CN1341147A - 减数分裂活化甾醇增大着床率 - Google Patents

减数分裂活化甾醇增大着床率 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种改善所获得的与体外受精和前成胚移植处理有关的卵母细胞和前成胚的生存力和怀孕潜力的新原理的用途。更明确地,通过提高在其中发生体外受精的培养基中减数分裂活化甾醇(MAS)的含量来改善。这通过将一个或多个卵母细胞与精子一起暴露和培养于一种包括至少一种减数分裂活化甾醇(MAS),一种MAS类似物,和/或能够内源性刺激至少一种MAS累积的添加剂或多种添加剂的培养基中而实现。优选的添加剂是FSH和EGF。

Description

减数分裂活化甾醇增大着床率
发明领域
本发明涉及一种改善所获得的与体外受精和前成胚转移处理有关的卵母细胞和前成胚的生存力和怀孕潜力的新原理的用途。更明确地，本申请涉及通过提高在其中至少发生体外受精的培养基中的，并且也优选地在其中在体外受精之前培养卵母细胞的培养基中的，减数分裂活化甾醇的含量改善卵母细胞和前成胚的妊娠潜力。
发明背景
寻求不育治疗的夫妇，几乎没有例外地，将接受体外受精，其中发生卵母细胞和精子之间的体外会合。妇女通常正在接受用外生的激素治疗，从而调节和促进卵巢形成多于在自然月经周期期间见到的通常一个排卵前卵泡。本治疗的一部分包括从卵巢的排卵前卵泡中回收卵母细胞从而使卵母细胞成熟和/或体外受精。在体外受精和前成胚发育之后，将1到3个前成胚放置到妇女的子宫，她因此有怀孕和生育自己的孩子的可能。这现在是一项公认的治疗，它已经大规模进行了超过20年。
虽然实现怀孕的可能性这些年来已经增加了，但是回收的卵母细胞经历受精和前成胚发育的频率已经保持显著恒定，大约是60-70％。然而，被置换的前成胚仅有大约15-25％着床并发育成后代。因此，回收的卵母细胞仅有一部份产生孕体。虽然为什么体外发育的前成胚只有这样小的一部份拥有着床能力的原因在很大程度上还不知道，但是已经提出了数种解释(Salha等，1998)：卵泡/卵母细胞缺乏足够的成熟；卵泡/卵母细胞已经被暴露于最适度以下浓度的促性腺激素；卵母细胞的培养条件可能没有反映雌性生殖道内腔液的条件；卵母细胞遭受最适度以下的培养条件。
在其天然的环境下，在第一次位于输卵管期间在包围着卵母细胞的卵泡液的海洋中的卵母细胞被从卵泡中排出。卵泡液与来自输卵管的分泌物混合，确定了在其中发生受精的环境。卵泡液含有许多据信是增加卵母细胞细胞核和卵母细胞细胞质成熟的物质。最近的报告显示：特别是促卵泡激素(FSH)和表皮生长因子(EGF)参与了这些成熟过程。他们都存在于卵泡液，并且输卵管特别在排卵周围合成EGF(Morishige等，1993)。
哺乳动物卵母细胞在以存在核膜，和/或胚泡(GV)为特征的第一次减数分裂的前期内被停滞。当卵母细胞恢复减数分裂时，利用胚泡崩解(GVBD)，又称为卵母细胞成熟，使其被显示。在卵泡中，因为在卵泡液中存在的次黄嘌呤(HX)和其它嘌呤的抑制成熟的作用，卵母细胞停留在GV期。当在存在生理浓度的次黄嘌呤的条件下培养时，培养中卵母细胞也保持在GV期，如果HX被除去，则恢复减数分裂。HX对于在培养的小鼠丘包封的卵母细胞(cumulus enclosed oocytes)，以及失去丘的裸露卵母细胞中减数分裂恢复的抑制作用，可以通过加入减数分裂活化甾醇(meiosis activating sterols)克服，例如FF-MAS(4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇)或T-MAS(4，4-二甲基-5α-胆甾-8，24-二烯-3β-醇)。从人的卵泡液分离和鉴定FF-MAS，并从牛睾丸分离和鉴定T-MAS(Byskov等，1995)。这些甾醇是胆固醇生物合成途径中的中间体，并且是羊毛甾醇的直接产物(Schroepfer等，1972)(图1)。
由CYP51基因编码的细胞色素P450羊毛甾醇14α-脱甲基酶(P45014DM)催化从羊毛甾醇合成FF-MAS。FF-MAS被甾醇14-还原酶(Δ14R)的活性转变为T-MAS。药物AY9944-A-7(AY)，选择性地抑制Δ14R的活性，它在二十世纪五十年代被用来降低血浆胆固醇。AY的化学结构与甾醇和胆固醇生物合成中的中间体完全无关(见综述：Mercer，1993)。几项研究已经显示，当在存在AY的条件下培养时，产生胆固醇的细胞，累积4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇(也就是说，FF-MAS)。已经显示，AY(0.1μM)在培养的大鼠肝细胞中起一种Δ14R竞争性抑制剂的作用。
已经显示，在体外生理浓度的FSH在小鼠中促进卵母细胞成熟，还在人和猴卵母细胞的胚泡期内的卵母细胞中促进卵母细胞成熟(Schramm和Bavister 1995)。已经显示，FSH刺激丘细胞合成正促进成熟的物质(Byskov等，1997)。然而，最近的一项研究显示，FSH降低在存在FSH的条件下生长的一组前成胚的三倍性比率，提示FSH在减数分裂最后阶段的一个特异性作用(Merriman等，1998)。进一步地，通过将这些前成胚放置到假孕的小鼠中，已经显示，在卵母细胞成熟培养基中存在FSH的组中，较之于对照培养基，着床(implantation)的数量提高了，并且几乎相似于体内成熟的卵母细胞的着床数量。
已经表明，EGF在许多物种中增加卵母细胞成熟，例如牛、猪、小鼠和大鼠，并且，一项研究发现：FSH似乎上调了大鼠粒层细胞中EGF受体的表达(Maruo等，1993)。EGF促进小鼠二细胞发育成胚泡(Morishige等，1993)。在人的卵母细胞中结果较不清楚。6小时的EGF浓度为1和10ng/ml的暴露没有反映在从IVF程序获得的卵母细胞的受精率增加中(Gomez等，1993)，尽管Goud等(1998)发现：EGF(2ng/ml)增加培养30小时后达到中期II(MII)的胚泡卵母细胞的数量，并得出结论：EGF改善体外人类卵母细胞的细胞核和细胞质成熟。
在此即定的处理期间，体外受精在基础培养基中进行(Salha等，1998；Trounson和Gardner 1993)。在这样的基本培养基中，这些卵母细胞缺乏天然的卵泡液环境。因此，例如，Merriman等1998洗涤这些卵母细胞，在转移到在其中发生体外受精的基本培养基中之前在含有FSH和EGF的培养基中培养
本发明详述
本发明所解决的一个问题是体外创造的前成胚的非常低的着床率(rate of implantation)。这通过将一个或多个卵母细胞与精子一起暴露和培养于一种培养基中而实现，此培养基包括至少一种减数分裂活化甾醇(MAS)-MAS是位于羊毛甾醇和胆固醇之间的代谢途径中任何甾醇，一种MAS类似物，和/或能够内源性刺激至少一种MAS累积的添加剂或多种添加剂。
根据本发明，在其中发生实际的体外受精的培养基，基于在实施例中给出的发现。因此，在实施例2中证明，与被暴露于对照培养的那些比较，人类的着床率在体外受精期间被暴露于含有FSH和EGF的培养基的卵母细胞和前成胚的组中显著更高。而且，与对照培养基比较，FSH和EGF的存在引起FF-MAS和T-MAS在卵母细胞已经在其中生长的培养基中累积。在实施例1中证明，在小鼠中，FSH和EGF在丘包封的卵母细胞的培养中的存在，通过减弱T-MAS向胆固醇的转变导致内生性合成的FF-MAS和T-MAS的累积。
实施例1和2不仅表明，当在含有体内观察的那些浓度左右的EGF和FSH的培养基中进行体外受精时，着床率显著提高，而且证实根本的机制是MAS的内源性生产，而且其它实施例强调了这些发现。实施例3证明，在体外FSH和EGF提高了小鼠卵母细胞的卵母细胞成熟，并且，FSH和EGF的组合似乎增强了这个作用。实施例5证明，一种甾醇14-还原酶抑制剂(AY9944-17)按照剂量依赖性的方式刺激丘包封的小鼠卵母细胞的卵母细胞成熟，并且，AY化合物在丘包封的小鼠卵母细胞的培养中的存在，通过衰减T-MAS向胆固醇的转变，引起内生性产生的FF-MAS和T-MAS的累积。这些发现第一次证明，小鼠的丘卵母细胞复合体能够在存在AY的条件下产生并累积FF-MAS。在实施例6中，用一种胆固醇生物合成抑制剂，两性霉素B，获得了相似的结果。
因此，增强MAS的内源性生产代表了一种增大体外受精的前成胚的怀孕潜力(pregnancy potential)的新机制。
因此，本发明的一个方面涉及包括将一个或多个MII卵母细胞与精子一起暴露和培养于一种培养基中之步骤的体外受精的方法，此培养基包括至少一种减数分裂活化甾醇(MAS)-MAS是代谢途径中羊毛甾醇和胆固醇之间的任何甾醇，一种MAS类似物，和/或能够内生性刺激至少一种MAS累积的添加剂和多种添加剂。优选体外受精是人类的卵母细胞的体外受精。
体外受精程序优选地如下进行：将完好的丘卵母细胞复合体定位在卵泡抽出物，并转移到包括至少MAS，一种MAS类似物，和/或能够内生性促进至少一种MAS累积的添加剂或多种添加剂的培养基中。数小时之后，将纯化的精子加入丘包封的卵母细胞，发生体外受精，这可在次日(培养16-24小时)通过在卵母细胞中存在两个原核而被显示。具有两个原核的卵母细胞称为受精卵。继续培养另外的24-48小时通常引起受精卵最初几次不多的有丝分裂，在此情形中现在使用术语前成胚。因此，前成胚由至少两个细胞组成(那两个细胞被称为卵裂球(blastomers))。卵母细胞被回收之后通常48-72小时，在体外受精后观察到前成胚的存在，并且随后将前成胚放回到妇女的子宫以进一步发育。
在本发明的一个实施方案中，持续卵母细胞的暴露和培养，直到形成受精卵和/或前成胚。受精卵和/或前成胚的形成通常在16-24小时之内出现。在一个有关的实施方案中，一个或多个被暴露和培养的卵母细胞是中期(Metafase)II(MII)的卵母细胞。
到MII为止，理解了经历胚泡分解，存在有第一极体并具有或多或少的扩展的丘复合体的卵母细胞。这些卵母细胞很容易被操作卵母细胞的领域中的熟练技术人员识别。MII的卵母细胞是所制备的并且准备给精子受精的卵母细胞的类型。
本发明的一个实施方案涉及一种体外受精方法，包括如下步骤：
    (a)在培养基中培养一个或多个GV卵母细胞，此培养基包括
至少一种减数分裂活化甾醇MAS，一种MAS类似物，和/或能够内生
性促进至少一种MAS累积的添加剂或多种添加剂；由此形成一个或
多个MII卵母细胞；
    (b)将步骤(a)的一个或多个MII卵母细胞与精子一起暴露和
培养于培养基中，此培养基包括至少一种MAS，一种MAS类似物，
和/或能够内生性促进至少一种MAS累积的添加剂或多种添加剂；
持续此暴露和培养，直至形成受精卵和/或前成胚。
在本发明的一个方面，用步骤(a)和步骤(b)中同样的培养基实施本方法。由此贯穿本过程维持了天然的环境，并省略了一个洗涤步骤。在本发明的另一个方面，在步骤(a)和步骤(b)之间引进了一个洗涤步骤。
能够内生性促进至少一种MAS累积的添加剂或多种添加剂(例如，FSH和EGF)可正影响成熟，并且通过两种不同的机制为丘-卵母细胞复合体提供减数分裂促进作用。一种可以是通过对于直接影响卵母细胞的丘细胞的正刺激。丘细胞也可向培养基释放物质，这些物质可以诱导减数分裂的恢复，并且维持培养基中其它卵母细胞的进一步成熟。因此，通过在含有添加剂或多种添加剂的相同的培养基中将数种丘-卵母细胞复合体一起共培养，从而改善着床率，受精率，和/或卵母细胞的生存力是本发明的又一个方面。这些在卵巢刺激过程期间已经经历了最适度之下的成熟或者不能够按照生理上正确方式恢复减数分裂的卵母细胞-丘复合体，在体外可以在通过将数个卵母细胞-丘复合体一起在存在添加剂或多种添加剂的条件下共培养进行刺激之后，通过从更成熟的卵母细胞-丘复合体释放物质，从而接受一个正刺激。共培养的生存力增加和将添加剂或多种添加剂加入此培养基中，将会导致这些卵母细胞的一个更适度的成熟，这在卵巢刺激期间缺乏一个适宜的刺激以恢复减数分裂。因为由最适度成熟的丘包封的卵母细胞内生性地产生的MAS被释放到培养基中，所以较不适度成熟的卵母细胞将从此刺激受益，并被诱导恢复减数分裂。回收的卵母细胞的受精能力将会增加，并且可能增加受精率。当通过在含有添加剂或多种添加剂的培养基中的体外受精创造生存力更高的前成胚时，与不育治疗有关的怀孕的可能性将会增加。
在所说的具有1)诸如一种具有促卵泡活性(也就是说卵泡刺激激素(FSH))的糖蛋白的天然存在的激素，等电点大于5.0的特定的FSH同工型体的混合物，和具有类似表皮生长因子(EGF)的活性的生长因子的，或具有2)按照这样一种方式干扰将羊毛甾醇转变成胆固醇的生物合成途径以致中间体累积，导致MAS浓度增加的物质的培养基中，MAS含量的增加。本发明的一个方面涉及以上提到的物质的作用，这增加了卵巢的卵泡的丘细胞的MAS生产，并且因此增加卵母细胞经历正常的前成胚发育的能力，导致在所使用的与辅助生殖和不育治疗有关的培养期间获得的衍生的前成胚的着床和受孕潜力增加。
目前考虑，MAS的内生性生产在与卵母细胞连接的或在卵母细胞周围的丘细胞中发生。因此，在本发明的一个实施方案中，将没有或几乎没有丘细胞的卵母细胞与精子一起暴露和培养于包括MAS或一种MAS类似物的培养基中，从体外受精产生的前成胚的着床率被提高了。在另一个实施方案中，将丘包封的卵母细胞与精子一起暴露和培养于包括MAS或一种MAS类似物的培养基中，从体外受精产生的前成胚的着床率被提高了。
在本发明的一个优选实施方案中，培养基包括能够内生性促进至少一种MAS累积的添加剂或多种添加剂。在本发明的一个相关方面，将2-30个卵母细胞一起培养和暴露，例如2-25，2-20，或仅2-15个卵母细胞，其中这些之中的若干(例如少于50％，比如小于40％，小于30％，或者小于20％的卵母细胞)是丘包封的。
本发明的另一个主要方面涉及包括至少一种减数分裂活化甾醇(MAS)——MAS是代谢途径中位于羊毛甾醇和胆固醇之间的任何甾醇，一种MAS类似物，和/或能够内生性促进至少一种MAS累积的添加剂或多种添加剂的培养基用于体外受精的用途，由此体外受精产生的前成胚在体内具有改善的着床率。
又一个实施方案涉及至少一种减数活化甾醇(MAS)——MAS是代谢途径中位于羊毛甾醇和胆固醇之间的任何甾醇，一种MAS类似物，和/或能够内生性促进至少一种MAS在丘包封的卵母细胞中累积的添加剂或多种添加剂制备体外受精的培养基的用途，在体内从此体外受精产生的前成胚具有改善的着床率。
术语减数分裂活化甾醇(MAS)是指在胆固醇生物合成中在羊毛甾醇和胆固醇之间的一种中间体的物质(见图1)。MAS的两个实例是FF-MAS(4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇)或T-MAS(4，4-二甲基-5α-胆甾-8，24-二烯-3β-醇)。一种MAS将优选是甾醇。MAS化合物的实例在WO96/00235，WO96/27658，WO97/00884，WO98/28323，WO98/54965和WO98/55498在被提到。MAS优选地选自FF-MAS，T-MAS，1-甲基-酵母甾醇，和酵母甾醇。
在另一个实施方案中，一种MAS类似物被加到培养基中。一种MAS类似物被定义为一种引起可与已公开之MAS效应比较的效应的物质。这可能是已经公开的对于卵母细胞成熟(Hegele-Hartung等，1999)或GVBD(Byskov等，1995)或，优选地对于如同实施例2中所描述的着床率的效应。更明确地，MAS和MAS类似物是在下文的实施例7中所述的测试中具有显著高于对照的胚泡崩解(breakdown)(在下文中称为GVBD)百分数的化合物。优选的MAS和MAS类似物是具有至少50％的，优选地至少80％的GVBD百分数的那些。
本发明的一个方面涉及增加卵巢卵泡丘细胞MAS生产，并因此增强卵母细胞经历正常的前成胚发育，导致在所使用的与辅助生殖和不育治疗有关的培养期期间获得的衍生前成胚的着床和受孕潜力增大的添加剂或多种添加剂的作用。添加剂或多种添加剂被定义为导致在存在此添加剂或多种添加剂的条件下培养的丘包封的卵母细胞中MAS的相对含量之间的至少为2的比值的添加剂或多种添加剂，在培养的丘包封的卵母细胞中MAS的相对含量通过如下方式测定：在从小鼠去除卵巢之前48小时用外源的促性腺激素刺激雌性小鼠，并通过穿刺单个卵泡从卵巢回收丘包封的卵母细胞，并将回收的卵母细胞在补充了3mg/l牛血清白蛋白，5mg/l人血清白蛋白，2mM/l L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素，4mM次黄嘌呤和3H-mevalonat的α-MEM培养基中在37℃，100％湿度和含5％CO2的空气中培养24小时，此后用50μl 0.3MNa2PO4pH＝1酸化，用五倍过量的正-庚烷∶异丙醇(3∶1v/v)有机萃取三次，利用HPLC从有机相纯化MAS，测定在存在添加剂或多种添加剂的条件下培养的丘包封的卵母细胞和在不存在添加剂和多种添加剂的条件下培养的丘包封的卵母细胞之间每个丘包封的卵母细胞的放射性的比值。
优选此添加剂选自诸如FSH和类似物的促性腺激素，诸如EGF和类似物的生长激素，胆固醇生物合成抑制剂，诸如抑制甾醇Δ14-还原酶的化合物的，例如AY9944-A-7，或抑制将T-MAS转变成酵母甾醇的4-脱甲基酶的化合物，活化细胞色素P450羊毛甾醇14α-脱甲基酶的化合物，以及具有两性霉素样作用的化合物。
术语FSH是指具有卵泡-刺激活性的包括FSH的异二聚体的氨基酸序列和垂体衍生蛋白的链的蛋白。然而，术语FSH也定义来指活化卵巢的丘细胞的FSH受体的物质。这样的物质能够活化位于丘细胞上的FSH受体，由此启始减数分裂的恢复。这样的物质的实例可以是从FSH分子的完整序列衍生的寡肽或其衍生物。
术语EGF是指所有活化EGF受体(例如EGF和转化生长因子-α)并引起MAS在丘-卵母细胞复合体中累积的所有蛋白。其它可能拥有相似活性的物质包括象活化素，胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II的物质。
术语胆固醇合成抑制剂是指以导致减数分裂活化甾醇累积的方式干扰胆固醇生物合成的物质。AY 9944和两性霉素是这样的化合物的实例。
优选此添加剂是一种促性腺激素和一种生长激素的联合，例如EGF和FSH的联合。然而，数据提示EGF和FSH单独能够内生性促进至少一种MAS累积。优选EGF的浓度在1和10ng EGF/ml，例如9ng/ml，8ng/ml，7ng/ml，6ng/ml，5ng/ml，4ng/ml，或3ng/ml，优选地2ng EGF/ml。
EGF和FSH的联合对着床率和对卵母细胞成熟具有协同作用，是本发明的又一个的方面。
正如在实施例4中说明的一样，在体外，低酸性和中酸性的具有大于5.0的pI的FSH同工型(isoform)在诱导小鼠的丘包封的卵母细胞恢复减数分裂中比酸性FSH同工型显著更有效。因此优选一种添加剂是FSH，其中FSH是具有大于5.0的等电点的FSH同工型。术语FSH同工型是指具有FSH的氨基酸序列，但是在其寡糖结构，包括末端唾液酸化和/或硫酸化程度不同的，产生不同的等电点pI(也就是说，在蛋白质的净电荷是零处的pH值)的蛋白。FSH同工型利用酶或化学修饰或优选地利用天然存在的没有分级的FSH的层析聚焦获得。碳水化合物链用这些不影响氨基酸序列的处理去除。这样的处理的实例是引起部分脱唾液酸化的氟化氢和神经氨酸酶处理。
FSH衍生自天然存在的FSH，例如从尿提取的FSH，或来自重组FSH。FSH的优选浓度在2和200IU FSH/l之间，例如5和50IU FSH/l之间，比如50IU/l，40IU/l，30IU/l，20IU/l，或10IU/l，优选地是25IUFSH/l。
本发明的又一个方面涉及诸如FSH和EGF的多种添加剂与一种MAS或一种MAS类似物的联合。当体外受精在用油覆盖培养基中进行时，这个实施方案是特别优选的。典型地，此培养基是水溶性的，并且，此油是水不溶性的，例如矿物油。
优选用主要由各种盐组成的简单培养基(simple medium)作为起点。简单培养基的实例是M16，EBSS，Ham-F10，Whitten，Brinster，BWW，T6，Eagle’s，HTF，CZB，MTF，P1和Menezo’s B3培养基。对于本领域中熟练技术人员，如何制备培养基的详细描述参考资料见Trounson和Gardner，第98-101页，是充份公知的。
优选此培养基包括抗生素(例如青霉素和/或链霉素)和人血清白蛋白(HSA)。还优选此培养基进一步包括一种pH调节成分以维持pH在7.3和7.5之间。一种pH调节成分的一个优选实例是碳酸氢钠(bicarbonate)。甚至进一步优选培养基具有280-300mOsmol/kg的摩尔渗透压浓度。正如将会容易地被本领域中的熟练人员承认的一样，优选此培养基还含有丙酮酸盐。
术语生殖培养基是指可在其中进行体外受精和前成胚培养的培养基。因此，此培养基能够维持培养中的卵母细胞和精子的生存力，促进卵母细胞与精子受精，并且支持前成胚发育。
参考文献
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实施例
实施例1：培养期间，减数分裂活化甾醇在用FSH和EGF刺激的小鼠的丘包封的卵母细胞中之内源性产生
用外生的促性腺激素(每只小鼠7.5IU；Gonadoplex，Leo，Ballerup，Denmark)刺激总共20只不成熟的小鼠。用促性腺激素注射之后四十八小时，处死小鼠并去除卵巢。通过穿刺单个卵泡回收卵母细胞，并且收集在补充了3mg/l牛血清包蛋白，5mg/l人血清白蛋白，2mg/lL-谷氨酰胺，100IU/l青霉素，100μg/ml链霉素和4mM次黄嘌呤的培养基(α-MEM，Gibco，BRL)中。分离了总共大概650个丘包封的卵母细胞。将丘包封的卵母细胞(CEO)随机地分成两个各由350个CEO组成的相等集合。其中一个集合用做对照，并培养于没有加FSH和EGF的对照培养基中。另一集合用做测试，并将卵母细胞在存在25IU/L人FSH(GonalF，Serono Nordic，Sweden)和2ng/ml EGF(Sigma，USA)的条件下培养。此外，测试和对照培养都接受放射性标记的甲羟戊酸(3H-甲羟戊酸)(90μCi/3H-甲羟戊酸；30μCi/mmol：NEN Life Science Products.Boston，MA，USA)，它是甾醇和类固醇合成的天然前体。各孔体积都是400μl。
在24小时的培养期之后(37℃，100％湿度，在含有5％CO2的空气中)，在用50μl 0.3M Na2PO4，pH1.0酸化之后利用有机萃取从培养基和CEO去除类固醇和甾醇。加入五倍过量的正庚烷-异丙醇(3∶1v/v)混合物并剧烈摇晃3小时。分离有机相，并且用两个连续的HPLC步骤纯化羊毛甾醇，FF-MAS，T-MAS，胆固醇和孕酮(详细请见Baltzen和Byskov 1999)，包括一个主要的正相柱(ChromSpher-TM Si，5μm，250×4.6mm；移动相：99.5％正庚烷，0.5％异丙醇(v/v)；流动相：1.0ml/min；温度：28℃)和第二个反相柱(LiChrospher-TM RP-8，5μm，250×4.6mm；移动相：92.5％乙氰，7.5％水(v/v)；流速：1.0ml/min；温度40℃)。选择在第二个柱子上纯化的部份被干燥并重新溶解于100μl乙氰。含有羊毛甾醇，FF-MAS，和T-MAS的部份在加载到第二个HPLC柱子上之前，用相应物质的冷标准示踪，以避免放射性甾醇由非特异性结合引起的损失。
监测各纯化部份中的放射性。羊毛甾醇，FF-MAS，T-MAS和胆固醇的生物合成通过测量被掺入的放射性而被定量。FSH/EGF的作用通过计算测试和对照培养中每个CEO的放射性的比值来评价。
表1在培养的具有和没有FSH和EGF刺激的CEO之间掺入甾醇和类固醇中的放射性的比值
       羊毛甾醇  FF-MAS  T-MAS  胆固醇  孕酮
       0.9       4.0     2.2    0.2     2.1
在表1中给出的结果证明，FSH和EGF在CEO的培养中的存在通过衰减T-MAS向胆固醇的转变引起内生性产生的FF-MAS和T-MAS的累积。正如羊毛甾醇的比率几乎没有受到影响而胆固醇被减少了大约5倍这个事实所说明的一样，FSH和EGF对于FF-MAS和T-MAS的累积产生了了一个特异性的作用。然而，FSH和EGF也刺激孕酮的产生。
实施例2：在存在FSH和EGF的条件下培养的前成胚的显著的着床率
为了评价用FSH和EGF加富的卵母细胞培养基的作用，五十七个经历体外受精治疗(IVF)的妇女参加了本研究。对本研究使用了下面的包括标准：i)妇女的年龄在40岁以下，ii)间隔在26到32天的规律的月经，iii)正常的治疗前促性腺激素水平(小于10IU/L的FSH和LH)，iiii)在卵母细胞回收时超过12个排卵前卵泡。排除标准：i)其中使用细胞质内精子注射(ICSI)的案例，ii)内分泌异常引起的不育，例如多囊卵巢。对于垂体下调，所有的妇女都接受了促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa；每日0.5mg buserelin)，在周期第21天开始并持续10-14天。在完成卵巢静止后，使用每日150-225IU重组FSH(Gonal F，Serono Nordic，Sweden)的剂量与buserelin一起(每日0.2mg)，开始用外生的促性腺激素刺激。当多于两个卵泡测量的直径超过17mm时，则诱导排卵(10000IUhCG)。使用超声引导的经阴道吸引术(ultrasoud guided transvaginalaspiration)回收了卵母细胞。将一半回收的卵母细胞(每隔一个)培养在没有加FSH和EGF的标准培养基中，并将另一半在补充了2ng重组EGF/ml和25IU/L重组FSH(Gonal F)的培养基中培养最初24小时。标准的培养基由Eagles平衡盐溶液组成，补充碳酸氢钠(NaHCO3 2.1m/L)，丙酮酸(11mg/L)，人血清白蛋白(10mg/ml)，和青霉素(100IU/L)。使用之前，将培养基调整到280mOsmol/kg，和pH7.3-7.4并过滤除菌。在发生体外受精的24小时时间之后，去除此培养基，用在两组中都相似的标准培养基置换。继续培养48小时(达到总共72小时)，此后进行前成胚的放置)。由此每一个妇女作为她自己的对照。总体上形态看上去最好的前成胚决定从其中选择移植的前成胚的组。选择形态上看上去最好的前成胚的标准按照Yding Andersen等(1991)做。因此，这两组前成胚没有被混合，使得以后可能明确地确定从其中产生怀孕的组。
这57个妇女中有三个具有在体外不分裂的卵母细胞，且有三个——因为可能发展的过度刺激症状——将所有已发育的前成胚冷藏。
表2患者特征和经历IVF治疗的妇女的卵巢刺激的结果
                       对照培养基   FSH/EGF培养基妇女的数量                 24           27年龄                       31.4(24-39)  30.7(26-37)治疗前FSH的水平(IU/l)      5.5±0.3     6.5±0.4治疗前LH的水平(IU/l)       5.7±0.6     4.9±0.3生育诊断输卵管因子                 15(63％)     18(68％)子宫内膜异位               6(25％)      4(15％)自发的                     3(12％)      5(18％)刺激天数                   9.9±0.2     9.4±0.2外源性FSH(IU)              1800±90     1725±90雌二醇周期第2天(pmol/l)    115±15      112±12雌二醇周期第9天(pmol/l)    2980±450    3860±500
表3 IVF治疗和衍生前成胚的着床率结果
                       对照培养基   FSH/EGF培养基妇女的数量                 24           27卵母细胞的数量             448          456受精的卵母细胞的数量       327(73％)    356(78％)NS前成胚的数量               315(70％)    338(74％)NS具有≥3个原核的            23(5.1％)    24(5.3％)卵母细胞的数量前成胚复位的数量           24           27所放回的前成胚的数量       45           52怀孕测试阳性的数量         6(25％)      15(56％)p＜0.03临床怀孕的数量             6(25％)      13(48％)NS着床率                     6(13％)      18(38％)p＜0.025
以上在表2和3中给出的所监测的参数中，没有一个在两组之间显著不同，除了着床率和阳性怀孕测试的数量之外，与对照的参数比较，其在被暴露于含有FSH和EGF的培养基中的卵母细胞/前成胚组中显著较高。
从这两组中每一组的40个卵母细胞收集培养基，并合并成来自对照培养基的一个集合和来自用FSH和EGF加富的培养基的一个集合。使用巴斯德吸管手动吸取直接从四孔板收集培养基。在这两个集合中的类固醇和甾醇如同在实施例中所描述的一样提取。
表3a卵母细胞已经在其中生长的具有或没有富集FSH和EGF的培养基中的MAS定量
             羊毛甾  FF-      T-       FF+T-     胆固醇  孕酮
             醇(ng)  MAS(ng)  MAS(ng)  MAS(ng)   (μg)   (μg)
对照培养基   ＜7     ＜4      ＜7      ＜11      ＜15    1.7
FSH/EGF 培   90      117      94       210       13      5.4
养基
在表3a中给出的结果显示，FSH和EGF的存在引起FF-MAS和T-MAS，以及它们的前体羊毛甾醇的累积，与在其中不能检测到这些物质的对照培养基形成对比。胆固醇浓度维持不变，而孕酮含量在用FSH和EGF富集的培养基中也似乎增加了。
实施例3：FSH和EGF对体外培养的小鼠卵母细胞的恢复减数分裂的作用
不成熟的雌性小鼠(B6D2-F1品系C57B1/2J)在受控制的光照和温度条件下饲养，自由地接触食物和水。当小鼠重10-16克时进行卵巢的刺激，包括腹膜内注射含有(7，5U/小鼠)的Gonadoplex(Leo，Copenhagen，Demark)。44-48小时以后利用子宫颈离位处死小鼠。用于卵母细胞培养的培养基由α-Minimum Essential Medium(α-MEM)组成，含有Eagles平衡盐溶液(EBSS)，4mM次黄嘌呤(HX)，3mg/ml牛血清白蛋白，0.23mM丙酮酸，2mM谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100mg/ml链霉素。回收卵巢，并将其放置于HX-培养基中在其中进行最初的清洗并去除结缔组织。通过使用25号针头穿刺单个卵泡从卵巢分离卵母细胞。卵母细胞的分离在HX-培养基中进行，以防止恢复减数分裂，直至准备好进行测试。然后在每个实验开始之前在对照培养基中将卵母细胞洗涤三次。丘包封的卵母细胞在4-孔板(Nunclon，Roskilde，Denmark)上单独培养于37℃，100％加湿的5％CO2和95％空气环境中，各孔的0.4ml培养基含有对照培养基或补充了FSH和/或EGF添加的培养基。培养期是22-24小时。到培养期结束为止，通过在倒置显微镜上检查卵母细胞来计数胚泡崩解(GVBD)。计算了具有GVBD的卵母细胞/卵母细胞总数的百分数。
表4 FSH和EGF对于在体外培养的小鼠卵母细胞中恢复减数分裂的作用
                        卵母细胞的数量    GVBD的数量  ％GVBD对照培养基                  154               29          19a，b，cFSH(10IU/l)                 162               73          45bEGF(0.5ng/ml)               68                21          31c，dFSH(10IU/l)+EGF(0.5ng/ml)   63                33          52a，d
具有相似的字母的值显著差异P＜0.05
在表4中给出的结果证明，在体外FSH和EGF增强小鼠卵母细胞的卵母细胞成熟，并且证明FSH和EGF的联合似乎给出一个增强的效应。
实施例4：不同的FSH同工型对于体外培养的小鼠卵母细胞恢复减数分裂的作用
进行了相似于在实施例3中所描述的那些的实验。
使用糖蛋白提取并且在此后进行层析聚焦，从人的垂体提取物分离了FSH同工型。在被应用来在小鼠卵母细胞中诱导减数分裂恢复之前，将FSH同工型对于对照培养基彻底地透析。
以连续稀释测试了各FSH同工型部份，并测定了50％的卵母细胞恢复减数分裂的稀释度(50％GVBD的等效剂量(ED50％GVBD)，并对于各FSH部份重复测定3-5次。在各四孔板上，一个孔永远用做对照并含有在没有FSH的对照培养基中培养的卵母细胞。每一孔含有的CEO在30和40之间。
使用两种方法监测所测试的同工型部份的FSH浓度：1)使用特异性兔抗FSH抗体和125I-标记的人FSH作为示踪剂的放射-免疫分析。结合的和游离的放射性利用包被到右旋糖苷颗粒上的抗-兔免疫球蛋白分离。含有25IU/l的样品的分析内和分析间变异分别是7％和5％，2)一个稳定表达重组人FSH受体并且一旦FSH刺激就释放cAMP的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-cell)系。由FSH同工型部份所生成的cAMP的量与标准品相关。分析内和分析间变异分别是15％和18％。
表5 FSH同工型级份对于在小鼠卵母细胞中恢复减数分裂的作用FSH同工型级份  卵母细胞  每孔卵母细胞  ED50％GVBD   ED50％GVBD
           总数      平均数        RIA(IU/l)     CHO-cell分析(ng/l)低酸性         517       34            6.4±0.32a  142±7c(pI6.43-5.69)中酸性         1088      37            6.1±0.67a  146±16c(pI5.62-4.96)酸性           608       34            12.2±0.74b 215±13d(pI4.69-3.75)
数值是平均值±SD。ED50％GVBD数值是在24小时培养时期之后50％的卵母细胞进入减数分裂的FSH浓度。在每一栏中具有相似字母的数值没有显著的差异而具有不同字母的数值表现以下水平的显著性：a，b：p＜0.0005；c，d＜0.001。
在表5所显示的结果说明，在体外，具有一个大于5.0的pI的低酸性和中酸性FSH同工型在诱导小鼠CEO恢复减数分裂中比酸性FSH同工型显著更有效。与低酸性和中酸性FSH同工型的浓度比较，需要几乎双倍浓度的酸性FSH同工型以诱导50％的卵母细胞恢复减数分裂。
在本研究中获得的诱导50％的卵母细胞恢复减数分裂所需要的FSH同工型的实际水平有利地与使用没有分级的FSH的研究比较，其中ED50％GVBD是大约8IU/l。
尽管循环中FSH的mid-cycle达到大约10-15IU/l的幅度，最可能代表CEO体内所暴露的浓度的卵泡内FSH水平，已在恰好在排卵之前在来自妇女的排卵前卵泡液中测量，是4-6IU/l。这些数据有利地与特别是在小鼠系统中的低酸性和中酸性同工型的有效剂量比较，其中卵母细胞被暴露于FSH 20到24小时。
正如在实施例2中所描述的一样，使用了浓度为25IU/l的未分级FSH，从而确保人卵母细胞以及那些在体内接受了不是最适度的成熟的卵母细胞或那些在回收时不成熟的卵母细胞的最适度刺激，这些可以预期对于FSH刺激反应性较低。
实施例5：在培养期间被暴露于一种甾醇Δ14还原酶抑制剂(AY9944-A-7)的小鼠的丘包封的卵母细胞中诱导减数分裂的恢复和减数分裂活化甾醇的内生性生产
用外生的促性腺激素(每只小鼠7.5IU；Gonadoplex，Leo，Ballerup，Denmark)刺激不成熟的雌性C57BI/2J B6D2小鼠(11-15)。注射促性腺激素之后四十八小时，处死小鼠，并去除卵巢。通过穿刺单个卵泡回收丘包封的卵母细胞(CEO)，并收集在补充了3mg/ml牛血清白蛋白，5mg/ml人血清白蛋白，2mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素和4mM次黄嘌呤(对照培养基)的培养基(α-MEM，Gibco，BRL)。
在培养期间被暴露于一种甾醇Δ14-还原酶抑制剂(AY9944-A-7)的小鼠的丘包封的卵母细胞中诱导减数分裂恢复。
合并来自10-15只小鼠的卵母细胞并随机地分成不同的测试组。使用四孔培养皿(Nunclon，Roskilde，Denmark)进行测试，各孔在400μl培养基中含有20-25个卵母细胞。每个培养皿中有一个孔作为对照，其它的孔作为测试。
使用HX-培养基制备所有测试培养基。AY9944-A-7(AY)由Wyeth-Ayerst，Princeton，NJ，USA慷慨地提供。AY与MAS没有结构相似性。AY9944-A-7在水中的贮存液保存在-20℃，并在卵母细胞培养之前直接加到HX-培养基中。AY用从0.2到25μM的浓度使用。
在图2中给出的结果表明，AY以剂量依赖性方式刺激CEO的卵母细胞成熟。与对照比较，5，10和25μM的浓度显著地增加GVBD(分别地，p＜0.05，p＜0.001，p＜0.001)
在培养期间被暴露于一种甾醇Δ14-还原酶抑制剂(AY9944-A-7)的小鼠的丘包封的卵母细胞中减数分裂活化甾醇的内生性生产
分离了丘包封的卵母细胞(CEO)，并随机地分成两个各含有250个CEO的相等的集合。这两个集合中的一个作为对照，并在没有加AY的对照培养基中培养。另一个作为测试，并在存在10μM的AY的条件下培养卵母细胞。另外，测试和对照培养都接受放射标记的甲羟戊酸(3H-甲羟戊酸)(90μCi3H-甲羟戊酸；30μCi/mmol：NEN Life Science Products，Boston，MA，USA)，它是甾醇和类固醇合成的天然前体。各孔体积是400μl。
24小时的培养期之后，如同在实施例1中所描述的一样提取类固醇和甾醇。
通过测量被掺入的放射性，定量羊毛甾醇，FF-MAS，T-MAS和胆固醇的生物合成。通过计算测试组和对照组中每个CEO放射性比值评价AY的作用。
表6在培养期间从培养的有或没有暴露于AY的CEO所获得的类固醇和甾醇中被掺入的放射性的比值
羊毛甾醇  FF-MAS   T-MAS     胆固醇   孕酮
2.3∶1    11∶1    1∶5.2    1∶44    2.8∶1
这些结果证明，AY在CEO培养中的存在通过衰减T-MAS向胆固醇的转变引起内源性产生的-FF-MAS和T-MAS的累积。正如尽管T-MAS和胆固醇的产生分别被减少了大约5倍和44倍，然而羊毛甾醇仅仅在小程度上累积这个事实所说明的一样，AY对于FF-MAS的累积产生了一个特异性的作用。
实施例6：在培养期间在被暴露于一种胆固醇生物合成抑制剂，两性霉素B的小鼠的丘包封的卵母细胞中恢复减数分裂
两性霉素是一种用于通过抑制胆固醇生物合成来抗真感染菌的医药产品。它与MAS没有结构相似性。在体外，在小鼠的丘包封的卵母细胞上测试了它对于恢复减数分裂的作用。在不成熟的雌性小鼠上进行了卵巢刺激，并且如实施例3所述分离了丘包封的卵母细胞(CEO)。
丘包封的卵母细胞在四孔板上单独培养(Nunclon，Roskidle，Denmark)，各孔的0.4ml培养基在5％CO2和95％空气的100％加湿的环境中在37℃含有对照培养基或补充了两性霉素B(Bristol-Myers Squibb)的培养基。
在22小时之后评价了在培养中的0.6和1.2μg/ml的两性霉素的作用。
在另一个连续稀释实验中，也就是说，CEO的刺激，具有两性霉素的培养期，刺激期，在含有1.2μg/ml两性霉素的测试培养基中从5分钟变到240分钟。刺激期之后，将CEO转移到对照培养基中并继续培养达到总共22小时。
到培养期结束为止，通过在倒置显微镜下检查卵母细胞来计数胚泡崩解(GVBD)。计算每总数的卵母细胞的具有GVBD的卵母细胞的百分数(％GVBD)。
表7在体外，两性霉素对于在小鼠的丘包封的卵母细胞卵母细胞中减数分裂恢复的作用
两性霉素(μg/ml)  卵母细胞的数量  GVBD的数量  ％GVBD
对照              176             28          16
0.6               94              26          28
1.2               121             92          76
表8在体外，两性霉素(1.2μg/ml)引发(也就是说CEO在其中暴露的时期)对于在小鼠的丘包封的卵母细胞中减数分裂恢复的作用
时间(分钟)  卵母细胞的数量  GVBD的数量  ％GVBD
对照        175             26          15
5           98              21          21
10          88              26          29
30          116             42          36
120         50              25          50
240         49              34          69
在表7和表8中给出的结果证明，两性霉素引起卵母细胞减数分裂的剂量依赖性的恢复
实施例7：用于选择MAS和MAS类似物的方法
从在受控制的温度(20-22℃)，光照(lights on 06.00-18.00)和相对湿度(50-70％)下饲养的体重13-16克的不成熟的雌性小鼠(C57BL/67×DBA/2J F1，Bomholtgaard，Denmark)中获得卵母细胞。小鼠接受腹膜内注射含有20IU FSH的0.2ml促性腺激素(Gooal-F，Serono)，在48小时以后通过子宫颈离位处死。切除卵巢，并且在显微镜下通过使用一对27号针头人工破裂卵泡而在HX-培养基中分离卵母细胞(见下文)。显示完好的胚泡(在下文称为GV)的球形卵母细胞在丘包封的卵母细胞(在下文称为CEO)和裸露的卵母细胞(在下文称为NO)中分裂，并被置于补充了3mg/ml牛血清白蛋白(BSA，Sigma Cat No.A-7030)，5mg/ml人血清白蛋白(HAS，Stantens，Seruminstitut，Denmark)，0.23mM丙酮酸(Sigma，Cat No.S-8636)，2mM谷氨酰胺(Flow Cat No.16-801)，100IU/l青霉素和100mg/ml链霉素(Flow Cat No.16-700)的α-极限必需培养基(α-MEM，没有核糖核苷，Gibco BRL，Cat No.22561)中。此培养基补充了3mM次黄嘌呤(Sigma Cat No.H-9377)，并称为Hx-培养基。将卵母细胞在Hx-培养基中漂洗三次，将一样大小的卵母细胞分成CEO和NO组。CEO和NO在四孔平皿(Nunclon，Denmark)中培养，其中各孔含有0.4ml Hx-培养基和浓度为10mM的要被测试的化合物。一个对照孔(也就是说，在没有加测试化合物的同样的培养基中培养的35-45个卵母细胞)总是与三个测试孔同时培养(35-45卵母细胞，补充了测试化合物)。这些卵母细胞在含有5％CO2的空气的加湿的环境中在37℃培养24小时。到培养期结束为止，使用立体显微镜(Widlt，Leica MZ 12)分别计数了有GV，GVB和极体(在下文中称为PB)的卵母细胞的数量。GVB的百分数，定义为该孔中卵母细胞总数中经历GVB的卵母细胞的百分数，如下计算：％GVB＝((GVB的数量+PB的数量)/卵母细胞的总数)×100。

Claims (29)

1.一种包括
-至少一种减数分裂活化甾醇(MAS)，MAS是在羊毛甾醇和胆固醇之间代谢途径中任何甾醇，
-一种MAS类似物，或者
-能够内源性刺激至少一种MAS累积的添加剂或多种添加剂的培养基用于体外受精的用途，其中从体外受精产生的前成胚具有改善的体内着床率。
2.至少一种MAS，一种MAS类似物，或能够内源性刺激至少一种MAS在丘包封的卵母细胞中累积的添加剂或多种添加剂制备为体外受精培养基的用途，其中从体外受精产生的前成胚具有改善的体内着床率。
3.根据权利要求1或2的用途，其中MAS选自FF-MAS，T-MAS，1-甲基-酵母甾醇，和酵母甾醇。
4.根据前述权利要求中任何一项的用途，其中MAS是FF-MAS。
5.根据前述权利要求中任何一项的用途，其中MAS是T-MAS。
6.根据权利要求1或2的用途，其中培养基包括一种MAS类似物。
7.根据权利要求1或2的用途，其中该添加剂或多种添加剂导致在存在该添加剂或多种添加剂的条件下培养的丘包封的卵母细胞中MAS的相对含量之间至少为2的比值，该培养的丘包封的卵母细胞中MAS的相对含量通过如下方式测定：在从小鼠去除卵巢之前48小时用外源的促性腺激素刺激雌性小鼠，通过穿刺单个卵泡从卵巢回收丘包封的卵母细胞，并在补充了3mg/l牛血清白蛋白，5mg/ml人血清白蛋白，2mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素，4mM次黄嘌呤和3H-mevalonat的α-MEM培养基中在37℃，100％湿度和含有5％CO2的空气中培养24小时，此后用50μl 3M Na2PO4 pH＝1酸化，用5倍过量的正庚烷∶异丙醇(3∶1v/v)有机萃取三次，利用HPLC从有机相纯化MAS，并测定在存在此添加剂或多种添加剂的条件下培养的丘包封的卵母细胞和不存在此添加剂或多种添加剂的条件下培养的丘包封的卵母细胞之间每个丘包封的卵母细胞的放射性的比值。
8.根据权利要求7的用途，其中此添加剂选自诸如FSH和类似物的促性腺激素，诸如EGF和类似物的生长激素，诸如A9944-A7的抑制甾醇Δ14-还原酶的化合物，抑制将T-MAS转变成酵母甾醇的4-脱甲基酶的化合物，活化细胞色素P450羊毛甾醇14α-脱甲基酶的化合物和有两性霉素样作用的化合物。
9.根据权利要求8的用途，其中此添加剂是一种促性腺激素和一种生长激素的联合。
10.根据权利要求9的用途，其中此添加剂是EGF和FSH的联合。
11.根据权利要求8的用途，其中此添加剂是EGF。
12.根据权利要求8的用途，其中此添加剂是FSH。
13.根据权利要求10或12的用途，其中FSH是一种具有大于5.0的等电点的FSH同工型。
14.根据权利要求10，12或13的用途，其中此FSH衍生于天然存在的FSH，例如从尿提取的FSH，或来自FSH的。
15.根据权利要求10或12-14的用途，其中FSH的浓度是在2和200IUFSH/l之间。
16.根据权利要求10或11的用途，其中EGF的浓度是在1和10ngEGF/ml之间。
17.根据权利要求7或8的用途，其中此添加剂是两性霉素。
18.根据前述权利要求中任何一项的用途，其中体外受精是人卵母细胞的体外受精。
19.一种体外受精的方法，包括步骤：将一个或多个MII卵母细胞与精子一起暴露和培养于一种培养基中，此培养基包括至少一种MAS，一种MAS类似物或能够内源性刺激至少一种MAS累积的添加剂或多种添加剂；持续此暴露和培养直至形成了受精卵和/或前成胚。
20.一种体外受精的方法，包括步骤：
(a)在一种培养基中培养一个或多个GV卵母细胞，此培养基包括至
   少一种MAS，一种MAS类似物，或能够内源性刺激至少一种MAS
   累积的添加剂或多种添加剂；由此形成一个或多个MII卵母细
   胞。
(b)将步骤(a)的一个或多个MII卵母细胞与精子一起暴露和培养在
   一种培养基中，此培养基包括至少一种MAS，一种MAS类似物，
   或能够内源性刺激至少一种MAS累积的添加剂或多种添加剂；持
   续此暴露和培养直至形成受精卵和/或前成胚。
21.根据权利要求19或20的一种方法，其中MII卵母细胞是丘包封的卵母细胞。
22.根据权利要求19-21的一种方法，其中此培养基包括能够内源性刺激至少一种MAS累积的添加剂或多种添加剂。
23.根据权利要求19-21的一种方法，其中此培养基包括FF-MAS，T-MAS，1-甲基-酵母甾醇，和/或酵母甾醇。
24.根据权利要求19-21的一种方法，其中MAS是FF-MAS。
25.根据权利要求19-21的一种方法，其中MAS是T-MAS。
26.根据权利要求19-21的一种方法，其中此培养基包括一种MAS类似物。
27.根据权利要求19-26的一种方法，其中卵母细胞是裸的。
28.根据权利要求19-27的一种方法，其中此培养基包括至少一种MAS或至少一种MAS类似物。
29.根据权利要求19-18的一种方法，其中1-15个卵母细胞被一起培养和暴露。
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