JP3987105B2 - 減数分裂の調節 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は特定のステロール誘導体及びそれらの薬剤としての使用に関する。特に特定のステロール誘導体を減数分裂の調節に用いることができることが分かった。
発明の背景
減数分裂は有性生殖に基礎を置く生殖細胞の独特で、かつ、根源的な出来事である。減数分裂は２つの有糸分裂を含む。最初の分裂の間に、染色体の対が２つの娘細胞に分裂する前に母親の遺伝子と父親の遺伝子の間の交換が行なわれる。これらは染色体の半数（１ｎ）及び2c DNAを含有するだけである。第２の有糸分裂はDNAの合成を伴わずに進行する。したがって、この分裂は1c DNAのみを有する単相生殖細胞を生じる。
有糸分裂の出来事は雄生殖細胞及び雌生殖細胞中で同様であるが、卵子と精子へ導くタイムスケジュールと分化の過程が全く異っている。すべての雌生殖細胞は生涯の初期に、しばしば誕生の前に、最初の有糸分裂の前期に入っているが、すべては有糸分裂の後期（網糸状態）の卵母細胞として、思春期後の排卵まで停止されている。したがって雌は生涯の初期から、ストックがつきるまで取り出される卵母細胞のストックを持っている。雌の減数分裂は受精後まで完了せず、生殖細胞当り１つの卵子と２つの発育不全の極体を生じる。反対に、ほんのいくつかの雄生殖細胞が思春期から減数分裂に入り、生涯を通じて生殖細胞の幹集団を残す。一旦開始すると雄細胞中の減数分裂は顕著な遅れもなしに進行し４つの精子を生産する。
雄及び雌における減数分裂の開始を調節するメカニズムについてはほんの少ししか知られていない。卵母細胞では、新しい研究が、濾胞のプリン、ヒポキサンチンまたはアデノシンが減数分裂の停止の原因であり得ることを示している（Downs，S.M.他「Dev.Biol. 」82，第454〜458頁（1985年）；Eppig，J.J.他「Dev.Biol. 」119，第313〜321頁（1986年）及びDowns，S.M.「Mol.Reprod.Dev. 」35，第82〜94頁（1993年））。拡散性の減数分裂調節物質の存在は最初にバイスコフ他によって胎児マウスの生殖腺の培養系について記載された（Byskov，A.G.他「Dev.Biol. 」52 第193〜200頁（1976年））。減数分裂を誘導する物質（MIS）は減数分裂が進行中の胎児マウスの卵巣から分泌され、減数分裂を妨げる物質（MPS）は休止している非−減数分裂生殖細胞を有する、形態学的に分化された精巣から遊離された。MISとMPSの相対的濃度が雄及び雌生殖細胞における減数分裂の開始、停止及び再開を調節したことが示唆された（Knobil，E及びNeill，J.D.編「有性生殖の生理学（The Physiology of Reproduction）」Raven Press，New York（1994年）にByskov A.G.他著）。もし減数分裂が制御されるなら、明らかに有性生殖を調節できる。不運にも現在まで減数分裂を誘導する物質を同定することができなかった。
発明の概要
驚くべきことに、コレステロールの生合成の中間体として知られている特定のステロール及びいくつかの新規な構造的に関連する合成ステロールが減数分裂の調節のために用いられることが発見された。
したがって、本発明は一般式（Ｉ）；
式中、Ｒ1及びＲ2は独立に、水素、ハロゲンもしくはヒドロキシ基によって置換されていてもよい、非分枝もしくは分枝Ｃ1〜Ｃ6アルキル基からなる群から選ばれるか、またはＲ1及びＲ2はそれらが結合している炭素原子といっしょになって、シクロペンタン環もしくはシクロヘキサン環を形成し、
Ｒ3及びＲ4はいっしょになってそれらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、その場合にはＲ5は水素で、Ｒ6及びＲ7は水素であるか、またはそれらはいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な二重結合であるかのいずれかを表わすか、
Ｒ5及びＲ4は、いっしょになってそれらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、その場合にはＲ3は水素で、Ｒ6及びＲ7は水素であるか、またはそれらはいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な二重結合を表わすか、または
Ｒ6及びＲ4はいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、その場合には、Ｒ3，Ｒ5及びＲ7はすべて水素であり、
Ｒ8及びＲ9は水素であるか、いっしょになってそれらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、
Ｒ10は水素か、ホスホノ基もしくはスルホ基を含む、アシル基であるか、Ｒ10は分子の残部といっしょになってエーテルを形成する基である、
薬剤として用いるための化合物に関する。
さらなる面では、本発明は一般式（Ｉ）の新規な化合物に関する。
本明細書の文脈では、表現「減数分裂を調節する」は、化合物を、試験管内、生体内及び生体外で減数分裂を刺激するのに用い得ることを示すものと理解される。
したがって、さらに特別な面では、本発明は減数分裂の調節に上記一般式（Ｉ）の化合物を用いることに関する。
さらに他の面では、本発明は哺乳動物の生殖細胞における減数分裂を調節する方法に関し、その方法は上記治療の必要な生殖細胞に上記一般式（Ｉ）の化合物の有効量を投与することを含む。
発明の詳細な説明
雄牛の精巣から及びヒトの濾胞液から抽出された減数分裂を誘導する物質は共に培養マウス卵母細胞における減数分裂の再開を誘導すること（卵母テスト）及び培養胎児マウス精巣の雄生殖細胞における減数分裂を刺激すること（生殖腺テスト）もできる。減数分裂を誘導する物質は男性を含む種々の哺乳類の成熟した精巣により生産され、女性を含む、いくつかの哺乳類の成熟した卵巣の濾胞にも見い出される。例１及び２から分かるように、雄牛の精巣に見い出される減数分裂を誘導する物質は４，４−ジメチルチモステロールであるのに対し、ヒトの濾胞液中に見い出される減数分裂を誘導する物質は、４，４−ジメチル−５α−コレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オールである。
減数分裂を誘導する物質の存在は相当長い間知られている。しかしながら、現在まで減数分裂を誘導する物質の同定は知られていない。本発明者の知る限り、薬においては、今まで一般式（Ｉ）の化合物の実際的な使用はなされていない。特にいかなる一般式（Ｉ）の化合物も今まで、減数分裂を調節するために薬剤として用いられていない。
減数分裂に影響し得る見込みはいくらかある。本発明の好ましい態様によれば、一般式（Ｉ）の化合物は減数分裂を刺激するのに用いられる。本発明の他の好ましい態様によると、一般式（Ｉ）の化合物はヒトの減数分裂を刺激するのに用いられる。したがって、式（Ｉ）の化合物は従来用いられている、エストロゲン及び／またはゲスターゲンに基づくホルモン性避妊薬に知られている、体細胞への通常の副作用のない、新しい受精率調節剤を期待させている。女性の避妊薬として用いるためには、減数分裂を誘導する物質を、ゴナドトロピンの排卵ピークが起こる前に、卵母細胞がまだ成長する濾胞である間に、それらにおける減数分裂の再開を早めに誘導するために投与することができる。女性では、たとえば減数分裂の再開を直前の月経が終った一週後に誘導できる。排卵時、過成熟の卵母細胞はほとんど受精しないようである。月経の周期には影響を及ぼさないようである。この点について、培養ヒト顆粒層細胞（濾胞の体細胞）におけるプロゲステロンの生合成は減数分裂を誘導する物質の存在により影響を受けないのに対し、従来用いられたホルモン性避妊薬に用いられたエストロゲン及びゲスターゲンはプロゲステロンの生合成に逆の影響を有している。
本発明の他の面では、一般式（Ｉ）の減数分裂を誘導する物質は、MISの不充分な自己生産により、成熟した卵母細胞を生産できない雌にそれを投与することにより、女性を含む雌における不妊の特定の症例の治療に用いることができる。また、試験管内受精を実施する場合、卵母細胞が維持されている培地に一般式（Ｉ）の減数分裂を誘導する物質を加えると、より良い結果が達成される。
また、男性を含む雄の不妊症が減数分裂を誘導する物質の不充分な自己生産による場合、一般式（Ｉ）の減数分裂を誘導する物質を投与することにより問題を除去し得る。
式（Ｉ）の化合物を含有する組成物の投与の方法は、その活性物質をその作用部位へ効果的に運搬する方法ならどんな方法でもよい。
したがって、本発明の化合物を哺乳類に投与する場合、それらは、医薬として許容し得る担体と関連して少くとも一つの式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物の型で適宜供給される。経口的使用には、上記組成物はカプセルまたは錠剤の型が好ましい。
上述したことから、要求される投与の養生法は治療される状態に依存することが分かるであろう。したがって、不妊の治療に用いる時、投与は一回だけまたは限定された期間、たとえば妊娠に達成するまでであるかもしれない。避妊薬として用いる時、一般式（Ｉ）の減数分裂を誘導する物質を継続的または周期的のいずれかで摂取しなければならない。女性によって避妊薬として用いられ、継続的に摂取しない場合には、月経周期に関連するタイミングが重要である。
医薬組成物は、担体、希釈剤、吸収促進剤、保存剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、錠剤崩壊剤及び当業界で適宜用いられる他の成分を含んでもよい。固体の担体の例としては炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、デキストリン、ラクトース、砂糖、タルク、ゼラチン、ペクチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、低融点ワックス及びカカオバターである。
液体組成物は殺菌した溶液、懸濁液及びエマルジョンを包含する。上記液体組成物は注射または体外または試験管内受精に関して用いるのに適切である。液体組成物は当業界で用いられる他の成分、そのいくつかは上記リストにあげられている成分、を含有してもよい。
さらに本発明の化合物の経皮投与のための組成物は、膏薬の型で供給してもよいし、経鼻投与のための組成物は液体または粉末型の点鼻剤の形で供給してもよい。
用いられる本発明の化合物の投与量は、医者により決定され、特に、用いられる特定の化合物、投与方法、使用目的に依存するだろう。
式（Ｉ）の好ましい化合物は次のものである；
コレスト−７−エン−３β−オール；
４−メチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４−エチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４，４−ジメチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４α−メチル−４β−エチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４α−エチル−４β−メチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４，４−ジエチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４−プロピルコレスト−７−エン−３β−オール；
４−ブチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４−イソブチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４，４−テトラメチレンコレスト−７−エン−３β−オール；
４，４−ペンタメチレンコレスト−７−エン−３β−オール；
コレスト−８−エン−３β−オール；
４−メチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４−エチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４，４−ジメチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４α−メチル−４β−エチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４α−エチル−４β−メチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４，４−ジエチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４−プロピルコレスト−８−エン−３β−オール；
４−ブチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４−イソブチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４，４−テトラメチレンコレスト−８−エン−３β−オール；
４，４−ペンタメチレンコレスト−８−エン−３β−オール；
コレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４−メチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４−エチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４，４−ジメチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４α−メチル−４β−エチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４α−エチル−４β−メチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４，４−ジエチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４−プロピルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４−ブチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４−イソブチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４，４−テトラメチレンコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４，４−ペンタメチレンコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
コレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４−メチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４−エチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４，４−ジメチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４α−メチル−４β−エチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４α−エチル−４β−メチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４，４−ジエチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４−プロピルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４−ブチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４−イソブチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４，４−テトラメチレンコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４，４−ペンタメチレンコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
コレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４−メチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４−エチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４，４−ジメチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４α−メチル−４β−エチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４α−エチル−４β−メチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４，４−ジエチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４−プロピルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４−ブチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４−イソブチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４，４−テトラメチレンコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４，４−ペンタメチレンコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
コレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４−メチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４−エチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４，４−ジメチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４α−メチル−４β−エチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４α−エチル−４β−メチルココレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４，４−ジエチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４−プロピルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４−ブチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４−イソブチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４，４−テトラメチレンコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；及び
４，４−ペンタメチレンコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
並びにそれらのエステル及びエーテル。
式（Ｉ）の好ましいエステルは分枝もしくは非分枝または環状であってもよく、さらにステロール骨格に結合するＲ10のエステル基のカルボニル酸素に対して、所望により置換されたアミノ基及び／または／もしくは２酸素原子を含んでいてもよい、Ｒ10がカルボン酸のアシル基であるものである。Ｒ10がアシル基を表わすとき、好ましくは１〜20炭素原子、より好ましくは１〜12炭素原子、さらにより好ましくは１〜10炭素原子、もっとさらに好ましくは１〜７炭素原子を含む。Ｒ10の由来する酸はジカルボン酸であってもよい。Ｒ10の例は、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ブチリル、ニコチノイル、イソニコチノイル、ヘミスクシノイル、ヘミグルタロイル、ヘミマロイル、ヘミフタロイル、ブチルカルバモイル、フェニルカルバモイル、ブトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、エトキシカルボニル、４−ジメチルアミノメチルベンゾイル、４−ジエチルアミノメチルベンゾイル、４−ジプロピルアミノメチルベンゾイル、４−（モルホリノメチル）−ベンゾイル、４−（４−メチル−１−ピペラジノメチル）−ベンゾイル、３−ジメチルアミノ−メチル−ベンゾイル、３−ジエチルアミノメチルベンゾイル、３−ジプロピルアミノメチルベンゾイル、３−（モルホリノメチル）−ベンゾイル、３−（４−メチル−１−ピペラジニルメチル）−ベンゾイル、スルホ（この場合、（Ｉ）は硫酸エステルまたはその塩を表わす）またはホスホノ（この場合、（Ｉ）はリン酸エステルまたはその塩を表わす）である。
式（Ｉ）の好ましいエーテルは、Ｒ10がメチル基、メトキシメチル基、ベンジル基またはピバロイルオキシメチル基であるものである。
本発明による天然の化合物はそれ自体公知の方法により天然源から得ることができる。代りに、それらは本発明の合成ステロールと構造的に関連するように、自体公知の方法により合成によって得てもよい。
本発明は次の例により更に説明されるが、それは保護の範囲を限定するものと解すべきではない。前述の記載及び次の例により開示される特性は、別々に及びそれらを組み合せることのいずれにおいても、種々の形で発明を実施するための材料である。
例
例 １
雄牛の精巣からの減数分裂を誘導する物質（MIS）の単離、精製及び同定
６才の雄牛（デンマークのランドレース）からの精巣をと殺直後に除去した。白膜を除去し、精巣組織をドライアイス上に置き、−80℃で貯蔵した。凍結した精巣組織（92ｇ）を１mm3よりも小さい断片に切りきざみ暗所で、約90時間、完全に乾くまで、凍結乾燥させた。凍結乾燥させた組織を400mlのｎ−ヘプタン（LiChrosolv，Merck 4390，ドイツ国）で、窒素の存在下、20℃で24時間撹拌しながら抽出した。懸濁液をろ過し、固体物質をもう一度同じ手順で抽出した。プールした有機相を室温で回転蒸発器上で乾燥するまで蒸発させて、981mgの抽出物を得た。この物質をｎ−ヘプタンに溶解し、15のガラスびんに分け、そこからｎ−ヘプタンを蒸発させた。びんを窒素の存在下暗所に４℃で貯蔵した。
抽出物に３段階HPLC精製を適用した：
第１段階では、１つのびんの内容物を50μｌの50％（ｖ／ｖ）テトラヒドロフラン（THF）−水に溶解し、逆相HPLCカラム（LiChroSpher 100 RP-8末端封鎖５μｍ、250×４mm i.d.，Merck）を適用した。溶離を40℃で15分で50％〜100％へ向うTHFの直線勾配を用いて行った（流量：１ml／分）。１mlの18の分画を捕集し、MIS−活性を試験した。
第２段階では、卵母細胞試験で活性を認められた、第１段階からの分画を50〜100μｌの70％THFに溶解し、第１段階で用いたのと同様なカラムに適用した。40℃で16分で60〜78％となるTHFの線状勾配を用いて溶離を実施した（流量１ml／分）。１mlの８分画を捕集し、MIS−活性を試験した。
第３段階では、卵母細胞試験で活性を認められた第２段階からの分画を100μｌのｎ−ヘプタン：２−プロパノール（98：２）（ｖ／ｖ）に溶解し、半予備HPLCカラム（ChromSpher Si ５μｍ、250×10mm i.d.，Chrompack）に適用した。溶離は室温でｎ−ヘプタン：２−プロパノール（98：２）（ｖ／ｖ）からなる移動相を用いて実施した（流量５ml／分）。2.5mlの５分画を捕集し、MIS−活性を試験した。
３段階のすべてにおいて、溶離を220nmのUS−検出で監視した。
上記の３段階精製手順を経た物質を、核磁気共鳴分析（NMR）及び質量分析によって、活性化合物の分子構造を研究するために用いた。
NMRスペクトルについて、約１mgの精製物質を0.6mlの重水素クロロホルム中に溶解した。13Ｃプロトン分離NMRスペクトル、1H NMRスペクトル（分解増強の有無で）及び2D TOCSYスペクトルを勾配コイルのついた逆広バンド５mmプローブヘッドを備えたBruker A MX2 400 NMR分光計で記録した。単離されたMISについてのppm（δ）での13C-NMR化学シフトをチモステロール（Taylor，U.F.他「J.Lipid Res．」22 第171頁（1981年））及びラノステロール（Emmons，G.T.他「Magn.Res.Chem.」27 第1012頁（1989年））についての相当するデータと比較して表１に示す。
質量分析をChromSpher Si，３μｍ、100×4.6mmカラムを含むHPLCシステム（Chrompack）を有するLINC粒子ビーム インターフェース及びLAB-BASE 2.1ソフトウェアを備えたVG Trio 1000 LC/MS（Fisons Instruments）を用いて実施した。室温でHPLCを実施し、移動相としてｎ−ヘプタン：２−プロパノール（98：２）（ｖ／ｖ）を用いた。注入すべきMISの標本をｎ−ヘプタンに溶解した。質量分析計をエレクトロン衝撃モードで操作した。単離生成物の相対的ピーク高さを参考文献１からの４，４−ジメチルチモステロールについてのデータと比較して、結果を表２に示す。参考文献２の下の「＋」は相当するピークがこの研究でも報告されたことを表わす。参考文献１または２の下の「−」は、これらの研究で相当するピークが報告されなかったことを表わす。
13C-NMRスペクトル、質量分光分析法（MS）により決定された、分子量412に基づいて、雄牛の精巣から単離されたMISの構造を４，４−ジメチル−５α−コレステ−８，24−ジエン−３β−オールであると提案し、４，４−ジメチルチモステロール（DMZ）とも表わした。第３HPLC精製段階からのMIS−活性物質の個々の炭素原子の化学シフトを構造的に非常に密接に関連する物質であるラノステロール及びチモステロールの化学シフトと比較した。認められたプロトン化学シフト、化学結合常数及びTOCSY補正は、単離された化合物が４，４−ジメチルチモステロールであることを完全に支持している。
例 ２
ヒト濾胞液からの減数分裂を誘導する物質（MIS）の単離、精製及び同定
ヒト濾胞液（FF）を試験管内受精による不妊の治療における卵母細胞捕集物を吸引された濾胞から得た。液体を凍結乾燥し、ｎ−ヘプタンで抽出し、抽出物を例１に記載した手順と同じ手順を用いて精製した。活性ピークの化合物はｍ／ｚ＝410の分子イオンを有し、質量スペクトルはFF-MIS分子の化学構造が４，４−ジメチル−５α−コレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オールであることを明らかにした。
方法：質量分光分析法を、ChromSpher Si，３μｍ、100×４mm i.d. カラム（Chrompack）からなる直相HPLCシステムに結合するLINC粒子ビーム インターフェース及びLAB-BASE2.1ソフトウェアを有するVG Trio 1000 LC/MS（Fisons Instruments）及び移動相としてｎ−ヘプタン：２−プロパノール：メタノール：アンモニア（68：30：２：0.2）を用いて実施した。注入されるMISの標本をｎ−ヘプタンに溶解した。質量分光分析計をエレクトロン衝撃モードで操作した。結果を表３に示す。
例 ３
発酵による４β−メチルチモステロールの生産段階Ａ
酵母株、クルイベロマイセス ブルガリクス（Kluyveromyces bulgaricus）A3410をYPG寒天スラント上に接種し恒温インキュベーター中で30℃で３日間増殖させた。スラントに５mlの無菌YE培地を加え、酵母コロニーを回転混合機上で管を振とうしながら液体中に懸濁させた。次いで細胞の懸濁液を５mlの殺菌した注射器中に取り、底に２つのじゃま板を備えた500ml振とうフラスコに加えた。フラスコは200mlのZYMを含有していた。フラスコを回転板上に固定し、250rPM，30℃で24時間増殖させた。そこでフラスコに0.4mlの無菌ろ過したアンホテリシンＢ溶液を加え、さらに25時間増殖を継続した。酵母細胞を遠心分離（Beckman model J6，５℃、10分、4000rpm）により収集し、水で１回洗浄した。細胞のスラリーを小さなプラスチック製の容器に分離し、ステロールの最終的な抽出まで−18℃に貯蔵した。
栄養培地及び上記アンホテリシンＢ溶液は次の組成を有していた。
YPG寒天
酵母抽出物、Difco ４ｇ
KH2PO4 １ｇ
MgSO4・7H2O 1.5ｇ
グルコース 15ｇ
寒 天 20ｇ
脱イオン水 1000ml
121℃、20分間のオートクレーブ処理の前にpHを5.8に調整した。
YE培地
酵母抽出物、Difco 10ｇ
脱イオン水 1000ml
オートクレーブ処理121℃、20分間。
ZYM培地
酵母抽出物、Difco 20ｇ
ペプトン、Bacto 10ｇ
生 水 1000ml
121℃、20分間のオートクレーブ処理の前にpHを6.5〜6.6に調整した。
グルコース（オートクレーブ処理後、別に添加した）60ｇ
アンホテリシンＢ溶液
脱イオン水１mlに溶解した１mgのFungizone（商標、Squibbからの50mgのアンホテリシンＢの凍結乾燥塊、41mgのデオキシコレートナトリウム及び20.2mgのリン酸ナトリウム）
段階Ｂ
段階Ａからの培養細胞を10mlの水に懸濁し、10mlの40％のKOHメタノール溶液を加えた。混合物を４時間還流加熱し、室温で１晩置き、次いで20mlのｎ−ヘプタンで２回抽出した。抽出物をいっしょにして、10％の塩化ナトリウム溶液で洗浄し、次に中性になるまで水で（５回）洗浄し、乾燥させた。溶媒を蒸発させると40mgの粗ステロールが残った。
段階Ｃ
段階Ｂからの粗ステロールを１mlのｎ−ヘプタン／２−プロパノール（98：２）に溶解し、渦巻混合機上で振とうし、5000rpmで10分間遠心分離し、次にHPLCを受けさせた。
カラム LichroSorb DIOL 10μｍ、250×４mm i.d.（Merck）
溶離液 ｎ−ヘプタン／２−プロパノール（98：２）
検 出 220nm UV
6.8分後のピーク溶離物を数行程から捕集した。捕集された分画をプールし、溶媒を蒸発させると残留物が残り、それを質量分析にかけ、卵母細胞試験で試験した。
表４に報告された質量スペクトルのデータは国立標準局の図書館に記録されている４β−メチルチモステロールのものと一致する。
例 ４
４，４−ジメチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オールの製造
この化合物をショロエプファー（Schroepfer）他の「脂質の化学と物理（Chemistry and Physics of Lipids）」47 第187頁（1988年）に記載されているように製造し、該文献中に記載されている物理常数を示した。
例 ５
４，４−ジメチルコレスト−８−エン−３β−オールの製造段階Ａ
2.48ｇの４，４−ジメチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール（例４）を０℃で20mlのピリジンに溶解した。1.7ｇの塩化安息香酸を加え、混合物を周囲温度で１晩撹拌した。蒸発乾燥後、25mlのトルエンを加え、標準的水溶性仕上げ、蒸発及びアセトンを用いた粉末化後、2.3ｇ（74％）の安息香酸塩結晶を得た。
1H-NMRスペクトル（CDCl3、δ）は8.1（d，2H）；7.55（t，1H）；7.4（t，2H）；5.4（s，広い、1H）；4.2（dd，1H）で特徴的シグナルを示した。
段階Ｂ
2.04ｇの３−ベンゾイルオキシ−４，４−ジメチルコレスタ−８，14−ジエン（段階Ａ）を50mlのTHFに溶解し、１ＭのボランのTHF溶液360mlを０℃で滴加した。混合物を周囲温度で１晩撹拌し、０℃に冷却し、140mlの水を滴加し、続いて10％の水酸化ナトリウム360ml及び30％の過酸化水素378mlを滴加した。90分間撹拌後、混合物に100mlのジエチルエーテルを加え、水相をジエチルエーテルで２回抽出した。有機相をいっしょにし、重亜硫酸ナトリウム溶液で２回洗浄し、次に水で洗浄した。蒸発後、生成物をSiO2でのクロマトグラフィーで精製し（トルエン中の２％ジエチルエーテル）、0.62ｇの３−ベンゾイルオキシ−４，４−ジメチルコレスト−８−エン−15−オールを得た。
MS（分子イオン）：534.4
1H-NMRスペクトル（CDCl3、δ）は、8.0（d，2H）；7.5（t，1H）；7.4（t，2H）；4.75（m，1H）；4.1（m，1H）に特徴的なシグナルを示した。
段階Ｃ
0.54ｇの３−ベンゾイルオキシ−４，４−ジメチルコレスト−８−エン−15−オールを０℃で2.7mlのピリジンに溶解し、33mgのジメチルアミノピリジン及び287mgのフェニルクロロチオホルメートを慎重に加えた。混合物を周囲温度で20時間撹拌した。25mlのジエチルエーテルの添加後、混合物を硫酸銅の飽和水溶液で６回、10％の水酸化ナトリウム、水及び塩水で２回洗浄し、蒸発させて、0.68ｇの粗３−ベンゾイル−４，４−ジメチルコレスト−８−エン−15−フェニルチオカーボネートを得、それをさらに20mlのトルエンに溶解することにより処理し、370mgのトリブチル錫水素化物及び20mgのアゾイソブチロニトリルで処理した。混合物を90℃で20分間加熱し、同じ処理を繰り返した。蒸発後、混合物をSiO2でのクロマトグラフィー（ヘプタン／メチレンクロライド：70／30）で、粗く精製して、相当する８，14−ジエン（段階Ａ）で汚染された、150mgの粗３−ベンゾイルオキシ−４，４−ジメチルコレスト−８−エンを得た。
段階Ｄ
段階Ｃで製造した混合物150mgを2mlのメチレンクロライドに溶解し、０℃に冷却した。0.7mlのジイソブチルアルミニウム水素化物を滴加し、15分後に0.15mlの水を慎重に加えた。次に、25mlのジエチルエーテルを加え、有機相を酒石酸カリウムナトリウムの飽和溶液で２回洗浄し、水で洗浄し、塩水で洗浄して、蒸発させて、130mgの混合物を得、該混合物をAgNO3／SiO2（「Chem. & Phys. of Lipids」63 第115頁（1992年）に記載されたように調整した）でクロマトグラフィーに付し、トルエンで溶出した。エーテル／メタノールからの結晶化により49mgの表題の化合物を得た。
融 点：154〜155℃
MS（分子イオン）：414.4
13C-NMRスペクトル（CDCl3、100.6MHz）は、78.49（C3）；127.49（C8）；135.35（C9）に特徴的シグナルを示した。
例 ６
３−アセトキシ−４，４−ジメチルコレスタ−８，14−ジエンの製造
1.3ｇの４，４−ジメチルコレスタ−８，14−ジエン−３−オール（Schroepfer他の「Chemistry and Physics of Lipids）」47 第187頁（1988年））を7.5mlのピリジン及び7.5mlの酢酸無水物に溶解し、22℃で１晩撹拌した。混合物を真空で蒸発させ、トルエンで２回取り除き、SiO2でフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（トルエン）。溶出液の最初の300mlを蒸発させ、生成物をジエチルエーテルから結晶化させ、140mgの３−アセトキシ−８，14−ジメチルコレスタジエンを生じた。
融 点：120〜125℃（分解した）
MS（分子イオン）：454.4
1H-NMRスペクトル（CDCl3、δ）は、5.4（s，広い、1H）；4.5（dd，1H）；2.0（s，3H）に特徴的なシグナルを示した。
例 ７
コレスタ−８，14−ジエン−３β−オールの製造
770mgのデヒドロコレステロールを2.7mlのベンゼン、19mlのエタノール及び2.7mlの濃塩酸の混合物に溶解し、還流温度で３時間加熱した。混合物を氷浴で冷却し、それにより、最初の収穫物の結晶110mgを得た。ろ液を蒸発により乾燥させ、エーテル／メタノールからの結晶化により、第２の収穫物の結晶220mgを得、それを第１の収穫物と合せて、AgNO3／SiO2（例５、段階Ｄで記載したように調製）でクロマトグラフィーに付し、トルエン中の2.5％アセトンで溶出させて、94mgの純コレスタ−８，14−ジエン−３β−オールを得た。
融 点：113〜114.5℃
MS（分子イオン）：384.4
生成物の1H-NMRスペクトルは、5.35（s，広い、1H）；3.6（m，1H）に特徴的なシグナルを示した。
13C-NMRスペクトル（CDCl3、50.3MHz）は、70.99（C3）；117.42（C15）；123.1（C8）；140.8（C9）；151.1（C14）に特徴的なシグナルを示した。
例 ８
４，４−テトラメチレンコレスタ−８，14−ジエン−３−オールの製造
段階Ａ
1.15ｇのデヒドロコレステロールを15mlの２−ブタノンに溶解し、0.34ｇのアルミニウムイソプロポキシドを加え、混合物を還流温度で75分間加熱した。氷浴で冷却後、15mlの２Ｎ塩化水素酸を加えた。相が分離し、有機相を7.5mlの２Ｎ塩化水素酸で２回洗浄した。水相をトルエンで抽出し、有機相をいっしょにし、水と塩水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させて、1.18ｇの粗コレスタ−５，７−ジエン−３−オンを粘稠な油として得た。
1H-NMRスペクトルは5.8（s，1H）；5.2（m，1H）；3.2（d，1H）；2.7（dd，1H）に特徴的なシグナルを示した。
段階Ｂ
0.67ｇのカリウムｔ−ブトキシドを45℃で16mlのｔ−ブタノールに溶解させ、0.57ｇのコレスタ−５，７−ジエン−３−オンを加え、混合物を10分間撹拌した。0.47ｇの１，４−二沃化ブタンを加え、混合物を30分間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をトルエンと水に再溶解し、少量の塩水を加えて相分離を誘導させた。有機相を水で４回洗浄し、水相をいっしょにして、トルエンで１回抽出した。トルエン抽出物をいっしょにして、乾燥させ、蒸発させて、0.45ｇの泡状物を得た。それはジエチルエーテル／メタノールから結晶化後、0.35ｇの結晶４，４−テトラメチレンコレスタ−５，７−ジエン−３−オンを生じた。
MS（分子イオン）：436.4
1H-NMRスペクトル（CDCl3δ）は、5.75（d，1H）；5.5（m，1H）に特徴的シグナルを示した。
段階Ｃ
130mgのLiAlH4を６mlのTHF中に懸濁し、40mlのTHFに溶解した４，４−テトラメチレンコレスタ−５，７−ジエン−３−オンを30分間かけて滴加した。15分後、添加が完了し、なお、いくらかの未反応の出発物質（TLC）が残存し、65mgの追加のLiAlH4を加えた。30分間撹拌後反応が完了し、５mlのTHFに溶解した0.9mlの水を滴加した。30分撹拌後、過剰の硫酸マグネシウムを添加し、混合物を更に30分間撹拌し、ろ過し、蒸発させて乾燥させた。残留物を25mlのジエチルエーテル及び25mlのメタノールに溶解し、エーテルを真空中で慎重に除去した。１晩撹拌後、ろ過により1.75ｇの結晶４，４−テトラメチレン−コレスタ−５，７−ジエン−３−オールを単離した。
MS（分子イオン）：438.4
1H-NMRスペクトルは5.8（d，1H）；5.5（m，1H）；3.5（m，1H）に特徴的なシグナルを示した。
段階Ｄ
770mgの段階Ｃで製造した化合物を、2.38mlのベンゼン、17.5mlのエタノール及び2.38mlの濃塩化水素酸の混合物に溶解し、還流で16時間加熱し、真空で蒸発させた。残留物を５mlのトルエンに再溶解し、ろ過し、AgNO3／SiO3の中圧カラムのクロマトグラフィーに付し（ヘプタン：トルエン、10:90）、35mgの４，４−テトラメチレン−コレスタ−８，14−ジエン−３−オールを得た。
MS（分子イオン）：438.4
1H-NMRスペクトル（CDCl3、δ）は、5.35（s，広い、1H）；3.3（d，d，1H）に特徴的なシグナルを示した。
13C-NMRスペクトル（CDCl3、100.6MHz）は79.0（C3）；117.4（C15）；122.9（C8）；141.3（C9）；151.1（C14）に特徴的なシグナルを示した。
例 ９
４，４−ジメチルコレスト−８（14）−エン−３β−オールの製造
580mgの４，４−ジメチルコレスト−８−エン−３β−オールを20mlのジエチルエーテル及び20mlの酢酸に溶解した。60mgの10％Pd／Ｃ触媒を加え、混合物を3.5気圧の水素下で撹拌しながら１晩置いた。触媒を除去し、ろ液を10mlに濃縮し、それにより、結晶化が始まった。10mlのメタノールを加え、結晶を16時間後に採取した。メタノールからの再結晶により230mgの物質を生じ、それは1H-NMR及び13C-NMRにより８（９）及び８（14）異性体混合物であることが分かった。
混合物を10mlのジエチルエーテル及び10mlの酢酸に再溶解した。75mgの５％Pb／Ｃ触媒を加え、混合物を常圧で１晩水素処理した。触媒を除去し、溶媒を蒸発させ、結晶性残留物を５mlのメタノールで粉末にし、190mgの純４，４−ジメチルコレスト−８（14）−エン−３β−オールを得た。
MS（分子イオン）：414.4
13C-NMRスペクトル（CDCl3、100.6MHz）は、79.24（C3）；126.11（C8）；142.20（C14）に特徴的なシグナルを示した。
例 10
卵母細胞試験での減数分裂を誘導する物質の試験動物
未成熟の雌のマウス（B6D2-F1、系統C57B1／2J）を食物と水は自由にして調節光（14時間明、10時間暗）及び温度に保った。動物が重さ13〜16ｇに達した時（出産後20〜22日に相当する）、約20IUのFSH及び20IUのLH（Ziebe，S.他「Hum.Reprod. 」８ 第385〜388頁（1993年））を含有するヒトの閉経期のゴナドトロピン（Humegon，Organon，The Netherlands）から１回注射（腹腔内）した。48時間後、動物を頸部脱臼により殺した。
卵母細胞の捕集及び培養
卵巣を除去し、HX−培地（下記参照）中に置き、付着組織を除去した。捕集及び培養培地は、４mMのヒポキサンチン、３mg／mlのウシ血清アルブミン、0.23mMのピルビン酸ナトリウム、２mMのグルタミン、100Ｕ／mlのペニシリン及び100μｇ／mlのストレプトマイシン（すべてSigma，USA）を含有するイーグル最少必須培地（Flow，USA）から成った。この培地をHX−培地という。同じ培地であるがHXのないものを対照培地として用いた。
卵巣の腔の小胞を27−ゲージの針を用いて解剖顕微鏡の下で穴をあけた。均一なサイズの卵母細胞を包含する丘（CEO）を選択し、新鮮なHX−培地で３回洗浄した。
丘細胞から除去した卵母細胞、すなわち、露出された卵母細胞（DO）を細い穴の口で調節するピペットによってCEOをおだやかに洗い流すことにより得た。対照培地中で培養された対照を除いて、0.5mlのHX−培地を含有する４ウェルマルチ皿（Nunclon，デンマーク）中でCEO及びDOを培養した。各ウェルは35〜50卵母細胞を含有していた。試験培養は表５に示されるように異なる濃度の被試験化合物で作った。
培養は37℃で５％のCO2を含有する空気中で湿度100％で実施した。
卵母細胞試験
培養期間の終りに、胚胞（GB）または胚胞崩壊（GVBD）を有する卵母細胞の数及び極体（PB）を有する卵母細胞の数を、微分干渉コントラスト装置付き倒立顕微鏡中で数えた。全卵母細胞数に対するGVBDを有する卵母細胞のパーセント及びGVBDに対するPBを有する卵母細胞のパーセントを計算した。MIS活性の単位として計算した、DO及びCEOについての結果を表５に示す。MIS活性の１単位は、
と定義され、
MIS活性単位の数は、
と計算される。
例 11
生殖腺試験における減数分裂を誘導する物質の試験
生殖腺試験を本質的にバイスコフ，A.G.他の「Mol.Reprod.Dev.」34 第47〜52頁（1993年）に記載されているように実施した。表６に示された結果はウェスターガード（Westergaard），Ｌ．他の「Fertil.Steril.」41 第377〜384頁（1984年）に記載されているように半定量的に評価した。
例 12
モノ（５α−コレスタ−８，14−ジエン）−３β−スクシネートの製造
0.50ｇの５α−コレスタ−８，14−ジエン−３β−オールを10mlのTHFに溶解し、次いで0.39ｇのコハク酸無水物及び16mgの４−ジメチルアミノピリジンを溶解した。溶液を還流で１晩加熱し、次いで、蒸発させて乾燥した。残留物を10mlの水に懸濁し、沈殿をろ過により取り除き、水洗し、乾燥させて、0.48ｇの表題の化合物を得た。この化合物を更に水性炭酸水素ナトリウム及びエタノールの混合物に溶解し、塩化水素酸を加えてPH2とし、続いて溶液を濃縮して沈殿を生じさせることにより精製することができた。
融 点：128〜131℃
MS（分子イオン）：484.4
生成物の1H-NMRスペクトル（CDCl3、δ）は5.36（s，1H）；4.75（m，1H）；2.67（m，2H）；2.6（m，2H）に特徴的なシグナルを示した。
13C-NMRスペクトル（CDCl3、100.6MHz）は、73.4；117.1；122.7；140.0；150.5；171.2；177.2に特徴的なシグナルを示した。
例 13
３β−エトキシカルボニルオキシ−５α−コレスタ−８，14−ジエンの製造
氷浴中で冷却しながら、0.50ｇの５α−コレスタ−８，14−ジエン−３β−オールを５mlのトルエン及び５mgのピリジンの混合物に溶解した。５mlのトルエンに溶解した2.3mlのエチルクロロホルメートを５分間にわたり添加した。30分後、氷浴を取り除き、室温で20時間、次いで60℃で２時間撹拌を継続させた。反応混合物を真空中で蒸発させて乾燥させ、10mlのエタノールで粉末にし、0.505ｇの表題化合物を得、それはさらにエタノールから再結晶により精製できた。
融 点：101〜106℃
MS（分子イオン）：456.3
生成物の1H-NMRスペクトル（CDCl3、δ）は、5.30（s，1H）；4.50（m，1H）；4.12（q，2H）；1.24（t，3H）に特徴的なシグナルを示した。
13C-NMRスペクトル（CDCl3、100.6MHz）は62.6；116.6；122.2；139.4；150.0；153.6に特徴的なシグナルを示した。
例 14
３β−ホスホノオキソ−４，４−ジメチル−５α−コレスタ−８，14−ジエンの製造
2.00ｇの４，４−ジメチル−５α−コレスタ−８，14−ジエン−３β−オールを10mlの乾燥ピリジンに溶解し、氷浴中で冷却しながら、10mlの乾燥アセトン中の1.66mlのオキシ塩化燐の溶液に５分間かけて添加した。室温で30分間撹拌後、沈殿物をろ過して取り除き、乾燥アセトンで洗浄した。残留物を70mlの水に懸濁させ、還流で１1/4時間加熱した。室温に冷却後、沈殿物をろ過して取り除き、水で洗浄し、乾燥して0.93ｇの粗生成物を得た。0.70ｇの粗生成物を75mlの0.1Ｍ水性水酸化カリウムに溶解し、10ｇのアンバーライト樹脂IR-120（H）を通してろ過し、真空中で蒸発させて乾燥した。残留物を10mlの水で粉末にし、沈殿物をろ過により取り除き、水で洗浄し、乾燥して、0.48ｇの表題の化合物を得た。
融 点：183〜185℃
生成物の1H-NMRスペクトル（CDCl3＋２滴のCD3OD）は5.36（s，1H）；3.89（m，1H）に特徴的なシグナルを示した。
生成物の13C-NMRスペクトル（CDCl3＋２滴のCD3OD、100.6MHz）は、85.1；116.9；122.3；140.9；150.5に特徴的なシグナルを示した。
例 15
３β−イソニコチノイル−５α−コレスタ−８，14−ジエンの製造
0.50ｇの５α−コレスタ−８，14−ジエン−３β−オールを５mlのピリジンに溶解し、続いて1.16ｇの塩化イソニコチノイル塩酸塩を溶解した。懸濁液を還流で１晩加熱し、次いで蒸発させて乾燥した。氷浴中で冷却しながら、残留物を100mlの水に懸濁した。沈殿物をろ過により取り除き、水で洗浄し、乾燥させて0.97ｇの粗生成物を得、それをアセトン／水から再結晶し、0.40ｇの表題の化合物を得た。
融 点：129〜131℃
生成物の1H-NMRスペクトルは、8.77（d，2H）；7.84（d，2H）；5.39（s，1H）；4.49（m，1H）に特徴的なシグナルを示した。
13C-NMRスペクトル（CDCl3、50.3MHz）は、75.0；117.7；122.8；123.3；138.0；140.3；150.5；150.9；164.6に特徴的なシグナルを示した。
本発明は特定のステロール誘導体及びそれらの薬剤としての使用に関する。特に特定のステロール誘導体を減数分裂の調節に用いることができることが分かった。
発明の背景
減数分裂は有性生殖に基礎を置く生殖細胞の独特で、かつ、根源的な出来事である。減数分裂は２つの有糸分裂を含む。最初の分裂の間に、染色体の対が２つの娘細胞に分裂する前に母親の遺伝子と父親の遺伝子の間の交換が行なわれる。これらは染色体の半数（１ｎ）及び2c DNAを含有するだけである。第２の有糸分裂はDNAの合成を伴わずに進行する。したがって、この分裂は1c DNAのみを有する単相生殖細胞を生じる。
有糸分裂の出来事は雄生殖細胞及び雌生殖細胞中で同様であるが、卵子と精子へ導くタイムスケジュールと分化の過程が全く異っている。すべての雌生殖細胞は生涯の初期に、しばしば誕生の前に、最初の有糸分裂の前期に入っているが、すべては有糸分裂の後期（網糸状態）の卵母細胞として、思春期後の排卵まで停止されている。したがって雌は生涯の初期から、ストックがつきるまで取り出される卵母細胞のストックを持っている。雌の減数分裂は受精後まで完了せず、生殖細胞当り１つの卵子と２つの発育不全の極体を生じる。反対に、ほんのいくつかの雄生殖細胞が思春期から減数分裂に入り、生涯を通じて生殖細胞の幹集団を残す。一旦開始すると雄細胞中の減数分裂は顕著な遅れもなしに進行し４つの精子を生産する。
雄及び雌における減数分裂の開始を調節するメカニズムについてはほんの少ししか知られていない。卵母細胞では、新しい研究が、濾胞のプリン、ヒポキサンチンまたはアデノシンが減数分裂の停止の原因であり得ることを示している（Downs，S.M.他「Dev.Biol. 」82，第454〜458頁（1985年）；Eppig，J.J.他「Dev.Biol. 」119，第313〜321頁（1986年）及びDowns，S.M.「Mol.Reprod.Dev. 」35，第82〜94頁（1993年））。拡散性の減数分裂調節物質の存在は最初にバイスコフ他によって胎児マウスの生殖腺の培養系について記載された（Byskov，A.G.他「Dev.Biol. 」52 第193〜200頁（1976年））。減数分裂を誘導する物質（MIS）は減数分裂が進行中の胎児マウスの卵巣から分泌され、減数分裂を妨げる物質（MPS）は休止している非−減数分裂生殖細胞を有する、形態学的に分化された精巣から遊離された。MISとMPSの相対的濃度が雄及び雌生殖細胞における減数分裂の開始、停止及び再開を調節したことが示唆された（Knobil，E及びNeill，J.D.編「有性生殖の生理学（The Physiology of Reproduction）」Raven Press，New York（1994年）にByskov A.G.他著）。もし減数分裂が制御されるなら、明らかに有性生殖を調節できる。不運にも現在まで減数分裂を誘導する物質を同定することができなかった。
発明の概要
驚くべきことに、コレステロールの生合成の中間体として知られている特定のステロール及びいくつかの新規な構造的に関連する合成ステロールが減数分裂の調節のために用いられることが発見された。
したがって、本発明は一般式（Ｉ）；
Ｒ3及びＲ4はいっしょになってそれらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、その場合にはＲ5は水素で、Ｒ6及びＲ7は水素であるか、またはそれらはいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な二重結合であるかのいずれかを表わすか、
Ｒ5及びＲ4は、いっしょになってそれらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、その場合にはＲ3は水素で、Ｒ6及びＲ7は水素であるか、またはそれらはいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な二重結合を表わすか、または
Ｒ6及びＲ4はいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、その場合には、Ｒ3，Ｒ5及びＲ7はすべて水素であり、
Ｒ8及びＲ9は水素であるか、いっしょになってそれらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、
Ｒ10は水素か、ホスホノ基もしくはスルホ基を含む、アシル基であるか、Ｒ10は分子の残部といっしょになってエーテルを形成する基である、
薬剤として用いるための化合物に関する。
さらなる面では、本発明は一般式（Ｉ）の新規な化合物に関する。
本明細書の文脈では、表現「減数分裂を調節する」は、化合物を、試験管内、生体内及び生体外で減数分裂を刺激するのに用い得ることを示すものと理解される。
したがって、さらに特別な面では、本発明は減数分裂の調節に上記一般式（Ｉ）の化合物を用いることに関する。
さらに他の面では、本発明は哺乳動物の生殖細胞における減数分裂を調節する方法に関し、その方法は上記治療の必要な生殖細胞に上記一般式（Ｉ）の化合物の有効量を投与することを含む。
発明の詳細な説明
雄牛の精巣から及びヒトの濾胞液から抽出された減数分裂を誘導する物質は共に培養マウス卵母細胞における減数分裂の再開を誘導すること（卵母テスト）及び培養胎児マウス精巣の雄生殖細胞における減数分裂を刺激すること（生殖腺テスト）もできる。減数分裂を誘導する物質は男性を含む種々の哺乳類の成熟した精巣により生産され、女性を含む、いくつかの哺乳類の成熟した卵巣の濾胞にも見い出される。例１及び２から分かるように、雄牛の精巣に見い出される減数分裂を誘導する物質は４，４−ジメチルチモステロールであるのに対し、ヒトの濾胞液中に見い出される減数分裂を誘導する物質は、４，４−ジメチル−５α−コレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オールである。
減数分裂を誘導する物質の存在は相当長い間知られている。しかしながら、現在まで減数分裂を誘導する物質の同定は知られていない。本発明者の知る限り、薬においては、今まで一般式（Ｉ）の化合物の実際的な使用はなされていない。特にいかなる一般式（Ｉ）の化合物も今まで、減数分裂を調節するために薬剤として用いられていない。
減数分裂に影響し得る見込みはいくらかある。本発明の好ましい態様によれば、一般式（Ｉ）の化合物は減数分裂を刺激するのに用いられる。本発明の他の好ましい態様によると、一般式（Ｉ）の化合物はヒトの減数分裂を刺激するのに用いられる。したがって、式（Ｉ）の化合物は従来用いられている、エストロゲン及び／またはゲスターゲンに基づくホルモン性避妊薬に知られている、体細胞への通常の副作用のない、新しい受精率調節剤を期待させている。女性の避妊薬として用いるためには、減数分裂を誘導する物質を、ゴナドトロピンの排卵ピークが起こる前に、卵母細胞がまだ成長する濾胞である間に、それらにおける減数分裂の再開を早めに誘導するために投与することができる。女性では、たとえば減数分裂の再開を直前の月経が終った一週後に誘導できる。排卵時、過成熟の卵母細胞はほとんど受精しないようである。月経の周期には影響を及ぼさないようである。この点について、培養ヒト顆粒層細胞（濾胞の体細胞）におけるプロゲステロンの生合成は減数分裂を誘導する物質の存在により影響を受けないのに対し、従来用いられたホルモン性避妊薬に用いられたエストロゲン及びゲスターゲンはプロゲステロンの生合成に逆の影響を有している。
本発明の他の面では、一般式（Ｉ）の減数分裂を誘導する物質は、MISの不充分な自己生産により、成熟した卵母細胞を生産できない雌にそれを投与することにより、女性を含む雌における不妊の特定の症例の治療に用いることができる。また、試験管内受精を実施する場合、卵母細胞が維持されている培地に一般式（Ｉ）の減数分裂を誘導する物質を加えると、より良い結果が達成される。
また、男性を含む雄の不妊症が減数分裂を誘導する物質の不充分な自己生産による場合、一般式（Ｉ）の減数分裂を誘導する物質を投与することにより問題を除去し得る。
式（Ｉ）の化合物を含有する組成物の投与の方法は、その活性物質をその作用部位へ効果的に運搬する方法ならどんな方法でもよい。
したがって、本発明の化合物を哺乳類に投与する場合、それらは、医薬として許容し得る担体と関連して少くとも一つの式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物の型で適宜供給される。経口的使用には、上記組成物はカプセルまたは錠剤の型が好ましい。
上述したことから、要求される投与の養生法は治療される状態に依存することが分かるであろう。したがって、不妊の治療に用いる時、投与は一回だけまたは限定された期間、たとえば妊娠に達成するまでであるかもしれない。避妊薬として用いる時、一般式（Ｉ）の減数分裂を誘導する物質を継続的または周期的のいずれかで摂取しなければならない。女性によって避妊薬として用いられ、継続的に摂取しない場合には、月経周期に関連するタイミングが重要である。
医薬組成物は、担体、希釈剤、吸収促進剤、保存剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、錠剤崩壊剤及び当業界で適宜用いられる他の成分を含んでもよい。固体の担体の例としては炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、デキストリン、ラクトース、砂糖、タルク、ゼラチン、ペクチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、低融点ワックス及びカカオバターである。
液体組成物は殺菌した溶液、懸濁液及びエマルジョンを包含する。上記液体組成物は注射または体外または試験管内受精に関して用いるのに適切である。液体組成物は当業界で用いられる他の成分、そのいくつかは上記リストにあげられている成分、を含有してもよい。
さらに本発明の化合物の経皮投与のための組成物は、膏薬の型で供給してもよいし、経鼻投与のための組成物は液体または粉末型の点鼻剤の形で供給してもよい。
用いられる本発明の化合物の投与量は、医者により決定され、特に、用いられる特定の化合物、投与方法、使用目的に依存するだろう。
式（Ｉ）の好ましい化合物は次のものである；
コレスト−７−エン−３β−オール；
４−メチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４−エチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４，４−ジメチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４α−メチル−４β−エチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４α−エチル−４β−メチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４，４−ジエチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４−プロピルコレスト−７−エン−３β−オール；
４−ブチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４−イソブチルコレスト−７−エン−３β−オール；
４，４−テトラメチレンコレスト−７−エン−３β−オール；
４，４−ペンタメチレンコレスト−７−エン−３β−オール；
コレスト−８−エン−３β−オール；
４−メチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４−エチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４，４−ジメチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４α−メチル−４β−エチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４α−エチル−４β−メチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４，４−ジエチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４−プロピルコレスト−８−エン−３β−オール；
４−ブチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４−イソブチルコレスト−８−エン−３β−オール；
４，４−テトラメチレンコレスト−８−エン−３β−オール；
４，４−ペンタメチレンコレスト−８−エン−３β−オール；
コレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４−メチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４−エチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４，４−ジメチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４α−メチル−４β−エチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４α−エチル−４β−メチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４，４−ジエチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４−プロピルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４−ブチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４−イソブチルコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４，４−テトラメチレンコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
４，４−ペンタメチレンコレスト−８（14）−エン−３β−オール；
コレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４−メチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４−エチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４，４−ジメチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４α−メチル−４β−エチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４α−エチル−４β−メチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４，４−ジエチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４−プロピルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４−ブチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４−イソブチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４，４−テトラメチレンコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
４，４−ペンタメチレンコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール；
コレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４−メチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４−エチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４，４−ジメチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４α−メチル−４β−エチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４α−エチル−４β−メチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４，４−ジエチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４−プロピルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４−ブチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４−イソブチルコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４，４−テトラメチレンコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
４，４−ペンタメチレンコレスタ−８，24−ジエン−３β−オール；
コレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４−メチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４−エチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４，４−ジメチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４α−メチル−４β−エチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４α−エチル−４β−メチルココレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４，４−ジエチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４−プロピルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４−ブチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４−イソブチルコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
４，４−テトラメチレンコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；及び
４，４−ペンタメチレンコレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オール；
並びにそれらのエステル及びエーテル。
式（Ｉ）の好ましいエステルは分枝もしくは非分枝または環状であってもよく、さらにステロール骨格に結合するＲ10のエステル基のカルボニル酸素に対して、所望により置換されたアミノ基及び／または／もしくは２酸素原子を含んでいてもよい、Ｒ10がカルボン酸のアシル基であるものである。Ｒ10がアシル基を表わすとき、好ましくは１〜20炭素原子、より好ましくは１〜12炭素原子、さらにより好ましくは１〜10炭素原子、もっとさらに好ましくは１〜７炭素原子を含む。Ｒ10の由来する酸はジカルボン酸であってもよい。Ｒ10の例は、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ブチリル、ニコチノイル、イソニコチノイル、ヘミスクシノイル、ヘミグルタロイル、ヘミマロイル、ヘミフタロイル、ブチルカルバモイル、フェニルカルバモイル、ブトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、エトキシカルボニル、４−ジメチルアミノメチルベンゾイル、４−ジエチルアミノメチルベンゾイル、４−ジプロピルアミノメチルベンゾイル、４−（モルホリノメチル）−ベンゾイル、４−（４−メチル−１−ピペラジノメチル）−ベンゾイル、３−ジメチルアミノ−メチル−ベンゾイル、３−ジエチルアミノメチルベンゾイル、３−ジプロピルアミノメチルベンゾイル、３−（モルホリノメチル）−ベンゾイル、３−（４−メチル−１−ピペラジニルメチル）−ベンゾイル、スルホ（この場合、（Ｉ）は硫酸エステルまたはその塩を表わす）またはホスホノ（この場合、（Ｉ）はリン酸エステルまたはその塩を表わす）である。
式（Ｉ）の好ましいエーテルは、Ｒ10がメチル基、メトキシメチル基、ベンジル基またはピバロイルオキシメチル基であるものである。
本発明による天然の化合物はそれ自体公知の方法により天然源から得ることができる。代りに、それらは本発明の合成ステロールと構造的に関連するように、自体公知の方法により合成によって得てもよい。
本発明は次の例により更に説明されるが、それは保護の範囲を限定するものと解すべきではない。前述の記載及び次の例により開示される特性は、別々に及びそれらを組み合せることのいずれにおいても、種々の形で発明を実施するための材料である。
例
例 １
雄牛の精巣からの減数分裂を誘導する物質（MIS）の単離、精製及び同定
６才の雄牛（デンマークのランドレース）からの精巣をと殺直後に除去した。白膜を除去し、精巣組織をドライアイス上に置き、−80℃で貯蔵した。凍結した精巣組織（92ｇ）を１mm3よりも小さい断片に切りきざみ暗所で、約90時間、完全に乾くまで、凍結乾燥させた。凍結乾燥させた組織を400mlのｎ−ヘプタン（LiChrosolv，Merck 4390，ドイツ国）で、窒素の存在下、20℃で24時間撹拌しながら抽出した。懸濁液をろ過し、固体物質をもう一度同じ手順で抽出した。プールした有機相を室温で回転蒸発器上で乾燥するまで蒸発させて、981mgの抽出物を得た。この物質をｎ−ヘプタンに溶解し、15のガラスびんに分け、そこからｎ−ヘプタンを蒸発させた。びんを窒素の存在下暗所に４℃で貯蔵した。
抽出物に３段階HPLC精製を適用した：
第１段階では、１つのびんの内容物を50μｌの50％（ｖ／ｖ）テトラヒドロフラン（THF）−水に溶解し、逆相HPLCカラム（LiChroSpher 100 RP-8末端封鎖５μｍ、250×４mm i.d.，Merck）を適用した。溶離を40℃で15分で50％〜100％へ向うTHFの直線勾配を用いて行った（流量：１ml／分）。１mlの18の分画を捕集し、MIS−活性を試験した。
第２段階では、卵母細胞試験で活性を認められた、第１段階からの分画を50〜100μｌの70％THFに溶解し、第１段階で用いたのと同様なカラムに適用した。40℃で16分で60〜78％となるTHFの線状勾配を用いて溶離を実施した（流量１ml／分）。１mlの８分画を捕集し、MIS−活性を試験した。
第３段階では、卵母細胞試験で活性を認められた第２段階からの分画を100μｌのｎ−ヘプタン：２−プロパノール（98：２）（ｖ／ｖ）に溶解し、半予備HPLCカラム（ChromSpher Si ５μｍ、250×10mm i.d.，Chrompack）に適用した。溶離は室温でｎ−ヘプタン：２−プロパノール（98：２）（ｖ／ｖ）からなる移動相を用いて実施した（流量５ml／分）。2.5mlの５分画を捕集し、MIS−活性を試験した。
３段階のすべてにおいて、溶離を220nmのUS−検出で監視した。
上記の３段階精製手順を経た物質を、核磁気共鳴分析（NMR）及び質量分析によって、活性化合物の分子構造を研究するために用いた。
NMRスペクトルについて、約１mgの精製物質を0.6mlの重水素クロロホルム中に溶解した。13Ｃプロトン分離NMRスペクトル、1H NMRスペクトル（分解増強の有無で）及び2D TOCSYスペクトルを勾配コイルのついた逆広バンド５mmプローブヘッドを備えたBruker A MX2 400 NMR分光計で記録した。単離されたMISについてのppm（δ）での13C-NMR化学シフトをチモステロール（Taylor，U.F.他「J.Lipid Res．」22 第171頁（1981年））及びラノステロール（Emmons，G.T.他「Magn.Res.Chem.」27 第1012頁（1989年））についての相当するデータと比較して表１に示す。
例 ２
ヒト濾胞液からの減数分裂を誘導する物質（MIS）の単離、精製及び同定
ヒト濾胞液（FF）を試験管内受精による不妊の治療における卵母細胞捕集物を吸引された濾胞から得た。液体を凍結乾燥し、ｎ−ヘプタンで抽出し、抽出物を例１に記載した手順と同じ手順を用いて精製した。活性ピークの化合物はｍ／ｚ＝410の分子イオンを有し、質量スペクトルはFF-MIS分子の化学構造が４，４−ジメチル−５α−コレスタ−８，14，24−トリエン−３β−オールであることを明らかにした。
方法：質量分光分析法を、ChromSpher Si，３μｍ、100×４mm i.d. カラム（Chrompack）からなる直相HPLCシステムに結合するLINC粒子ビーム インターフェース及びLAB-BASE2.1ソフトウェアを有するVG Trio 1000 LC/MS（Fisons Instruments）及び移動相としてｎ−ヘプタン：２−プロパノール：メタノール：アンモニア（68：30：２：0.2）を用いて実施した。注入されるMISの標本をｎ−ヘプタンに溶解した。質量分光分析計をエレクトロン衝撃モードで操作した。結果を表３に示す。
発酵による４β−メチルチモステロールの生産段階Ａ
酵母株、クルイベロマイセス ブルガリクス（Kluyveromyces bulgaricus）A3410をYPG寒天スラント上に接種し恒温インキュベーター中で30℃で３日間増殖させた。スラントに５mlの無菌YE培地を加え、酵母コロニーを回転混合機上で管を振とうしながら液体中に懸濁させた。次いで細胞の懸濁液を５mlの殺菌した注射器中に取り、底に２つのじゃま板を備えた500ml振とうフラスコに加えた。フラスコは200mlのZYMを含有していた。フラスコを回転板上に固定し、250rPM，30℃で24時間増殖させた。そこでフラスコに0.4mlの無菌ろ過したアンホテリシンＢ溶液を加え、さらに25時間増殖を継続した。酵母細胞を遠心分離（Beckman model J6，５℃、10分、4000rpm）により収集し、水で１回洗浄した。細胞のスラリーを小さなプラスチック製の容器に分離し、ステロールの最終的な抽出まで−18℃に貯蔵した。
栄養培地及び上記アンホテリシンＢ溶液は次の組成を有していた。
YPG寒天
酵母抽出物、Difco ４ｇ
KH2PO4 １ｇ
MgSO4・7H2O 1.5ｇ
グルコース 15ｇ
寒 天 20ｇ
脱イオン水 1000ml
121℃、20分間のオートクレーブ処理の前にpHを5.8に調整した。
YE培地
酵母抽出物、Difco 10ｇ
脱イオン水 1000ml
オートクレーブ処理121℃、20分間。
ZYM培地
酵母抽出物、Difco 20ｇ
ペプトン、Bacto 10ｇ
生 水 1000ml
121℃、20分間のオートクレーブ処理の前にpHを6.5〜6.6に調整した。
グルコース（オートクレーブ処理後、別に添加した）60ｇ
アンホテリシンＢ溶液
脱イオン水１mlに溶解した１mgのFungizone（商標、Squibbからの50mgのアンホテリシンＢの凍結乾燥塊、41mgのデオキシコレートナトリウム及び20.2mgのリン酸ナトリウム）
段階Ｂ
段階Ａからの培養細胞を10mlの水に懸濁し、10mlの40％のKOHメタノール溶液を加えた。混合物を４時間還流加熱し、室温で１晩置き、次いで20mlのｎ−ヘプタンで２回抽出した。抽出物をいっしょにして、10％の塩化ナトリウム溶液で洗浄し、次に中性になるまで水で（５回）洗浄し、乾燥させた。溶媒を蒸発させると40mgの粗ステロールが残った。
段階Ｃ
段階Ｂからの粗ステロールを１mlのｎ−ヘプタン／２−プロパノール（98：２）に溶解し、渦巻混合機上で振とうし、5000rpmで10分間遠心分離し、次にHPLCを受けさせた。
カラム LichroSorb DIOL 10μｍ、250×４mm i.d.（Merck）
溶離液 ｎ−ヘプタン／２−プロパノール（98：２）
検 出 220nm UV
6.8分後のピーク溶離物を数行程から捕集した。捕集された分画をプールし、溶媒を蒸発させると残留物が残り、それを質量分析にかけ、卵母細胞試験で試験した。
表４に報告された質量スペクトルのデータは国立標準局の図書館に記録されている４β−メチルチモステロールのものと一致する。
４，４−ジメチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オールの製造
この化合物をショロエプファー（Schroepfer）他の「脂質の化学と物理（Chemistry and Physics of Lipids）」47 第187頁（1988年）に記載されているように製造し、該文献中に記載されている物理常数を示した。
例 ５
４，４−ジメチルコレスト−８−エン−３β−オールの製造段階Ａ
2.48ｇの４，４−ジメチルコレスタ−８，14−ジエン−３β−オール（例４）を０℃で20mlのピリジンに溶解した。1.7ｇの塩化安息香酸を加え、混合物を周囲温度で１晩撹拌した。蒸発乾燥後、25mlのトルエンを加え、標準的水溶性仕上げ、蒸発及びアセトンを用いた粉末化後、2.3ｇ（74％）の安息香酸塩結晶を得た。
1H-NMRスペクトル（CDCl3、δ）は8.1（d，2H）；7.55（t，1H）；7.4（t，2H）；5.4（s，広い、1H）；4.2（dd，1H）で特徴的シグナルを示した。
段階Ｂ
2.04ｇの３−ベンゾイルオキシ−４，４−ジメチルコレスタ−８，14−ジエン（段階Ａ）を50mlのTHFに溶解し、１ＭのボランのTHF溶液360mlを０℃で滴加した。混合物を周囲温度で１晩撹拌し、０℃に冷却し、140mlの水を滴加し、続いて10％の水酸化ナトリウム360ml及び30％の過酸化水素378mlを滴加した。90分間撹拌後、混合物に100mlのジエチルエーテルを加え、水相をジエチルエーテルで２回抽出した。有機相をいっしょにし、重亜硫酸ナトリウム溶液で２回洗浄し、次に水で洗浄した。蒸発後、生成物をSiO2でのクロマトグラフィーで精製し（トルエン中の２％ジエチルエーテル）、0.62ｇの３−ベンゾイルオキシ−４，４−ジメチルコレスト−８−エン−15−オールを得た。
MS（分子イオン）：534.4
1H-NMRスペクトル（CDCl3、δ）は、8.0（d，2H）；7.5（t，1H）；7.4（t，2H）；4.75（m，1H）；4.1（m，1H）に特徴的なシグナルを示した。
段階Ｃ
0.54ｇの３−ベンゾイルオキシ−４，４−ジメチルコレスト−８−エン−15−オールを０℃で2.7mlのピリジンに溶解し、33mgのジメチルアミノピリジン及び287mgのフェニルクロロチオホルメートを慎重に加えた。混合物を周囲温度で20時間撹拌した。25mlのジエチルエーテルの添加後、混合物を硫酸銅の飽和水溶液で６回、10％の水酸化ナトリウム、水及び塩水で２回洗浄し、蒸発させて、0.68ｇの粗３−ベンゾイル−４，４−ジメチルコレスト−８−エン−15−フェニルチオカーボネートを得、それをさらに20mlのトルエンに溶解することにより処理し、370mgのトリブチル錫水素化物及び20mgのアゾイソブチロニトリルで処理した。混合物を90℃で20分間加熱し、同じ処理を繰り返した。蒸発後、混合物をSiO2でのクロマトグラフィー（ヘプタン／メチレンクロライド：70／30）で、粗く精製して、相当する８，14−ジエン（段階Ａ）で汚染された、150mgの粗３−ベンゾイルオキシ−４，４−ジメチルコレスト−８−エンを得た。
段階Ｄ
段階Ｃで製造した混合物150mgを2mlのメチレンクロライドに溶解し、０℃に冷却した。0.7mlのジイソブチルアルミニウム水素化物を滴加し、15分後に0.15mlの水を慎重に加えた。次に、25mlのジエチルエーテルを加え、有機相を酒石酸カリウムナトリウムの飽和溶液で２回洗浄し、水で洗浄し、塩水で洗浄して、蒸発させて、130mgの混合物を得、該混合物をAgNO3／SiO2（「Chem. & Phys. of Lipids」63 第115頁（1992年）に記載されたように調整した）でクロマトグラフィーに付し、トルエンで溶出した。エーテル／メタノールからの結晶化により49mgの表題の化合物を得た。
融 点：154〜155℃
MS（分子イオン）：414.4
13C-NMRスペクトル（CDCl3、100.6MHz）は、78.49（C3）；127.49（C8）；135.35（C9）に特徴的シグナルを示した。
例 ６
３−アセトキシ−４，４−ジメチルコレスタ−８，14−ジエンの製造
1.3ｇの４，４−ジメチルコレスタ−８，14−ジエン−３−オール（Schroepfer他の「Chemistry and Physics of Lipids）」47 第187頁（1988年））を7.5mlのピリジン及び7.5mlの酢酸無水物に溶解し、22℃で１晩撹拌した。混合物を真空で蒸発させ、トルエンで２回取り除き、SiO2でフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（トルエン）。溶出液の最初の300mlを蒸発させ、生成物をジエチルエーテルから結晶化させ、140mgの３−アセトキシ−８，14−ジメチルコレスタジエンを生じた。
融 点：120〜125℃（分解した）
MS（分子イオン）：454.4
1H-NMRスペクトル（CDCl3、δ）は、5.4（s，広い、1H）；4.5（dd，1H）；2.0（s，3H）に特徴的なシグナルを示した。
例 ７
コレスタ−８，14−ジエン−３β−オールの製造
770mgのデヒドロコレステロールを2.7mlのベンゼン、19mlのエタノール及び2.7mlの濃塩酸の混合物に溶解し、還流温度で３時間加熱した。混合物を氷浴で冷却し、それにより、最初の収穫物の結晶110mgを得た。ろ液を蒸発により乾燥させ、エーテル／メタノールからの結晶化により、第２の収穫物の結晶220mgを得、それを第１の収穫物と合せて、AgNO3／SiO2（例５、段階Ｄで記載したように調製）でクロマトグラフィーに付し、トルエン中の2.5％アセトンで溶出させて、94mgの純コレスタ−８，14−ジエン−３β−オールを得た。
融 点：113〜114.5℃
MS（分子イオン）：384.4
生成物の1H-NMRスペクトルは、5.35（s，広い、1H）；3.6（m，1H）に特徴的なシグナルを示した。
13C-NMRスペクトル（CDCl3、50.3MHz）は、70.99（C3）；117.42（C15）；123.1（C8）；140.8（C9）；151.1（C14）に特徴的なシグナルを示した。
例 ８
４，４−テトラメチレンコレスタ−８，14−ジエン−３−オールの製造
段階Ａ
1.15ｇのデヒドロコレステロールを15mlの２−ブタノンに溶解し、0.34ｇのアルミニウムイソプロポキシドを加え、混合物を還流温度で75分間加熱した。氷浴で冷却後、15mlの２Ｎ塩化水素酸を加えた。相が分離し、有機相を7.5mlの２Ｎ塩化水素酸で２回洗浄した。水相をトルエンで抽出し、有機相をいっしょにし、水と塩水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させて、1.18ｇの粗コレスタ−５，７−ジエン−３−オンを粘稠な油として得た。
1H-NMRスペクトルは5.8（s，1H）；5.2（m，1H）；3.2（d，1H）；2.7（dd，1H）に特徴的なシグナルを示した。
段階Ｂ
0.67ｇのカリウムｔ−ブトキシドを45℃で16mlのｔ−ブタノールに溶解させ、0.57ｇのコレスタ−５，７−ジエン−３−オンを加え、混合物を10分間撹拌した。0.47ｇの１，４−二沃化ブタンを加え、混合物を30分間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をトルエンと水に再溶解し、少量の塩水を加えて相分離を誘導させた。有機相を水で４回洗浄し、水相をいっしょにして、トルエンで１回抽出した。トルエン抽出物をいっしょにして、乾燥させ、蒸発させて、0.45ｇの泡状物を得た。それはジエチルエーテル／メタノールから結晶化後、0.35ｇの結晶４，４−テトラメチレンコレスタ−５，７−ジエン−３−オンを生じた。
MS（分子イオン）：436.4
1H-NMRスペクトル（CDCl3δ）は、5.75（d，1H）；5.5（m，1H）に特徴的シグナルを示した。
段階Ｃ
130mgのLiAlH4を６mlのTHF中に懸濁し、40mlのTHFに溶解した４，４−テトラメチレンコレスタ−５，７−ジエン−３−オンを30分間かけて滴加した。15分後、添加が完了し、なお、いくらかの未反応の出発物質（TLC）が残存し、65mgの追加のLiAlH4を加えた。30分間撹拌後反応が完了し、５mlのTHFに溶解した0.9mlの水を滴加した。30分撹拌後、過剰の硫酸マグネシウムを添加し、混合物を更に30分間撹拌し、ろ過し、蒸発させて乾燥させた。残留物を25mlのジエチルエーテル及び25mlのメタノールに溶解し、エーテルを真空中で慎重に除去した。１晩撹拌後、ろ過により1.75ｇの結晶４，４−テトラメチレン−コレスタ−５，７−ジエン−３−オールを単離した。
MS（分子イオン）：438.4
1H-NMRスペクトルは5.8（d，1H）；5.5（m，1H）；3.5（m，1H）に特徴的なシグナルを示した。
段階Ｄ
770mgの段階Ｃで製造した化合物を、2.38mlのベンゼン、17.5mlのエタノール及び2.38mlの濃塩化水素酸の混合物に溶解し、還流で16時間加熱し、真空で蒸発させた。残留物を５mlのトルエンに再溶解し、ろ過し、AgNO3／SiO3の中圧カラムのクロマトグラフィーに付し（ヘプタン：トルエン、10:90）、35mgの４，４−テトラメチレン−コレスタ−８，14−ジエン−３−オールを得た。
MS（分子イオン）：438.4
1H-NMRスペクトル（CDCl3、δ）は、5.35（s，広い、1H）；3.3（d，d，1H）に特徴的なシグナルを示した。
13C-NMRスペクトル（CDCl3、100.6MHz）は79.0（C3）；117.4（C15）；122.9（C8）；141.3（C9）；151.1（C14）に特徴的なシグナルを示した。
例 ９
４，４−ジメチルコレスト−８（14）−エン−３β−オールの製造
580mgの４，４−ジメチルコレスト−８−エン−３β−オールを20mlのジエチルエーテル及び20mlの酢酸に溶解した。60mgの10％Pd／Ｃ触媒を加え、混合物を3.5気圧の水素下で撹拌しながら１晩置いた。触媒を除去し、ろ液を10mlに濃縮し、それにより、結晶化が始まった。10mlのメタノールを加え、結晶を16時間後に採取した。メタノールからの再結晶により230mgの物質を生じ、それは1H-NMR及び13C-NMRにより８（９）及び８（14）異性体混合物であることが分かった。
混合物を10mlのジエチルエーテル及び10mlの酢酸に再溶解した。75mgの５％Pb／Ｃ触媒を加え、混合物を常圧で１晩水素処理した。触媒を除去し、溶媒を蒸発させ、結晶性残留物を５mlのメタノールで粉末にし、190mgの純４，４−ジメチルコレスト−８（14）−エン−３β−オールを得た。
MS（分子イオン）：414.4
13C-NMRスペクトル（CDCl3、100.6MHz）は、79.24（C3）；126.11（C8）；142.20（C14）に特徴的なシグナルを示した。
例 10
卵母細胞試験での減数分裂を誘導する物質の試験動物
未成熟の雌のマウス（B6D2-F1、系統C57B1／2J）を食物と水は自由にして調節光（14時間明、10時間暗）及び温度に保った。動物が重さ13〜16ｇに達した時（出産後20〜22日に相当する）、約20IUのFSH及び20IUのLH（Ziebe，S.他「Hum.Reprod. 」８ 第385〜388頁（1993年））を含有するヒトの閉経期のゴナドトロピン（Humegon，Organon，The Netherlands）から１回注射（腹腔内）した。48時間後、動物を頸部脱臼により殺した。
卵母細胞の捕集及び培養
卵巣を除去し、HX−培地（下記参照）中に置き、付着組織を除去した。捕集及び培養培地は、４mMのヒポキサンチン、３mg／mlのウシ血清アルブミン、0.23mMのピルビン酸ナトリウム、２mMのグルタミン、100Ｕ／mlのペニシリン及び100μｇ／mlのストレプトマイシン（すべてSigma，USA）を含有するイーグル最少必須培地（Flow，USA）から成った。この培地をHX−培地という。同じ培地であるがHXのないものを対照培地として用いた。
卵巣の腔の小胞を27−ゲージの針を用いて解剖顕微鏡の下で穴をあけた。均一なサイズの卵母細胞を包含する丘（CEO）を選択し、新鮮なHX−培地で３回洗浄した。
丘細胞から除去した卵母細胞、すなわち、露出された卵母細胞（DO）を細い穴の口で調節するピペットによってCEOをおだやかに洗い流すことにより得た。対照培地中で培養された対照を除いて、0.5mlのHX−培地を含有する４ウェルマルチ皿（Nunclon，デンマーク）中でCEO及びDOを培養した。各ウェルは35〜50卵母細胞を含有していた。試験培養は表５に示されるように異なる濃度の被試験化合物で作った。
培養は37℃で５％のCO2を含有する空気中で湿度100％で実施した。
卵母細胞試験
培養期間の終りに、胚胞（GB）または胚胞崩壊（GVBD）を有する卵母細胞の数及び極体（PB）を有する卵母細胞の数を、微分干渉コントラスト装置付き倒立顕微鏡中で数えた。全卵母細胞数に対するGVBDを有する卵母細胞のパーセント及びGVBDに対するPBを有する卵母細胞のパーセントを計算した。MIS活性の単位として計算した、DO及びCEOについての結果を表５に示す。MIS活性の１単位は、
MIS活性単位の数は、
生殖腺試験における減数分裂を誘導する物質の試験
生殖腺試験を本質的にバイスコフ，A.G.他の「Mol.Reprod.Dev.」34 第47〜52頁（1993年）に記載されているように実施した。表６に示された結果はウェスターガード（Westergaard），Ｌ．他の「Fertil.Steril.」41 第377〜384頁（1984年）に記載されているように半定量的に評価した。
モノ（５α−コレスタ−８，14−ジエン）−３β−スクシネートの製造
0.50ｇの５α−コレスタ−８，14−ジエン−３β−オールを10mlのTHFに溶解し、次いで0.39ｇのコハク酸無水物及び16mgの４−ジメチルアミノピリジンを溶解した。溶液を還流で１晩加熱し、次いで、蒸発させて乾燥した。残留物を10mlの水に懸濁し、沈殿をろ過により取り除き、水洗し、乾燥させて、0.48ｇの表題の化合物を得た。この化合物を更に水性炭酸水素ナトリウム及びエタノールの混合物に溶解し、塩化水素酸を加えてPH2とし、続いて溶液を濃縮して沈殿を生じさせることにより精製することができた。
融 点：128〜131℃
MS（分子イオン）：484.4
生成物の1H-NMRスペクトル（CDCl3、δ）は5.36（s，1H）；4.75（m，1H）；2.67（m，2H）；2.6（m，2H）に特徴的なシグナルを示した。
13C-NMRスペクトル（CDCl3、100.6MHz）は、73.4；117.1；122.7；140.0；150.5；171.2；177.2に特徴的なシグナルを示した。
例 13
３β−エトキシカルボニルオキシ−５α−コレスタ−８，14−ジエンの製造
氷浴中で冷却しながら、0.50ｇの５α−コレスタ−８，14−ジエン−３β−オールを５mlのトルエン及び５mgのピリジンの混合物に溶解した。５mlのトルエンに溶解した2.3mlのエチルクロロホルメートを５分間にわたり添加した。30分後、氷浴を取り除き、室温で20時間、次いで60℃で２時間撹拌を継続させた。反応混合物を真空中で蒸発させて乾燥させ、10mlのエタノールで粉末にし、0.505ｇの表題化合物を得、それはさらにエタノールから再結晶により精製できた。
融 点：101〜106℃
MS（分子イオン）：456.3
生成物の1H-NMRスペクトル（CDCl3、δ）は、5.30（s，1H）；4.50（m，1H）；4.12（q，2H）；1.24（t，3H）に特徴的なシグナルを示した。
13C-NMRスペクトル（CDCl3、100.6MHz）は62.6；116.6；122.2；139.4；150.0；153.6に特徴的なシグナルを示した。
例 14
３β−ホスホノオキソ−４，４−ジメチル−５α−コレスタ−８，14−ジエンの製造
2.00ｇの４，４−ジメチル−５α−コレスタ−８，14−ジエン−３β−オールを10mlの乾燥ピリジンに溶解し、氷浴中で冷却しながら、10mlの乾燥アセトン中の1.66mlのオキシ塩化燐の溶液に５分間かけて添加した。室温で30分間撹拌後、沈殿物をろ過して取り除き、乾燥アセトンで洗浄した。残留物を70mlの水に懸濁させ、還流で１1/4時間加熱した。室温に冷却後、沈殿物をろ過して取り除き、水で洗浄し、乾燥して0.93ｇの粗生成物を得た。0.70ｇの粗生成物を75mlの0.1Ｍ水性水酸化カリウムに溶解し、10ｇのアンバーライト樹脂IR-120（H）を通してろ過し、真空中で蒸発させて乾燥した。残留物を10mlの水で粉末にし、沈殿物をろ過により取り除き、水で洗浄し、乾燥して、0.48ｇの表題の化合物を得た。
融 点：183〜185℃
生成物の1H-NMRスペクトル（CDCl3＋２滴のCD3OD）は5.36（s，1H）；3.89（m，1H）に特徴的なシグナルを示した。
生成物の13C-NMRスペクトル（CDCl3＋２滴のCD3OD、100.6MHz）は、85.1；116.9；122.3；140.9；150.5に特徴的なシグナルを示した。
例 15
３β−イソニコチノイル−５α−コレスタ−８，14−ジエンの製造
0.50ｇの５α−コレスタ−８，14−ジエン−３β−オールを５mlのピリジンに溶解し、続いて1.16ｇの塩化イソニコチノイル塩酸塩を溶解した。懸濁液を還流で１晩加熱し、次いで蒸発させて乾燥した。氷浴中で冷却しながら、残留物を100mlの水に懸濁した。沈殿物をろ過により取り除き、水で洗浄し、乾燥させて0.97ｇの粗生成物を得、それをアセトン／水から再結晶し、0.40ｇの表題の化合物を得た。
融 点：129〜131℃
生成物の1H-NMRスペクトルは、8.77（d，2H）；7.84（d，2H）；5.39（s，1H）；4.49（m，1H）に特徴的なシグナルを示した。
13C-NMRスペクトル（CDCl3、50.3MHz）は、75.0；117.7；122.8；123.3；138.0；140.3；150.5；150.9；164.6に特徴的なシグナルを示した。
Claims (35)
- 一般式（Ｉ）の化合物であって、
式中、Ｒ1及びＲ2は、独立に、水素、ハロゲンもしくは水酸基により置換されていてもよい、非分枝もしくは分枝Ｃ1〜Ｃ6アルキル基を含む群から選択されるか、またはＲ1及びＲ2はそれらが結合している炭素原子といっしょになってシクロペンタン環もしくはシクロヘキサン環を形成し、
Ｒ3及びＲ4はいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、その場合に、Ｒ5は水素で、Ｒ6及びＲ7は水素またはいっしょになってそれらが結合している炭素結合の間の付加的な二重結合を表わすかのいずれかであるか、または、
Ｒ5及びＲ4はいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、その場合Ｒ3は水素で、Ｒ6及びＲ7は水素またはいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わすかのいずれかであるか、または
Ｒ6及びＲ4はいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、その場合、Ｒ3，Ｒ5及びＲ7はすべて水素であり、Ｒ8及びＲ9は水素またはいっしょになってそれらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、
Ｒ10はスルホニル基もしくはホスホニル基を含むアシル基（アセチル及びベンゾイルを除く。）のいずれであるか、分子の残りの部分といっしょになってエーテルを形成する基である、
前記化合物。 - Ｒ1が水素またはメチル基である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ1がエチル基並びに非分枝または分枝Ｃ3〜Ｃ6アルキル基からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ1が６炭素原子までの非分枝または分枝ヒドロキシアルキル基である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ1が６炭素原子までの非分枝または分枝α−ヒドロキシアルキル基である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ1がハロゲンで置換された、非分枝または分枝アルキル基である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ1がトリフルオロメチル基である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ2が水素またはメチル基である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ2がエチル基並びに非分枝もしくは分枝Ｃ3〜Ｃ6アルキル基からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ2が６炭素原子までの非分枝または分枝ヒドロキシアルキル基である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ2が６炭素原子までの非分枝または分枝α−ヒドロキシアルキル基である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ2がハロゲンで置換された非分枝または分枝アルキル基である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ2がトリフルオロメチル基である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ1とＲ2がそれらが結合している炭素原子といっしょになってシクロペンタン環を形成している、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ1とＲ2がそれらが結合している炭素原子といっしょになってシクロヘキサン環を形成している、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ3及びＲ4がいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、Ｒ5が水素である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ5及びＲ4がいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、Ｒ3が水素である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ6及びＲ4がいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わし、Ｒ3，Ｒ5及びＲ7が水素である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ6及びＲ7が水素である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ6及びＲ7がいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わしている、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ8及びＲ9が水素である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ8及びＲ9がいっしょになって、それらが結合している炭素原子の間の付加的な結合を表わしている、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ10が１〜20の炭素原子を有する酸から誘導されたアシル基（アセチル及びベンゾイルを除く。）である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ10が、ピバロイル、ブチリル、ニコチノイル、イソニコチノイル、半スクシノイル、半グルタロイル、ブチルカルバモイル、フェニルカルバモイル、ブトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル及びエトキシカルボニル基からなる群から選択されるアシル基である、請求項23に記載の化合物。
- Ｒ10がアルキル基、アルアルキル基、アルキルオキシアルキル基またはアルカノイルオキシアルキル基であって、各基が全体として炭素原子10までであって、分子の残りの部分とエーテルを形成する、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ10がメトキシメチル基またはピバロイルオキシメチル基である、請求項25に記載の化合物。
- Ｒ10がスルホ基である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ10がホスホノ基である、請求項１に記載の化合物。
- 不妊の治療のための又は避妊のための請求項１〜28のいずれか１項に記載の一般式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物。
- 哺乳類の生殖細胞における減数分裂の調節のための請求項１〜28のいずれか１項に記載の一般式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物。
- 請求項１〜28のいずれか１項に記載の化合物の有効量を含む、哺乳類の生殖細胞における減数分裂を調節するための医薬組成物であって、当該組成物が、上記治療が必要な生殖細胞に投与される、前記組成物。
- 請求項１〜28のいずれか１項に記載の化合物が、哺乳類宿主生殖細胞にそれを投与することにより、前記細胞に投与される、請求項31に記載の医薬組成物。
- 減数分裂が調節される生殖細胞が卵母細胞である、請求項31または32に記載の医薬組成物。
- 請求項１〜26のいずれか１項に記載の化合物が体外で卵母細胞に投与される、請求項31に記載の医薬組成物。
- 減数分裂が調節される生殖細胞が精子である、請求項32に記載の医薬組成物。
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