hz, C-q)**, 143.4 (d, J = 252.5 Hz, C-r)**, 159.4 (carboni aromatici), 160.5 (C-h)****, 163.0 162.2 (C-g)****; MS (ES-): 430 (M-1), MS (ES+) 432 (M+1). ESI?HRMS (m/z): [M+H]<+ >calcd for C21H14F4N3O3, 432.0966; obsd, 432.0969.

2-Idroxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-3'-propoxi-[1,1'-bifenil]-4-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (17). Solido beige (209.4 ? 210.0 ?C da diisopropiletere). Resa: 69 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) ? 0.98 (t, 3H, J = 7.2 Hz, -OCH2CH2CH3), 1.68 ? 1.81 (m, 2H, -OCH2CH2CH3), 3.98 (t, 2H, J = 6.1 Hz, -OCH2CH2CH3), 7.02 (t, 1H, J = 6.5 Hz, H-b), 7.05 ? 7.14 (m, 3H, protoni aromatici), 7.46 (t, 1H, J = 7.8 Hz, protoni aromatici or H-c), 7.51 (t, 1H, J = 7.6 Hz, protoni aromatici or H-c), 7.99 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 8.61 (d, 1H, J = 6.5 Hz, H-a), 8.91 (s, 1H, -NH), 12.86 (s, 1H, -OH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6) ? 10.4 (-OCH2CH2CH3), 22.0 (-OCH2CH2CH3), 69.2 (-OCH2CH2CH3), 88.2 (C-f), 113.3 (C-b), 115.5 (C-d), 116.2 (carboni aromatici), 116.8 (carboni aromatici), 116.9 ? 117. 7 (m, C-s and C-p), 122.2 (carboni aromatici), 127.8 (carboni aromatici), 128.4 (C-a), 129.2 (C-c), 129.9 (carboni aromatici), 141.7 (C-e), 142.8 (dd, J = 245.5, 21.8 Hz, C-q)**, 143.3 (d, J = 245.6 Hz, Cr)**, 158.8 (carboni aromatici)***, 160.4 (C-h)****, 162.6 (C-g)****; MS (ES-): 458 (M-1), MS (ES+): 460 (M+1). ESI?HRMS (m/z): [M+H]<+ >calcd for C23H18F4N3O3, 460.1279; obsd, 460.1280.

2-Idroxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1?-bifenil]-4-il)-4,5,6,7-tetraidropirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (5). Palladio su carbonio (Pd / C, 20% p / p) ? stato aggiunto a una soluzione del composto 46, (1,0 mmol) in THF anidro (10 mL). La miscela risultante ? stata agitata sotto un'atmosfera di idrogeno di 40 bar, alla temperatura di 65 ? C per 3 ore utilizzando un apparecchio a Microonde SynthWAVE. La sospensione ? stata filtrata attraverso Celite e il solido ? stato lavato con metanolo. Il filtrato ? stato concentrato a pressione ridotta. Il solido ottenuto ? stato ulteriormente purificato mediante Cromatografia flash (eluente: diclorometano / EtOAc / HCOOH 80: 20: 1 v / v / v). Solido bianco (p.f.

270,9 - 272,9 ? C dec, da diisopropiletere).Resa 40% <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 1.70-1.80 (m, 2H, H-b), 1.89-1.98 (m, 2H, H-c), 2.92 (t, 2H, J=6.1 Hz, H-d), 3.86 (t, 2H, J=5.8 Hz, H-a), 7.49 ? 7.55 (m, 5H, protoni aromatici), 9.11 (s, 1H, -NH), 11.94 (v br s,1H, -OH). Segnali protonici intercambiabili sovrapposti al segnale dell'acqua;

<13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 18.5 (C-b), 22.1 (C-d), 22.9 (C-c), 46.5 (C-a), 95.5 (C-f), 116.8 (t, J = 14.3 Hz, C-s)*, 117.0 (t, J = 17.4 Hz, C-p)*, 126.7 (carboni aromatici), 128.9 (carboni aromatici), 129.4 (carboni aromatici), 130.1 (carboni aromatici), 141.8 (C-e) 143.2 (d, J = 248.4, 21.8 Hz, C-q)**, 144.3 (d, J = 244.0 Hz, C-r)**, 159.7 (C-g)***, 160.7 (C-h)***; MS (ES-) 404 (M-1). IR (KBr) v (cm<-1>): 3338, 2924, 2519, 1685, 1577, 1522, 1437, 1374, 1316, 1283, 1241, 1144, 992. ESI?HRMS (m/z): [M+H]<+ >calcd for C20H16F4N3O2, 406.1173; obsd, 406,1170.

Procedura generale di idrogenazione per l'ottenimento di composti finali 10 - 13.

Palladio su carbonio (Pd / C, 6% p / p), ? stato aggiunto a una soluzione dell'ammide appropriata (composti 47-50, 1,0 mmol), in THF anidro (15 mL) e HCl (1,0 mmol). La miscela risultante ? stata agitata vigorosamente sotto un'atmosfera di idrogeno per 6 ore. La sospensione ? stata filtrata attraverso Celite, quindi il solido ? stato lavato con metanolo. Il filtrato ? stato concentrato a pressione ridotta. Quando necessario, il solido ottenuto ? stato ulteriormente purificato mediante Cromatografia flash (vedi dettagli sotto).

2-Idroxi-N-(2,3,4',5,6-pentafluoro-[1,1'-bifenil]-4-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (10). Ottenuto da 47, Cromatografia flash (eluente: dichloromethane / EtOAc / HCOOH 80:20:1 v/v/v). Solido bianco (m.p. 293.4 ? 294.5 ?C dec. da triturazione con diisopropiletere). Resa 75 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 7.03 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.42 (t, 2H, J = 8.7 Hz, protoni aromatici), 7.51 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 7.57 ? 7.71 (m, 2H, protoni aromatici ), 7.98 (d, 1H, J = 8.7, H-d), 8.62 (d, 1H, J = 6.7, H-a), 8.93 (s, 1H, -NH), 12.88 (br s, 1H, -OH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 88.2 (C-f), 113.3 (C-b), 116.0 (d, J = 22.0 Hz, carboni aromatici), 116.3 (t, J = 17.4 Hz, C-p)*, 116.8 (C-d), 117.1 (t, J = 14.1 Hz, C-s)*, 123.0 (carboni aromatici), 128.4 (C-a), 129.2 (C-c), 132.5 (d, J = 8.4 Hz, carboni aromatici), 141.7 (C-e), 142.8 (d, J = 246.4 Hz, C-q)**, 143.3 (d, J = 248.6 Hz, C-r)**, 160.4 (C-g)***, 162.6 (d, J = 247.1 Hz, -CF), 162.7 (C-h)***; MS (ESI) 420 (M+1).

ESI?HRMS (m/z): [M+H]<+ >calcd for C20H11F5N3O2, 420.0766; obsd, 420.0766.

2-Idroxi-N-(2,3,3',5,6-pentafluoro-[1,1'-bifenil]-4-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (11). Ottenuto da 48, Cromatografia flash eluente: dicloromethane/EtOAc / HCOOH 80:20:1 v/v/v. Solido bianco (m.p. 255.4 ? 256.2 ?C dec. da triturazione con diisopropiletere). Resa 75 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 7.03 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 7.33 ? 7.56 (m, 4H, protoni aromatici), 7.62 (dd, 1H, J = 14.3, 7.7 Hz, protoni aromatici), 7.99 (d, 1H, J = 8.7, H-d), 8.62 (d, 1H, J = 6.8, H-a), 8.94 (s, 1H, -NH), 12.83 (br s, 1H, -OH); <13>C NMR (151 MHz, CDCl3): ? 88.2 (C-f), 113.3 (C-b), 115.9 (t, J = 17.4 Hz, C-p)*, 116.4 (d, J = 20.9 Hz, carboni aromatici), 116.9 (C-d), 117.2 (d, J = 23.0 Hz, carboni aromatici), 117.4 (t, J = 14.8 Hz, C-s)*, 126.5 (carboni aromatici), 128.4 (C-a), 128.7 (d, J = 9.6 Hz, carboni aromatici), 129.2 (C-c), 130.9 (d, J = 8.3 Hz, carboni aromatici), 141.7 (C-e), 142.8 (d, J = 243.6 Hz, C-q)**, 143.2 (d, J = 244.6 Hz, C-r)**, 160.4 (C-g)***, 162.0 (d, J = 244.4 Hz, -CF), 162.7 (C-h)***; MS (ESI) 418 (M-1). ESI?HRMS (m/z): [M+H]<+ >calcd for C20H11F5N3O2, 420.0766; obsd, 420.0763.

2-Idroxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-4'-(trifluorometil)-[1,1'-bifenil]-4-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (12). Ottenuto da 49, Cromatografia flash eluente: diclorometano/EtOAc /HCOOH 80:20:1 v/v/v. Solido bianco (m.p. 286.1 ? 286.8 ?C dec. da triturazione con diisopropiletere). Resa 95 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 7.03 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.51 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 7.83 (d, 2H, J = 7.8 Hz, protoni aromatici), 7.94 (d, 2H, J = 8.0 Hz, protoni aromatici), 7.98 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 8.61 (d, 1H, J = 6.7 Hz, H-a), 9.00 (s, 1H, -NH), 12.92 (br s, 1H, -OH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 88.2 (C-f), 113.3 (C-b), 115.7 (t, J = 16.9 Hz, C-p)*, 116.8 (C-d), 117.8 (t, J = 13.1 Hz, C-s)*, 124.0 (q, J = 272.4 Hz, -CF3), 125.8 (q, J = 3.3 Hz, carboni aromatici), 128.4 (C-a), 129.2 (C-c), 129.7 (q, J = 32.3 Hz, carboni aromatici), 131.0 (carboni aromatici), 131.2 (carboni aromatici), 141.7 (C-e), 142.7 (dd, J = 246.0, 14.9 Hz, C-q)**, 143.2 (dd, J = 244.9, 19.5 Hz, C-r)**, 160.3 (C-g)***, 162.7 (C-h)***; MS (ESI) 468 (M-1). ESI?HRMS (m/z): [M+H]<+ >calcd for C21H11F7N3O2, 470.0734; obsd, 470.0731.

2-Idroxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-3'-(trifluorometil)-[1,1'-bifenil]-4-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (13). Ottenuto da 50, Cromatografia flash eluente: diclorometano/EtOAc/HCOOH 80:20:1 v/v/v. Solido rosa pallido (m.p. 220.3 ? 220.7 ?C dec. da triturazione con diisopropiletere). Resa 98 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 7.03 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.51 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 7.82 (t, 1H, J = 7.7 Hz, protoni aromatici), 7.91 (d, 2H, J = 7.6 Hz, protoni aromatici), 7.95 -8.02 (m, 2H, protoni aromatici and H-d), 8.62 (d, 1H, J = 6.7, H-a), 8.98 (s, 1H, -NH), 12.87 (br s, 1H, -OH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 88.2 (C-f), 113.3 (C-b), 115.6 (t, J = 17.0 Hz, C-p)*, 116.8 (C-d), 117.6 (t, J = 15.6 Hz, C-s)*, 123.9 (q, J = 271.9 Hz, -CF3), 126.2 (carboni aromatici), 126.9 (carboni aromatici), 127.9 (carboni aromatici), 128.4 (C-a), 129.2 (C-c), 129.7 (q, J = 32.4 Hz, carboni aromatici), 130.1 (carboni aromatici), 134.4 (carboni aromatici), 141.7 (C-e), 143.8 (d, J = 246.0 Hz, C-q)**, 143.9 (d, J = 246.9 Hz, C-r)**, 160.3 (C-g)***, 162.7 (C-h)***; MS (ESI) 468 (M-1). ESI?HRMS (m/z): [M+H]<+ >calcd for C21H11F7N3O2, 470.0734; obsd, 470.0735.

Etil 2-((tert-butoxicarbonil)oxi)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxilate (62). Cs2CO3 (2.86 g, 8.74 mmol) e tert-butoxicarbonil anidride (0.699 g, 3.2 mmol) furono aggiunte ad una soluzione di 39 (0.600 g, 2.91 mmol) in THF anidro (25 mL). La miscela di reazione ? stata agitata a riflusso per una notte e lasciata raffreddare a temperatura ambiente. Il solvente ? stato concentrato a pressione ridotta e il residuo ? stato sciolto in acqua (50 mL) ed estratto con dietil etere (3 x 50 mL). Gli estratti organici combinati sono stati lavati con soluzione satura di NaCl, essiccati su Na2SO4 anidro e concentrati a pressione ridotta. Il residuo ? stato purificato mediante Cromatografia flash (eluente: etere di petrolio / acetato di etile 80:20 v / v) per fornire il composto del titolo come solido bianco (p.f. 95,4 - 96,4 ? C da triturazione con diisopropiletere). Resa 93%. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d3): ? 1.39 (t, 3H, J = 7.1 Hz, -OCH2CH3), 1.58 (s, 9H, -OC(CH3)3), 4.36 (q, 2H, J = 7.0 Hz, -OCH2CH3), 6.96 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 7.42 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 8.08 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.38 (d, 1H, J = 6.6 Hz, H-a). <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d3): ? 14.6 (-OCH2CH3), 27.8 (-C(CH3)3), 60.2 (-OCH2CH3), 84.8 (C-f), 93.4(-C(CH3)3), 114.1 (C-b), 119.2 (C-d), 128.0 (C-a), 129.3 (C-c), 142.3 (C-e), 150.2 (C-h), 158.2 (C-g)*, 162.1 (C-i)*. MS (ESI) 307 (M+1).

Etil 2-((tert-butoxicarbonil)oxi)-7-cloropirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxilato (63). LiHMDS (1.0 M THF solution: 0.980 mL, 0.98 mmol, 1.5 equiv.) fu aggiunto goccia a goccia ad una soluzione di 62 (0.400 g, 0.654 mmol) in THF anidro (10 mL) raffreddata a -78?C. La miscela ? stata agitata a -78 ? C per 1 ora, quindi una soluzione di esacloroetano (0,170 g, 0,72 mmol, 1,1 equiv.) in THF anidro ? stata aggiunta a -78 ? C e la miscela di reazione ? stata agitata per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, la reazione ? stata spenta con una soluzione acquosa satura di NH4Cl (100 mL). La fase acquosa ? stata estratta con diclorometano (4 x 100 mL). Le fasi organiche riunite sono state essiccate su Na2SO4, filtrate ed evaporate a secchezza sotto vuoto. Il prodotto grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash (eluente: etere di petrolio / acetato di etile 80:20 v / v) per fornire il composto del titolo come solido bianco (p.f. 104,6 - 106,0 ? C da triturazione con diisopropiletere). Resa 81%. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d3): ? 1.40 (t, 3H, J = 7.1 Hz, -OCH2CH3), 1.58 (s, 9H, -OC(CH3)3), 4.37 (q, 2H, J = 7.2 Hz, -OCH2CH3), 7.11 (dd, 1H, J = 7.5, 1.1 Hz, H-b), 7.39 (dd, 1H, J = 8.9, 7.5 Hz, H-c), 8.09 (dd, 1H, J = 8.9, 1.2 Hz, H-d). <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d3): ? 14.6 (-OCH2CH3), 27.8 (-C(CH3)3), 60.5 (-OCH2CH3), 85.0 (C-f) 3, 95.2(-C(CH3)3), 114.4 (C-b), 117.5 (C-d), 128.2 (C-c), 131.0 (C-a), 143.9 (C-e), 150.0 (C-h), 158.0 (C-g)*, 161.8 (C-i)*. MS (ESI) 241 (M+1, -Boc).

Etil 7-chloro-2-idroxipirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxilato (64). L'acido trifluoroacetico (10 mL) ? stato aggiunto a una soluzione di 63 in diclorometano anidro (25 mL) e la miscela di reazione ? stata agitata a temperatura ambiente per 4 ore. La miscela ? stata spenta con acqua e le due fasi sono state separate. La soluzione acquosa ? stata ulteriormente estratta con diclorometano (3 x 25 mL). Le fasi organiche combinate sono state essiccate su Na2SO4, filtrate ed evaporate a secchezza a pressione ridotta. Il prodotto grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash (eluente: diclorometano / metanolo 98: 2 v / v) per ottenere il composto del titolo come un solido bianco (m.p. 134.0 ? 135.8 ?C da triturazione con diisopropiletere). Resa 94%. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d3): ? 1.44 (t, 3H, J = 7.2 Hz, -OCH2CH3), 4.44 (q, 2H, J = 7.2 Hz, -OCH2CH3), 7.02 (dd, 1H, J = 7.5, 1.2 Hz, H-b), 7.35 (dd, 1H, J = 8.7, 7.5 Hz, H-c), 7.72 (dd, 1H, J = 8.7, 1.2 Hz, H-d), 9.09 (s, 1H, -OH). <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d3): ? 14.6 (-OCH2CH3), 60.9 (-OCH2CH3), 87.9 (C-f), 113.6 (C-b), 115.5 (C-d), 128.4 (C-c), 131.3 (C-a), 142.0 (C-e), 166.0 (C-h)*, 166.9 (C-g)*. MS (ESI) 241 (M+1).

Etil 2-(benziloxi)-7-cloropirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxilato (65). Benzil bromuro (645 mg, 3.20 mmol, 1.10 eq) fu aggiunto goccia a goccia ad una miscella di 64 (600 mg, 2.91 mmol) e Cs2CO3 (2.295 g, 7.04 mmol, 2.4 eq) in DMF anidra (15 mL). La miscela di reazione ? stata agitata per una notte a temperatura ambiente, quindi ? stata aggiunta acqua (100 mL). La miscela ? stata estratta con EtOAc (4 ? 70 mL), gli estratti organici riuniti sono stati essiccati su Na2SO4 ed evaporati a pressione ridotta per ottenere un olio giallo. La miscela ottenuta ? stata purificata utilizzando cromatografia flash (eluente: etere di petrolio / EtOAc 6/4 v / v) per ottenere il composto del titolo come un solido giallo pallido (m.p. 98.2 ? 99.3 ?C da triturazione con diisopropiletere). Resa 85% <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d3): ? 1.41 (t, 3H, J = 7.1 Hz, -OCH2CH3), 4.38 (q, 2H, J = 7.1 Hz, -OCH2CH3), 5.58 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.96 (dd, 1H, J = 7.4, 1.2 Hz, H-b), 7.27 ? 7.34 (m, 2H, H-c and protoni aromatici), 7.39 (t, 2H, J = 7.5 Hz, protoni aromatici), 7.59 (d, 2H, J = 7.4 Hz, protoni aromatici), 7.99 (dd, 1H, J = 8.8, 1.2 Hz, H-d). <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d3): ? 14.6 (-OCH2CH3), 60.0 (-OCH2CH3), 71.1 (-OCH2Ph), 90.1 (C-f), 112.8 (C-b), 116.5 (C-d), 127.8 (carboni aromatici), 127.9 (carboni aromatici), 128.0 (C-c), 128.5 (carboni aromatici), 130.6 (C-a), 136.7 (carboni aromatici), 144.6 (C-e), 163.1 (C-h)*, 164.8 (C-g)*. MS (ESI) 331 (M+1).

Acido 2-(Benziloxi)-7-chloropirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxilico (66). 6 M NaOH (5.0 eq) fu aggiunto ad una soluzione di 65 (785 mg, 2.40 mmol) in EtOH assoluto (20 mL). La miscela ? stata agitata per 4 ore a 75 ? C, quindi neutralizzata con HC1 6 M e concentrata a pressione ridotta. La miscela ? stata raffreddata a 0 ? C quindi acidificata con HC1 2 M fino a raggiungere pH 2, ottenendo una sospensione. Quest'ultima ? stata filtrata per ottenere il composto del titolo come un solido bianco (p.f.

178,4 - 179,8 ? C dec. con sviluppo di gas, da triturazione con diisopropiletere). Resa 84 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 5.48 (s, 2H, -OCH2Ph), 7.31 (dd, 1H, J = 7.5, 1.1 Hz, H-b), 7.35 (t, 1H, J = 7.4 Hz, protoni aromatici), 7.41 (t, 2H, J = 7.4 Hz, protoni aromatici), 7.52 (dd, 1H, J = 8.7, 7.6 Hz, H-c), 7.55 (d, 2H, J = 7.5 Hz, protoni aromatici), 7.95 (dd, 1H, J = 8.9, 1.1 Hz, H-d), 12.34 (br s, 1H, -COOH). <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 70.5 (-OCH2Ph), 89.4 (C-f), 113.3 (C-b), 116.1 (C-d), 127.9 (C-a), 128.1 (carboni aromatici), 128.4 (carboni aromatici), 128.9 (carboni aromatici), 129.4 (C-c), 136.4 (carboni aromatici), 144.1 (C-e), 163.3 (C-h)*, 164.0 (C-g)*. MS (ESI) 301 (M-1).

1-Benzil-7-chloro-2-oxo-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil]-4-il)-1,2-dihidropirazolo[1,5a]piridin-3-carboxamide (67). Cloruro di ossalile (3,0 mmol) e DMF anidra (1 goccia) sono stati aggiunti a una soluzione raffreddata (0 ? C) di 66 (1,0 mmol), in THF anidro (20 mL), sotto atmosfera di azoto. La soluzione ottenuta ? stata agitata a temperatura ambiente per 2 ore. La soluzione ? stata quindi concentrata a pressione ridotta e il residuo sciolto in THF anidro (10 mL, questo passaggio ? stato ripetuto tre volte). Il cloruro acilico risultante ? stato immediatamente utilizzato senza ulteriore purificazione e sciolto in 10 mL di toluene anidro e trasferito alla soluzione descritta in seguito. Trimetilalluminio (2,0 M in esano, 1,5 mmol), ? stato aggiunto a una soluzione di 4-fenil-2,3,5,6-tetrafluoroanilina (1,5 mmol) in toluene anidro (15 mL), sotto atmosfera di azoto. La miscela risultante ? stata agitata per 2 ore a temperatura ambiente producendo una sospensione marrone, quindi ? stata addizionata della soluzione di cloruro acilico in toluene anidro precedentemente descritta (30 mL). La miscela ? stata riscaldata per una notte a 90 ? C e quindi raffreddata a t.a. La reazione ? stata spenta con HCl 1M, le due fasi sono state separate. La fase acquosa ? stata estratta in modo esaustivo utilizzando EtOAc. Le fasi organiche riunite sono state lavate con NaOH 1M e soluzione satura di NaCl, essiccate e il solvente ? stato evaporato a pressione ridotta. Il prodotto grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash (eluente: da etere di petrolio / EtOAc 8: 2 v / v a etere di petrolio / EtOAc 4: 6 v / v) per ottenere il composto del titolo come solido bianco (pf 201,1 -202,4?C da triturazione con diisopropiletere).Resa 38 %.<1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d3): ? 5.74 (s, 2H, -NCH2Ph), 6.73 (dd, 1H, J = 7.5, 1.2 Hz, H-b), 7.06 (dd, 2H, J = 7.4, 1.7 Hz, protoni aromatici), 7.22- 7.30 (m, 3H, protoni aromatici), 7.35 (dd, 1H, J = 8.8, 7.6 Hz, H-c), 7.42 ? 7.53 (m, 5H, protoni aromatici), 8.28 (dd, 1H, J = 8.8, 1.2 Hz, H-d), 10.01 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d3): ? 52.6 (-NCH2Ph), 89.2 (C-f), 114.6 (C-b), 115.9 (t, J = 16.3 Hz, C-p)*, 116.7 (C-d), 118.0 (t, J = 17.2 Hz, C-s)*, 127.2 (carboni aromatici), 127.6 (C-a), 128.6 (carboni aromatici), 128.7 (carboni aromatici), 129.1 (carboni aromatici), 129.2 (carboni aromatici), 130.4 (C-c), 130.6 (carboni aromatici), 133.7 (carboni aromatici), 133.8 (carboni aromatici), 142.8 (dd, J = 248.8, 15.1 Hz, C-q)**, 144.2 (d, J = 248.3 Hz, C-r)**, 150.3 (C-e), 161.2 (C-g)***, 167.5 (C-h)***. MS (ESI) 526 (M-1).

7-Chloro-2-idroxi-N-(2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil]-4-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (4). Tioanisole (240 ?L, 1.90 mmol, 10.0 eq) fu aggiunto ad una soluzione di 67 (100 mg, 0.19 mmol, 1.0 eq) in TFA (2 mL). La miscela ? stata riscaldata a 70 ?C per 3 ore quindi raffreddata a t.a. La miscela ? stata parzialmente concentrata, e il grezzo ? stato ripreso con acqua ottenendo una sospensione che ? stata filtrata, il solido lavato con ulteriore quantit? di acqua fredda. Il solido risultante ? stato triturato con diisopropiletere per ottenere i composti del titolo, in forma pura come solido bianco (p.f. 259,3 - 260,4 ? C dec. da triturazione con diisopropiletere). Resa 64%. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 7.32 (dd, 1H, J = 7.5, 1.1 Hz, H-b), 7.53 (dd, 1H, J = 8.7, 7.5 Hz, H-c), 7.53 ? 7.60 (m, 5H, protoni aromatici), 8.02 (dd, 1H, J = 8.8, 1.1 Hz, H-d), 8.99 (s, 1H, -NH), 13.33 (br s, 1H, -OH). <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 89.9 (C-f), 113.5 (C-b), 115.6 (C-d), 116.7 (t, J = 17.8 Hz, C-p)*, 117.4 (t, J = 17.7 Hz, C-s)*, 126.6 (Ca), 128.8 (carboni aromatici), 128.9 (carboni aromatici), 128.9 (C-c), 129.4 (carboni aromatici), 130.1 (carboni aromatici), 142.9 (d, J = 246.6 Hz, C-q)**, 143.2 (d, J = 241.3 Hz, C-r)**, 143.5 (C-e), 160.2 (C-g)***, 162.6 (C-h)***. MS (ESI) 436 (M+1). ESI?HRMS (m/z): [M+H]+ calcd for C20H11ClF4N3O2, 436.0470; obsd, 436.0472.

Procedura generale per la sintesi delle ammidi pirazolo[1,5-a] piridiniche 68 ? 77. Cloruro di ossalile (1,75 mL, 3,5 mmol) e DMF anidra (7 ?L) sono stati aggiunti a una soluzione raffreddata (0 ? C) di 40 (1,0 mmol) in THF anidro (15 mL) sotto atmosfera di azoto. La miscela di reazione ? stata agitata per 2 ore a temperatura ambiente in atmosfera di azoto, quindi concentrata a pressione ridotta. Il residuo ? stato sciolto in THF anidro (10 mL) e la soluzione nuovamente concentrata, questo passaggio ? stato ripetuto tre volte. Una soluzione della appropriata anilina (78-87, 1.00 mmol), piridina anidra (3.0 mmol) in toluene anidro (5 mL) ? stata aggiunta goccia a goccia alla soluzione di cloruro acilico sciolto in toluene anidro (15 mL) e mantenuto sotto atmosfera di azoto. La miscela risultante ? stata agitata a riflusso per una notte, quindi raffreddata a temperatura ambiente e solo per i composti 70-73 spenta con 0,5 M HCl (25 mL). Le due fasi sono state separate, la fase acquosa ? stata ulteriormente estratta con EtOAc (3 x 50 mL), gli estratti organici riuniti sono stati lavati con una soluzione satura di NaCl, essiccati su Na2SO4 ed evaporati a pressione ridotta. Il materiale grezzo ? stato purificato utilizzando la cromatografia flash (dettagli in ogni specifica ricetta).

2-Benziloxi-N-(5-fenoxipiridin-2-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (68). Ottenuta da 40 usando l? anilina 78. Cromatografia flash eluente: petroletere/ EtOAc 80 / 20 v/v. Solido bianco (m.p.

120.6 ? 120.7 ?C; da triturazione con diisopropiletere) Resa 87 %. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 5.55 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.86 ? 6.92 (m, 2H, protoni aromatici and H-b), 7.10 (d, 2H, J = 7.9 Hz, protoni aromatici), 7.17 (t, 1H, J = 7.4 Hz, H-c), 7.34 ? 7.42 (m, 4H, protoni aromatici), 7.45 (t, 2H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.53 (d, 2H, J = 7.2 Hz, protoni aromatici), 8.01 (d, 1H, J = 2.6 Hz, protoni aromatici), 8.25 ? 8.30 (m, 2H, protoni aromatici and H-d), 8.32 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.64 (s, 1H, -NH). <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 72.4 (-OCH2Ph), 90.5 (C-f), 111.8, 113.1 (C-b), 118.8 (C-d), 120.7, 124.4, 127.9 (C-c), 128.3, 128.8 (C-a), 129.1, 129.2, 129.8, 131.4, 131.9, 135.6, 138.6, 143.0 (C-e), 155.0 (C-s)*, 159.6 (C-v)*, 161.4 (C-g)*, 162.3 (C-h)*. IR (KBr) v (cm<-1>): 3373, 3100, 3044, 2925, 1947, 1663, 1636, 1534, 1473, 1365, 1296, 1249, 1207, 1120, 1005. MS (ESI) 435 (M-1).

2-Benziloxi-N-5-[3-(trifluorometil)fenoxi]piridin-2-ilpirazolo[1,5-a]piridine-3-carboxamide (69). Ottenuta da 40 usando l?anilina 79. Cromatografia flash, eluente: petroletere/ EtOAc 70 / 30 v/v). Solido bianco (m.p. 133.6 ? 135.9 ?C; da triturazione con diisopropiletere). Resa 50 %. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 5.65 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.89 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.14 (dd, 1H, J = 8.2, 1.9 Hz, protoni aromatici), 7.23 (s, 1H, protoni aromatici), 7.33 ? 7.46 (m, 7H, protoni aromatici), 7.60 (d, 2H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 8.12 (d, 1H, J = 2.8 Hz, protoni aromatici), 8.29 (d, 1H, J = 8.9 Hz, H-d), 8.31 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a), 8.42 (d, 1H, J = 9.0 Hz, protoni aromatici), 9.40 (s, 1H, -NH), <13>C-NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 72.0 (-OCH2Ph), 90.7 (C-f), 113.1 (C-b), 114.6 (q, J = 3.8 Hz), 114.9, 118.8 (C-d), 119.8 (q, J = 3.8 Hz), 120.8, 123.8 (q, J = 272.0 Hz, -CF3), 127.9, 128.0, 128.6, 128.8, 128.9, 129.7, 130.6, 132.5 (q, J = 32.8 Hz), 135.9, 140.3, 143.2 (C-e), 148.3, 148.9 (C-s)*, 158.2 (C-v)*, 161.2 (C-g)*, 162.4 (C-h)*. IR (KBr) v (cm<-1>): 3373, 3069, 2924, 2853, 1666, 1634, 1538, 1449, 1328, 1287, 1163, 1130, 1012. MS (ESI) 505 (M+1).

2-(Benziloxi)-N-(2-metil-4-fenoxifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (70). Ottenuta da 40 usando l?anilina 80. Cromatografia flash(eluente petroletere/ EtOAc 85 / 15 v/v). Solido giallo tenue (m.p. 186.1 - 190.9 ?C from diisopropiletere). Resa 87 %. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 1.83 (s, 3H, Ar-CH3), 5.54 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.76 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-t), 6.85 ? 6.91 (m, 2H, protoni aromatici), 6.96 (d, 2H, J = 8.1, protoni aromatici), 7.05 (t, 1H, J = 7.3 Hz, H-b), 7.30 (t, 2H, J =7.8 Hz, protoni aromatici), 7.34 ? 7.45 (m, 4H, protoni aromatici and H-c), 7.53 (d, 2H, J = 6.3 Hz, protoni aromatici), 8.20 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.29 ? 8.37 (m, 2H, protoni aromatici), 8.44 (s, 1H, -NH). <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 17.6 (Ar-CH3), 72.6 (-OCH2Ph), 91.1 (C-f), 112.9 (C-b), 117.5 (C-d), 118.3, 119.0, 121.1, 122.8, 123.0, 127.6, 128.6, 129.0, 129.2, 129.4, 129.5, 129.7, 132.7, 135.4, 143.1 (C-e), 152.6 (C-g)*, 158.1 (C-s)*, 161.2 (C-v)*, 162.3 (C-h)*; IR (KBr) ? (cm<-1>): 3391, 3308, 3040, 2922, 2737, 1963, 1882, 1660, 1590, 1588, 1362, 1334, 1219, 1151, 1130, 1101; MS (ESI) 450 (M+1).

2-(Benziloxi)-N-(2-isopropil-5-metil-4-fenoxifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (71). Ottenuta da 40 usando l?anilina 81. Cromatografia flash, eluente: petroletere/ EtOAc 70 / 30 v/v). Solido bianco (m.p. 166.2 ? 167.7 ?C; da triturazione con diisopropiletere). Resa 54 %. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 0.90 (d, 6H, J = 6.8 Hz, CH(CH3)2), 2.16 (s, 3H, Ar-CH3), 2.72 (hept, 1H, J = 6.7 Hz, -CH(CH3)2), 5.55 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.81 (s, 1H, H-t), 6.84 (d, 2H, J = 8.1 Hz, protoni aromatici), 6.87 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 6.98 (t, 1H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.22 ? 7.28 (m, 2H, protoni aromatici), 7.34 - 7.45 (m, 4H, protoni aromatici), 7.52 (d, 2H, J = 6.9 Hz, protoni aromatici), 8.02 (s, 1H, H-q), 8.31 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.35 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.48 (s, 1H, - NH). <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 16.1 (Ar-CH3), 22.7 CH(CH3)2), 27.8 (-CH(CH3)2), 72.5 (-OCH2Ph), 91.1 (C-f), 112.9 (C-b), 116.3, 117.9, 119.1 (C-d), 121.8, 126.4, 127.6 (C-c), 128.3, 128.6, 129.0 (C-a), 129.1, 129.2, 129.7, 131.5, 135.5, 138.4, 143.2 (C-e), 150.4 (C-s)*, 158.7 (C-v)*, 161.5 (C-h)**, 162.4 (C-g)**; IR (KBr) v (cm-

<1>): 3398, 3040, 2963, 1652, 1636, 1528, 1490, 1445, 1402, 1368, 1289, 1220, 1181, 1147, 1127, 1044, 993 ; MS (ESI) 492 (M+1).

2-(Benziloxi)-N-(5-isopropil-2-metil-4-fenoxifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (72). Ottenuta da 40 usando l?anilina 82. Cromatografia flash, eluente: petroletere/ EtOAc 60 / 40 v/v). Solido bianco (m.p. 157.5 ? 158.9 ?C; da triturazione con diisopropiletere). Resa 92 %. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 1.24 (d, 6H, J = 6.8 Hz, -CH(CH3)2), 1.77 (s, 3H, Ar-CH3), 3.20 (hept, 1H, J = 6.8 Hz, -CH(CH3)2), 5.54 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.64 (s, 1H, H-t), 6.85 ? 6.91 (m, 3H, protoni aromatici and H-b), 7.01 (t, 1H, J = 7.3 Hz, H-c), 7.20 ? 7.45 (m, 6H, protoni aromatici), 7.52 (d, 2H, J = 6.4 Hz, protoni aromatici), 8.29 (s, 1H, H-q), 8.32 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.37 (d, 1H, J= 8.8 Hz, H-d), 8.47 (s, 1H, -NH). <13>C NMR (151 MHz Cloroformio-d): ? 17.1 (-CH(CH3)2), 23.2 (-CH(CH3)2), 27.4 (Ar-CH3), 72.6 (-OCH2Ph), 91.2 (C-f), 112.8 (C-b), 117.0, 119.1 (C-d), 120.2, 122.0, 122.1, 126.4, 127.5, 128.6, 128.9, 129.2, 129.4, 129.6, 133.6, 135.4, 138.8, 143.0 (C-e), 148.8 (C-s)*, 159.0 (C-v)*, 161.2 (C-g)**, 162.3 (C-h)**; IR (KBr) ? (cm<-1>): 3392, 3045, 2970, 1652, 1636, 1597, 1533, 1486, 1456, 1407, 1360, 1290, 1223, 1146, 1129, 1007, 911; MS (ESI) 492 (M+1).

2-(Benziloxi)-N-(2-isopropil-5-metil-4-(4-(trifluorometil)fenoxi)fenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (73). Ottenuta da 40, usando l?anilina 83. Cromatografia flash (eluente petroletere/ EtOAc 85 / 15 v/v). Solido bianco (186.2 - 187.3 ?C da diisopropiletere). Resa 95 %.

<1>H NMR (600 MHz Cloroformio-d): ? 0.91 (d, 6H, J = 6.8 Hz, -CH(CH3)2), 2.14 (s, 3H, Ar-CH3), 2.73 (hept, 1H, J = 6.8 Hz, -CH(CH3)2), 5.56 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.82 (s, 1H, H-t), 6.87 ? 6.91 (m, 3H, protoni aromatici and H-b), 7.36 ? 7.46 (m, 4H, protoni aromatici), 7.49 ? 7.56 (m, 4H, protoni aromatici), 8.10 (s, 1H, H-q), 8.33 (d, 1H, J = 6.9 Hz, H-a ), 8.35 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.53 (s, 1H, -NH). <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 16.0 (Ar-CH3), 22.7 (-CH(CH3)2), 27.8 (-CH(CH3)2), 72.6 (-OCH2Ph), 91.0 (C-f), 112.9 (C-b), 115.9, 118.2 (C-d), 119.0, 123.8 (q, J = 33.2 Hz), 124.5 (q, J = 270.9, -CF3), 126.4, 127.2 (q, J = 3.7 Hz), 127.7, 128.4, 128.7, 129.0, 129.2, 129.3, 132.3, 135.5, 138.5, 143.2 (C-e), 149.2 (C-s), 161.4 (C-v)*, 161.5 (C-g)*, 162.4 (C-h)*; IR (KBr) ? (cm<-1>): 3403, 3084, 3043, 2976, 2891, 1655, 1638, 1613, 1578, 1543, 1511, 1501, 1477, 1446, 1401, 1360, 1330, 12090, 1240, 1215, 1148, 1120, 1064, 1042, 994; MS (ESI) 560 (M+1).

2-(Benziloxi)-N-(1H-indol-5-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (74). Ottenuta da 40 usando l?anilina 84. Cromatografia flash, eluente: petroletere/ EtOAc 60 / 40 v/v). Solido bianco (m.p. 133.6 ? 135.9 ?C; da triturazione con diisopropiletere). Resa 74 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 5.60 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.38 (s, 1H, protoni aromatici), 7.03 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 7.11 (dd, 1H, J = 8.6, 1.6 Hz, protoni aromatici), 7.30 ? 7.34 (m, 2H, protoni aromatici), 7.41 (t, 1H, J = 7.4 Hz, H-c), 7.47 (t, 2H, J = 7.5 Hz, protoni aromatici), 7.50 ? 7.54 (m, 2H, protoni aromatici), 7.65 (d, 2H, J = 7.4 Hz, protoni aromatici), 7.88 (s, 1H, protoni aromatici), 8.13 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.69 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.82 (s, 1H, -NH), 11.03 (s, 1H, -NH indole).

<13>C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 71.5 (-OCH2Ph), 90.4 (C-f), 101.1, 110.6, 111.4, 113.1 (C-b), 114.8, 117.5 (C-d), 126.1, 127.6, 128.1, 128.2, 128.5, 128.7, 129.4, 130.6, 132.8, 136.3, 141.9 (C-e), 160.0 (C-g)*, 161.6 (C-h)*. MS (ESI) 505 (M+1).

2-(Benziloxi)-N-(1-fenil-1H-indol-5-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (75). Ottenuta da 40 usando l?anilina 85. Cromatografia flash, eluente: petroletere/ EtOAc 60 / 40 v/v). Solido bianco (m.p. 133.6 ? 135.9 ?C; da triturazione con diisopropiletere) Resa 74 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 5.60 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.38 (s, 1H, protoni aromatici), 7.03 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 7.11 (dd, 1H, J = 8.6, 1.6 Hz, protoni aromatici), 7.30 ? 7.34 (m, 2H, protoni aromatici), 7.41 (t, 1H, J = 7.4 Hz, H-c), 7.47 (t, 2H, J = 7.5 Hz, protoni aromatici), 7.50 ? 7.54 (m, 2H, protoni aromatici), 7.65 (d, 2H, J = 7.4 Hz, protoni aromatici), 7.88 (s, 1H, protoni aromatici), 8.13 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.69 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.82 (s, 1H, -NH). <13>C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 71.5 (-OCH2Ph), 90.4 (C-f), 101.1, 110.6, 111.4, 113.1 (C-b), 114.8, 117.5 (C-d), 126.1, 127.6, 128.1, 128.2, 128.5, 128.7, 129.4, 130.6, 132.8, 136.3, 141.9 (C-e), 160.0 (C-g)*, 161.6 (C-h)*. MS (ESI) 505 (M+1).

2-(Benziloxi)-N-(1-fenil-1H-benzo[d]imidazol-5-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (76). Ottenuta da 40 usando l?anilina 86. Cromatografia flash, eluente: DCM / MeOH 95 / 5 v/v). Solido rosa pallido (m.p. 133.6 ? 135.9 ?C; da triturazione con diisopropiletere) Resa 67 %. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 5.29 (s, 1H, protoni aromatici), 5.59 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.87 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 7.35 ? 7.60 (m, 11H, protoni aromatici), 7.63 (d, 1H, J = 8.7 Hz, protoni aromatici), 7.94 (s, 1H, protoni aromatici), 8.10 (s, 1H, protoni aromatici), 8.31 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.35 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.84 (s, 1H, -NH). <13>C-NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 72.3 (-OCH2Ph), 91.1 (C-f), 110.5, 111.4, 112.9 (C-b), 117.6, 119.0 (C-d), 124.0, 127.6, 128.1, 128.3, 128.7, 129.0, 129.1, 130.2, 130.4, 134.5, 135.9, 136.5, 142.9, 143.0 (C-e), 144.5, 161.4 (C-g)*, 162.3 (C-h)*. MS (ESI) 505 (M+1).

2-(Benziloxi)-N-(1-fenil-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-5-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (77). Ottenuta da 40 usando l?anilina 87. Cromatografia flash, eluente: DCM / MeOH 95 / 5 v/v). Solido rosa pallido (m.p. 133.6 ? 135.9 ?C; da triturazione con diisopropiletere) Resa 90 %. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 5.61 (s, 2H, -OCH2Ph), 7.06 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 7.40 (t, 1H, J = 7.3 Hz, H-c), 7.47 (t, 2H, J = 7.5 Hz, protoni aromatici), 7.53 ? 7.72 (m, 7H, protoni aromatici), 7.85 ? 7.92 (m, 3H, protoni aromatici), 8.12 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.59 (s, 1H, protoni aromatici), 8.70 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 9.23 (s, 1H, -NH). <13>C-NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 71.5 (-OCH2Ph), 90.0 (C-f), 107.6, 111.3(C-b), 113.5, 117.4 (C-d),, 122.5, 128.1, 128.4, 128.5, 128.6, 128.7, 128.8, 129.6, 130.1, 135.8, 136.3, 136.4, 142.0 (C-e), 146.3, 160.6 (C-g)*, 161.9 (C-h)*. MS (ESI) 505 (M+1).

Procedura generale di idrogenazione per ottenere i composti 19 ? 24, 28 ? 30, e 37. Palladio al 10% su carbonio (Pd / C, 45 mg) ? stato aggiunto a una soluzione dell'ammide appropriata (composti 68-77, 0,300 mmol) in THF anidro (15 mL). La miscela risultante ? stata agitata vigorosamente sotto un'atmosfera di idrogeno per 3 ore. La sospensione ? stata filtrata attraverso Celite e il lettino ottenuto ? stato lavato con metanolo. Il filtrato ? stato concentrato a pressione ridotta. Quando necessario, il solido ottenuto ? stato ulteriormente purificato mediante cromatografia flash.

2-idroxi-N-(1H-indol-5-il)pirazolo[1,5-a]piridine-3-carboxamide (19). Obtained from 74. Cromatografia flasheluente: dichloromethane / methanol 95 / 5 v/v). Solido bianco (m.p. 133.6 ? 135.9 ?C; da triturazione con diisopropiletere). Resa 74 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 6.39 (s, 1H, protoni aromatici), 6.95 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.24 (dd, 1H, J = 8.6, 1.1 Hz, protoni aromatici), 7.27 ? 7.38 (m, 2H, protoni aromatici), 7.44 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 7.97 (d, 1H, J = 1.9 Hz, protoni aromatici), 8.07 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.55 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 9.03 (s, 1H, -NH), 11.02 (s, 1H, -NH indole), 18.84 (v br s, 1H, -OH) . <13>C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 89.6 (C-f), 101.1, 110.6, 111.4, 112.5 (C-b), 115.0, 117.1 (C-d), 126.0, 127.3 (C-c), 127.7, 128.3, 130.8 (C-a), 132.7, 141.4 (C-e), 160.8 (C-g)*, 162.1 (C-h)*. MS (ESI) 293 (M+1).

2-Idroxi-N-(1-fenil-1H-indol-5-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (20). Ottenuto da 75. Cromatografia flash, eluente: DCM / methanol 95 / 5 v/v). Solido bianco (m.p. 133.6 ? 135.9 ?C; da triturazione con diisopropiletere). Resa 90 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 6.68 (d, 1H, J = 3.0 Hz, protoni aromatici), 6.96 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.32 ? 7.42 (m, 2H, protoni aromatici), 7.45 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 7.49 ? 7.62 (m, 5H, protoni aromatici), 7.65 (d, 1H, J = 3.1 Hz, protoni aromatici), 8.08 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.13 (s, 1H, protoni aromatici), 8.56 (d, 1H, J = 6.7 Hz, H-a), 9.15 (s, 1H, -NH), 12.95 (s, 1H, -OH). <13>C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 89.6 (C-f), 103.6, 110.5, 111.2, 112.6 (C-b), 115.9, 117.0 (C-d), 123.5, 126.3, 127.4 (C-c), 128.9, 129.0, 129.3 (C-a), 129.9, 131.7, 132.2, 139.2, 141.4 (C-e), 160.9, 162.2. MS (ESI) 369 (M+1).

2-Idroxi-N-(1-fenil-1H-benzo[d]imidazol-5-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (21). Ottenuto da 76. Cromatografia flash, eluente: DCM / MeOH 80 / 20 v/v). Solido rosa pallido (m.p. 133.6 ? 135.9 ?C; da triturazione con diisopropiletere). Resa 90 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 6.87 (t, 1H, J = 6.5 Hz, H-b), 7.37 (t, 1H, J = 7.7 Hz, H-c), 7.46 ? 7.54 (m, 2H, protoni aromatici), 7.57 (d, 1H, J = 8.6 Hz, protoni aromatici), 7.63 (t, 2H, J = 7.8 Hz, protoni aromatici), 7.69 (d, 2H, J = 7.7 Hz, protoni aromatici), 8.00 (d, 1H, J = 8.6 Hz, H-d), 8.32 (s, 1H, protoni aromatici), 8.48 (d, 1H, J = 6.4 Hz, H-a), 8.54 (s, 1H, protoni aromatici), 9.99 (s, 1H, -NH). <13>C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 89.6 (C-f), 109.8, 110.6, 111.8, 116.4 (C-b), 116.5, 123.4, 126.7, 127.6 (C-c), 128.4, 128.9, 130.1 134.8, 136.1, 141.4 (C-e), 141.5, 143.6, 144.2, 161.9. MS (ESI) 368 (M-1).

2-Idroxi-N-(1-fenil-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-5-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (22). Ottenuto da 77. Cromatografia flash, eluente: DCM / MeOH 95 / 5 v/v). Solido grigio (m.p. 133.6 ? 135.9 ?C; da triturazione con diisopropiletere). Resa 72 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 6.85 (t, 1H, J = 6.6 Hz, H-b), 7.35 (t, 1H, J = 7.7 Hz, H-c), 7.58 (t, 1H, J = 7.5 Hz, protoni aromatici), 7.70 (t, 2H, J = 7.9 Hz, protoni aromatici), 7.78 (d, 1H, J = 8.1 Hz, protoni aromatici), 7.84 ? 7.91 (m, 3H, protoni aromatici), 7.95 (d, 1H, J = 8.6 Hz, H-d), 8.44 (d, 1H, J = 6.6 Hz, H-a), 8.71 (s, 1H, protoni aromatici), 10.53 (s, 1H, -NH). <13>C-NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 89.5 (C-f), 106.8, 111.1 (C-b), 111.7, 116.1 (C-d), 122.5, 122.7, 126.6, 128.0, 128.3, 128.7, 130.1, 136.5, 136.8, 137.6, 141.5 (C-e), 146.5, 162.5. MS (ESI) 369 (M-1).

2-Idroxi-N-(5-fenoxipiridin-2-il)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (23). Ottenuto da 68, Cromatografia flash(eluente: DCM / methanol 90 / 10 v/v). Solido bianco (m.p. 161.1 ? 161.9 ?C dec.; da triturazione con diisopropiletere). Resa 76 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 6.75 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 6.97 (d, 1H, J = 8.7 Hz, protoni aromatici), 7.08 (d, 2H, J = 8.0 Hz, protoni aromatici), 7.16 (t, 1H, J = 7.4 Hz, protoni aromatici), 7.26 (t, 1H, J = 7.8 Hz, protoni aromatici) 7.39 (t, 2H, J = 7.8 Hz, protoni aromatici), 7.83 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 8.21 (dd, 1H, J = 8.8, 2.5 Hz, protoni aromatici), 8.33 (d, 1H, J = 6.6 Hz, H-a), 8.48 (d, 1H, J = 2.2 Hz, protoni aromatici), 10.78 (s, 1H, -NH). <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 89.3 (C-f), 111.1 (C-b), 111.7, 115.6 (C-d), 120.2, 123.9, 125.9 (C-c), 127.9, 129.7, 131.1 (C-a), 132.9, 137.8, 141.4 (C-e), 154.9, 157.6 (C-g), 162.8 (C-h). MS (ESI) 345 (M-1). IR (KBr) v (cm<-1>): 3061, 1653, 1636, 1534, 1476, 1379, 1248, 1205, 1124, 1023.

2-Idroxi-N-5-[3-(trifluorometil)fenoxi]piridin-2-ilpirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (24). Ottenuto da 69, Cromatografia flash (eluente: DCM / methanol 90 / 10 v/v). Solido bianco (m.p. 241.2 ? 242.0 ?C dec.; da triturazione con diisopropiletere). Resa 45 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 6.59 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.10 (t, 1H, J = 7.7 Hz, H-c), 7.26 ? 7.34 (m, 2H, protoni aromatici), 7.46 (d, 1H, J = 7.6 Hz, protoni aromatici), 7.55 (dd, 1H, J = 9.0, 2.8 Hz, protoni aromatici), 7.61 (t, 1H, J = 8.0 Hz, protoni aromatici), 7.65 (d, 1H, J = 8.4 Hz, protoni aromatici), 8.12 (d, 1H, J = 2.8 Hz, protoni aromatici), 8.14 (d, 1H, J = 6.5 Hz, H-a), 8.40 (d, 1H, J = 9.0 Hz, H-d), 12.48 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 89.0 (C-f), 109.8, 113.6 (q, J = 4.0 Hz), 114.3, 119.4 (q, J = 3.4 Hz), 120.9, 123.8 (q, J = 272.0 Hz, -CF3), 124.4, 127.0, 129.9, 130.7 (q, J = 32.1 Hz), 131.5, 140.1, 140.8, 141.7, 146.0, 150.7, 158.4, 163.9, 173.1. MS (ESI) 413 (M-1). IR (KBr) v (cm<-1>): 3328, 2925, 1653, 1636, 1559, 1448, 1328, 1284, 1241, 1173, 1129, 1065.

2-Idroxi-N-(2-metil-4-(ptoliloxi)fenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (28). Ottenuto da 70, Cromatografia flash (eluente: DCM / methanol 90 / 10 v / v). Solido bianco (m.p.

238.3 ? 239.9 ?C da triturazione con diisopropiletere). Resa 87 %. <1>H NMR (600 MHz DMSO-d6): ? 2.28 (s, 3H, Ar-CH3), 6.88 (dd, 1H, J = 8.8, 2.6 Hz, H-r), 6.94 ? 7.01 (m, 4H, protoni aromatici), 7.09 (t, 1H, J = 7.3 Hz, H-b), 7.37 (t, 2H, J = 7.9 Hz, protoni aromatici), 7.47 (t, 1H, J = 7.9, H-c), 8.06 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-q), 8.20 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.57 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.93 (s, 1H, -NH), 12.99 (v br s, 1H, -OH).

<13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 17.6 (Ar-CH3), 89.5 (C-f), 112.9 (C-b), 117.0, 117.1 (C-d), 117.9, 121.0, 122.2, 122.9, 127.8 (C-c), 129.0 (C-a), 129.2, 130.0, 133.1, 141.5 (C-e), 151.6 (C-s), 157.5 (C-v), 160.8 (C-g)*, 162.1 (C-h)*; IR (KBr) ? (cm-1): 3388, 3039, 2567, 1664, 1633, 1590, 1549, 1485, 1445, 1413, 1380, 1333, 1307, 1273, 1245, 1227, 1173, 1134; MS (ESI) 360 (M+1).

2-Idroxi-N-(2-ispropil-5-metil-4-fenoxifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (29). Ottenuto da 71, Cromatografia flash (eluente: DCM / methanol 98 / 2 v/v). Solido bianco (m.p.

244.2 ? 247.9 ?C dec.; da triturazione con diisopropiletere). Resa 91 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 1.17 (d, 6H, J = 6.8 Hz, -CH(CH3)2), 2.10 (s, 3H, Ar-CH3), 3.10 (hept, 1H, J = 6.8 Hz, -CH(CH3)2), 6.85 (d, 2H, J = 8.1 Hz, protoni aromatici), 6.89 (s, 1H, H-t), 6.98 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 7.03 (t, 1H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.33 (t, 2H, J = 7.9 Hz, protoni aromatici), 7.47 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 8.00 (s, 1H, H-q), 8.06 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.57 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.98 (s, 1H, -NH), 12.95 (v br s, 1H, -OH). <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 15.7 (Ar-CH3), 22.6 (-CH(CH3)2), 27.4 (-CH(CH3)2), 89.4 (C-f), 112.9 (C-b), 116.0, 117.1 (C-d), 117.5, 122.0, 125.7, 127.0, 127.8 (C-c), 129.0 (C-a), 129.9, 131.9, 138.0, 141.5 (C-e), 149.5, 158.0 (C-v), 161.0 (C-h)*, 162.1 (C-g)*. IR (KBr) v (cm <-1>): 3400, 2964, 2579, 1661, 1637, 1547,1492, 1446, 1404, 1332, 1228, 1185, 1130, 887; MS (ESI) 402 (M+1).

2-Idroxi-N-(5-isopropil-2-metil-4-fenoxifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (30). Ottenuto da 72, Cromatografia flash (eluente: DCM / methanol 95 / 5 v/v). Solido bianco (m.p.

273.9 ? 276.5 ?C dec.; da triturazione con diisopropiletere). Resa 70%. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) ? 1.16 (d, 6H, J = 6.8 Hz, -CH(CH3)2), 2.23 (s, 3H, Ar-CH3), 3.09 (hept, 1H, J = 6.8 Hz, -CH(CH3)2), 6.82 (s, 1H, H-t), 6.87 (d, 2H, J = 8.0 Hz, protoni aromatici), 7.98 (t, 1H, J = 6.6 Hz, H-b), 7.03 (t, 1H, J = 7.2 Hz, protoni aromatici), 7.33 (t, 2H, J = 7.7 Hz, protoni aromatici), 7.47 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 8.10 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 8.31 (s, 1H, H-q), 8.58 (d, 1H, J = 6.6 Hz, H-a), 8.98 (s, 1H, -NH), 13.01 (v br s, 1H, -OH). <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 17.0 (-CH(CH3)2), 23.0 (-CH(CH3)2), 26.6 (Ar-CH3), 89.5 (C-f), 112.9 8 (C-b), 116.4, 117.1 (C-d), 119.1, 122.1, 122.2, 126.2, 127.7 (C-c), 129.0 (C-a), 129.9, 134.2, 137.6, 141.5 (C-e), 147.5, 158.5, 160.8 (C-g)*, 162.1 (C-h)*. IR (KBr) v (cm <-1>): 3393, 2961, 2578, 1659, 1636, 1548, 1486, 1446, 1407, 1333, 1217, 1160, 1126, 1042, 978; MS (ESI) 402 (M+1).

2-Idroxi-N-(2-isopropil-5-metil-4-(4-(trifluorometil)fenoxi)fenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (37). Ottenuto da 73, Cromatografia flash (eluente: DCM / methanol 95 / 5 v/v). Solido bianco (m.p. 249.2 ? 249.9 ?C da triturazione con diisopropiletere). Resa 98 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 1.20 (d, 6H, J = 6.7 Hz, -CH(CH3)2), 2.08 (s, 3H, Ar-CH3), 3.08 ? 3.16 (m, 1H, -CH(CH3)2), 6.95 ? 7.03 (m, 4H, protoni aromatici, H-t and H-b), 7.48 (t, 1H J = 7.8 Hz, H-c), 7.70 (d, 2H J = 8.6 Hz, protoni aromatici), 8.07 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.10 (s, 1H, H-q), 8.58 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 9.05 (s, 1H, -NH), 13.01 (v br s, 1H, -OH). <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 15.6 (Ar-CH3), 22.6 (CH(CH3)2), 27.4 (CH(CH3)2), 89.4 (C-f), 112.9 (C-b), 115.9, 117.0 (C-d), 118.2, 122.4 (q, J = 33.1 Hz), 124.4 (q, J = 271.1 Hz, -CF3), 125.5, 127.1, 127.5 (q, J = 3.7 Hz), 127.8 (C-c), 129.0 (C-a), 132.8, 138.1, 141.6 (C-e), 148.1 (C-s), 161.0 (C-v), 161.1 (C-g), 162.1 (C-h); IR (KBr) ? (cm<-1>): 3402, 2948, 2576, 1665, 1640, 1615, 1550, 1515, 1482, 1446, 1404, 1334, 1250, 1214, 1183, 1156, 114, 1103; MS (ESI) 470 (M+1).

N-(2,5-dimetil-4-(piridin-4-iltio)fenil)-2-((4-metoxibenzil)oxi)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (88). Il cloruro di ossalile (201 ?L, 2,35 mmol, 3,6 eq.) e la DMF anidra (7 ?L) sono stati aggiunti a una soluzione raffreddata (0 ? C) di 52 (0,783 mmol, 1,2 eq.) In THF anidro (15 mL), sotto un'atmosfera di azoto. La miscela di reazione ? stata agitata per 2 ore a temperatura ambiente in atmosfera di azoto. La soluzione ? stata concentrata a pressione ridotta e il residuo ? stato sciolto in THF anidro (10 mL), questo passaggio ? stato ripetuto tre volte. Una soluzione di anilina 95 (0,652 mmol, 1 eq.) e piridina anidra (2,347 mmol, 3,6 eq.) in toluene anidro (5 mL) ? stata aggiunta alla soluzione di cloruro acilico sotto atmosfera di azoto. A causa della parziale insolubilit? di 95 nel toluene anidro, sono stati aggiunti 5 mL di THF anidro. La miscela risultante ? stata agitata a temperatura ambiente per 12 ore, quindi a 70 ? C per una notte. La miscela ? stata quindi spenta con 0,5 M di HC1 (25 mL). Le fasi sono state separate, la fase acquosa ? stata ulteriormente estratta con EtOAc (3 x 50 mL), gli estratti organici riuniti sono stati essiccati ed evaporati a pressione ridotta. Il materiale grezzo ? stato purificato utilizzando cromatografia flash (eluente: da petroletere / EtOAc 70:30 v / v a DCM / metanolo 80:20 v / v) per fornire il composto del titolo come solido marrone. Resa 80 %. <1>H-NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 1.77 (s, 3H, Ar-CH3), 2.34 (s, 3H, Ar-CH3), 3.84 (s, 3H, -OCH3), 5.48 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.81 (d, 2H, J = 5.7 Hz, protoni aromatici), 6.90 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 6.94 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H-n), 7.24 (s, 1H, protoni aromatici), 7.40 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.47 (d, 2H, J = 8.4 Hz, protoni aromatici), 8.28 (d, 2H, J = 5.5 Hz, protoni aromatici); 8.31 - 8.36 (m, 2H, protoni aromatici), 8.51 (s, 1H, protoni aromatici), 8.62 (s, 1H, -NH); <13>C-NMR (151 MHz Cloroformio-d): ? 16.8 (Ar-CH3), 20.7 (Ar-CH3), 55.5 (-OCH2Ph), 72.6 (-OCH2Ph), 91.1 (C-f), 113.1 (C-b), 114.3, 118.9 (C-d), 120.1, 121.0, 122.5, 125.3, 127.4, 127.9 (C-a), 128.8 (C-c), 131.4, 138.5, 139.4, 141.9, 143.1 (C-e), 149.4, 150.9, 160.5, 161.4, 162.4; MS (ESI) 511 (M+1).

Procedura generale per la sintesi delle ammidi pyrazolo[1,5-a]pyridiniche 89 ? 94. Il cloruro di ossalile (1,75 mL, 1,5 mmol) e la DMF anidra (10 ?L) sono stati aggiunti a una soluzione raffreddata (0 ? C) di 52 (1,2 mmol) in THF anidro (15 mL), mantenuta sotto un'atmosfera di azoto. La miscela di reazione ? stata agitata per 2 ore a temperatura ambiente in atmosfera di azoto. La soluzione ? stata concentrata a pressione ridotta e il residuo ? stato sciolto in THF anidro (10 mL), questo passaggio ? stato ripetuto tre volte. Ad una soluzione dell'appropriata anilina (96-101, 1.00 mmol) e piridina anidra (3.6 mmol) in toluene anidro (5 mL), ? stata aggiunta la soluzione del cloruro acilico in toluene anidro (10 mL), conservata sotto atmosfera di azoto. La miscela risultante ? stata agitata a riflusso durante la notte, quindi spenta con 0,5 M di HC1 (25 mL). Le fasi sono state separate, la fase acquosa ? stata ulteriormente estratta con acetato di etile (3 x 50 mL) e le fasi organiche riunite sono state essiccate ed evaporate a pressione ridotta. Il materiale grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash.

2-(Benziloxi)-N-(2-isopropoxi-5-metil-4-fenoxifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (89). Ottenuto da 52, usando l? anilina 96. Il prodotto grezzo fu purificato con cromatografia flash(eluente: from petroleum ether/EtOAc 85:15 v/v) Solido appiccicoso. Resa 90 %.<1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 1.12 (d, 6H, J = 6.1 Hz, -CH(CH3)2), 2.17 (s, 3H, Ar-CH3), 4.36 (h, 1H, J = 6.1 Hz, -CH(CH3)2), 5.67 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.55 (s, 1H, H-t), 6.83 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 6.88 (d, 2H, J = 8.1 Hz, H-n), 7.0 (t, 1H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.25 ? 7.41 (m, 6H, protoni aromatici), 7.53 (d, 2H, J = 7.5 Hz, protoni aromatici), 8.26 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.35 (d, 1H, J = 8.9 Hz, H-d), 8.48 (s, 1H, H-q), 9.20 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 15.8 (Ar-CH3), 21.9 (-CH(CH3)2), 71.5 (-CH(CH3)2), 71.6 (-OCH2Ph), 91.6 (C-f), 106.7, 112.7 (C-b), 116.2, 119.0 (C-d), 121.8, 122.5, 122.9, 126.3, 127.4, 127.9, 128.4, 128.6, 128.8, 129.7, 136.4, 143.2 (C-e), 145.7, 148.6, 158.8, 161.3, 162.3. MS (ESI) 538 (M-1).

N-(2-Ciclobutoxi-5-metil-4-fenoxifenil)-2-((4-metoxibenzil)oxi)pirazolo[1,5-a]piridin-3carboxamide (90). Ottenuto da 52 usando l?anilina 97. Il prodotto grezzo fu purificato con cromatografia flash (eluente: petroletere/ EtOAc 85:15 v/v) Solido appiccicoso. Resa 79 %.<1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 1.46 ? 1.56 (m, 1H, ciclobutoxi proton), 1.59 ? 1.68 (m, 1H, ciclobutoxi proton), 1.80 ? 1.91 (m, 2H, ciclobutoxi proton), 2.15 (s, 3H, Ar-CH3), 2.18 ? 2.25 (m, 2H, ciclobutoxi proton), 3.80 (s, 3H, -OCH3), 4.46 (p, 1H, J = 7.1 Hz, ciclobutoxi proton), 5.58 (s 2H, -OCH2Ph), 6.38 (s, 1H, H-t), 6.84 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 6.87 (d, 2H, J = 8.0 Hz, protoni aromatici), 6.91 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H-n), 7.00 (t, 1H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.25 ? 7.30 (m, 2H, protoni aromatici), 7.35 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.49 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H-m), 8.28 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.34 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.44 (s, 1H, H-q), 9.16 (s, 1H, -NH);

<13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 13.1, 15.8, 30.5, 55.4, 71.6, 72.2 (-OCH2Ph), 91.6 (C-f), 105.6, 112.7 (C-b), 114.1, 116.3, 118.9 (C-d), 121.9, 122.3, 122.8, 125.3, 127.4, 128.4, 128.6, 129.7, 129.8, 143.1 (C-e), 145.4, 148.6, 158.6, 159.8, 161.3, 162.4. MS (ESI) 550 (M+1).

N-(2-(Sec-butoxi)-5-metil-4-fenoxifenil)-2-((4-metoxibenzil)oxi)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (91). Ottenuto da 52, usando l?anilina 98. Il prodotto grezzo fu purificator con cromatografia flash (eluente: petroletere/ EtOAc 85:15 v/v) Solido appiccicoso. Resa 94 %.<1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 0.85 (t, 3H, J = 7.5 Hz, -CHCH2CH3), 1.12 (d, 3H, J = 6.1 Hz, -CH3CHCH2CH3), 1.33 ? 1.60 (m, 2H, -CH3CHCH2CH3), 2.16 (s, 3H, Ar-CH3), 3.79 (s, 3H, -OCH3), 4.12 (h, 1H, J = 6.1 Hz, -CH3CHCH2CH3), 5.56 (d, 1H, J = 12.1 Hz, -OCH2Ph), 5.59 (d, 1H, J = 12.1 Hz, -OCH2Ph), 6.54 (s, 1H, H-t), 6.83 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 6.86 ? 6.92 (m, 4H, protoni aromatici), 7.0 (t, 1H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.25 ? 7.31 (m, 2H, protoni aromatici), 7.34 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.47 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-m), 8.27 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.34 (d, 1H, J = 8.9 Hz, H-d), 8.46 (s, 1H, H-q), 9.17 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 10.1 (-CH3CHCH2CH3) 15.8 (Ar-CH3), 19.3 (-CH3CHCH2CH3), 29.1 (-CH3CHCH2CH3), 55.4 (-OCH3), 71.5 (-CH3CHCH2CH3), 76.8 (-OCH2Ph), 91.6 (C-f), 106.7, 112.6 (C-b), 114.1, 116.2, 119.0 (C-d), 121.8, 122.4, 123.0, 126.3, 127.3, 128.4, 128.6, 129.7, 129.9, 143.2 (C-e), 146.0, 148.6, 158.8, 159.8, 161.4, 162.3. MS (ESI) 552 (M+1).

2-((4-Metoxibenzil)oxi)-N-(5-metil-2-(pentan-2-iloxi)-4-fenoxifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (92). Ottenuto da 52, usando l?anilina 99. Il prodotto grezzo fu purificato con cromatografia flash(eluente: petroleum ether/EtOAc 85:15 v/v). Solido appiccicoso. Resa 89%.<1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 0.82 (t, 3H, J = 6.9 Hz, -CH2CH2CH3), 1.11 (d, 2H, J = 6.0 Hz, -CH3CHCH2CH2CH3)1.21 ? 1.40 (m, 3H, --CH3CHCH2CH2CH3), 1.47 ? 1.57 (m, 1H, -CH3CHCH2CH2CH3), 2.16 (s, 3H, Ar-CH3), 3.79 (s, 3H, -OCH3), 4.16 ? 4.23 (m, 1H, -CH3CHCH2CH2CH3), 5.56 (d, 1H, J = 12.1 Hz, -OCH2Ph), 5.60 (d, 1H, J = 12.1 Hz, -OCH2Ph), 6.54 (s, 1H, H-t), 6.83 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 6.85 ? 6.92 (m, 4H, protoni aromatici), 7.0 (t, 1H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.24 ? 7.31 (m, 2H, protoni aromatici), 7.34 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.47 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-m), 8.27 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.34 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.47 (s, 1H, H-q), 9.17 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 14.1 (-CH3CHCH2CH2CH3) 15.8 (Ar-CH3), 18.9 (-CH3CHCH2CH2CH3), 19.8 (-CH3CHCH2CH2CH3), 38.4 (-CH3CHCH2CH2CH3), 55.4 (-OCH3), 71.5 (-OCH2Ph), 75.3 (-CH3CHCH2CH2CH3), 91.6 (C-f), 106.6, 112.6 (C-b), 114.1, 116.2, 118.9 (C-d), 121.8, 122.4, 122.9, 126.3, 127.3, 128.4, 128.6, 129.7, 129.8, 143.2 (C-e), 146.0, 148.6, 158.7, 159.8, 161.4, 162.3. MS (ESI) 566 (M+1).

2-((4-Metoxibenzil)oxi)-N-(5-metil-2-(pentan-3-iloxi)-4-fenoxifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (93). Ottenuto da 52 usando l?anilina 100. Il prodotto grezzo ottenuto fu purificator con cromatografia flash (eluente: petroletere/ EtOAc 85:15 v/v) Solido appiccicoso. Resa 61 %.<1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 0.84 (t, 6H, J = 7.4 Hz, -CHCH2CH3), 1.43 ? 1.54 (m, 4H, -CHCH2CH3), 2.15 (s, 3H, Ar-CH3), 3.79 (s, 3H, -OCH3), 3.97 (p, 1H, J = 5.8 Hz, -CHCH2CH3), 5.58 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.54 (s, 1H, H-t), 6.83 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 6.85 ? 6.92 (m, 4H, protoni aromatici), 7.0 (t, 1H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.25 ? 7.31 (m, 2H, protoni aromatici), 7.34 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.46 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H-m), 8.27 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.34 (d, 1H, J = 8.9 Hz, H-d), 8.47 (s, 1H, H-q), 9.20 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 9.8 (-CHCH2CH3) 15.8 (Ar-CH3), 26.3 (-CHCH2CH3), 55.4 (-OCH3), 71.5 (-OCH2Ph), 81.9 (-CHCH2CH3), 91.6 (C-f), 106.5, 112.6 (C-b), 114.1, 116.2, 119.0 (C-d), 121.8, 122.3, 122.9, 126.3, 127.3, 128.5, 128.6, 129.7, 129.8, 143.2 (C-e), 146.5, 148.5, 158.7, 159.8, 161.4, 162.3. MS (ESI) 566 (M+1).

N-(2-Isopropil-5-metil-4-(piridin-4-iloxi)fenil)-2-((4-metoxibenzil)oxi)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (94). Ossalil cloruro (198 ?L, 2,23 mmol, 3,6 eq.) e DMF anidra (7 ?L), sono stati aggiunti a una soluzione raffreddata (0 ? C) di 52 (0,743 mmol, 1,2 eq.), in THF anidro (15 mL ) mantenuto in atmosfera di azoto. La miscela di reazione ? stata agitata per 2 ore a temperatura ambiente in atmosfera di azoto. La soluzione ? stata concentrata a pressione ridotta e il residuo ? stato sciolto in THF anidro (10 mL, questo passaggio ? stato ripetuto tre volte). Il cloruro acilico risultante ? stato sciolto in toluene anidro (10 mL). Una soluzione di anilina 101 (0,619 mmol, 1 eq.) e piridina anidra (2,228 mmol, 3,6 eq.), In toluene anidro (5 mL), ? stata aggiunta alla soluzione di cloruro acilico in atmosfera di azoto. La miscela risultante ? stata agitata a temperatura ambiente per una notte. La miscela ? stata spenta in acqua (80 mL) e parzialmente concentrata sotto pressione ridotta. La fase acquosa ? stata estratta con EtOAc (3 x 50 mL). Gli estratti organici riuniti sono stati essiccati ed evaporati a pressione ridotta. Il materiale grezzo ? stato purificato utilizzando cromatografia flash (eluente: etere di petrolio / EtOAc 50:50 v / v) per ottenere il composto del titolo come solido marrone. Resa 80 %. <1>H NMR (600 MHz, Cloroformiod): ? 0.94 (d, 6H, J = 6.7 Hz, CH(CH3)2), 2.11 (s, 3H, -CH3), 2.70 (hept, 1H, J = 6.7 Hz, -CH(CH3)2), 3.82 (s, 3H, -OCH3), 5.49 (s, 2H, -OCH2Ph), 6.74 (d, 2H, J = 4.3 Hz, protoni aromatici), 6.83 (s, 1H, protoni aromatici), 6.88 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 6.95 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H-n), 7.38 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 7.47 (d 2H, J = 8.4 Hz, H-m), 8.13(s, 1H, protoni aromatici), 8.31 ? 8.36 (m, 2H, protoni aromatici), 8.41 (d, 2H, J = 4.7 Hz, protoni aromatici), 8.55 (s,1H, -NH). <13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 15.9 (Ar-CH3), 22.6 (-CH(CH3)2), 27.8 (-CH(CH3)2), 55.5 (-OCH3), 72.4 (-OCH2Ph), 91.0 (C-f), 111.3, 112.9 (C-b), 114.3, 118.3, 119.0 (C-d), 126.1, 127.6, 127.7 (C-a), 128.3, 128.7 (C-c), 131.1, 132.9, 138.3, 143.2 (C-e), 148.1, 151.4, 160.4, 161.6, 162.5, 165.2. MS (ESI) 523 (M+1).

Procedura generale per la sintesi dei composti 26, 31 - 36. Tioanisole (10.0 eq.) ? stato aggiunto a una soluzione della rispettiva ammide protetta 88 -94 (1,0 eq.) in TFA (4 mL). La miscela ? stata riscaldata a 70 ?C per 4 ore quindi raffreddata a t.a.. La miscela ? stata parzialmente concentrata, il grezzo ? stato ripreso con tampone fosfato pH = 5 ottenendo una sospensione che ? stata filtrata, il solido cos? ottenuto ? stato triturato con esano per ottenere il composti del titolo, in forma pura.

2-Idroxi-N-(2,5-dimetil-4-(piridin-4-iltio)fenil) pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (26). Solido bianco. Resa 80 %. <1>H-NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 2.31 (s, 3H, Ar-CH3), 2.32 (s, 3H, Ar-CH3), 7.02 (t, 1H, J = 6.9 Hz, H-b), 7.28 (d, 2H, J = 6.1 Hz, protoni aromatici), 7.48 ? 7.56 (m, 2H, protoni aromatici), 8.08 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d); 8.50 (d, 2H, J = 5.0 Hz, protoni aromatici), 8.58 ? 8.65 (m, 2H, protoni aromatici), 9.20 (s, 1H, -NH); <13>C-NMR (151 MHz DMSO-d6): ? 16.6 (Ar-CH3), 20.2 (Ar-CH3), 89.4 (C-f), 113.2 (C-b), 117.0, 118.1 (C-d), 120.8, 121.7, 125.5, 128.2 (C-a), 129.1 (C-c), 138.1, 140.2, 140.9, 141.6, 143.8 (C-e), 160.9, 162.2. MS (ESI) 389 (M-1).

2-Idroxi-N-(2-isopropoxi-5-metil-4-fenoxifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (31). Solido bianco. Resa 89 %.<1>H NMR (600 MHz, Cloroformio-d): ? 1.40 (d, 6H, J = 6.0 Hz, -CH(CH3)2), 2.19 (s, 3H, Ar-CH3), 4.51 (h, 1H, J = 6.0 Hz, -CH(CH3)2), 6.63 (s, 1H, H-t), 6.88 ? 6.92 (m, 3H, H-b and protoni aromatici), 7.0 (t, 1H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.30 (t, 2H, J = 7.9 Hz, protoni aromatici), 7.43 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 8.27 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.35 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.52 (s, 1H, H-q), 9.32 (s, 1H, -NH);

<13>C NMR (151 MHz, Cloroformio-d): ? 15.9 (Ar-CH3), 22.4 (-CH(CH3)2), 72.0 (-CH(CH3)2), 91.1 (C-f), 107.3, 113.2 (C-b), 116.3, 118.8 (C-d), 122.0, 122.5, 123.1, 126.6, 127.4, 128.2, 129.8, 136.4, 141.9 (C-e), 145.4, 148.7, 158.7, 161.4, 162.8. MS (ESI) 418 (M-1).

N-(2-ciclobutoxi-5-metil-4-fenoxifenil)-2-idroxipirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (32). Solido bianco. Resa 75 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSOd6): ? 1.55 ? 1.65 (m, 1H, ciclobutoxi proton), 1.73 ? 1.82 (m, 1H, ciclobutoxi proton), 2.00 ? 2.14 (m, 2H, ciclobutoxi proton), 2.06 (s, 3H, Ar-CH3), 2.30 ? 2.39 (m, 2H, ciclobutoxi proton), 4.70 (p, 1H, J = 7.0 Hz, ciclobutoxi proton), 6.53 (s, 1H, H-t), 6.85 (d, 2H, J = 8.1 Hz, protoni aromatici), 6.98 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 7.03 (t, 1H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.32 (t, 2H, J = 7.8 Hz, protoni aromatici), 7.47 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 8.09 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 8.46 (s, 1H, H-q), 8.58 (d, 1H, J = 6.7 Hz, H-a), 9.62 (s, 1H, -NH), 12.85 (br s, 1H, -OH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 12.7, 15.5, 29.8, 71.8, 89.7 (C-f), 105.9, 112.8 (C-b), 115.9, 117.0 (C-d), 120.8, 121.0, 122.0, 125.8, 127.7, 129.0, 129.9, 141.5 (C-e), 144.3, 147.4, 158.0, 160.6, 162.0. MS (ESI) 430 (M+1).

N-(2-(Sec-butoxi)-5-metil-4-fenoxifenil)-2-idroxipirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (33). Solido bianco. Resa 76 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 0.91 (t, 3H, J = 7.4 Hz, -CHCH2CH3), 1.22 (d, 3H, J = 6.0 Hz, -CH3CHCH2CH3), 1.56 ? 1.75 (m, 2H, -CH3CHCH2CH3), 2.06 (s, 3H, Ar-CH3), 4.36 (h, 1H, J = 5.8 Hz, -CH3CHCH2CH3), 6.73 (s, 1H, H-t), 6.85 (d, 2H, J = 8.1 Hz, protoni aromatici), 6.98 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H-b), 7.02 (t, 1H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.32 (t, 2H, J = 7.9 Hz, protoni aromatici), 7.34 (m, 1H, H-c), 8.09 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.47 (s, 1H, H-q), 8.57 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 9.63 (s, 1H, -NH), 12.79 (br s, 1H, -OH);

<13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 9.4 (-CH3CHCH2CH3) 15.5 (Ar-CH3), 18.9 (-CH3CHCH2CH3), 28.4 (-CH3CHCH2CH3), 76.1 (-CH3CHCH2CH3), 89.7 (C-f), 107.0, 112.8 (C-b), 115.8, 117.1 (C-d), 120.9, 121.1, 121.9, 126.8, 127.7, 129.0, 129.9, 141.5 (C-e), 144.9, 147.4, 158.1, 160.6, 162.0. MS (ESI) 432 (M+1).

2-Idroxi-N-(5-metil-2-(pentan-2-iloxi)-4-fenoxifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (34). Solido bianco. Resa 89%.<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 0.84 (t, 3H, J = 7.3 Hz, -CH2CH2CH3), 1.22 (d, 2H, J = 6.0 Hz, -CH3CHCH2CH2CH3), 1.27 ? 1.44 (m, 2H, -CH3CHCH2CH2CH3), 1.47 ? 1.57 (m, 1H, -CH3CHCH2CH2CH3), 1.63 ? 1.74 (m, 1H, -CH3CHCH2CH2CH3), 2.06 (s, 3H, Ar-CH3), 4.37 ? 4.43 (m, 1H, -CH3CHCH2CH2CH3), 6.72 (s, 1H, H-t), 6.85 (d, 2H, J = 8.1 Hz, protoni aromatici), 6.96 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.02 (t, 1H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.32 (t, 1H, J = 7.8 Hz, protoni aromatici), 7.45 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H-c), 8.08 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-d), 8.47 (s, 1H, H-q), 8.55 (d, 1H, J = 6.7 Hz, H-a), 9.71 (s, 1H, -NH), 12.84 (s, 1H, -OH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 13.9 (-CH3CHCH2CH2CH3) 15.5 (Ar-CH3), 18.1 (-CH3CHCH2CH2CH3), 19.4 (-CH3CHCH2CH2CH3), 37.8 (-CH3CHCH2CH2CH3), 74.9 (-CH3CHCH2CH2CH3), 89.7 (C-f), 106.9, 112.6 (C-b), 115.8, 116.9 (C-d), 120.9, 121.0, 121.9, 126.8, 127.5, 128.9, 129.9, 141.5 (C-e), 144.9, 147.4, 158.1, 160.7 MS (ESI) 446 (M+1).

2-Idroxi-N-(5-metil-2-(pentan-3-iloxi)-4-fenoxifenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (35). Solido bianco. Resa 30 %.<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 0.96 (t, 6H, J = 7.4 Hz, -CHCH2CH3), 1.70 ? 1.77 (m, 4H, -CHCH2CH3), 2.18 (s, 3H, Ar-CH3), 4.12 (p, 1H, J = 5.6 Hz, -CHCH2CH3), 6.59 (s, 1H, H-t), 6.89 (d, 2H, J = 8.1 Hz, protoni aromatici), 6.93 (t, 1H, J = 6.7 Hz, H-b), 7.02 (t, 1H, J = 7.3 Hz, protoni aromatici), 7.30 (t, 2H, J = 7.8 Hz, protoni aromatici), 7.47 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 8.27 ? 8.41 (m, 2H, H-a and H-d), 8.49 (s, 1H, H-q), 9.25 (s, 1H, -NH); <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 9.7 (-CHCH2CH3) 15.9 (Ar-CH3), 26.2 (-CHCH2CH3), 81.7 (-CHCH2CH3), 91.0 (C-f), 106.5, 113.4 (C-b), 116.3, 118.6 (C-d), 122.0, 122.5, 122.6, 126.1, 127.6, 128.6, 129.8, 141.7 (C-e), 146.0, 148.9, 153.2, 158.7, 161.4. MS (ESI) 446 (M+1).

2-Idroxi-N-(2-isopropil-5-metil-4-(piridin-4-iloxi)fenil)pirazolo[1,5-a]piridin-3-carboxamide (36). Solido bianco. Resa 74 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 1.22 (d, 6H, J = 6.8 Hz, CH(CH3)2), 2.01 (s, 3H, -CH3), 3.14 (hept, 1H, J = 6.8 Hz, -CH(CH3)2), 6.96 - 7.04 (m, 1H, H-b), 7.09 ? 7.16 (m, 3H, protoni aromatici), 7.49 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H-c), 8.07 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H-d), 8.18 (s, 1H, protoni aromatici), 8.59 (d, 1H, J = 6.8 Hz, H-a), 8.60 ? 8.70 (m, 2H, protoni aromatici), 9.10 (s,1H, -NH). <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 15.4 (Ar-CH3), 22.5 (-CH(CH3)2), 27.4 (-CH(CH3)2), 89.4 (C-f), 112.3, 112.9 (C-b), 117.0, 118.3 (C-d), 125.3 (C-a), 127.1, 127.9 (C-c), 129.0, 133.7, 138.1, 141.6, (C-e), 146.6, 146.7, 147.7, 161.0, 162.1. MS (ESI) 403 (M+1)

(E)-3-((2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil]-4-il)diazenil)pirazolo[1,5-a]piridin-2-ol (25) Una soluzione di NaNO2 (51 mg, 0,74 mmol.) in acqua (5 mL) ? stata aggiunta goccia a goccia a una soluzione raffreddata (0 ? C) di 2,3,5,6-tetrafluoro-[1,1'-bifenil]-4-ammina (150 mg, 0,62 mmol) in acido nitrico (1,55 mL); la miscela risultante ? stata agitata per 10 minuti. La soluzione risultante ? stata aggiunta goccia a goccia a una soluzione raffreddata di 102 (83 mg, 0,62 mmol) in acqua (5 ml) a pH ~ 10. La miscela risultante ? stata agitata per 5 minuti e si ? osservato un precipitato arancione. Il precipitato ? stato filtrato su buckner per fornire il composto del titolo come solido arancione (triturato con diisopropiletere). Resa 48 %. <1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6): ? 7.27 (t, 1H, J = 6.5 Hz, H-b), 7.50 ? 7.60 (m, 5H, protoni aromatici), 7.80 (t, 1H, J = 7.7 Hz, H-c), 8.19 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-d), 8.75 (d, 1H, J = 6.6 Hz, H-a), <13>C NMR (151 MHz, DMSO-d6): ? 117.0, 117.2, 118.4, 127.4, 129.1, 129.3, 129.9, 130.7, 130.75, 130.9, 133.3, 133.4, 140.3 (d, J = 246.5 Hz, CF), 144.2 (d, J = 244.3 Hz, CF), 164.0; MS (ESI) 403 (M+1)

Espressione e Purificazione della proteina. Le cellule BL21DE3 PyrD E. Coli sono state trasformate utilizzando il costrutto plasmidico pFN2A ? hDHODH (gentilmente fornito dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Farmaco, Universit? di Torino, Torino). Il vettore produce hDHODH come proteina di fusione con GST N-terminale. Le cellule sono state coltivate a 37 ?C in terreno LB con supplement di flavin mononucleotide 0,1 mM (Cayman Chemical). Dopo 20 ore di crescita, le cellule sono state indotte con 0,8 mM di isopropil-D-tiogalattopiranoside a 28 ?C per ulteriori 6 ore fino a un OD600 di 0,5-0,7. Il pellet di cellule derivante da 250 mL di coltura ? stato lisato in 20 mL di PBS (50 mM Na2HPO4, 50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl), con aggiunta di 24 mg di lisozima e 0,2% v / v di un cocktail di inibitori della proteasi, incubato per 30 min in ghiaccio e lisato per sonicazione (tempo totale di sonicazione: 8 minuti con cicli On / Off di 10" / 50"). E? stato aggiunto al lisato del Triton X-100, ad una concentrazione finale dell'1%, prima della centrifugazione a 14000 x g per 40 min a 4 ?C. Il surnatante incolore ? stato incubato con DNasiI per 30 minuti a temperatura ambiente, addizionato con ditiotreitolo 2 mM (DTT) e filtrato attraverso un filtro per siringa da 0,45 ?m come descritto in precedenza da Sainas et al. <6>. L'enzima con GST fuso ? stato purificato dal lisato batterico mediante cromatografia di affinit? su colonna contenente glutatione-sefarosio immobilizzati (GE-HiTrap Protein G HP 1 ml). Il tag GST non ? stato tagliato per le analisi successive. Tutti i reagenti utilizzati nell'espressione e nella purificazione delle proteine sono stati forniti da Merck / Sigma-Aldrich, se non diversamente specificato.

Saggio di inibizione di hDHODH. Il test di inibizione enzimatica ? stato ottimizzato per essere eseguito su una piastra da 96 pozzetti e per ottenere una maggiore produttivit?. Per ogni pozzetto della piastra ? stato utilizzato un volume totale di 200 ?L: 5 ?L di GST-hDHODH purificato; 60 ?L di 2,6-dicloroindofenolo (DCIP) 50 ?M; 20 ?L di coenzima Q10 100 ?M; 20 ?L di diidroorotato (DHO) 500 ?M; Tris-HCl pH8 fino a un volume finale di 200 ?L. L'attivit? inibitoria ? stata valutata monitorando la riduzione del DCIP, che ? associata all'ossidazione del diidroorotato catalizzata dall'enzima DHODH. L'enzima ? stato preincubato per 5 min a 37 ?C in Tris-HCl pH8 con coenzima Q10, con DCIP (50 ?M) e con i composti da testare utilizzati a diverse concentrazioni (concentrazione finale DMSO 0,1% v / v). La reazione ? stata avviata mediante l'aggiunta di DHO (500 ?M) e la riduzione cinetica dell'assorbanza ? stata monitorata a ? = 650 nm utilizzando un lettore multi-piastra (Tecan, M1000Pro). Per valutare i valori di riduzione di assorbanza minima e massima della reazione enzimatica, ? stato ottenuto un valore di controllo Min misurando l'assorbanza senza DHO. Allo stesso modo, un valore Max ? stato ottenuto misurando l'assorbanza con DHO, senza inibitore. ? stato inoltre eseguito un calcolo di eliminazione del bianco misurando i valori di assorbanza utilizzando 180 ?L di Tris-HCl e 20 ?L di coenzima Q10. Lo strumento ? stato impostato per leggere i valori di assorbanza ogni 10 secondi per un tempo di lettura totale di 10 minuti a 37 ?C. La velocit? iniziale ? stata misurata nei primi 5 min (? = 10400 M<?1 >cm<?1 >) ed ? stato calcolato un valore IC50, <16 >utilizzando il software GraphPad Prism 7. I valori sono presentati come medie ? SE di tre esperimenti indipendenti.

Analisi statistica. Le analisi statistiche sono state eseguite con il software Prism, versione 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). I dati sono riportati come medie ? DS. Il test t di Student a due code accoppiate ? stato eseguito per valutare le differenze tra i valori medi e un P <0,05 ? stato considerato significativo. Per la determinazione di EC50, ? stato applicato un modello di regressione non lineare.

ADME preliminare e caratterizzazione chimicofisica

Test di solubilit? a pH 7.4. La solubilit? ? stata analizzata sia in soluzione tampone fosfato salina (PBS: 12 mM con NaCl 137 mM e KCl 2.7 mM, pH 7.4), sia in PBS con DMSO (2% V / V). Ogni composto solido (1 mg), ? stato aggiunto a 1 ml di PBS o PBS / DMSO. I campioni sono stati agitati in un agitatore orbitale a 25 ?C per 24 ore. Queste sospensioni sono state filtrate attraverso un filtro PTFE da 0,45 ?m (VWR) e le soluzioni sono state analizzate cromatograficamente utilizzando uno strumento per cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UHPLC) Perkin Elmer, dotato di una colonna Phenomenex C18 a fase inversa (RP) (2,1x100 mm, dimensione delle particelle 1,7 ?m). Eluizione in gradiente: il rapporto tra gli eluenti A e B (0,1% di acido trifluoroacetico in acqua e 0,1% di acido trifluoroacetico in acetonitrile, rispettivamente) ? cambiato linearmente dal 60% A40% B allo 0% A-100% B in 12 minuti, seguito per 5 minuti in eluizione isocratica al 100% di eluente B e quindi per 4 minuti in eluizione di equilibrio per ripristinare le condizioni di partenza. La velocit? di flusso era di 0,5 mL / min. I volumi di iniezione standard erano 2 o 4 ?L per i composti scarsamente solubili. Il sistema di rilevamento era un rivelatore a serie di diodi Perkin Elmer. Le lunghezze d'onda che sono state monitorate per ciascun composto sono state definite in base allo spettro di assorbimento del composto. La solubilit?, espressa come concentrazione ?M della soluzione satura, ? stata calcolata tramite interpolazione con curve di calibrazione esterne ottenute con soluzioni di ciascun composto in acetonitrile.

Clog P e log D (pH 7.4). I valori di ClogP sono stati calcolati utilizzando il programma Bio-Loom per Windows, versione 1.5 (BioByte). I coefficienti di ripartizione tra n-ottanolo e PBS a pH 7,4 (log D<7.4>), sono stati ottenuti utilizzando la tecnica dello shake-flask a temperatura ambiente. Negli esperimenti di shake-flask, come fase acquosa ? stata usata una soluzione salina tamponata con fosfato 50 mM a pH 7,4. Le fasi organiche (nottanolo) e acquose sono state saturate reciprocamente mediante agitazione per 4 ore. I composti sono stati solubilizzati nella fase acquosa tamponata alla massima concentrazione compatibile con la solubilit? e sono state aggiunte quantit? appropriate di n-ottanolo. Le due fasi sono state agitate per circa 20 minuti, in quel momento era stato raggiunto l'equilibrio di partizione dei soluti, e quindi centrifugate (10000 rpm, 10 min). La concentrazione dei soluti ? stata misurata nella fase acquosa mediante spettrofotometro UV (Varian Cary 50BIO); i valori di assorbanza (registrati per ciascun composto alla lunghezza d'onda dell'assorbimento massimo) sono stati interpolati nelle curve di calibrazione ottenute utilizzando soluzioni standard dei composti (r<2>> 0,99). Ogni valore di log D ? una media di almeno sei misurazioni.

Legame con le proteine in vitro. La separazione dei farmaci liberi da quelli legati alle proteine ? stata ottenuta mediante ultrafiltrazione utilizzando sistemi a membrana disponibili in commercio (dispositivi di ultrafiltrazione a centrifuga con membrana YM-T ultracel, Merck). Una soluzione in DMSO del composto selezionato ? stata aggiunta al siero umano (sterile e filtrato da plasma umano maschile AB, Sigma-Aldrich), per ottenere la concentrazione finale desiderata con il 2% di co-solvente. 1 mL della soluzione ottenuta, inserito nel serbatoio del campione del dispositivo di ultrafiltrazione, ? stato delicatamente agitato in un agitatore orbitale a 37 ?C per 1 ora. La provetta ? stata quindi centrifugata a 1000 x g per 25 minuti. Le concentrazioni dei composti nell'ultrafiltrato e nel filtrato sono state determinate usando l?HPLC a fase inversa con le condizioni cromatografiche sopra descritte. La quantificazione dei composti nel filtrato ? stata eseguita utilizzando le curve di calibrazione dei composti ottenute da soluzioni standard (linearit? determinata in un intervallo di concentrazione di 1-100 ?M; r<2>> 0,99). La quantificazione dei composti nell'ultrafiltrato ? stata eseguita utilizzando curve di calibrazione ottenute con il metodo dell'addizione standard (linearit? determinata in un intervallo di concentrazione di 0-2,5 ?M; r<2>> 0,99). La capacit? di recupero del processo di ultrafiltrazione ? stata calcolata al fine di scoprire se un qualsiasi composto potesse essere stato perso durante l'ultrafiltrazione, considerando la limitata solubilit? dei composti testati.

Recupero = 100 x [(vol. legato x conc. legato) (vol. non legato x conc. non legato)] / vol. iniziale siero x conc. iniziale

vol. legato: calcolato dividendo il peso della frazione legata (differenza tra i pesi del serbatoio del campione dopo ultrafiltrazione e vuoto), per la sua densit? (0,991 g / mL valutata pesando cinque repliche di un volume noto di frazione legata).

vol. non legato: calcolato dividendo il peso della frazione non legata (differenza tra i pesi del recipiente dell?ultrafiltrato dopo dell'ultrafiltrazione e vuoto), per la sua densit? (0,999 g / mL valutata pesando cinque repliche di un volume noto di frazione non legata).

conc. legato: calcolato usando il metodo HPLC a fase inversa.

conc. non legato: calcolato usando il metodo HPLC a fase inversa (calibrazione con aggiunte standard)

Il recupero medio ? stato del 90% per tutti i composti testati.

Metodi virologici:

Virus Herpes Simplex di tipo 1 e 2 (HSV-1/2)

Cellule, condizioni di coltura e virus - Le cellule renali di scimmia verde africana (Vero) (ATCC CCL-81) sono state coltivate in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Euroclone) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS; Euroclone), 2 mM L-glutammina, piruvato di sodio 1 mM, penicillina 100 U / ml e solfato di streptomicina 100 mg / ml.

Gli isolati clinici di HSV-1 e HSV-2 sensibili all'aciclovir sono stati gentilmente forniti dal Dr. V. Ghisetti (Ospedale Amedeo di Savoia, Torino, Italia). HSV-1 e HSV-2 sono stati propagati e titolati mediante saggio di placca su cellule Vero come descritto in precedenza (Terlizzi et al., Antiviral Research 132, 154-164, 2016).

Saggio antivirale - Per determinare la vitalit? cellulare, le cellule Vero sono state esposte a concentrazioni crescenti di 17, 1 o Brequinar. Dopo 3 giorni di incubazione, il numero di cellule vitali ? stato determinato utilizzando il test di vitalit? cellulare luminescente Cell Titer Glo (R) (Promega).

Per valutare l'attivit? anti-HSV di 1, 17 o Brequinar mediante saggi di riduzione della placca (PRA), le cellule Vero sono state seminate in piastre da 24 pozzetti con una densit? di 70 x 10<3 >cellule. Dopo 24 ore, le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di 17, 1 o Brequinar un?ora prima dell'infezione e quindi infettate con HSV-1 o HSV-2 (50 PFU / pozzetto). Dopo l'adsorbimento del virus (2 ore a 37 ?C), le colture sono state mantenute in mezzo di coltura contenente metilcellulosa (Sigma) allo 0,8% pi? i composti. A 48 ore dopo l'infezione (h.p.i.), le cellule sono state fissate e colorate utilizzando etanolo al 20% e cristalvioletto all'1%. Le placche sono state conteggiate al microscopio e il numero medio di placche per ciascuna concentrazione espressa come percentuale della conta media di placche per il virus di controllo. Il numero di placche ? stato posto in grafico in funzione della concentrazione del farmaco; la concentrazione che produce una riduzione del 50% nella formazione della placca (EC50) ? stata determinata come descritto da Terlizzi et al. (Antiviral Research 132, 154-164, 2016).

Virus dell?influenza

Cellule, condizioni di coltura e virus - Le cellule Madin Darby Canine Kidney (MDCK, ATCC CCL-34TM) sono state propagate in DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS; Euroclone), L-glutammina 2 mM, piruvato di sodio 1 mM, 100 U / ml di penicillina e 100 ?g / ml di streptomicina solfato. Le infezioni sono state eseguite in presenza di 1 ?g / ml di tripsina TPCK trattata da pancreas bovino (Sigma-Aldrich) e 0,14% di albumina sierica bovina (Sigma-Aldrich). I ceppi del virus dell'influenza A / Puerto Rico / 8/34 (IAV) (VR-1469) e B B / Lee / 40 (IBV) (VR-101) sono stati ottenuti da ATCC. IAV e IBV sono stati coltivati e titolati mediante saggio di placca su cellule MDCK come descritto da Luganini et al., Front. Microbiol. 9: 1826, 2018.

Saggi antivirali - La citossicit? di 1 e Brequinar ? stata determinata sulle cellule MDCK dopo 72 ore di trattamento mediante il test di vitalit? cellulare luminescente (Promega) Cell Titer Glo (R).

L'attivit? antivirale di 1 e Brequinar ? stata determinata dal PRA. A tal fine, le cellule MDCK sono state seminate in piastre da 24 pozzetti (3 x 10<5 >cellule / pozzetto) e dopo 24 ore sono state esposte un?ora prima dell'infezione a concentrazioni crescenti di 1 o Brequinar e quindi infettate con IAV o IBV (40 PFU /bene). Dopo l'adsorbimento del virus (1 h a 37 ?C), le colture sono state incubate in un mezzo contenente lo 0,7% di Avicel (FMC BioPolymer) pi? 1 o Brequinar. A 48 ore dall'infezione (h p.i.), le cellule sono state fissate con una soluzione di formaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato 1X (PBS) per 1 ora a temperatura ambiente (RT) e colorate con una soluzione di cristalvioletto all'1%. Il conteggio microscopico delle placche ha quindi consentito di definire la EC50 (Luganini et al., Front. Microbiol. 9: 1826, 2018.

Virus respiratorio sinciziale (VRS)

Cellule, condizioni di coltura e virus - Le cellule HEp-2 (ATCC CCL-23) sono state mantenute in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Euroclone) integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS; Euroclone), 2 mM L-glutammina, 1 mM piruvato di sodio, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina solfato.

I ceppi di virus respiratorio sinciziale (RSV) A-Long (VR-26) e B-Washington (RSV-9320 VR-955) sono stati ottenuti da ATCC e propagati e titolati su cellule HEp-2 come descritto da Rameix-Welti et al. Nat. Commun. 5: 5104, 2014.

Saggi antivirali - I saggi di citossicit? di 1 e Brequinar sono stati eseguiti su cellule HEp-2 con il saggio di vitalit? cellulare luminescente (Promega) Cell Titer Glo (R) dopo 72 ore di incubazione con i composti.

L'attivit? antivirale di 1 e Brequinar ? stata determinata con PRA. In breve, le cellule HEp-2 sono state seminate in piastre da 24 pozzetti (3 x 10<5 >cellule / pozzetto) e dopo 24 ore sono state trattate con diverse concentrazioni di 1 o Brequinar un?ora prima dell'infezione e quindi infettate con RSV A o B ( 50 PFU / pozzetto). Dopo l'adsorbimento del virus (2 ore a 37 ?C), le colture sono state mantenute in terreno con metilcellulosa (Sigma) allo 0,3% pi? i composti. A 96 ore dopo l'infezione (h p.i.), le cellule sono state fissate e colorate utilizzando etanolo al 20% e cristalvioletto all'1%. Le placche sono state conteggiate al microscopio e il numero medio di placche per ciascuna concentrazione ? stato espresso come percentuale del numero medio di placche del virus di controllo. I numeri delle placche sono stati posti in grafico in funzione delle concentrazioni del composto e l'EC50 ? stata determinata come concentrazione del composto che produce una riduzione del 50% dei numeri delle placche.

SARS-CoV-2

Cellule, condizioni di coltura e virus - Le cellule Vero E6 (ATCC CRL-1586) sono state mantenute in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS), L-glutammina 2 mM, piruvato di sodio 1 mM, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina solfato. Il ceppo del virus SARS-CoV-2 2019-nCoV / Italy-INMI1 ? stato ottenuto dall'Istituto Nazionale Malattie Infettive ?Lazzaro Spallanzani?, propagato e titolato su cellule Vero E6.

Saggio antivirale - I test di citossicit? di 1 e Brequinar sono stati eseguiti su cellule Vero E6 mediante il test MTT dopo 72 ore di incubazione con i composti.

L'attivit? antivirale di 1 e Brequinar ? stata determinata mediante saggio di riduzione della Resa del virus (VRA). In breve, le cellule Vero E6 sono state seminate in piastre da 24 pozzetti e dopo 24 ore sono state trattate con diverse concentrazioni di 1 o Brequinar un?ora prima dell'infezione e quindi infettate con SARS-CoV-2 (50 PFU / pozzetto). Dopo l'adsorbimento del virus (2 ore a 37 ?C), le colture sono state mantenute in terreno contenente i composti. A 72 ore dall'infezione (h.p.i.), i surnatanti cellulari sono stati raccolti e la loro infettivit? ? stata titolata mediante analisi della placca su monostrati cellulari Vero E6. Le placche sono state contate microscopicamente a 72 h.p.i., e il numero medio di placche per ciascuna concentrazione espressa come percentuale del numero medio di placche per il virus di controllo. I numeri delle placche sono stati posti in grafico in funzione delle concentrazioni del composto e l'EC50 ? stata determinata come concentrazione del composto che produce una riduzione del 50% dell'infettivit? SARS-CoV-2.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composto scelto dal gruppo che consiste di: - composti di Formula (I):
Formula (I) - composti di Formula (II):
Formula (II) - composti di Formula (III):
Formula (III) - composti di Formula (IV):
Formula (IV) e - composti di Formula (V):
Formula (V) per l?uso come inibitore della replicazione virale, in cui: R1, R2, R4 e R5 nelle Formule (I), (II), (III), (IV) e (V) sono indipendentemente scelti fra un atomo di idrogeno, un atomo di alogeno, un gruppo C1- C4 alchile, un gruppo alchilossi, un gruppo alchiltio, un gruppo alo C1- C4 alchile, un gruppo alo C1- C4 alchilossi, un gruppo nitro, un gruppo ciano, un gruppo alchilammino; R3 nelle Formule (I), (II), (III), (IV) e (V) ? indipendentemente scelto fra un gruppo fenile, un gruppo eteroarile, un gruppo piridinile, un gruppo piperidinile, un gruppo fenossi, un gruppo piridinossi, un gruppo piperidinilossi, un gruppo feniltio, un gruppo azinile, un gruppo fenilsulfonile, un gruppo fenilsulfinile, un gruppo fenilsulfonilamino, un gruppo C1- C12 alchile, un gruppo alchilossi, un gruppo alchiltio, un gruppo alo C1-C12 alchile, e un gruppo alo C1- C12 alchlossi opzionalmente sostituiti; R7, R8 e R9 nelle Formule (I), (II), (III), (IV) e (V) sono indipendentemente scelti fra un atomo di idrogeno, un gruppo nitro, un gruppo ciano, un gruppo alo C1- C4 alchile, un gruppo tio C1- C4 alchile, un gruppo ammino C1- C4 alchile, un gruppo C1-C4 alchile, e un gruppo idrossi C1-C4 alchile; R6 nelle Formule (I), (II), (III), (IV) e (V) ? indipendentemente scelto fra un gruppo C1-C4 alchilossi, un atomo di alogeno, un gruppo acilossi, un gruppo monofosfato, un gruppo ossidrile, un gruppo tiolo, un gruppo ammino, o un sale da essi derivato; X, Y e Z nelle Formule (I), (II), (III), (IV) e (V) sono indipendentemente scelti fra un atomo di carbonio, un atomo di azoto, un atomo di ossigeno e un atomo di zolfo, con la condizione che quando uno fra X, Y o Z ? azoto, ossigeno o zolfo, gli altri due fra X, Y o Z sono atomi di carbonio; T nella Formula (I) ? un atomo di carbonio o un atomo di azoto, con la condizione che quando T ? un atomo di azoto, R5 nella Formula (I) non esiste; M nella Formula (IV) ? scelto fra un atomo di carbonio sp2, un atomo di azoto sp3, un atomo di azoto sp2, un gruppo carbonile e un gruppo sulfonile; Q nella Formula (IV) ? scelto fra un atomo di carbonio sp2, un gruppo carbonile, un gruppo tiocarbonile, un gruppo sulfonile, una catena alchile-C2-polialogenato, un gruppo carbonilamino, un gruppo aminocarbonile, un atomo di azoto sp2 e un atomo di azoto sp3, con le condizioni che quando M ? un atomo di carbonio sp2, Q ? un atomo di carbonio sp2; quando M ? un atomo di azoto sp3, Q ? scelto fra un gruppo carbonile, un gruppo tiocarbonile, un gruppo sulfonile, una catena alchilica-C2-polialogenato, un gruppo carbonilamino, un gruppo aminocarbonile; quando M ? un atomo di azoto sp2, Q ? un atomo di azoto sp2; quando M ? un gruppo carbonile o un gruppo sulfonile, Q ? un atomo di azoto sp3; Het nella Formula (V) ? scelto fra azoli, quali imidazolo, pirazolo, ossazolo, tiazolo, triazolo, ossadiazolo, tiadiazolo, e tetrazolo. 2. Composto per l?uso secondo la rivendicazione 1, che ? un composto di Formula (I) in cui X=Y=Z sono atomo di carbonio sp2 e R9 ? un protone. 3. Composto per l?uso secondo la rivendicazione 1, che ? un composto di Formula (II) in cui X=Y=Z sono atomi di di carbonio sp3 e R9 ? un protone. 4. Composto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui almeno uno fra R1, R2, R4 e R5 ? o contiene un atomo di alogeno, preferibilmente un atomo di fluoro. 5. Composto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui R6 ? OH o un monofosfato. 6. Composto per l?uso secondo la rivendicazione 1, scelto dal gruppo che consiste di:
7. Composto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui il virus ? un virus a DNA o RNA.
8. Composto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui il virus ? scelto dal gruppo che consiste di Herpesviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae e Coronaviridae.
9. Composto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui il virus ? scelto dal gruppo che consiste di Herpes simplex virus 1 (HSV-1), Herpes simplex virus 2 (HSV-2), virus dell'influenza A, virus dell'influenza B, virus respiratorio sinciziale (RSV), coronavirus 1 da sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-1), coronavirus 2 da sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2) e coronavirus della sindrome respiratoria mediorientale (MERS-CoV).
10. Composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, per l?uso nel trattamento terapeutico di una infezione da un virus patogeno in un soggetto.
11. Composto per l?uso secondo la rivendicazione 10, in cui il virus ? un virus a DNA o RNA.
12. Composto per l?uso secondo la rivendicazione 10, in cui il virus ? scelto dal gruppo che consiste di Herpesviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae e Coronaviridae.
13. Composto per l?uso secondo la rivendicazione 10, in cui il virus ? scelto dal gruppo che consiste di Herpes simplex virus 1 (HSV-1), Herpes simplex virus 2 (HSV-2), virus dell'influenza A, virus dell'influenza B, virus respiratorio sinciziale (RSV), coronavirus 1 da sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-1), coronavirus 2 da sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2) e coronavirus della sindrome respiratoria mediorientale (MERS-CoV).
14. Composizione farmaceutica per l?uso come antivirale, la composizione farmaceutica comprendendo un composto come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6 e un veicolo, eccipiente e/o diluente farmaceuticamente accettabile.