HUT76343A

HUT76343A - Sterol derivatives which applicable for regulation of meiosis

Info

Publication number: HUT76343A
Application number: HU9603584A
Authority: HU
Inventors: Claus Yding Andersen; Anne Grete Byskov; Ivan Verner Diers; Erling Guddal; Lars Nordholm; Henning Thogersen; Ole Wassmann
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1994-06-23
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 1997-08-28
Also published as: PL317830A1; DE69531682T2; FI965144A; IL114294A; DE69531682D1; ATE248852T1; RU2194510C2; IS4404A; CZ372596A3; CA2192941C; AU694240B2; CA2192941A1; BG101067A; BR9508074A; CN1151164A; JP3987105B2; EP0767798A1; MX9700174A; CZ289407B6; SI9520077A

Description

A meiózis a csírasejteknek az egyetlen és végső eseménye, amelyen az ivaros szaporodás alapul. A meiózis két meiotikus szakaszból áll. Az első szakaszban az anyai és az apai gének közötti cserére kerül sor mielőtt a kromoszóma párok két utód sejtté szétválnának. Ezek a sejtek feleannyi (In) kromoszómát és 2c DNS-t tartalmaznak. A meiózis második szakasza DNS szintézis nélkül zajlik. Ennek a szakasznak az eredményeként csupán le DNS-sel rendelkező fél kromoszóma számú csírasejtek képződnek.

A meiotikus folyamatok a férfi és női csírasejtekben hasonlóak, de az osztódás időbeosztása, üteme valamint a differenciálódási eljárások, amelyek a petesejthez és az ondósejthez vezetnek, meglehetősen különbözőek. Minden egyes női csírasejt már az élet korai szakaszában a meiózis első szakaszának elő fázisába lép, gyakran még a megszületés előtt; de a pubertáskort követő ovulációig valamennyi oocytaként megáll a fejlődésben, visszamarad a növekedésben a pro fázisban (dictyate állapot). Ennek megfelelően a korai életszakaszban a nők egy oocyta készlettel rendelkeznek, amelyből meríthetnek mindaddig, amíg a készlet el nem fogy. A női ivarsejtek meiózisa nem teljes, csak a megtermékenyítést követően és csak egyetlen petesejtben következik be és csírasejtenként két, a fejlődés kezdeti állapotába levő polár testet is eredményez. Ezzel szemben férfiaknál a pubertáskortól kezdve csak bizonyos csírasejtek lépnek a meiózis szakaszába, de a csírasejtek egy törzs populációja egy életen keresztül változatlan marad. A meiózis szakaszában a férfi sejtből jelentősebb késedelem nélkül 4 ondósejt jön létre.

Csak keveset tudunk a férfi és női meiózis megindulását szabályozó mechanizmusokról. Az újabb vizsgálatok arról számolnak be, hogy esetleg tüszős purinok, hipoxantin vagy adenozin lehetnek felelősek az oocyiákban a fejlődés megállításáért, ahogyan azt Downs, S. M. és mtársai Dev, Bioi. 82 (1985) 454-458; Epping, J.J. és mtársai Dev Bioi. 119 (1986) 313-321; valamint Downs S. M. Mól. Repród. Dev. 35 (1993) 82-94. irodalmi helyeken leírták. A diffúz meiózist szabályozó vegyületet magzati (foetalis) egér ivarmirigyek (gonádok) tenyészet rendszerében először Byskov és mtársai írták le (lásd. Byskov, A. G. és mtársai Dev. Biok 52 (1976) 193-200). Olyan foetalis egér petefészekből, amelyben meiózis volt folyamatban, kiválasztott meiózis indukáló vegyületet (MIS=Meiosis Inducing Substance), valamint a morfológiailag differenciálódott, nyugvó nem meiotikus csírasejteket tartalmazó heréből kiválasztódó meiózist gátló vegyületet (MPS=Meiosis Preventing Substance) választottunk el. A szakirodalom szerint a MIS és az MPS relatív koncentrációja szabályozza a női és férfi csírasejtek meiózisának megindulását, megállását, illetve folytatását (Lásd Byskov, A.G. és mtársai: Physiology of Reproduction, kiadók Knobil, E. és Neill, J.D., Raven Press, New York (1994)). Világos, ha a meiózist szabályozni tudjuk, a szaporodás is befolyásolhatóvá válik. Sajnálatos módon a mai napig nem vált lehetővé a meiózis indukáló vegyület azonosítása.

Meglepő módon azt találtuk, hogy bizonyos a koleszterol bioszintézis köztitermékeiként ismert szterolok, valamint néhány új, szerkezetileg hasonló szintetikus szerelők felhasználhatók a meiózis szabályozására.

Mindezek alapján a jelen találmány tárgyát az alábbi (I) általános képletű vegyület képezi:

(I) képlet amely képletben

R¹ és R² jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, elágazó vagy el nem ágazó szénláncú 1 - 6 szénatomos alkilcsoport, amely halogénatommal vagy hidroxicsoporttal

2 helyettesített lehet vagy R és R azzal a szénatommal együtt amelyhez mindkettő kapcsolódik egy ciklopentán vagy egy ciklohexán gyűrűt képez;

R³ ésR⁴ együtt egy további kötést jelöl azok között a szénatomok között, amelyekhez azok kapcsolódnak, ebben az esetben az R' jelentése hidrogénatom, R és R jelentés pedig vagy hidrogénatom vagy egy további kettős kötést jelöl azok között a szénatomok között amelyekhez azok kapcsolódnak; vagy

R⁵ és R⁴ együtt egy további kötést jelöl azok között a szénatomok között, amelyekhez azok kapcsolódnak, ebben az esetben az R³ jelentése hidrogénatom, R⁶ és R⁷ jelentés pedig vagy hidrogénatom vagy egy további kettős kötést jelöl azok között a szénatomok között amelyekhez azok kapcsolódnak; vagy

R⁶ és R⁴ együtt egy további kötést jelöl azok között a szénatomok között, amelyekhez azok kapcsolódnak, ebben az esetben az R³, R⁵ és R⁷ jelentése egyaránt hidrogénatom; R⁸ és R⁹ jelentése hidrogénatom vagy együtt egy további kötést jelölnek azok között a szénatomok között, amelyekhez azok kapcsolódnak; valamint

R¹⁰ jelentése vagy hidrogénatom vagy egy foszfono csoportot magában foglaló acilcsoport vagy egy szulfocsoport vagy R¹⁰ jelentése egy olyan csoport, amely együtt a molekula maradék részével étert alkot, továbbá annak gyógyszerként történő felhasználására.

Egy további aspektusból a jelen találmány tárgyát a (I) általános képletü új vegyületek képezik.

A jelen összefüggésben a meiózis szabályozása kifejezés alatt azt értjük, hogy a találmány szerinti vegyületek a meiózis in vitro, in vivő és ex vivő ösztönzésére, illetve elősegítésére szolgálnak.

Ennek megfelelően egy még közelebbi aspektusát tekintve a jelen találmány a fenti (I) általános képletű vegyület meiózis szabályozásában történő felhasználására vonatkozik.

Egy még további aspektusból a jelen találmány tárgyát képezi az emlős csírasejtek meiózisának szabályozási eljárása, amely eljárás a fenti (I) általános képletű vegyület hatásos mennyiségben történő beadását jelenti a kezelést igénylő csírasejtekbe.

Munkánk során azt találtuk, hogy a bika mintákból és emberi tüsző folyadékból kivont meiózis indukáló vegyületek egyaránt képesek a meiózis folytatásának indukálására tenyésztett egér oocytákban (az oocyta teszt) és tenyésztett foetalis egér tesztek hím csírasejtjeinek meiózisát is serkentik (a gonád teszt). A meiózis indukáló vegyületet különböző emlősök, ideértve az embert is felnőtt (ivarérett) egyedeinek mintáiból állítjuk elő, de megtalálható néhány emlős faj, ideértve a nőket is érett petefészek tüszőiben is. Amint az 1. és 2. kiviteli példákból is világosan kitűnik, a bika mintákban talált meiózis indukáló vegyület a 4,4-dimetil-zimoszterol, miközben az emberi tüszőfolyadékban talált meiózis indukáló vegyület a 4,4-dimetil-5a-kolesta-8,14,24-ίπέη-3β-ο1.

A meiózis indukáló vegyületek létezése már egy ideje ismert. Mindamellett a meiózis indukáló vegyület vagy vegyületek a mai napig nem ismertek. A jelen találmány feltalálóinak legjobb tudása szerint a (I) általános képletű vegyületek gyakorlati alkalmazására sem került sor mindezidáig az orvostudományban. Főként pedig a (I) általános képletű vegyületeket meiózis szabályozására alkalmas gyógyszerként nem használták.

Az, hogy képesek legyünk meiózis befolyásolására számos távlati lehetőséget nyújthat. A jelen találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja értelmében az (I) általános képletű vegyületeket a meiózis serkentésére használjuk. A jelen találmány egy másik előnyős megvalósítási módja szerint az (I) általános képletű vegyületeket az emberi meiózis serkentésére használjuk. Mindezek alapján az (I) általános képletű vegyületek egy új fogamzó képesség, illetve megtermékenyítő képesség szabályozó szereknek ígérkeznek anélkül, hogy a szomatikus sejtekre gyakorolt olyan szokásos mellékhatások jelentkeznének, amelyek az ez idáig alkalmazott ösztrogén- és/vagy gesztagénalapú hormonális fogamzásgátlók esetében ismertek. A nők esetében fogamzásgátló szerként történő felhasználásra egy meiózis indukáló vegyület adható be és ily módon idő előtt indukálja a meiózis folytatását az oocytákban, miközben azok még a tüszőben növekednek, mielőtt a gonadotropin szint ovulációs csúcsa bekövetkezik. Nők esetében például a meiózis folytatódása indukálható egy héttel az előző menstruáció megszűntét követően. így amikor az ovuláció bekövetkezik, a kezeléssel kapott túlérett oocyták nagy valószínűséggel nem termékenyülnek meg, ugyanakkor a normál menstruációs ciklusra pedig nem gyakorol hatást. Ebben az összefüggésben fontos megjegyezni, hogy a progeszteron a tenyésztett emberi granulóz a sejtekben zajló bioszintézisét (a tüsző szomatikus sejtjei) a jelen találmány szerinti meiózis indukáló vegyület nem befolyásolja, miközben az ez idáig a • · • · hormonális fogamzásgátlókban használt ösztrogének és gesztagének zavaró hatással vannak a progeszteron bioszintézisére.

A jelen találmány egy másik aspektusa szerint az (I) általános képletű meiózis indukáló vegyület a nőstények, ideértve a nőket, meddősége (fogamzás képtelensége) bizonyos eseteinek kezelésére használható, azoknak a nőknek adva be, akik a saját MIS (= meiosis inducing substance) termelődés elégtelenség következtében képtelenek érett oocyták létrehozására. Amikor in vitro megtermékenyítésre kerül sor akkor is jobb eredményeket érünk el, amikor (I) általános képletű meiózis indukáló vegyületet adunk az oocyták tartalmazó közeghez.

A hímek, ideértve a férfiakat is, saját meiózis indukáló vegyület termelődés elégtelensége által okozott nemzőképtelensége esetében is az (I) általános képletű meiózis indukáló vegyület beadásával a probléma megszüntethető.

Az (I) általános képletű vegyületet tartalmazó készítmények beadásának módja bármely olyan beviteli utat jelenthet, amely hatásosan eljuttatja az aktív hatóanyagot arra a helyre, ahol hatását kifejti.

Ennek megfelelően amikor a jelen találmány szerinti vegyületeket emlősöknek beadjuk, azt hagyományosan az (I) általános képletű vegyületek egyikét valamely gyógyszerészetileg elfogadott hordozóval együtt tartalmazó gyógyszerkészítmény formájában tesszük. A szájon át történő adagolás céljára leginkább a kapszulák vagy a tabletták felelnek meg.

A fentiek után magától értetődő, hogy az adagolás kialakított rendje a kezelendő állapot függvénye. Ily módon, amikor a meddőség vagy megtermékenyítő képtelenség kezelésében használjuk a beadásra csak egyszer vagy egy igen behatárolt periódusban • · · kerülhet sor, például amíg a terhesség be nem következik. Amikor fogamzásgátló hatóanyagként használjuk, az (I) általános képletű meiózis indukáló vegyületet vagy folyamatosan vagy ciklikus jelleggel adagoljuk. Amikor női fogamzásgátlóként használjuk és a páciens nem folyamatosan szedi, a menstruációs ciklushoz viszonyított időzítés válik fontossá.

A gyógyszerészeti készítmények tartalmazhatnak hordozókat, hígító-, illetve oldószereket, abszorpció fokozókat, tartósító szereket, puffereket, az ozmózisnyomás beállítására szolgáló szereket, a tabletták szétesését elősegítő anyagokat és egyéb olyan összetevőket, amelyek a technika állásából ismertek és hagyományosan használtak. A szóbajövő szilárd hordozóanyagok közül példaként említjük a magnézium-karbonátot, a magnézium-sztearátot, a dextrint, a laktózt, a cukrot, a talkumot, a zselatint, a pektint, a tragantmézgát, a metilcellulózt, a nátrium-karboximetilcellulózt, az alacsony olvadáspontú gyantákat és a kakaóvajat.

A folyadék készítmények steril oldatokból, szuszpenziókból és emulziókból állnak. Ezek a folyékony készítmények alkalmasak injekciózásra, illetve az ex vivő és in vitro megtermékenyítéskor történő alkalmazásra. A folyadék készítmények tartalmazhatnak egyéb összetevőket is, amelyeket szakemberek a technika állása szerint hagyományosan használtnak, így például néhányat a fenti listában felsoroltak közül.

Továbbá a jelen találmány szerinti vegyület bőrön keresztüli adagolására szolgáló készítmények sorába tartozik bőrre ragasztható tapasz, az orron át bejuttatható készítmények közül pedig a folyékony vagy por alakú orr spray-ket említjük.

A találmány szerinti vegyület mindenkori adagját a kezelőorvos határozza meg és többek között az épp alkalmazott vegyülettől, valamint az adagolás módjától és a felhasználási céltól függ.

Az (I) általános képletű vegyületek sorába az alábbiak tartoznak:

Koleszt-7-én-3 β-οΐ;

4-Metil-koleszt-7-én-3 β-οΐ;

4-Etil-koleszt-7-én-3 β-οΐ;

4.4- Dimetil-koleszt-7-én-3 β-οΐ;

4cc-Metil-4p-etil-koleszt-7-én-3P-ol;

4cc-Etil-4p-metil-koleszt-7-én-3p-ol;

4.4- Dietil-koleszt-7-én-3 β-οΐ;

4-Propil-koleszt-7-én-3P-ol;

4-Butil-koleszt-7-én-3p-ol;

4-Izobutil-koleszt-7-én-3P-ol;

4.4- Tetrametilén-koleszt-7-én-3p-ol;

4.4- Pentametilén-koleszt-7-én-3 β -ol;

Koleszt-8-én-3 β-ol;

4-Metil-koleszt-8-én-3 β-οΐ;

4-Etil-koleszt-8-én-3 β-οΐ;

4.4- Dimetil-koleszt-8-én-3 β-οΐ;

4a-Metil-4P-etilkoleszt-8-én-3p-ol;

4a-Etil-4p-etilkoleszt-8-én-3P-ol;

4.4- Dietil-koleszt-8-én-3 β-ol;

4-Propil-koleszt-8-én-3 β-ol;

4-Butil-koleszt-8-én-3 β-ol;

4-Izobutil-koleszt-8-én-3 β-οΐ;

4.4- Tetrametilén-koleszt-8-én-33-ol;

4.4- Pentametilén-koleszt-8-én-3 β-ol;

Koleszt-8( 14)-én-3 β-οΐ;

4-Metil-koleszt-8( 14)-én-3 β-οΐ;

4-Etil-koleszt-8( 14)-én-3 β-οΐ;

4.4- Dimetil-koleszt-8( 14)-én-3 β-οΐ;

4a-Metil-4 β -etil-koleszt-8( 14)-én-3 β -ol;

4a-Etil-4p-metil-koleszt-8(14)-én-3P-ol;

4.4- Dietil-koleszt-8( 14)-én-3 β-οΐ;

4-Propil-koleszt-8( 14)-én-3 β-οΐ;

4-Butil-koleszt-8( 14)-én-3 β-οΐ;

4-Izobutil-koleszt-8( 14)-én-3 β-οΐ;

4.4- T etrametilén-koleszt-8( 14)-én-3 β-οΐ;

4.4- Pentametilén-koleszt-8(14)-én-33-ol;

Koleszta-8,14-dién-3 β-οΐ;

4-Metil-koleszta-8,14-dién-3 β-οΐ;

4-Etil-koleszta-8,14-dién-3 β-οΐ;

·· » · • · * · ·

4.4- Dimetil-koleszta-8,14-dién-3 β-ol;

4a-Metil-4p-etil-koleszta-8,14-dién-33-ol;

4a-Etil-43-metil-koleszta-8,14-dién-3P-ol;

4.4- Dietil-koleszta-8,14-dién-3p-ol;

4-Propil-koleszta-8,14-dién-3 β-οΐ;

4-Butil-koleszta-8,14-dién-3 β-οΐ;

4-Izobutil-koleszta-8,14-dién-3 β-οΐ;

4.4- Tetrametilén-koleszta-8,14-dién-3P-ol;

4.4- Pentametilén-koleszta-8,14-dién-3p-ol;

Koleszta-8,24-dién-3 β-οΐ;

4-Metil-koleszta-8,24-dién-3p-ol;

4-Etil-koleszta-8,24-dién-3P-ol;

4.4- Dimetil-koleszta-8,24-dién-3P-ol;

4a-Metil-4p-etil-koleszta-8,24-dién-3p-ol;

4a-Etil-4p-metil-koleszta-8,24-dién-3p-ol;

4.4- Dietil-koleszta-8,24-dién-3p-ol;

4-Propil-koleszta-8,24-dién-33-ol;

4-Butil-koleszta-8,24-dién-3β-ol;

4-Izobutil-koleszta-8,24-dién-3P-ol;

4.4- Tetrametilén-koleszta-8,24-dién-33-ol;

4.4- Pentametilén-koleszta-8,24-dién-33-ol;

Koleszta-8,14,24-trién-3 β-οΐ;

4-Metil-koleszta-8,14,24-trién-3 β-οΐ;

4-Etil-koleszta-8,14,24-trién-3 β-οΐ;

4.4- Dimetil-koleszta-8,14,24-trién^-ol;

4a-Metil-4 β -etil-koleszta-8,14,24-trién-3 β-οΐ;

4a-Etil-4P-metil-koleszta-8,14,24-trién^-ol;

4.4- Dietil-koleszta-8,14,24-trién-3 β-οΐ;

4-Propil-koleszta-8,14,24-trién-3 β-οΐ;

4-Butil-koleszta-8,14,24-trién^-ol;

4-Izobutil-koleszta-8,14,24-trién-3P-ol;

4.4- Tetrametilén-koleszta-8,14,24-trién^-ol;

4.4- Pentametilén-koleszta-8,14,24-trién^-ol;

valamint azok észterei és éterei.

Az (I) általános képletü előnyös észterek azok, ahol a képletben az R¹⁰jelentése a karboxilsav acilcsoportja, amely elágazó vagy el nem ágazó szénláncú vagy gyűrűs lehet, és valamely tetszőlegesen helyettesített aminocsoportot és/vagy az észtercsoport karboniljának oxigénjén túl 1 vagy 2 oxigénatomot tartalmazhat, amely az R^l0-et a szterol vázhoz kapcsolja. Amikor az R¹⁰ acilcsoportot jelöl, előnyösen 1-20 szénatomot, előnyösen 1-12 szénatomot, még előnyösebben 1-10 szénatomot, sőt még ennél is előnyösebben 1-7 szénatomot tartalmaz. A sav, amelyből az R¹⁰származtatható, dikarboxilsav. Az R¹⁰ csoportra példaként említjük a következőket: R¹⁰acetil, benzoil, pivaloil, butiril, nikotinod, izonikotinoil, hemi szukcinoil, hemi glutaroil, hemi maloil, hemi ftaloil, butil-karbamoil, fenil-karbamoil, butoxi-karbonil, terc-butoxi-karbonil, etoxi-karbonil, 4-dimetil-amino-metil-benzoil, 4-dietil-amino-metil-benzoil, 4-dipropil-amino-metil-benzoil, 4-(morfolino-metil)-benzoil, 4-(4-metil-1 -piperazinil-metil)-benzoil, 3-dimetil-amino-metil-benzoil, 3-dietil-amino-metil-benzoil, 3-dipropil-amino-metil-benzoil, 3-(morfolino-metil)-benzoil, 3-(4-metil-l-piperazinil-metil)-benzoil, szulfo (ebben az esetben (I) jelentése egy szulfát észter vagy annak valamely sója) vagy foszfon (ebben az esetben (I) jelentése egy foszfát észter vagy annak valamely sója).

Az (I) általános képletű előnyös éterek azok, ahol a képletben R¹⁰ jelentése metilcsoport, metoxi-metil-csoport, benzilcsoport vagy valamely pivaloiloxi-metil-csoport.

A természetben előforduló jelen találmány szerinti vegyületek a természetes forrásokból a technika állásából önmagukban ismert eljárásokkal nyerhetők ki.

Alternatív módon azokat - a szerkezetüket tekintve hasonló szintetikus szterolokhoz hasonlóan - önmagukban ismert szintézis módszerekkel állíthatjuk elő.

A jelen találmány szerinti megoldást a most következő kiviteli példákkal szemléltetjük, természetesen a találmány oltalmi körének bármilyen korlátozása nélkül. A leírás eddigi részében szereplő találmány ismertetés és a most következő kiviteli példák mindegyike külön-külön vagy azok bármely kombinációja elegendő információt szolgáltat a találmány változatos és sokféle formában történő megvalósításához.

Kiviteli példák

1. Példa

Meiózis indukáló vegyület (MIS) elválasztása, tisztítása és azonosítása bikából származó mintákból

Hat éves korú bikából (Danish Landrace) azonnal a leölést követően vettünk mintákat. A bőrhártya albuginea-t eltávolítottuk és a hereszöveteket szárazjégre tettük és -80 °C-os hőmérsékleten tároltuk. A lefagyasztott hereeredetű szöveteket (92 gramm) 1 mm³-nél kisebb darabokra szeleteltük fel és sötétben a teljes száradásig fagyasztva szárítottuk, ez körülbelül 90 órát vett igénybe. A fagyasztva szárított szöveteket nitrogéngázban 20 °C-os hőmérsékleten 24 órán keresztül állandó keverés közben 400 ml n-heptánnal (LiChrosolv, Merck 4390, Németország) extraháltuk. A szuszpenziót leszűrtük és a szilárd anyagot még egyszer ugyanazt a fenti eljárást követve extraháltuk. A szerves fázis készleteket szobahőmérsékleten rotációs bepárló készülékben száradásig bepároltuk, ily módon 981 mg extraktumot kaptunk. Ezt az anyagot n-heptánban oldottuk és 15 ampullába adagoltuk, amelyekből azután a nheptánt elpárologtattuk. Az ampullákat nitrogén gáz atmoszférában 4 °C-os hőmérsékleten sötéten tároltuk.

Az extraktumokat három lépésben HPLC-vel tisztítottuk:

Az első lépésben az ampulla tartalmát 50 pl 50 (v/v) %-os vizes tetrahidrofuránban (THF) oldottuk és reverz fázisú HPLC kolonnára (LiChroSpher 100 RP-8 5 pm-es zárókupakkal ellátva, 250x4 mm i. d., Merck), vittük fel. Az elúciót 40 °C-os hőmérsékleten 15 perces 50 % és 100 % közötti (áramlási sebesség: 1 ml/perc) lineáris gradiensű THF alkalmazásával végeztük. 18 darab 1 ml-es frakciót vettünk le és vizsgáltuk azok MIS aktivitását.

A második lépésben az első lépésben kapott, az oocyta-vizsgálatok során aktívnak talált frakciókat 50 -10 pl 70 %-os THF oldatban feloldottuk, majd az első lépésben alkalmazotthoz hasonló kolonnára vittük fel. Az elúciót 40 °C-os hőmérsékleten 16 perces 60 % és 78 % közötti (áramlási sebesség: 1 ml/perc) lineáris gradiensű THF alkalmazásával végeztük. 8 darab 1 ml-es frakciót választottunk le és vizsgáltuk azok MIS aktivitását.

A harmadik lépésben a második lépésben kapott, az oocyta-vizsgálatok során aktívnak talált frakciókat 100 μΐ 98 : 2 térfogatarányú n-heptán : 2-propanol elegyben oldottuk fel, majd félpreparatív HPLC kolonnára (ChromSpher Sí 5 pm, 250x10 mm

i.d.) vittük fel. Az elúciót szobahőmérsékleten 98 : 2 térfogatarányú n-heptán : 2-propanol elegyből álló mobil fázis alkalmazásával (áramlási sebesség: 5 ml/perc) végeztük. 5 darab 2.5 ml-es frakciót választottunk le és vizsgáltuk azok MIS aktivitását.

Mind a három lépésben az elúciót 220 nm-es UV-méréssel követtük nyomon.

A fenti három lépéses tisztítási eljáráson átesett anyagot használtuk az aktív vegyület molekulaszerkezetének mágneses magrezonancia (NMR=nuclear resonance spectromerty) és tömeg spektrofotometria módszerekkel történő vizsgálatához.

Az NMR spektrum felvételéhez, körülbelül 1 mg tisztított anyagot 0.6 ml deutérium-kloroformban oldottunk. ^I3C protont abszorbciós NMR spektrumot, *H NMR spektrumot (felbontóképesség növelésével és anélkül) és 2D TOCSY spektrumot vettünk fel AMX2 400 inverz széles spektrumsávos, gradiens spirállal ellátott 5 mm-es próbafejjel felszerelt NMR spektrofotométerrel. Az elválasztott MIS vegyületek esetében ^LlC-as NMR-el mért kémiai eltolódás értékeket ppm-ben (δ) az alábbi 1. sz. táblázatban adjuk meg az összehasonlítás céljából a megfelelő zimoszterol (Lásd

Taylor, U.F. és mtársai. J. Lipid Rés. 22 (1981) 171) és lanoszterol (Lásd Emmons,

G.T. és mtársai Magn. Rés. Chem. 27 (1989) 1012) adatokkal együtt.

X. Táblázat

Szén	Zimoszterol	Lanoszterol	MIS
1	35.1	35.5	35.8
2	31.5	27.8	28.0
3	70.9	79.0	79.0
4	38.2	38.9	38.9
5	40.7	50.4	50.2
6	25.5	18.2	18.4
7	27.1	26.5	28.5
8	128.0	134.4	128.0
9	134.8	134.4	135.8
10	35.6	37.0	37.0
11	22.8	21.0	22.1
12	36.9	30.9	29.7
13	42.0	44.4	42.1
14	51.8	49.8	51.9
15	23.7	30.8	23.8
16	28.7	28.2	28.8
17	54.7	50.4	54.8
18	11.2	15.7	11.3
19	17.8	19.1	19.8

1. Táblázat folytatása

Szén	Zimoszterol	Lanoszterol	MIS
20	36.0	36.2	36.0
21	18.6	18.6	18.6
22	36.0	36.3	36.1
23	24.7	24.9	24.8
24	125	125.2	125.2
25	130.6	130.9	130.9
26	17.6	17.6	17.6
27	25.7	25.7	25.7
28		15.4	15.4
29		27.9	27.9
30		24.2

A tömeg spektrofotometriai vizsgálatok elvégzéséhez LINC részecske sugárnyaláb interfázisú VG Trió 1000 LC/MS műszert, valamint LAB-BASE 2.1 software-t (Fisions Instruments) ChromSpher Si, 3 pm, 100x4.6 mm kolonnát tartalmazó HPLC-vel (Chrompack) együtt alkalmaztunk. A HPLC méréseket szobahőmérsékleten 98 : 2 térfogatarányú n-heptán : 2-propanol elegyből álló mobil fázis alkalmazásával (áramlási sebesség: 0.6 ml/perc) végeztük. A beinjektált MIS mintákat előzőleg n-heptánban oldottuk fel. A tömegspektrofotométert elektron impakt üzemmódban működtettük. A kapott mérési eredményeket az alábbi 2. sz. táblázatban adjuk meg, amelyben az elválasztott relatív csúcsmagasságokat adjuk meg összehasonlításként pedig a 4,4-dimetil-zimoszterollal végzett mérések eredményeit. Az l.sz referátum és a 2. sz. referátum esetében +-al jelezzük, ha a megfelelő csúcs már azokban is szerepelt. Az 1. és 2. referátum esetében a azt jelzi, hogy ezt a bizonyos csúcsot ezek a tanulmányok nem tartalmazzák.

2. Táblázat

m/z		MIS	Ref. 1	Ref. 2
412	[M]⁺	100	100	+
397	[M-CH₃]⁺	60	42	+
379	[M-CH₃-H₂O]⁺	24	17	+
301	[M-SC]⁺	11	-	+
299	[M-SC-2H]⁺	22	13	-
274	[M-SC-C₂H₃]⁺	8	8	-
259	[M-SC-C₃H₆]⁺	21	33	+
241	[M-SC-C₃H₆-H₂O]⁺

SC= oldallánc (side chain), C₂H₃= 16-os és 17-es pozíció, C₃H₆= 15-ös,16-os és 17-es pozíció.

4,4-dimetil-5a-koleszta-8,24-dién-3 β-ol 4,4-dimetil-zimoszterol (DMZ)

1. sz. referátum: Baloch és mtársai Phytochemistry 23 (1984) 2219.

2. sz. referátum: Morimoto és mtársai Liebigs Ann. Chem. 708 (1967) 230.

A ^L,C-as NMR spektrum és annak tömeg spektrofotometriás méréssel meghatározott 412-es molekulatömege alapján a bika mintákból elválasztott MIS vegyület meghatározott kémiai szerkezete 4,4-dimetil-5a-koleszte-8,24-dién-33-ol, amelyet 4,4-dimetil-zimoszterolként (DMZ) is nevezhetünk. A harmadik HPLC-s tisztítási eljárás eredményeként kapott MIS aktivitású anyag egyes szénatomjainak kémiai eltolódásait a szerkezetileg nagyon közel álló lanoszterol és zimoszterol vegyületek kémiai eltolódásaival hasonlítottuk össze. A megfigyelt proton kémiai eltolódásai, a kapcsolási konstansok és a TOCSY korrelációs értékek tökéletesen alátámasztják, hogy az elválasztott vegyület 4,4-dimetil-zimoszterol.

2. Példa

Meiózis indukáló vegyület (MIS) elválasztása, tisztítása és azonosítása emberi tüsző folyadékból

Az emberi tüszőfolyadékot (FF = follicular fluid) a tüszőből való leszívással nyertünk ki az infertilitás kezelésekor az in vitro megtermékenyítéshez szükséges oocyta készlet számára. A folyadékot fagyasztva szárítottuk, majd n-heptánnal extraháltuk és az extraktumot az 1. kiviteli példában ismertetett eljárási lépések segítségével tisztítottuk. Az aktív csúcshoz tartozó vegyület molekula ion értéke m/z = 410 volt, a tömegspektrum pedig azt mutatta, hogy az FF-MIS molekula kémiai szerkezete 4,4-dimetil-5a-koleszta-8,14,24-trién-3P-ol.

Módszerek: A tömeg spektrofotometriai vizsgálatok elvégzéséhez LINC részecske sugárnyaláb interfázisú VG Trió 1000 LC/MS műszert, valamint egyenes fázisú ChromSpher Si, 3 pm, 100x4 mm i.d. kolonnával rendelkező HPLC-hez (Chrompack) kapcsolt LAB-BASE 2.1 software-t (Fisions Instruments) alkalmaztunk. A HPLC méréseket szobahőmérsékleten 68 : 30 : 2 : 0.2 térfogatarányú n-heptán : 2-propanol : metanol : ammónia elegyből álló mobil fázis alkalmazásával (áramlási sebesség: 0.5 ml/perc) végeztük. A beinjektált MIS mintákat előzőleg n-heptánban oldottuk fel. A tömegspektrofotométert elektron impakt üzemmódban működtettük. A kapott mérési eredményeket az alábbi 3. sz. táblázatban adjuk meg.

3. Táblázat

m/z	Értelmezés
410	= M	[M]⁺
395	M- 15	[M-CH₃]⁺
392	M- 18	[M-H₂0]⁺
377	M-33	[M-CH₃ -H₂O]⁺
349	M-61	[M-43-H₂O]⁺
381	M- 129	[M-SC-H₂O]⁺ (SC-111)
279	M-131	[M-SC-2H-H₂O]⁺
257	M- 153	[M-SC-42]⁺
255	M- 155	[M-154-H]⁺
239	M-171	[M-SC-42-H₂O]⁺

SC = oldallánc (side chain)

3. Példa

A 4jj-metil-zimoszterol fermentációs úton történő előállítása

A eljárási lépés

A Kluyveromyces bulgaricus A3410 élesztő törzset YPG agar lejtőre (slant) oltottunk és termosztált inkubátorban 30 °C-os hőmérsékleten 3 napig tenyésztettünk. 5 ml steril YE közeget adtunk a lejtőhöz, majd a kémcsövek forgó/örvény-keverőben történő rázatásával az élesztő kolóniákat a vizes közegben szuszpendáltuk. A sejt szuszpenziót ezután 5 ml-es steril fecskendőbe szívtuk fel és 500 ml-es az alsó részén két terelőlemezes beáramlással ellátott rázólombikba töltöttük. A lombik 200 ml ZYM közeget tartalmazott. A lombikot a forgó asztalra rögzítettük és 250 fordulat/perc sebesség mellett 30 °C-os hőmérsékleten 24 órán keresztül tenyésztettük. Ekkor 0.4 ml steril szűrt amfotericin B oldatot adtunk a lombik tartalmához és a tenyésztést további órán keresztül folytattuk. Az élesztő sejteket centrifugálással (Beckman model J6, 5 °C 10 PERC, 4000 fordulat/perc) nyertük ki és vízzel egyszer mostuk. A sejteket tartalmazó zagyot egy kis műanyag tárolóedénybe választottuk el és a szterolok végső extrakcióját megelőzően -18 °C-os hőmérsékleten raktároztuk.

A fentiekben említett táptalaj és amfotericin B oldat összetételei a következők voltak:

YPG agar

Élesztő kivonat, Difco 4 gramm

KH₂PO₄ 1 gramm

MGSO₄.7 H₂O 0.5 gramm

Cukor 15 gramm

Agar 20 gramm ionmentesített víz 1000 ml a pH-t 5.8 értékre állítottuk be mielőtt 20 percre a 121 °C - os autoklávba helyeztük

YE közeg

Élesztő kivonat, Difco 10 gramm ionmentesített víz 1000 ml

Autokláv, 121 °C, 20 perc

ZYM közeg

Élesztő kivonat, Difco gramm

Pepton csapvíz gramm

1000 ml a pH-t 6.5-6.6 közötti értékre állítottuk be mielőtt 20 percre a 121 °C - os autoklávba helyeztük.

Glükóz (külön, az autoklávos kezelést 60 gramm követően hozzáadva)

Amfotericin B oldat mg Fungizone® (50 mg liofilizált amfotericin B, 41 mg nátrium-deoxikolát és

20.2 mg nátrium-foszfát a Squibb -tői) 1 ml ionmentesített vízben oldva.

B eljárási lépés

Az A eljárási lépésben kapott tenyésztett sejteket 10 ml vízben szuszpendáltuk, majd a kapott szuszpenzióhoz 40 tömeg %-os metanolos KOH oldatot adtunk. Az elegyet visszafolyó hűtő alatt 4 órán keresztül melegítettük, majd kétszer 20 ml n-heptánnal extraháltuk. Az egyesített extraktumokat 10 tömeg %-os nátrium-klorid oldattal mostuk, majd vízzel semlegesre mostuk (ötszöri mosás) és megszárítottuk. Az oldószer elpárologtatósa után 40 mg nyers szterolokat kaptunk.

C eljárási lépés

A B eljárási lépés eredményeként kapott nyers szterolokat 1 ml 98 : 2 térfogatarányú n-heptán : propanol elegyben oldottuk fel és vortex keverőben rázattuk, majd 5000 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugáltuk és HPLC analízisnek vetettük alá:

Kolonna

Eluens

Áramlási sebesség

Detektálás

LiChroSorb DIOL 10 pm, 250x4 mm i.d.

(Merck) n-heptán / 2-propanol (98:2)

1.1 ml/min, 20 °C

UV és 220 nm

A 6.8 perces elúciós csúcshoz tartozó frakciókat néhány menetben kinyertük. Az összegyűjtött frakciókat egyesítettük és az oldószert elpárologtattuk, az így kapott maradékot tömeg spektrofotometriával elemeztük és oocyta mintákban vizsgáltuk.

A tömeg spektrum adatokat az alábbi 4. sz. táblázatban foglaltuk össze, amelyek azonosak a National Bureau of Standards könyvtárában jegyzett 4[l-metilzimoszteroléival.

4. Táblázat

m/z	Értelmezés
398	= M	[M]⁺
383	M- 15	[M-CH₃]⁺
380	M- 18	[M-H₂0]⁺
365	M - 33	[M-CH₃ -H₂O]⁺
269	M- 129	[M-SC-H₂O]⁺ (SC=111)
267	M- 131	[M-SC -H₂O-2H]⁺
245	M- 153	[M-SC-C₃H₆]⁺
227	M- 171	[M-SC-C₃H₆-H₂O]⁺
213	M- 185	[M-SC-C₄H₈-H₂O]⁺

SC = oldallánc (side chain)

4. Példa

4.4- Dimetil-koleszta-8,14-dién-3ü-ol előállítása

Ezt a vegyületet a Schroepfer és mtársai: Chemistry and Physics of Lipids 47 (1988) 187 irodalmi helyen ismertetett módon állítottuk elő és a kapott termék fizikai tulajdonságai azonosak az irodalomban megadottakkal.

5. példa

4.4- Dimetil-koleszt-8-én-33-ol előállítása

A eljárási lépés

2.48 gramm 4,4-dimetil-koleszta-8,14-dién-3p-olt (4. példa) 20 ml 0 °C-os piridinben oldottunk. 1.7 gramm benzoil-kloridot adtunk hozzá és az elegyet szobahőmérsékleten egy éjszakán át kevertettük. Miután száradásig bepároltuk 25 ml toluolt adtunk hozzá és utána standard vizes feldolgozást, bepárlást és acetonos kicsapatás követően 2.4 gramm kristályos benzoátot kaptunk, amely 74 %-os kitermelésnek felel meg.

Az 'H-NMR spektrum (CDC1₃, δ) az alábbi karakterisztikus jeleket mutatta: 8.1 (d, 2H); 7.55 (t, 1H); 7.4 (t, 2H); 5.4 (s, széles, 1H); 4.2 (dd, 1H)

B eljárási lépés

2.04 gramm 3-benziloxi-4,4-dimetil-koleszta-8,14-diént (A eljárási lépés) 50 ml TffF-ben oldottunk, majd 360 ml 0 °C-os 1 mólos THF-os boránt csepegtettünk hozzá. Az elegyet környezeti hőmérsékleten egy éjszakán át kevertettük, majd 0 °C-ra hűtöttük és 140 ml vizet csepegtettünk hozzá, ezután 360 ml 10 tömeg %-os nátrium hidroxidot és 378 ml 30 tömeg %-os hidrogén-peroxidot adtunk hozzá. 90 percen keresztül kevertettük, majd 100 ml dietiétert adtunk az elegyhez és az elválasztott vizes fázist kétszer dietiléterrel extraháltuk. Az egyesített szerves fázisokat nátrium-biszulfit oldattal, majd vízzel mostuk. A bepárlást követően a terméket kromatográfiás úton SiO₂-on tisztítottuk (eluens: 2 % toluolban oldott dietiléter), ily módon 0.62 gramm 3benzoiloxi-4,4-dimetil-koleszt-8-en-15-olt kaptunk.

Az ’H-NMR spektrum (CDC1₃, δ) a következő karakterisztikus jeleket mutatta 8.0 (d, 2H); 7.5 (t, 1H); 7.4 (t, 2H); 4.75 (m, 1H); 4.1 (m, 1H).

C eljárási lépés

0.54 gramm 3-benziloxi-4,4-dimetil-koleszt-8-én-15-olt 2.7 ml 0 °C-os piridinben oldottunk, majd 33 mg dimetil-aminopiridint és 287 mg fenil-kloro27 tioformátot adtunk hozzá óvatosan. Az elegyet 20 órán keresztül környezeti hőmérsékleten kevertettük. 25 ml dietiléter hozzáadását követően az elegyet telített rézszulfát oldattal 6-szor, majd vízzel, majd 10 tömeg %-os nátrium-hidroxid oldattal kétszer, majd vízzel és sóoldattal mostuk, utána bepároltuk, ily módon 0.68 gramm nyers 3-benzoil-4,4-dimetil-kloleszt-8-én-15-feniltiokarbonátot kaptunk, amely 20 ml toluolban oldva további feldolgozásra került, az oldatot 370 mg truibutil-ón-hidráttal és 20 mg azo-izobutironitrillel kezeltük. Az elegyet 20 perc alatt 90 °C-os hőmérsékletre melegítettük és ugyanezt a kezelést megismételtük. Bepárlás után az elegy nyers tisztítását kromatográfiás úton SiO₂-on (eluens: heptán és metilén-klorid 70/30 térfogatarányú elegye) végeztük, ily módon 150 mg a megfelelő 8,14-diénnel (A eljárási lépés) szennyezett nyers 3-benzoiloxi-4,4-dimetil-koleszt-8-én kaptunk.

D eljárási lépés

150 mg a C eljárási lépésben előállított elegyet 2 ml metilénkloridban oldottuk fel, majd az oldatot 0 °C-ra hűtöttük le. 0.7 ml diizobutil-alumínium-hidridet csepegtettünk hozzá, majd 15 perc elteltével 0.15 ml vizet öntöttünk bele óvatosan.

Ezután 25 ml dietilétert adtunk hozzá és az elkülönített szerves fázist kálium-nátriumtartarát telített oldatával kétszer, majd vízzel és sóoldattal mostuk, az ezt követő bepárlással 130 mg elegyet kaptunk, amelyet azután AgNO₃/ SiO₂-n(előállítását lásd Chem. & Phys. of Lipids 63 (1992) 115) toluollal eluálva kromatografáltuk. Végül éter/metanol elegyből átkristályosítottuk és 49 mg cím szerinti vegyületet kaptunk. Olvadáspont: 154 - 155 °C.

MS (molekula ion): 414.4

Az ¹³C-NMR spektrum (CDC1₃ , 100.6 MHz) a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 78.49 (C₃); 127.49 (C₈); 135.35 (C₉);

6. Példa

3-Acetoxi-4,4-dimetil-koleszta-8,14-dién előállítása

1.3 gramm 4,4-dimetil-koleszta-8,14-dién-3-olt (Schroepfer és mtársai.: Chemistry and Physics of Lipids 47 (1988) 187) 7.5 ml piridin és 7.5 ml ecetsavanhidrid elegyében oldottunk, majd a kapott oldatot egy éjszakán keresztül 22 °C-os hőmérsékleten kevertettük. Az elegyet vákuum segítségével bepároltuk, toluollal kétszer sztrippeltük, majd gyors kromatográfiás úton SiO₂-on (toluollal) tisztítottuk. Az eluátum első 300 ml-ét bepároltuk és a terméket dietiléterből átkristályosítottuk, ily módon 140 mg 3-acetoxi-8,14-dimetilkolesztadiént kaptunk.

Olvadáspont: 120-125 °C (bomlással)

MS (molekula ion): 454.4

Az *H-NMR spektrum (CDC1₃, δ) a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 5.4 (s, széles, 1H); 4.5 (dd, 1H); 2.0 (s, 3H).

7. Példa

Koleszta-8,14-dién-3fi-ol előállítása

770 mg dehidro-koleszterolt 2.7 ml benzol, 19 ml etanol és 2.7 ml tömény sósav elegyében oldottunk fel, majd az elegyet 3 órán keresztül visszafolyó hűtő alatt melegítettük. Az elegyet jeges fürdőbe helyezve lehütöttük, amikor is a keletkező • · kristályok első 110 mg-os mennyiségét megkaptuk. A kristályokat leszűrtük, majd száradásig bepároltuk és éter/metanol elegyből átkistályosítva megkaptuk a kristályok második 220 mg-os mennyiségét, amelyet azután az első adaggal elegyítettünk. A kapott anyagot AgNC^/SiC^-on (előállítását lásd az 5. példa D eljárási lépésében) kromatografáltuk, az eluálást 2.5 tömeg %-os toluolos acetonnal végeztük, az eljárás eredményeként 94 mg tiszta koleszta-8,14-dién-33-olt kaptunk.

Olvadáspont: 113 - 114.5 °C.

MS (molekula ion): 384.4.

A termék 'H-NMR spektruma (CDCI3, δ) a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 5.35 (s, széles, 1H); 3.6 (m, 1H).

A ^{8 * * * * 13}C-NMR spektrum (CDC1₃, 50.3 MHz) a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 70.99(C₃); 117.42 (C15); 123.1 (C₈); 140.8 (C₉); 151.1 (C₁₄).

8. Példa

4,4-Tetrametilén-koleszta-8-14-dién-3-ol előállítása

A eljárási lépés

1. 15 gramm dehidro-koleszterol 15 ml 2-butanonban oldottunk fel, majd 0.34 gramm alumínium-izopropoxidot adtunk az oldathoz, az így kapott elegyet visszafolyó hűtő alatt 75 percig melegítettük. Miután az elegyet jeges fürdőben lehűtöttük, 15 ml 2 N-os sósavat adtunk hozzá, a fázisokat elválasztottuk , majd a szerves fázist kétszer 7.5 ml 2N-os sósav oldattal mostuk. Az elválasztott vizes fázist toluollal extraháltuk, az egyesített szerves fázisokat vízzel és sóoldattal mostuk, megszárítottuk, majd bepároltuk. Az eljárás eredményeként 1.18 gramm nyers koleszta-5,7-dién-3-ont nyertünk ki viszkózus olaj alakban.

Az ’H-NMR spektrum (CDC1₃, δ) a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 5.8 (s, 1H); 5.2 (m, 1H); 3.2 (d, 1H); 2.7 (dd, 1H).

B eljárási lépés

0.67 gramm kálium-terc-butoxidot 16 ml 45 °C-os hőmérsékletű tercbutoxidban oldottunk, az oldathoz 0.57 gramm koleszta-5,7-dién-3-ont adtunk hozzá, majd 10 percen keresztül kevertettük. 0.47 gramm 1,4-dijód-butánt adtunk hozzá és az elegyet újabb 30 percig kevertettük. Az oldószert elpárologtattuk, a maradékot toluolban újraoldottuk, majd vizet és egy kevés sóoldatot adtunk hozzá a fázisok elválasztása érdekében. Az elválasztott szerves fázist négyszer vízzel mostuk, majd az egyesített vizes fázisokat egyszer toluollal extraháltuk. Az egyesített toluolos extraktumokat megszárítottuk, majd bepároltuk, ily módon 0,45 gramm habot kaptunk, amelyet dietiléter/metanol elegyből átkristályosítottunk. Az eljárás eredményeként 0.35 gramm kristályos 4,4-tetrametilén-koleszta-5,7-dién-3-ont kaptunk.

MS (molekulaion): 436.4

Az ¹ H-NMR spektrum (CDC1₃, δ) a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 5.75 (d, 1H); 5.5 (m, 1H).

C eljárási lépés

130 mg LiAlH₄-et 6 ml THF-ben szuszpendáltunk, majd a szuszpenzióhoz 40 ml THF-ban oldott 1.97 gramm 4,4-tetrametilén-koleszta-5,7-dién-3-ont csepegtettünk hozzá több, mint 30 percen keresztül. A hozzáadás befejezése után 15 perccel még mindig maradt bizonyos mennyiségű reagálatlan kiindulási anyag (TLC), ezután újabb 65 mg LiAlH₄-et adtunk hozzá, 30 perces keverés után a reakció teljesen végbement, majd 5 ml tetrahidrofuránnal elegyített vizet csepegtettünk az elegyhez. 30 perces keverés következett, majd fölös mennyiségű magnézium-szulfátot adtunk hozzá és az elegyet újabb harminc percen keresztül kevertettük, ezután leszűrtük és vákuum segítségével száradásig bepároltuk. A maradékot 25 ml dietiléter és 25 ml metanol elegyben oldottuk fel, majd az étert vákuumban óvatosan eltávolítottuk. A maradékot egy éjszakán keresztül kevertettük és szűréssel 1.75 gramm kristályos 4,4-tetrametilénkoleszta-5,7-dién-3-olt választottunk el.

MS (molekula ion): 438.4

Az ‘H-NMR spektrum (CDCF„ δ) a következő karakterisztikus jeleket mutatta:

5.8 (d, 1H); 5.5 (m, 1H); 3.5 (m, 1H).

D eljárási lépés

770 mg C eljárási lépésben előállított vegyületet 2.38 ml benzol, 17.5 ml etanol és 2.38 ml tömény sósav oldószerelegyben oldottuk fel, majd az oldatot 16 órán keresztül visszafolyó hűtő alatt melegítettük, majd vákuumban betöményítettük. A maradékot 5 ml toluolban ismételten feloldottuk, leszűrtük és közepes nyomáson AgNO₄/SiO2-al töltött kolonnán kromatografáltuk (eluálószer: 10 : 90 térfogatarányú heptán : toluol elegy). Az eljárás végén 35 mg 4,4-tetrametilén-koleszta-8,14-dién-3-olt kaptunk.

MS (molekulaion): 438.4

Az ’H-NMR spektrum (CDCI3, δ) a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 5.35 (s, széles, 1H); 3.3 (d,d, 1H).

A ¹³C-NMR spektrum (CDCI3, 100.6 MHz) pedig a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 79.0 (C₃); 117.4 (C15); 122.9 (C₈); 141.3 (C₉); 151.1 (Ci₄).

9. Példa

4.4-Dimetil-koleszt-8( 14)-én-3ü-ol előállítása

580 mg 4,4-dimetilkoleszt-8-én-3p-olt 20 ml dietiléterből és 20 ml ecetsavból álló oldószer elegy ben oldottunk. Az oldathoz 60 mg 10 tömeg %-os Pd/C katalizátort adtunk és az elegyet egy éjszakán át 3.5 .10 5 Pa nyomású hidrogéngáz atmoszférában kevertettük. A katalizátort eltávolítottuk és a szűrletet 10 ml-es térfogatra töményítettük be, amikor is a kristálykiválás elkezdődött. 10 ml metanolt adtunk hozzá, majd 16 óra múlva a kristályokat összegyűjtöttük. Metanolból való átkristályosítással 230 mg olyan anyagot kaptunk, amely az *H- és ¹³C-NMR vizsgálatok alapján a 8(9) és a 8(14)-izomerek elegyeként azonosítottunk.

Az elegyet 10 ml dietiléterből és 10 ml ecetsavból álló oldószer elegyben ismételten feloldottuk. Az oldathoz 75 mg 5 tömeg %-os Pd/C katalizátort adtunk és az elegyet egy éjszakán át légköri nyomáson hidrogéngázzal kezeltük. A katalizátort eltávolítottuk és az oldószert bepároltuk, a kristályos maradékot pedig 5 ml metanollal péppé őröltük, ily módon 190 mg tiszta 4,4-dimetil-koleszt-8(14)-én-3P-onhoz jutottunk.

MS (molekula ion): 414.4

A ⁿC-NMR spektrum (CDC1₃, 100.6 MHz) a következő karakterisztikus jeleket adta: 79.24 (C₃); 126.11 (C₈); 142.20 (Ci₄).

10. Példa

Meiózis indukáló vegyületek vizsgálata oocyta mintákban

Ivaréretlen nőstény egeret (B6D2-F1, C57B1/2J törzs) szabályozott fényviszonyok között (14 óra világos, 10 óra sötét) és hőmérsékleten tartottunk kívánság szerinti mennyiségű élelemmel és vízzel. Amikor az állatok elérték a 13 - 16 gramm-os tömeget (amely megfelel a születést követő 20 - 22 napos kornak) azoknak egy egyszerű injekcióval körülbelül 20 IU FHS-t és 20 IU LH-t (Ziebe, S. és mtársai Hűm. Repród. 8 (1993) 385-88) tartalmazó emberi menopauzális gonadotropint (Humegon, Organon, Hollandia) adtunk be. 48 óra elteltével nyaki ficam előidézésével az állatokat leöltük.

Az oocyták tenyésztése és elválasztása

A petefészkeket eltávolítottuk, HX-közegbe (lásd alább) helyeztük és az oda nem tartozó részeket eltávolítottuk. Az anyagkészlet- és a tenyészet közegét 4 mmól hipoxantint, 3 mg/ml bovin szérum albumint, 0.23 mmol nátrium-piruvátot, 2 mmol glutamint, 100 U/ml penicillint, valamint 100 pg/ml sztreptomicint (mind Sigma termák, USA) Eagles minimum elemi tápoldat képezte (gyártó: Flow, USA). Ezt a tápoldatot neveztük el HX-közegnek. Ugyanilyen összetételű, de HX-et nem tartalmazó tápoldatot használtunk kontroll közegként.

A petefészek üreges tüszőit 27-es méretű punkciós tűvel nagy felbontású mikroszkóp alá vittük, egyforma nagyságú oocyta dombokat (későbbiekben CEO rövidítés: cumulus enclosed oocyte; cumulus oophorus = fogamzási domb a petesejten) válogattunk ki, majd azokat háromszor friss HX-közeggel leöblítettük.

Az oocytákból kivettük a cumulus sejteket, méghozzá oly módon, hogy a CEOkat egy szűk belső átmérőjű száj pipettán áramoltattuk keresztül, így lefejtett oocytákhoz (DO = denuded oocytes) jutottunk. A CEO-kat és a DO-kat 0.5 ml HXközeget tartalmazó, 4 üreges edénykékben (Nuclon, Denmark) tenyésztettük a kontroll kivételével, amit a kontroll közegben tenyésztettünk. Minden egyes üreg 35 és 50 közötti darabszámú oocytát tartalmazott. Ahogyan az 5. sz. táblázatban is látható, a minta tenyészeteket a vizsgált vegyületek különböző koncentrációi alkalmazásával készítettük el.

A tenyésztést 37 °C-os hőmérsékleten 100 %-os nedvességtartalmú és 5 % CO₂tartalmú levegőn végeztük. A tenyésztés ideje 24 óra volt.

Az oocyták elemzése

A tenyésztési idő elteltével megszámoltuk a csíra hólyaggal (GV = germinal vesicle) rendelkező oocytákat, az elroncsolt csíra hólyaggal (GVBD = germinal vesicle breakdown) rendelkező oocytákat és a poláris testtel (PB = polar body) rendelkező oocytákat különböző interferencia kontraszt berendezéssel ellátott inverter mikroszkóp alatt. A GVBD-vel rendelkező oocyták számát az összoocytaszámmal elosztva kaptuk a GVBD-vel rendelkező oocyták százalékát, továbbá a PB-vel rendelkező oocyták számát a GVDB-vel rendelkező oocyták számával elosztva kapott százalékos értéket számítottuk ki. A DO-k és A CEO-k esetében kapott eredményeket, mint számított MIS aktivitási mérőszámokat az 5. sz. táblázatban adjuk meg. A MIS aktivitás egység definíciója a következő:

%GVBD_kontroii a MIS aktivitást pedig a következőféleképpen számítjuk:

%GVBD_teszt - %GVBD_kontron 2( _) %GVBD_kontron

5. Táblázat

Hatóanyag	DO	CEO	Koncentráció pg/ml
4,4 - Dimetil-zimoszterol	2.7	2.9	1.2
	1.8	2.7	0.3
	0.6	1.3	0.2
	1.5	1.3	0.02
	0.9	1.0	0.002
4,4-Dimetil-5oc-koleszta-8,14,24-	0.6	2.3	0.3
-ίπέη-3β-ο1	1.6	0.5	0.03
Zimoszterol	1.2	1.1	0.1
	0.6	0.4 0.2	0.01 0.001
4β-Μ6ΐί1-ζϊΐΏθ8ζΐεΓθ1	6.2	3.5	3.9
	0.8	2.4	0.13
4,4-Dimetil-koleszt-8-én-3B-ol	0.8	12.8	0.03
4,4-Dimetil-koleszta-8,14-dién- -3β-ο1	2.25	0	3.0

• *

11. Példa

Meiózis indukáló vegyületek vizsgálata gonád mintában

A gonád mintákat lényegében a Byskov, A. G. és mtársai Mól. Repród. Dev. 34 (1993) 47-52. irodalmi helyen ismertetett eljárás szerint állítottuk elő. A Westergaard,

L. és mtársai Fertil. Steril. 41 (1984) 377-384 irodalmi helyen ismertetett félkvantitatív módon kapott eredményeket a 6. sz. táblázatban foglaltuk össze.

6. Táblázat

	Koncentráció pg/ml	Eredmény
4,4-Dimetil-zimoszterol	10	+ +
4,4-Dimetil-5a-koleszta- 8,14,24-ΐπέη-3β-ο1	30	+

12. Példa

Mono (5cc-koleszta-8,14-dién)-3ü-szukcinát előállítása

0.50 gramm 5a-koleszta-8,14-dién-3P-olt 10 ml THF-ben oldottunk, majd az oldathoz 0.39 gramm borostyánkősav-anhidridet és 16 mg 4-dimetil-aminopiridint adtunk hozzá. A kapott oldatot egy éjszakán keresztül kevertettük, majd száradásig betöményítettük. A maradékot 10 ml vízben szuszpendáltuk, a kivált csapadékot leszűrtük, vízzel mostuk, majd megszárítottuk és ily módon 0.48 gramm cím szerinti vegyületet kaptunk, amelyet vizes nátrium-hidrogénkarbonát és etanol elegyében feloldva, sósav hozzáadásával (végső pH = 2) és az oldat betöményítésével tudtunk tovább tisztítani. A cím szerinti vegyületet csapadék formájában nyertük ki.

Olvadáspont: 128 - 131 °C.

MS (molekula ion): 484.4

A termék 'H-NMR spektruma (CDC1₃, δ) a következő karakterisztikus jeleket mutatta:

5.36 (s, 1H); 4.75 (m, 1H); 2.67 (m, 2H); 2.6 (m, 2H).

A termék ¹³C-NMR spektruma (CDC1₃, 100.6 MHz) a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 73.4; 117.1; 122.7; 140.0; 150.5; 171.2; 177.2.

13. Példa

3ü-etoxikarboniloxi-5cc-koleszta-8,14-dién előállítása

0.50 gramm 5a-koleszta-8,14-dién-3P-olt 5 ml toluol és 5 ml piridin oldószer elegyben oldottunk fel jeges fürdő alkalmazásával. 5 ml toluolban oldott 2.3 ml etilkloroformátot csepegtettünk hozzá 5 percig. 30 perc elteltével a jeges fürdőt eltávolítottuk és az elegyet 20 órán keresztül szobahőmérsékleten, majd 2 órán keresztül 60 °C-on kevertettük. A reakcióelegyet vákuum segítségével száradásig betöményítettük, majd 10 ml etanollal péppé zúztuk. Az eljárás eredményeként 0.505 gramm cím szerinti vegyületet kaptunk, amelyet etanolból való átkristályosítással tovább tudtunk tisztítani.

Olvadáspont: 101 - 106 °C.

MS (molekula ion): 456.3

A termék ’H-NMR spektruma (CDC1₃, δ) a következő karakterisztikus jeleket mutatta:

5.30 (s, 1H); 4.50 (m, 1H); 4.12 (q, 2H); 1.24 (t, 3H).

* ·

A termék ^bC-NMR spektruma (CDC1₃, 100.6 MHz) a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 62.6; 116.6; 122.2; 139.4; 150.0; 153.6.

14. Példa

3(3-foszfonooxo-4,4-dimetil-5a-koleszta-8,14-dién előállítása

2.00 gramm 4,4-dimetil-5a-koleszta-8,14-dién-3P-olt 10 ml száraz piridinben oldottunk fel, majd több mint 5 percig 10 ml száraz acetonban oldott 1.66 ml foszforoxiklorid oldatához csepegtettük jeges fürdő alkalmazása mellett. Miután az elegyet 30 percig szobahőmérsékleten kevertettük a csapadékot leszűrtük, majd száraz acetonnal mostuk. A maradékot 70 ml vízben szuszpendáltuk és visszafolyó hűtő alatt 11/4 órán keresztül melegítettük. Miután az elegy szobahőmérsékletűre hűlt a csapadékot leszűrtük, vízzel mostuk és megszárítva 0.93 gramm nyers terméket kaptunk. 0.7 gramm nyers terméket 75 ml 0.1 mólos vizes kálium-hidroxid oldatban oldottunk fel. Az oldatot 10 gramm Amberlite gyantán IR-120(H) szűrtük keresztül, majd vákuum segítségével száradásig bepároltuk. A maradékot 10 ml vízzel péppé zúztuk, a csapadékot leszűrtük, vízzel mostuk, majd megszárítottuk. Az eljárás eredményeként 0.48 gramm cím szerinti vegyülethez jutottunk.

Olvadáspont: 183 - 185 °C

A termék 'H-NMR spektruma (CDC1₃ + 2 csepp CD₃OD) a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 5.36 (s, IH); 3.89 (m, IH).

A termék ^l3C-NMR spektruma (CDC1₃ + 2 csepp CD₃OD, 100.6 MHz) a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 85.1; 116.9; 122.3; 140.9; 150.5.

15. példa

3fi-izonikotinoil-5a-koleszta-8,14-dién előállítása

0.50 gramm 5a-koleszta-8,14-dién-3p-olt 5 ml piridinben oldottunk, majd az oldathoz 1.16 gramm izonikotinoil-klorid-hidrokloridot adtunk. A szuszpenziót visszafolyó hűtő alatt egy éjszakán keresztül melegítettük, majd száradásig betöményítettük. A maradékot 100 ml vízben szuszpendáltuk jeges fürdő alkalmazása mellett. A csapadékot leszűrtük, majd vízzel mostuk és szárítást követően 0.97 gramm nyers terméket kaptunk, amelyet aceton/víz elegyből átkristályosítottunk. Az eljárás eredményeként 0.40 gramm cím szerinti vegyülethez jutottunk.

Olvadáspont: 129 - 131 °C.

A termék 'ΐΊ-NMR spektruma (CDC1₃, δ) a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 8.77 (d, 2H); 7.84 (d, 2H); 5.39 (s, 1H); 4.49 (m, 1H).

A termék ^l3C-NMR spektruma (CDCI3, 50.3 MHz) a következő karakterisztikus jeleket mutatta: 75.0; 117.7; 122.8; 123.3; 138.0; 140.3; 150.5; 150.9; 164.6.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Az (I) általános képletű vegyület alkalmazása a meiózis szabályozására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítása során azzal j el lemezve, hogy a képletben

12·

R és R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, elágazó vagy el nem ágazó szénláncú 1 - 6 szénatomos alkilcsoport, amely halogénatommal vagy hidroxicsoporttal helyettesített lehet vagy R és R azzal a szénatommal együtt, amelyhez mindkettő kapcsolódik ciklopentán vagy ciklohexán gyűrűt képez;

R³ ésR⁴ együtt egy további kötést jelöl azok között a szénatomok között, amelyekhez azok kapcsolódnak, ebben az esetben az R' jelentése hidrogénatom, R és R jelentés pedig vagy hidrogénatom vagy egy további kettős kötést jelöl azok között a szénatomok között, amelyekhez azok kapcsolódnak; vagy

R⁵ és R⁴ együtt egy további kötést jelöl azok között a szénatomok között, amelyekhez azok kapcsolódnak, ebben az esetben az R jelentése hidrogénatom, R és R jelentés pedig vagy hidrogénatom vagy egy további kettős kötést jelöl azok között a szénatomok között amelyekhez azok kapcsolódnak; vagy

R⁶ és R⁴ együtt egy további kötést jelöl azok között a szénatomok között, amelyekhez

3 S 7 azok kapcsolódnak, ebben az esetben az R, R és R jelentése egyaránt hidrogénatom;

ο Π

R és R jelentése hidrogénatom vagy együtt egy további kötést jelölnek azok között a szénatomok között, amelyekhez azok kapcsolódnak; valamint

- 41 R¹⁰ jelentése vagy hidrogénatom vagy egy szulfonil csoportot vagy egy foszfonil csoportot magában foglaló acilcsoport, illetve egy a molekula maradék részével étert alkotó csoport.
2. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R¹ jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport.
3. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R¹ jelentése etilcsoport vagy elágazó vagy el nem ágazó szénláncú 3-6 szénatomos alkilcsoport.
4. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R¹ jelentése elágazó vagy el nem ágazó szénláncú legfeljebb hat szénatomos hidroxialkilcsoport.
5. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R¹ jelentése elágazó vagy el nem ágazó szénláncú legfeljebb hat szénatomos ahidroxialkilcsoport.
6. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R¹ jelentése elágazó vagy el nem ágazó szénláncú halogénatommal helyettesített alkilcsoport.
7. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R¹ jelentése trifuor-metilcsoport.
8. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R² jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport.

• ·

- 42
9. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R jelentése etilcsoport vagy elágazó vagy el nem ágazó szénláncú 3-6 szénatomos alkilcsoport.
10. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R jelentése elágazó vagy el nem ágazó szénláncú legfeljebb hat szénatomos hidroxialkilcsoport.
11. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R jelentése elágazó vagy el nem ágazó szénláncú legfeljebb hat szénatomos ahidroxialkilcsoport.
12. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R jelentése elágazó vagy el nem ágazó szénláncú halogénatommal helyettesített alkilcsoport.
13. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R jelentése trifuor-metilcsoport.
14. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve,

1 2 hogy R és R azzal a szénatommal együtt, amelyhez azok kapcsolódnak ciklopentán gyűrűt képeznek.
15. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve,

1 2 hogy R és R azzal a szénatommal együtt, amelyhez azok kapcsolódnak ciklohexán gyűrűt képeznek.

- 43
16. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R³ és R⁴ együtt egy további kötést jelöl azok között a szénatomok között, amelyekhez azok kapcsolódnak és az R⁵ jelentése hidrogénatom.
17. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R⁵ és R⁴ együtt egy további kötést jelöl azok között a szénatomok között, amelyekhez azok kapcsolódnak és az R jelentése hidrogénatom.
18. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R⁶ és R⁴ együtt egy további kötést jelöl azok között a szénatomok között, amelyekhez azok kapcsolódnak és az R³, R⁵ és R⁷ jelentése hidrogénatom.
19. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R⁶ és R⁷jelentése hidrogénatom.
20. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R⁶ és R⁷ együtt egy további kötést jelöl azok között a szénatomok között, amelyekhez azok kapcsolódnak.
21. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, o Q hogy R és R jelentése hidrogénatom.
22. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R⁸ és R⁹ együtt egy további kötést jelöl azok között a szénatomok között, amelyekhez azok kapcsolódnak.
23. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R¹⁰ jelentése hidrogénatom.

- 44
24. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R¹⁰ jelentése valamely 1 - 20 szénatomos savból származtatott acilcsoport.
25. A 24. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy az R¹⁰ csoportot jelentő acilcsoport acetilcsoport, benzoilcsoport, pivaloilcsoport, butirilcsoport, nikotinoilcsoport, izonikotinoilcsoport, hemi szukcinoilcsoport, hemi glutaroilcsoport, butilkarbamoilcsoport, fenilkarbamoilcsoport, butoxikarbonilcsoport, terc-butoxikarbonilcsoport, valamint etoxikarbonilcsoport.
26. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy az R¹⁰ csoportot jelentő alkilcsoport aralkilcsoport, alkiloxi-alkilcsoport vagy alkanoiloxicsoport, amely csoportok mindegyike legfeljebb 10 szénatomos, előnyösen legfeljebb 8 szénatomos, amely a molekula fennmaradó részével étert képez.
27. A 26. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R¹⁰ jelentése metoxi-metilcsoport vagy pivaloiloxi-metilcsoport.
28. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R¹⁰ jelentése szulfocsoport.
29. Az 1. igénypont szerinti vegyület alkalmazása azzal jellemezve, hogy R¹⁰ jelentése foszfocsoport.
30. Emlős csíra sejtek meiózisának szabályozási eljárása azzal jellemezve, hogy az 1 - 29. igénypontok bármelyikében hivatkozott vegyület hatásos mennyiségét adjuk az ilyen jellegű kezelésre szoruló csírasejthez.

- 45
31. A 30. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az 1 - 29. igénypontok bármelyikében hivatkozott vegyületet a csírasejthez az említett sejt gazdaemlősének beadva juttatjuk el.
32. A 30. vagy 31. igénypontok szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a csírasejtek meiózisa során az oocyták működését szabályozzuk
33. A 30. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az 1 - 27. igénypontok bármelyikében hivatkozott vegyületet az oocytákhoz ex vivő adjuk.
34. A 31. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a csírasejtek meiózisa során a spermium előalakok működését szabályozzuk.