SK165596A3

SK165596A3 - Sterol derivatives used for regulation of meiosis in the mammalian zygotes

Info

Publication number: SK165596A3
Application number: SK1655-96A
Authority: SK
Inventors: Anne G Byskov; Claus Y Andersen; Lars Nordholm; Henning Thogersen; Ole Wassmann; Ivan V Diers; Erling Guddal
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1994-06-23
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 1997-08-06
Also published as: BR9508074A; CN1151164A; CZ289407B6; EP0767798B1; PL186688B1; AU694240B2; ES2204955T3; DE69531682D1; HUT76343A; UA51622C2; FI965144A0; EP0767798A1; US5716777A; CN1068333C; FI965144A; HU9603584D0; NO965516D0; WO1996000235A1; PL317830A1; CA2192941A1

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka sterolových derivátov a spôsobu regulovania miózy v zárobkových bunkách cicavcov.

Doterajší stav techniky

Mióza je jedinečnou a základnou udalosťou zárobkových buniek, na ktorej je založená sexuálna reprodukcia. Mióza zahrňuje dve miotické delenia. V priebehu prvého delenia dochádza k výmene medzi materskými a otcovskými génmi pred tým, ako sa páry chromozómov rozdelia na dve dcérske bunky. Tie obsahujú len polovicu (ln) chromozómov a 2c DNA. Druhé miotické delenie prebieha bez DNA syntézy. Toto delenie teda vedie k tvorbe haploidných zárodkových buniek s len 1 c DNA.

Miotické udalosti sú podobné v samčích aj samičích zárodkových bunkách, ale časový postup a diferenciačné procesy, ktoré vedú k vajíčkam a spermiám, sa zásadne líši. Všetky samičie zárodkové bunky vstupujú do prefáze prvého miot-ického delenia v skorom štádiu života, často pred narodením, ale všetky sú neskôr zadržané ako oocyty v tejto prefáze až do ovulácie po puberte. Od velmi skorého obdobia života má teda samička zásobu oocytov, ktoré sa čerpajú tak dlho, pokial zásoba nie je vyčerpaná. Mióza u samičiek nie je po oplodnení ukončená a vedie len k jednému vajíčku a dvom abortívnym polárnym telieskam na zárodkovú bunku. Naopak, len niektoré samčie zárodkové bunky vstupujú po puberte do miózy a nechávajú kmeňovú populáciu zárodkových buniek na celý život. Ked mióza raz začne, potom v samčej bunke prebieha bez významného oneskorenia a produkuje 4 spermie.

mechanizme, ktorý reguluje iniciáciu miózy u samca a u samičky, je toho známe len veľmi málo. U oocytov nové štúdie poukazujú na to, že by folikulárne puriny, hypoxantín >

alebo adenozín mohli byť zodpovedné za miotické zadržanie (Downs S . M , J. a s po 1 . : R e p r o d . D e v .

a spol. : D e v . B i o 1 . 82 . 454 (1985), E p p i g J.

Dev. Biol. 119, 3 1 3 (1986) a Downs S. M. 35, 82 (1993))

Mol

Prítomnosť miózu regulujúcich látok schopných difúzie bola ako prvá napísaná Byskovom a spol. v kultivačnom systéme žliaz f'etálnych myší (Byskov A, G. a spol. : Dev. Biol. 52.. 193 ( 1 976)). Látka, indukujúca miózu (MIS) bola sekretovaná fetálnym myším vaječníkom u ktorého mióza nastúpila a látka, zabraŕiujúca miózu (MPS) bola uvoľnená z morfologicky diferencovaných vajíčok s odpočívajúcimi neini ot i ckými zárodkovými bunkami. Bolo navrhnuté. že relatívna koncentrácia MIS a MPS regulovali začiatok, zadržanie a opätovné zahájenie miózy v samčích a samičích zárobkových bunkách (Byskov A. G. a spol. v The Physiology of Reproduct i on (red. Knobil E.

Raven Press, New York (1994)) . Je jasné, regulovať miózu, možno regulovať reprodukciu. Nanešťastie až do dnešnej doby nebolo možné identifikovať látku, indukujúcu miózu.

, Neill J. D.), že ak je možné

Podstata vynálezu

Prekvapivo bolo zistené, že niektoré steroly, známe ako medziprodukt y biosyntézy cholesterolu, a niektoré nové, štruktúrne príbuzné syntetické steroly možno použiť pre reguláciu miózy.

Predložený vynález sa teda týka sterolových derivátov bežného vzorca I

R*

nerozvetvenej alebo rozvetvenej alkylovej skupiny s 1 až 6 atómami uhlíka, ktorá môže byť substituovaná atómom halogénu q

alebo hydroxylovou skupinou, alebo R¹ a R^z spoločne s atómom uhlíka, na ktorý sú naviazané, tvoria cyklopentánový alebo cyk1ohexánový kruh, r3 a R⁴ znamenajú spoločne dalšiu väzbu medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané, v tomto prípade R^ znamená r n atóm vodíka a R a R znamenajú alebo atóm vodíka alebo spoločne znamenajú dalšiu dvojitú väzbu medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané, alebo

R^d a R⁴ spoločne znamenajú dalšiu väzbu medzi atómami q uhlíka, na ktoré sú naviazané, v tomto prípade R znamená r 7 • atóm vodíka a R a R znamenajú alebo atóm vodíka alebo «ŕyboločne znamenajú dalšiu väzbu medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané, alebo

R^ a R⁴ spoločne znamenajú dalšiu väzbu medzi atómami q c n uhlíka, na ktoré sú naviazané, v tomto prípade R , R^J a R znamenajú atóm vodíka, o Q

R a R znamenajú atóm vodíka alebo spoločne znamenajú dalšiu väzbu medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané, a

R znamená alebo atóm vodíka alebo acylovú skupinu, vrátane fosfonylovej alebo sulfonylovej skupiny, alebo skupinu, ktorá so zostávajúcou časťou molekuly tvorí éter pre použitie ako liečivý prostriedok.

Podlá dalšieho aspektu sa predložený vynález týka nových sterolových zlúčenín bežného vzorca I.

V súvislosti s predloženým vynálezom výraz ” regulujúci miózu je chápaný ako označenie toho, že tieto zlúčeniny sa môžu používať pre stimulovanie miózy in vitro, in vivo a ex vivo.

Podía podrobnejšieho aspektu sa predložený vynález týka použitia zlúčeniny horeuvedeného bežného vzorca I na r egu 1ác i u miózy.

Podía ešte dalšieho aspektu sa predložený vynález týka spôsobu regulovania miózy v zárobkovej bunke cicavcov, ktorý sa vyznačuje tým, že zahŕňa podávanie efektívneho množstva zlúčeniny horeuvedeného bežného vzorca I do zárodkovej bunky, ktorá také liečenie potrebuje.

V dalšej časti tohoto spisu bude predložený vynález popísaný podrobnejšie.

Bolo zistené, že látky indukujúce miózu, extrahované z býčich vajíčok a z Iudskej folikulárnej kvapaliny sú schopné, ako indukovať opätovné zahájenie miózy v kultivovaných myších oocytoch (oocytový test), tak stimulovať miózu v samčích zárodkových bunkách kultivovaných fetálnych myších vajíčok (gonádový test). Látka, ktorá indukuje miózu je produkovaná dospelými vajíčkami rôznych cicavcov vrátane človeka. Nachádza sa tiež v zrelých vaječníkových folikulách niektorých druhov c i cavcov,. vrátane žien. Z príkladov 1 a 2 je zrejmé, že látkou, indukujúcou miózu, ktorá sa nachádza v býčich vajíčkach, je 4,4-dimet y 1zymostero 1 , pričom látkou ľudí . Zlúčeniny bežného činidlami , regulujúcimi indukujúcou miózu. ktorá sa nachádza v ludskej ίο 1 i ku 1árnej kvapaline, je 4,4-dimet y 1-5a-cho 1 e s ta-S , 1 4,24-1 r i e n-3β-ο 1 .

Existencia látok, indukujúcich miózu je známa už dlhšie. Avšak až do dnešného dňa nebola známa identita látky indukujúcej miózu, alebo látok. Podľa najlepších vedomostí autorov predloženého vynálezu nie je až dosiaľ v lekárstve známe žiadne praktické použitie zlúčenín bežného vzorca I. Zvlášť nie je dosiaľ známe použitie žiadnej zlúčeniny bežného vzorca I ako liečivého prípravku na reguláciu miózy.

Perspektíva schopnosti ovplyvňovať miózu je viacerá. Podľa výhodného uskutočnenia predloženého vynálezu sa zlúčeniny bežného vzorca I používajú na stimulovanie miózy. Podľa iného výhodného uskutočnenia predloženého vynálezu sa zlúčeniny bežného vzorca I používajú na stimulovanie miózy u vzorca I sú teda sľubnými novými plodnosť bez známeho vedľajšieho účinku na somatické bunky, ktoré sú známe z doposiaľ používaných hormonálnych antikoncepčných činidiel, ktoré sú založené na estrogénoch a/alebo gestagénoch. Pre použitie ako antikoncepčného činidla u žien sa látka indukujúca miózu môže podávať tak, aby prematuračne indukovala opätovné zahájenie miózy v oocytoch, ktoré sú ešte v rastúcom fol i — kule, pred ovulačným maximom výskytu gonadotropí nov. U žien môže byť opätovné zahájenie miózy indukované napríklad týždeň po tom, čo skončila predchádzajúca menštruácia. Ked dochádza k ovulácii, výsledné prezreté oocyty sa najpravdepodobnejšie neoplodnia. Normálny menštruačný cyklus sa pravdepodobne neovplyvní. V tejto súvislosti je dôležité si všimnúť, že biosyntéza progesteronu v kultivovaných ľudských granulóznych bunkách (somatické bunky folikulu) nie je ovplyvnená prítomnosťou látky indukujúcej miózu, pričom estrogény a gestagény až dosial používané v hormonálnych antikoncepčných prostriedkoch majú nepriaznivý účinok na biosyntézu progesteronu.

Podía iného aspektu tohoto vynálezu sa látka indukujúca miózu bežného vzorca I môže používať pri liečení niektorých pri pádov neplodnosti u samičiek, vrátane žien, môže sa podávať tým, ktoré, vdaka nedostatočnej vlastnej produkcii MIS, nie sú schopné produkovať zrelé oocyty. Ak sa uskutočňuje oplodnenie in vitro, dosiahnu sa tiež lepšie výsledky, ak sa látka indukujúca miózu bežného vzorca I pridáva k médiu, v ktorom sú oocyty uchovávané.

Ak je neplodnosť samcov, vrátane mužov, spôsobená nedostatočnou vlastnou produkciou látky indukujúcej miózu, potom podávanie látky indukujúcej miózu bežného vzorca I môže tento problém odstrániť.

Spôsobom podávania prostriedkov obsahujúcich zlúčeninu bežného vzorca I môže byť akýkolvek spôsob, ktorý efektívne dopravuje aktívnu zlúčeninu do miesta jej pôsobenia.

.Ak sa teda zlúčeniny podlá tohoto vynálezu podávajú cicavcovi,potom sa výhodne podávajú vo forme farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje aspoň jednu zlúčeninu bežného vzorca I spoločne s farmaceutický prijatelným nosičom. Pre orálne použitie sa pripravujú tieto prostriedky výhodne vo forme kapsuliek alebo tabletiek.

Podlá horeuvedeného bude zrejmé, že režim podávania bude závisieť na stave liečeného. Ak sa používa na liečenie neplodnosti, podávanie môže byť len jediné alebo počas obmedzenej doby, napríklad do dosiahnutia tehotenstva. Ak sa podáva ako antikoncepčný prostriedok, látka indukujúca miózu bežného vzorca I sa musí brať kontinuálne alebo cyklicky. Ak sa používa ako antikoncepčné činidlo u žien a neberie sa kontinuálne, bude hrať dôležitú úlohu čas podávania vzhladom k menštruačnému cyklu.

Farmaceutické prostriedky môžu obsahovať nosiče, riedidlá, zosilovače absorpcie, ochranné činidlá, pufre, činidlá pre úpravu osmotického tlaku, činidlá dezintegrujúce tabletku a dalšie prísady, ktoré sa konvenčné používajú v oblasti techniky. Medzi príklady pevných nosičov patrí uhličitan horečnatý, stearát horečnatý, dextrín, laktóza, cukor, talok, želatína, pektín, tragant, mety 1ce1 u 1óza, sodná sol karboxymetylcelulózy, nízkotopiace sa vosky a kakaové mas1 o.

Medzi kvapalné prostriedky patria sterilné roztoky, suspenzie a emulzie. Také kvapalné prostriedky môžu byť vhodné pre injekciu alebo pre použitie v súvislosti s ex vivo alebo in vitro oplodnením. Kvapalné prostriedky môžu obsahovať iné prísady, ktoré sa konvenčné použ ívaj ú v oblasti techniky, zoznam niektorých z nich je uvedený hore.

Prostriedok pre transdermálne podávanie zlúčeniny podía tohoto vynálezu sa môže pripraviť vo forme náplasti. Prostriedok pre nosné podávanie sa môže pripraviť vo forme spreja v kvapalnej alebo práškovej forme, určenej na podávanie do nosa.

Dávka zlúčeniny podía vynálezu, ktorá sa používa, bude stanovená lekárom a bude, mimo iné, závisieť na príslušnej použitej zlúčenine, na spôsobe podávania a na účele použ i t i a.

Výhodnými zlúčeninami bežného vzorca I sú nasledujúce zlúčeniny : cho1 est-7-en-33-o1,

4-metylcholest-7-en-3(3-ol ,

4-ety1cho1 est-7-en-3p-o1,

4.4- dimetylcholest-7-en-33-ol,

4a-metyl-4P-etylcholest-7-en-3p-ol, a-e ty l-4(3-me ty 1 cholest-7-en-33-ol ,

4.4- dietylcholest-7-en-36-ol,

4-propylcholest-7-en-3p-ol,

4-buty1cholest-7-en-3B-ol ,

4-i zobúty 1 cholest-7-en-38-ol,

4.4- tetrametyléncholest-7-en-3(3-ol,

4.4- pentametyléncholest-7-en-33-ol , cho1 est-8-en-38-o1, 4-metylcholest-8-en-38-ol, 4-etylcholest-8-en-3(3-ol ,

4.4- dimetylcholest-8-en-38-ol,

4a-mety 1 — 4 (3 — e t y 1 cholest-8-en-3(3-ol , 4a-etyl-48-metylcholest-8-en-3f3-ol,

4.4- dietylcholest-8-en-38-ol,

4-propylcholest-8-en-3(3-ol ,

4-butylcholest-8-en-3|3-ol ,

4-i zobuty 1 cho 1 es t-8-en-3f3-o 1 ,

4.4- tetrametyléncholest-8-en-38-ol,

4.4- pentametyléncholes t-8-en-3ft-ol, cholest-8(14)-en-3|3-ol , 4-metylcholest-8(14)-en-3f3-ol , 4-etylcholest-8(14)-en-3P-ol,

4.4- dimetylcholest-8(14)-βη-3β-ο1, 4a-metyl-4(3-etylcholest-8( 14)-en-3P-ol , 4a-etyl-4P-metylcholest-8(14)-en-38-ol,

4.4- dietylcholest-8(14)-en-3(3-ol, 4-propylcholest-8(14)-en-30-ol,

4-buty1cholest-8(14)-en-38-ol,

4-i zobuty1cholest-8(14)-en-3B-ol,

4.4- tetrametyléncholest-8(14)-en-38-ol,

4.4- pentame ty 1 éncho1 es t-8(14)-βη-3β-ο1, cholesta-8,Η-άΐεη-ββ-οΙ, 4-metylcholesta-8,14-άϊβη-3β-ο1, 4-etylcholesta-8,14-άϊβη-3β-ο1,

4.4- dimetylcholesta-8,14-d i εη-3β-ο1,

4a-me t y1-40-ety 1 cholesta-8,14-dien-30-ol ,

4a-etyl-40-metylcholesta-8, 14-d i en-30-ο 1 ,

4.4- dietylcholesta-8,14-dien-30-ol,

4-propy1cho1 esta-8,14-dien-30-ο1,

4-buty1cho1 esta-8 ,14-dien-30-ο1,

4-izobutylcholesta-8,14-dien-30-ol,

4.4- tetrametyléncholesta-8,14-dien-30-ol,

4.4- pentametyléncholesta-8, 14-dien-30-ol , cholesta-8,24-dien-30-ol,

4-metylcholesta-8,24-dien-30-ol,

4-etylcholesta-8,24-dien-30-ol,

4.4- dimetylcholesta-8,24-dien-30-ol,

4a-mety 1-40-e ty 1cho1 es ta-8,24-dien-30-ol,

4a-etyl-40-metylcholesta-8,24-dien-30-ol,

4.4- dietylcholesta-8,24-dien-30-ol ,

4-propylcholesta-8,24-dien-30-ol,

4-butylcholesta-8,24-dien-30-ol,

4-izobutylcholesta-8,24-dien-30-ol,

4.4- tetrametyléncholesta-8,24-dien-30-ol,

4.4- pentametyléncholesta-8,24-dien-30-ol, cholesta-8,14,24-trien-30-ol,

4-metylcholesta-8,14,24-trien-30-ol,

4-etylcholesta-8,14,24-trien-30-ol,

4.4- dimety 1cholesta-8,14,24-trien-30-ol,

4a-mety1-40-etylcholes ta-8,14,24-trien-30-ol,

4a-e ty1-40-mety1cholesta-8,14,24-trien-30-ol,

4.4- dietylcholesta-8,14,24-1r i en-30-ο1,

4-propylcholesta-8,14,24-trien-30-ol,

4-buty1cholesta-8,14,24-trien-30-ol,

4-izobuty1cho1 esta-8,14,24-trien-30-ol,

4.4- tetrametyléncholesta-8,14,24-trien-30-ol,

4.4- pentamety1éncho1 esta-8,14,24-trien-30-ol a ich estery a étery.

Výhodnými estermi bežného vzorca I sú tie estery, v ktorých R^ znamená acylovú skupinu karboxylovej kyseliny, ktorá môže byť rozvetvená, nerozvetvená alebo cyklická a môže obsahovať prípadne substituovanú amínovú skupinu a/alebo 1 alebo 2 atómy kyslíka vedia karbony1ového atómu kyslíka esterovej skupiny, ktorý viaže skupinu R^ na sterolový skelet. Ak R^ znamená acylovú skupinu, potom výhodne znamená skupinu s 1 až 20 atómami uhlíka, výhodnejšie s 1 až 12 atómami uhlíka, výhodnejšie s 1 až 10 atómami uhlíka, ešte výhodnejšie s 1 až 7 atómami uhlíka. Kyselina, od ktorej je R^ odvodená, môže znamenať dikarboxy1ovú kyselinu. Medzi príklady R θ patrí acetylová , benzoy1ová, pivaloylová, butyrylová, nikotínoylová, izonikot ínoy1ová , hemisukcinoylová, herni g 1utaroy1ová, hemima1 ony 1ová, hemiftaloylová, butylkarbamoylová, fenylkarbamoy1ová, butoxykarbonylová, terc. butoxykarbony1ová, etoxykarbony1ová, 4-dimetylaminometylbenzoylová, 4-dietylaminometylbenzoylová,

4-d i propy1ami nomety 1benzoy1ová, 4-(morfoli nomety 1)-benzoylová, 4-(4-metyl-l-piperazinylmetyl)-benzoylová, 3-dimetylaminometylbenzoylová , 3-dietylaminometylbenzoylová, 3-dipropylaminometylbenzoylová, 3-(morfolinometyl)-benzoylová, 3-(4-metyl-l-piperazinylmetyl)-benzoylová, sulfonová (v tomto prípade zlúčenina bežného vzorca I znamená sulfátový ester alebo jeho sol) alebo fosŕónová skupina (v tomto prípade zlúčenina bežného vzorca I znamená fosfátový ester alebo j eho sol) .

Výhodnými estermi bežného vzorca I sú tie estery, v ktorých R^ znamená metylovú skupinu, metoxymetylovú skupinu, benzylovú skupinu alebo pivaloyloxymetylovú skupinu.

Prirodzene sa vyskytujúce zlúčeniny podlá predloženého vynálezu sa môžu zí skavať z prírodných zdrojov známymi spôsobmi. Môžu sa tiež - podobne ako štruktúrne príbuzné syntetické steroidy podlá predloženého vynálezu získavať syntézou známymi spôsobmi.

Predložený vynález je dalej ilustrovaný nasledovnými príkladmi, ktoré však nie sú konštruované ako obmedzujúce rozsah ochrany. Vlastnosti popísané v predchádzajúcom popise a v nasledovných príkladoch môžu ako oddelene, tak v akejkolvek kombinácii znamenať materiál pre realizovanie vynálezu v jeho rôznych formách.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia, čistenie a identifikácia látky indukujúcej miózu (MIS) z býčich vajíčok.

Ihned po porážke boli odobraté vajíčka býka starého 6 rokov (Danish Landrace). Bledý obal bol odstránený a testikulárne tkanivo bolo dané do suchého ladu a skladované pri teplote -80° C. Zmrazené testikulárne tkanivo (92 g) , o bolo rozdrvené na kúsky menšie ako 1 mm^J a sušené vymrazovaním v tme do úplného vysušenia, približne 90 hodín. Tkanivo vysušené vymrazovaním bolo extrahované 24 hodín 400 ml heptánu (LiChrosolv, Merck 4390, Nemecko) pod dusíkom, pri miechaní; pri 20° C. Suspenzia bola sfiltrovaná a pevný materiál bol ešte raz extrahovaný rovnakým postupom. Spojené organické fáze sa odparia dosucha na rotačnom odparováku pri teplote miestnosti. Získa sa 981 mg extrahovaného materiálu. Tento materiál sa rozpustí v heptáne a rozdelí sa do 15 liekoviek, z ktorých sa odparí heptán. Liekovky sa skladujú pod dusíkom pri 4° C v tme.

Extrakty boli čistené trojstupňovým HPLC.

V prvom stupni sa obsah liekovky rozpustí v 50 μΐ % (obj.) tetrahydrofuranu (THF) vo vode a nanesie sa na HPLC kolónu s obrátenou fázou (LiChroSpher 100 RP-8, 5 um, 250 krát 4 mm vnútorný priemer, Merck). Elúcia sa uskutočňuje 15 minút pri 40° C lineárnym gradientom THF od 50 % do 100 % (obj.) (prietok : 1 ml/min.). Zobraných bolo frakcií po 1 ml. Tieto frakcie boli testované na MIS aktivitu.

V druhom stupni boli tie frakcie z prvého stupňa, ktoré boli v oocytovom teste zistené ako aktívne, rozpustené v 50 až 100 ul 70 % (obj.) THF a nanesené na kolónu podobne ako v prvom stupni. Elúcia sa uskutočňuje 16 minút pri 40° C lineárnym gradiantom THF od 60 do 78 % (obj.) prietok 1 ml/min.). Bolo odobraných 8 frakcií po 1 ml. Tieto frakcie boli testované na MIS aktivitu.

V treťom stupni sa frakcie, ktoré boli zistené ako aktívne v oocytovom teste rozpustia v 100 ul zmesi heptánu s 2-propanolom (98 : 2, obj. diely) a nanesú na semipreparatívnu HPLC kolónu (ChrmoSpher Si 5 um, 250 x 10 mm vnútorný priemer, Chrompack). Elúcia sa uskutočňuje pri teplote miestnosti mobilnou fázou, ktorá obsahuje heptán/2propanol v pomere 98 : 2 (obj.), prietok 5 ml/min. Bolo odobraných 5 frakcií po 2,5 ml a tieto frakcie boli testované na MIS aktivitu.

Vo všetkých troch stupňoch bola elúcia sledovaná UF detekciou pri 220 nm.

Materiál, ktorý sa získa horepopísaným trojstupňovým čistením, bol použitý pre štúdie molekulárnej štruktúry aktívnej zlúčeniny NMR spektrometriou a hmotnostnou spektrometri ou.

Pre NMR spektrum sa približne 1 mg vyčisteného materiálu rozpustí v 0,6 ml deuterochloroformu. C-H NMR spektrum, ^H NMR spektrum s a bez rezolúcie) a 2D TOCSY spektra boli zmerané na spektrometri Bruker AMX2 400, ktorý má inverznú širokopásmovú 5 mm hlavu sondy s gradientovou 1 3 cievkou. ^JC NMR chemické posuny v ppm (ó), izolované MIS sú uvedené v tabulke 1 a porovnané so zodpovedajúcimi dátami zymesterolu (Taylor U. F a spol. : J. Lipid Res. 22 . 171 (1981)) a lanosterolu (Emmons G. T. a spol. : Magn. Res. Chem. 27, 1012 (1989)).

Tabuíka 1

atóm uhlíka č.	zymos tero1	lanos terol	MIS
1	35 , 1	35,5	35,8
2	31,5	27,8	28,0
3	70,9	79,0	79,0
4	38,2	38,9	38,9
5	40,7	50,4	50,2
6	25,5	18,2	18,4
7	27,1	26,5	28,5
8	128,0	134,4	128,0
9	134,8	134,4	135,8
10	35,6	37,0	37,0
1 1	22,8	21,0	22, 1
12	36,9	30,9	29,7
13	42,0	44,4	42, 1
14	51 ,8	49,8	51,9
1 5	23,7	30,8	23,8
16	28,7	28,2	28,8
17	54,7	50,4	54,8
18	11,2	15,7	11,3
19	17,8	19,1	19,8
20	36,0	36,2	36,0
21	18,6	18,6	18,6
22	36,0	36,3	36, 1

Tabuíka 1 (pokračovanie)

atóm uhlíka č.	zymosterol	1anos t ero 1	MIS
23	24,7	24,9	24,8
24	125,0	125,2	125,2
25	130,6	130,9	130,9
26	17,6	17,6	17,6
27	25,7	25,7	25,7
28		15,4	15,4
29		27,9	27,9
30		24,2

tok : 0,6 rozpustení

Hmotnostné spektrá boli merané na prístroji VG Trio 1000 LC/MS s LINC interfázou zväzku častíc a softwarom LAB BASE 2.1 (Fisons Instruments) s HPLC systémom s kolónou ChromSpher Si, 3 pm, kolóna 100 krát 4,6 mm (Chrompack). HPLC bola uskutočnená pri teplote miestnosti heptánom s 2propanolom v pomere 98 : 2 (obj.) ako mobilnou fázou (prieml/min.). Vzorka MIS bola injektovaná po heptáne. Hmotnostný spektrometer pracoval spôsobom elektronimpaktu (EI). Výsledky sú uvedené v tabulke 2, v ktorej sú relatívne výšky maxima izolovaného produktu porovnané s dátami pre 4,4-dimety1zymosterol (vid odkaz 1). Pod stĺpcom odkaz 2 označenie + znamená, že zodpovedajúce maximum bolo v tejto štúdii tiež popísané. Označenie v stlpčeku odkaz 1 alebo odkaz 2 znamená, že v týchto štúdiách nebolo zodpovedajúce maximum popísané.

Tabulka 2

m/z	i nt erpre tác i a	MIS	odkaz 1	odkaz 2
412	[M⁺]	100	100	+
397	[M-CH₃]⁺	60	42	+
379	[m-ch₃-h₂o]⁺	24	17	+
301	[M-SC]⁺	1 1	-	+
299	[M-SC-2H]⁺	22	13	-
274	[m-sc-c₂h₃]⁺	8	18	-
259	[m-sc-c₃h₆]⁺	21	33	+
241	[m-sc-c₃h₆-h₂o]₊	44	33	+

SC znamená vedlajší reťazec

C₂H₃ je poloha 16 a 17 je poloha 15, 16 a 17 odkaz 1 : Baloch a spol. : Phy tochemi stry 12.. 2219 ( 1984). odkaz 2 : Morimoto a spol. : Liehigs Ann. Chem. 708. 230 ( 1967) .

Na základe C-NMR spektra a molekulovej hmotnosti 412, ako bola stanovená hmotnostnou spektroskopiou (MS), bola navrhnutá štruktúra MIS izolovaná z býčích vajíčok ako

4.4- dimetyl-5a-cholesta-8,24-dien-38-ol, označovaný tiež ako

4.4- dimetyl-zymosterol (DMZ). Chemické posuny jednotlivých atómov uhlíka MIS aktívneho materiálu z tretieho čistiaceho HPLC stupňa boli porovnané so štruktúrne velmi príbuznými zlúčeninami lanosterolom a zymosterolom. Pozorované chemické posuny, interakčné konštanty a TOCSY korelácie celkom podporujú zistenie, že izolovaná zlúčenina je 4,4-d imetylzymosterol.

Príklad 2

Izolácia, čistenie a identifikácia látky indukujúcej miózu (MIS) z ludskej folikulárnej kvapaliny.

Ľudská folikulárna kvapalina (FF) bola získaná z folikulov, odobraných z oocytov zobraných pri liečení neplodnosti in vitro oplodnením. Kvapalina bola vysušená vymrazením a extrahovaná heptánom. Extrakt bol vyčistený rovnakými postupmi ako je popísané v príklade 1. Zlúčenina aktívneho maxima mala molekulárny ión m/z 410. Hmotnostné spektrum ukazuje na to, že chemická štruktúra FF-MIS molekuly je 4,4-dimetyl-5a-cholesta-8 , 14, 24 —t r i en-3|3-o 1 .

Spôsoby : Hmotnostné spektrá boli merané na prístroji VG Trio 1000 LC/MS s LINC interfázou zväzku častíc a softwarom LAB-BASE 2.1 (Fisons Instruments) spojeným s HPLC systémom s priamou fázou pozostávajúcim z kolóny ChromSpher Si, 3 um, 100 krát 4,6 mm (Chrompack) so zmesou heptánu s 2-propano1om, metanolom a amoniakom v pomere 68:30:2:0,2 (obj.) ako mobilnou fázou (prietok : 0,5 ml/min) pri teplote miestnosti. Vzorka MIS bola injektovaná po rozpustení v heptáne. Hmotnostný spektrometer pracoval spôsobom elektronimpaktu (EI). Výsledky sú uvedené v tabulke 3.

Tabulka 3 m/z interpretácia

410	= M	[M⁺]
395	M-15	[m-ch₃j⁺
392	M-18	[M-H₂O]⁺
377	M-33	[m-ch₃-h₂o]
349	M-6 1	[M-43-H₂O]⁺
281	M-129	[M-SC-H₂O]⁺

(SC=111)

Tabulka 3 (pokračovanie)

m/z	i nt erpre tác i a
279	M-1 3 1	[M-SC-2H-H₂O]⁺
257	M-1 53	[M-SC-42]⁺
255	M-155	[M-154-H]⁺
239	M-171	[M-SC-42-H₂O]⁺

SC znamená vedlajší reťazec

Príklad 3

Príprava 4(3-me ty 1 zymos t ero 1 u fermentáciou.

Stupeň A

Kvasinkový kmeň Kluyveromyces bulgaricus A3410 sa naočkuje na YPG šikmý agar a nechá sa rásť 3 dni pri 30° C v termostatovanom inkubátore. K šikmej pôde sa pridá 5 ml sterilného YE média. Kvasinkové kolónie sa suspendujú v kvapalnom médiu trepaním skúmavky vo vírivom mixéri. Suspenzia buniek sa naberie do 5 ml sterilnej injekčnej striekačky a pridá sa do 500 ml trepacej banky s dvomi narážacími priehradkami na dne. Banka obsahovala 200 ml média ZYM. Banka sa upevní na rotačnú dosku a kultivuje sa 24 hodín pri 250 otáčkach za minútu pri 30° C. Do banky sa pridá 0,4 ml sterilného sfi 1 trovaného roztoku amfotericínu Bav kultivácii sa pokračuje dalších 25 hodín. Kvasinkové bunky sa izolujú odstreďovaním (Beckman model J6, 5° C, 10 minút, 4000 otáčok za minútu) a raz sa premyjú vodou. Kaša buniek sa izoluje v malej plastikovej nádobe. Pred konečnou extrakciou sterolov sa skladuje pri -18° C.

Živné médium a horeuvedený roztok amfotericínu B majú nasledovné zloženie :

- 18 YP agar :

kvasinkový extrakt, Difco hydrogénfos forečnan draselný heptahydrát síranu horečnatého g 1ukóza agar deiónizovaná voda pred autoklávovaním 20 minút na 121° C bolo pH upravené na hodnotu 5,8

YE médium :

kvasinkový extrakt, Difco deiónizovaná voda autoklávovanie 20 minút pri 121° C

ZYM médium :

kvasinkový extrakt, Difco peptón, Bacto vodovodná voda pred autoklávovaním 20 minút na 121° C bolo pH upravené na hodnotu 6,5 až 6,6 glukóza (pridaná oddelene po autoklávovani) g 1 g 0,5 g g 20 g

1000 ml g 1000 ml g 10 g

1000 ml g

roztok amfotericínu B :

mg Fungizónu(^R) (lyofi 1 izovaný koláč 50 mg amfotericínu B, 41 mg deoxycholátu sodného a 20,2 mg fosforečnanu sodného od Squibb) rozpustený v 1 ml deiónizovanej vody.

Stupeň B :

Kultivované bunky zo stupňa A sa suspendujú v 10 ml vody. Pridá sa 10 ml 40 % (hmotn.) KOH v metanole. Zmes sa zohrieva 4 hodiny pod spätným chladičom, nechá sa stáť cez noc pri teplote miestnosti a potom sa extrahuje dvakrát 20 ml heptánu. Spojené extrakty sa premyjú 10 % (hmotn.) roztokom chloridu sodného. Potom sa premývajú vodou do neutrálnej reakcie (päťkrát) a vysušia sa. Odparením rozpúšťadla sa získa 40 mg surových sterolov.

Stupeň C :

Surové steroly zo stupňa B sa rozpustia v 1 ml zmesi heptán/2-propano 1 (98 : 2 obj. dielom), trepú sa vo vírivom mixere, odstredujú 10 minút pri 5000 otáčkach za minútu a potom sa podrobia HPLC :

kolóna : LichroSorb DIOL 10 um, 250 x 4 mm (vnútorný priemer) (Merck) eluent : heptán/2-propano1 (98 : 2 obj. dielom)

Príklad 5

Príprava 4,4-dimetylccholes t-8-en-3B-o lu.

Stupeň A

2,48 g 4,4-dimety 1cholesta-8,14-dien-3-olu (príklad 4) sa rozpustí v 20 ml pyridínu pri 0° C. Pridá sa 1,7 g benzoylchloridu a zmes sa miecha pri teplote miestnosti cez noc. Po odparení dosucha sa pridá 25 ml toluénu a po štandardnom spracovaní, odparení a rozotrení s acetónom sa získa 2,3 g (74 % hmotn.) kryštalického benzoátu. ^H-NMK spektrum (CDClg, 6) vykazovalo charakteristické signály pri 8,1 (d,

2H), 7,55 (t, 1H), 7,4 (t, 2H) , 5,4 (s, široký signál, 1H) , 4,2 (dd, 1H).

Stupeň B

2,04 g 3-benzoy1oxy-4,4-dimety 1cho1 es ta-8,14-dienu (stupeň A) sa rozpustí v 50 ml THF. Pri 0° C sa prikvapká 360 ml IM bóranu v THF. Zmes sa miecha pri teplote miest20 nosti, ochladí sa na 0° C, prikvapká sa 140 ml vody, 360 ml 10 % (hmotn.) hydroxidu sodného a 378 ml 30 % (hmotn.) peroxidu vodíka. Po 90 minútach miechania sa k zmesi pridá 100 ml dietyléteru a vodná fáza sa extrahuje dvakrát dietyléterom. Spojené organické fáze sa premyjú dvakrát roztokom síričitanu sodného a potom vodou. Po odparení sa produkt vyčistí chromatograf iou na oxide kremičitom (elúcia 2 % (obj.) dietyléteru v toluéne). Získa sa 0,62 g 3-benzoy1oxy-4,4-dimet y 1cho1 est-8-en-15-o1 u) . Hmotnostné spektrum : 534,4 (molekulový ión). ^H-NMR spektrum (CDC13, ó) vykazovalo charakteristické signály u 8,0 (d, 2H) , 7,5 (t, 1H), 7,4 (t, 2H), 4,75 (m, 1H), 4,1 (m, IM).

Stupeň C

0,54 g 3-benzoy1oxy-4,4-dimety 1cho1 est-8-en-15-olu sa rozpustí v 2,7 ml pyridínu pri 0° C. Opatrne sa pridá 33 mg dimetylaminopyridínu a 287 mg fenylchlórtiomravenčanu. Zmes sa miecha 20 hodín pri teplote miestnosti. Po pridaní 25 ml dietyléteru sa zmes 6 krát premyje nasýteným roztokom síranu mednatého, vodou, dvakrát 10 % (hmotn.) hydroxidom sodným, vodou a solným roztokom. Odparením sa získa 0,68 g surového 3-benzoyl-4,4-dimetylcholest-8-en-15-fenyltiokarbonátu, ktorý sa dalej spracuje po rozpustení v 20 ml toluénu zreagovaním s 370 mg tributy1cínhydridu a 20 mg azo-izobutyronitrilu. Táto zmes sa zohrieva 20 minút na 90° C, rovnaké spracovanie sa zopakuje, zmes sa odparí a zhruba sa vyčistí chromatografiou na oxide kremičitom (elúcia heptán s metylénchloridom : 70:30 /obj.)). Získa sa 150 mg surového 3-benzoyloxy-4,4-dimetylcholest-8-enu znečisteného zodpovedajúcim 8,14-dienom (stupeň A).

Stupeň D

150 mg zmesi pripravenej v stupni C sa rozpustí v 2 ml metylénchloridu, ochladí sa na 0° C a prikvapká sa 0,7 ml d i i zobú ty 1 a 1 um í n iumhydridu. Po 15 minútach sa opatrne pridá 0,15 ml vody. Potom sa pridá 25 ml dietyléteru a organická fáza sa dvakrát premyje nasýteným roztokom vinanu sódnodraselného, vodou a solným roztokom. Odparením sa získa 130 mg zmesi, ktorá sa chromatografuj e na oxide kremičitom s dusičnanom strieborným (pripraveným ako je popísané v Chem. and Phys . of Lipides 63 . 115 ( 1992)) a elúuje sa toluénom. Kryštalizáciou so zmesi éteru s metanolom sa získa 49 mg titulnej zlúčeniny. Teplota topenia 154 až 155° C.

i q

Hmotnostné spektrum : 414,4 (molekulový ión). ^1JC-NMR spektrum (CDClj, 100,6 MHz) vykazovalo charakteristické signály pri 78,49 (C₃), 127,49 (Cg) a 135,35 (C₉).

Príklad 6

Pri prava 3-ace toxy-4,4-dimetylcholesta-8,14-dienu.

1,3 g 4,4-dimety 1cho1 esta-8,14-dien-3-οlu (Schroepfer a spol.: Chemistry and Physics of Lipids 47 . 187 ( 1988)) sa rozpustí v 7,5 ml pyridínu a 7,5 ml anhydridu kyseliny octovej a miecha sa cez noc pri teplote 22° C. Zmes sa potom odparí vo vákuu, pridá sa toluén a znova sa odparí a tento postup sa ešte raz zopakuje. Potom sa zmes vyčistí bleskovou chromatografiou na oxide kremičitom (toluén). Prvých 300 ml eluátu sa odparí a produkt sa prekryštalizuj e z dietyléteru. Získa sa tak 140 mg 3-acetoxy-8,14-dimety 1cholestadienu. Teplota topenia : 120 až 125° C (pri rozklade). Hmotnostné spektrum : 454,4 (molekulárny ión). ^H-NMR spektrum (CDClg, ô) vykazovalo charakteristické signály u 5,4 (s, široký signál, 1H), 4,5 (dd, 1H) a 2,0 (s, 3H).

Príklad 7

Príprava cholésta-8,14-dien-3β-ο1 u.

770 mg dehydrocholesterolu sa rozpustí v zmesi 2,7 ml benzénu, 19 ml etanolu a 2,7 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej. Zmes sa varí pod spätným chladičom 3 hodiny. Táto zmes sa potom ochladí v ladovom kúpeli. Získa sa tak prvý podiel kryštálov (110 mg). Odparením filtrátu dosucha a kryštalizáciou zo zmesi éteru s metanolom sa získa druhý podiel kryštálov (220 mg), ktorý sa spojí s prvým podielom a schromatografu j e sa na oxide kremičitom s dusičnanom strieborným (pripraveným ako v stupni D príkladu 5). Elúciou 2,5 % (obj.) acetónu v toluéne sa získa 94 mg čistého cho1 es ta-8,14-diεη-3β-ο1 u. Teplota topenia 113 až 114,5° C. Hmotnostné spektrum : 384,4 (molekulárny ión). ^HNMR spektrum (CDCl^, δ) vykazovalo charakteristické signály u 5,35 (s, široký signál, 1H) a 3,6 (m, 1H). ¹³C-NMR spektrum (CDCI3, 50,3 MHz) vykazovalo charakteristické signály u 70,99 (C₃), 117,42 (C₁₅), 123,1 (C_g), 140,8 (C₉) a 151,1 (C14).

Príklad 8

Príprava 4,4-tetrametyléncholesta-8,14-dien-3-olu

Stupeň A

1,15 g dehydrocholesterolu sa rozpustí v 15 ml 2-butanónu. K zmesi sa pridá 0,34 g izopropylátu hlinitého a zmes sa varí 75 minút pod spätným chladičom. Po ochladení v ladovom kúpeli sa pridá 15 ml 2N kyseliny chlorovodíkovej, fáze sa oddelia a organická fáza sa premyje dvakrát 7,5 ml 2N kyseliny chlorovodíkovej. Vodná fáza sa extrahuje toluénom. Spojené organické fáze sa premyjú vodou a solným roztokom, vysušia sa a rozpúšťadlo sa odparí. Získa sa 1,18 g surového cho1 esta-5,7-dien-3-onu ako viskózny olej. ^H-NMR spektrum (CDCl^, 6) vykazovalo charakteristické signály u 5,8 (s, 1H), 5,2 (m, 1H), 3,2 (d, 1H) a 2,7 (dd, 1H).

Stupeň B

0,67 g terc. butoxidu draselného sa rozpustí v 16 ml terc. butanolu pri 45° C. Pridá sa 0,57 g cho1 esta-5,7-dien-3-onu a zmes sa miecha 10 minút. Pridá sa 0,47 g 1,4-dijódbutánu a zmes sa miecha 30 minút. Rozpúšťadlo sa odparí a odparok sa znova rozpustí v toluéne a vode. Pridá sa malé množstvo roztoku chloridu sodného, aby sa indukovalo oddelenie fáz. Organická fáza sa štyrikrát premyje vodou a spojené vodné fázy sa raz extrahujú toluénom. Spojené toluénové extrakty sa vysušia a odparia. Získa sa 0,45 g peny, ktorá kryštalizáciou zo zmesi diéty 1éter/metanol poskytne 0,35 g kryštalického 4,4-1 et ráme t y 1éncho1 e s ta-5,7-dien-3-onu. Hmotnostné spektrum : 436,4 (molekulárny ión). ^H-NMR spektrum (CDCl^, ó) vykazovalo charakteristické signály u 5,75 (d, 1H) a 5,5 (m, 1H).

Stupeň C

130 mg L1AIH4 sa suspenduje v 6 ml THF. V priebehu 30 minút sa prikvapká 1,97 g 4,4-tetramety1éncholesta-5,7-dien-3-onu rozpustených v 40 ml THF. 15 minút po ukončení pridávania zostal ešte nejaký nezreagovaný materiál (podlá TLC), preto bolo pridané dalších 65 mg L1AIH4. Po 30 minútach mi echáni a bola reakcia ukončená. K reakčnej zmesi sa prikvapká 0,9 ml vody v 5 ml THF. Po 30 minútach miechania sa pridá síran horečnatý a zmes sa miecha dalších 30 minút, sfiltruje a odparí sa dosucha. Odparok sa rozpustí v 25 ml dietyléteru a 25 ml metanolu a éter sa opatrne odstráni vo vákuu. Miechaním cez noc sa získa 1,75 g kryštalického 4,4-1 e t ráme ty 1éncho1 es ta-5,7-dien-3-ο1 u, ktorý sa odfiltruje. Hmotnostné spektrum : 438,4 (molekulárny ión). ^H-NMR spektrum (CDCI3, 6) vykazovalo charakteristické signály u 5,8 (d, 1H) , 5,5 (m, 1H) a 3,5 (m, 1H).

Stupeň D

770 mg zlúčeniny, ktorá bola pripravená v stupni C, sa rozpustí v zmesi 2,38 ml benzénu, 17,5 ml etanolu a 2,38 chlorovodíkovej. Táto zmes sa chladičom. Potom sa odparí vo ml koncentrovanej kyseliny varí 16 hodín pod spätným vákuu. Odparok sa znova rozpustí v 5 ml toluénu, sfiltruje a chromatografuj e sa na kremičitým s dusičnanom pomere 10 : 90 (obj)) stredotlakové j kolóne strieborným (heptán : Získa sa tak 35 mg s oxidom toluén v 4,4-tetra-mety1éncho1 esta-8,14-dien-3-ο1 u. Homtnostné spektrum :

438,4 (molekulárny ión). ^-NMR spektrum (CDCI3, ô) vykazovalo charakteristické signály u 5,35 (s, široký signál, 1H) a 3,3(dd, 1H). ^C-NMR spektrum (CDCI3, 100,6 MHz) vykazovalo charakteristické signály u 79,0 (C3), 117,4 (C45), 122,9 (Cg) , 141,3 (C₉) a 151,1 (C_u) .

Príklad 9

Príprava 4,4-dimetylcholest-8(14)-en-33-olu

580 ml 4,4-dimety 1cho1 est-8-en-38-olu sa rozpustí v 20 ml dietyléteru a 20 ml kyseliny octovej. Pridá sa 60 mg 10 % (hmotn.) paládia na uhlie a zmes sa miecha cez noc pod vodíkom pri 0,35 MPa. Katalyzátor sa odstráni a filtrát sa zahustí na 10 ml, pričom začne kryštalizovať. Pridá sa 10 ml metanolu. Kryštály sa izolujú po 16 hodinách. Prekryštalizáciou z metanolu sa získa 230 mg materiálu, o ktorom bolo podía H- a C-NMR dokázané, že je zmesou 8(9)- a 8(14)-i zomérov.

Táto zmesa sa znova rozpustí v 10 ml dietyléteru a 10 ml kyseliny octovej. Pridá sa 75 mg 5 % (hmotn.) Pt na uhlie a zmes sa nechá zreagovať s vodíkom cez noc pri atmosférickom tlaku. Katalyzátor sa odstráni, rozpúšťadlo sa odparí a kryštalický zvyšok sa rozotrie s 5 ml metanolu. Získa sa 190 mg čistého 4,4-d i me t y 1 cho 1 es t-8 (1 4)-en-3(3-o 1 u . Hmotnostné spektrum : 414,4 (molekulárny ión). ^l3C-NMR spektrum (CDClg, 100,6 MHz) vykazovalo charakteristické signály u 79,24 (C₃), 126,11 (Cg) a 142,20 (C₁₄).

Príklad 10

Test látok indukujúcich miózu v oocytovom teste

Zvi eratá

Nedospelé myšie samičky (B6D2-F1, kmeň C57B1/2J) sa udržiavajú pod kontrolovaným osvetlením (14 hodín svetlo, 10 hodín tma) a teplotou s potravou a vodou podlá potreby. Ked zvieratá dosiahli hmotnosti 13 až 16 g (čo zodpovedá veku 20 až 22 dní), bola im podaná jedna injekcia (i.p.) ľudského menopauzálneho gonadotropínu (Humegon, Organon, Holandsko) obsahujúceho približne 20 j. FSH a 20 j. LH (Ziebe S. a spol. : Hum. Reprod. 8, 385 ( 1993)). Po 48 hodinách boli zvieratá cervikálnou dislokáciou usmrtené.

Odohranie a kultivácia oocytov.

Vaječníky boli odobrané, boli umiestnené do HX média (vid nižšie) a bolo z nich odstránené cudzorodé tkanivo. Médium pre zbieranie a kultiváciu pozostávalo z EMEM média (Eagles minimum essential médium, Flow, USA), ktoré obsahovalo 4mM hypoxantín, 3 mg/ml hovädzieho sérového albumínu, 0,23mM 2-oxopropanoátu sodného, 2mM glutamínu, 100 j./ml penicilínu a 100 ug/ml streptomycínu (všetko od firmy Sigma, USA). Toto médium sa označuje ako HX - médium. Rovnaké médium, ale bez HX, bolo používané ako kontrolné médium.

Antrálne folikuly vaječníkov boli pod mikroskopom na pitvanie prepichnuté ihlou (27 gauge). Oocyty s obklopujúcimi bunkami (CEO) rovnakej velkosti boli vybrané a trikrát premyté čerstvým HX - médiom.

Oocyty bez obklopujúcich buniek, t.j. obnažené oocyty, DO, boli získané miernym premývaním CEO obyčajnou pipetou s jemným otvorom. CEO a DO boli kultivované vo viacerých miskách so štyrmi jamkami (Nucleon, Dánsko), ktoré obsahovali 0,5 ml HX - média okrem kontrol, ktoré boli kultivované v

kontrolnom	méd i u.	Každá	jamka obsahovala 35	až 50 oocytov.
Testované	kul túry	bo 1 i	pripravené s rôznymi	koncentrác i ami
zlúčenín,	ktoré	ma 1 i	byť testované, ako	je uvedené v
tabulke 5.
Kul t ivác i e	boli	uskutočňované pri 37	° C 100 %
(hmo t n.)	vlhkosti	s 5	% (obj.) CO₂ vo	vzduchu. Doba
kult ivác i e	bola 24	hodín	•

Skúmanie oocytov.

Na konci kultivačnej doby bol v inverznom mikroskope s diferenčným interferenčným kontrastným zariadením spočítaný počet oocytov so zárodkovým vačkom (GV) alebo s rozpadnutým zárodkovým vačkom (GVBD) a oocyty s polárnym telesom (PB). Boli spočítané percentá oocytov s GVBD na celkový počet oocytov a percentá oocytov s PB na GVBD. Výsledky pre DO a CEO, vypočítané ako jednotky MIS aktivity, sú uvedené v tabulke 5. Jedna jednotka MIS aktivity je def inovaná ako :

* ^GVDDkontrola/² a počet jednotiek MIS aktivity sa vypočíta ako :

2((X GVBD _test - X GVBD_kontrola) / X GVBD_kontrola)

Tabuľka 5

látka	DO	CEO	koncent rác i a (ug/ml)
4,4-dimetylzymosterol	2,7	2,9	1,2
	1 ,8	2,7	0,3
	0,6	1,3	0,2
	1,5	1,3	0,02
	0,9	1,0	0,002
4,4-dimetyl-5a-cholesta-8,14,24-
-tri en-3(3-o 1	0,6	2,3	0,3
	1,6	0,5	0,03
zymos t ero1	1,2	1 , 1	0,1
	0,6	0,4	0,01
		0,2	0,001
40-me ty 1zymos t ero 1	6,2	3,5	3,9
	0,8	2,4	0,13
4,4-dimetylcholest-8-en-3(3-ol	0,8	12,8	0,03
4,4-dimetylcholesta-8,14-
-d i en-3B-o1	2,25	0	3,0

Príklad 11

Test látok indukujúcich miózu v gonádovom teste

Gonádový test sa uskutočňuje v podstate tak, ako ho popísali Byskov A. G. a spol. : Mol. Reprod. Dev. 34 . 47 (1993). Výsledky uvedené v tabulke 6 boli vyhodnotené semi28 kvantitatívne ako popísali Westergaard L. a spol. : Fertil. Steri 1 . 41, 377 (1984).

Tabuľka 6

látka	koncentrácia (ug/ml)	výsledok
4,4-dimetylzymosterol	10	++
4,4-d imetyl-5a-cho les t a-
-8, 14,24-trien-3(3-ol	30	+

Príklad 12

Príprava mono(5a-cholesta-8 ,14-di en)-38-sukcinátu

V 10 ml THF sa rozpustí 0,50 g 5a-cho1 esta-8,14-dien-3(3-olu. Pridá sa 0,39 g anhydridu kyseliny jantárovej a 16 ml 4-dimetylaminopyridínu. Tento roztok sa varí pod spätným chladičom cez noc. Potom sa odparí dosucha. Odparok sa suspenduje v 10 ml vody. Zrazenina sa odfiltruje, premyje vodou a vysuší. Získa sa 0,48 g titulnej zlúčeniny, ktorá môže byť dalej vyčistená rozpustením v zmesi vodného hydrogénuhli č i tanú sodného a etanole, pridá sa kyselina chlorovodíková do pH 2 a zahustením sa roztok začne zrážať. Teplota topenia 128 až 131° C. Hmotnostné spektrum : 484,4 (molekulárny ión). ^-NMR spektrum (CDCI3, ô) vykazovalo charakteristické signály u 5,36 (s, 1H), 4,75 (m, 1H), 2,67 (m, 2H) a 2,6 (m, 2H) . ¹³C-NMR spektrum (CDC1₃, 100,6 MHz) vykazovalo charakteristické signály u 73,4, 117,1, 122,7,

140,0, 150,5, 171,2 a 177,2.

Príklad 13

Príprava 3f3 —e toxykarbony 1 oxy-5a-cho 1 es ta-8 , 14-dienu

0,50 g 5a-cho 1 es ta-8 , 1 4-di en-3|3-olu sa rozpustí v zmesi 5 ml toluénu a 5 ml pyridínu pri chladení v ladovom kúpeli. V priebehu 5 minút sa pridajú 2,3 ml etylesteru kyseliny ch 1órmravenčej, rozpustenej v 5 ml toluénu. Po 30 minútach sa ladový kúpeľ odstráni. V miechaní sa pokračuje 20 hodín pri teplote miestnosti a 2 hodiny pri 60° C. Reakčná zmes sa odparí dosucha a rozotrie sa s 10 ml etanolu. Získa sa tak 0,505 g titulnej zlúčeniny, ktorá sa môže dalej čistiť rekryštalizáciou z etanolu. Teplota topenia 101 až 106° C. Hmotnostné spektrum : 456,3 (molekulárny ión).

^H-NMR spektrum (CDC1₃, ó) vykazovalo charakteristické signály u 5,30 (s, 1H), 4,50 (m, 1H) , 4,12 (q, 2H) a 1,24 (t, 2H). l^c-NMR spektrum (CDC1₃, 100,6 MHz) vykazovalo charakteristické signály u 62,6 116,6 122,2 139,4 150,0 a

153,6.

Príklad 14

Príprava 3{3—f os f ónooxo-4,4-dime ty l-5a-cho 1 es ta-8 , 14-d i enu

2,00 g 4,4-dimetyl-5a-cho1 esta-8,14-dien-30-οlu sa rozpustí v 10 ml suchého pyridínu a v priebehu 5 minút sa pridá k roztoku 1,66 g oxychloridu fosforečného v 10 ml suchého acetónu pri chladení ladovým kúpelom. Po 30 minútach miechania pri teplote miestnosti sa zrazenina odfiltruje a premyje sa suchým acetónom. Odparok sa suspenduje v 70 ml vody a varí sa 1 1/4 hodiny pod spätným chladičom. Po ochladení na teplotu miestnosti sa zrazenina odfiltruje, premyje vodou a vysuší. Získa sa tak 0,93 g surového produktu. 0,70 g tohoto surového produktu sa rozpustí v 75 ml 0,lM vodného hydroxidu draselného a tento roztok sa s f i 11 ruj e 10 g živice Amberlit IR—120(H). Filtrát sa vo vákuu odparí dosucha. Odparok sa rozotrie s 10 ml vody, zrazenina sa odfiltruje, premyje vodou a vysuší. Získa sa tak 0,48 g titulnej zlúčeniny. Teplota topenia 183 až 185° C. H-NMR spektrum (CDCI3 + 2 kvapky CD3OD) produktu vykazovalo charakteristické signály u 5,36 (s, 1H) a 3,89 (m, 1H). ^³CNMR spektrum (CDCI3 a 2 kvapky CD3OD, 100,6 MHz) produktu vykazovalo charakteristické signály u 85,1, 116,9, 122,3,

140,9 a 150,5.

Príklad 15

Príprava 3β —izonikot inoy1-5a-cho1 es ta-8,14-dienu

0,50 g 5a-cho1 es ta-8,14-dien-30-οlu sa rozpustí v 5 ml pyridínu. K roztoku sa pridá 1,16 g hydrochlóridu izoni-kot inoy1 ch 1óridu. Suspenzia sa varí cez noc pod spätným chladičom. Potom sa odparí dosucha. Odparok sa suspenduje v 100 ml vody pri chladení v ladovom kúpeli. Zrazenina sa odfiltruje a premyje vodou. Vysušením sa získa 0„97 g surového produktu, ktorý sa prekryštalizuje pri zmesi acetón/voda. Získa sa tak 0,40 g titulnej zlúčeniny. Teplota topenia 129 až 131° C. ^-NMR spektrum (CDCI3, δ) produktu vykazovalo charakteristické signály u 8,77 (d, 2H), 7,84 (d, 2H) , 5,39 (s, 1H) a 4,49 (m, 1H). ^C-NMR spektrum (CDCI3,

50,3 MHz) vykazovalo charakteristické signály u 75,0, 117,7, 122,8, 138,0, 140,3, 150,5, 150,9 a 164,6.

Claims

Patentové nároky

1. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I

RS je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, nerozvetvenej alebo rozvetvenej alkylovej skupiny s 1 až 6 atómami uhlíka, ktorá môže byť substituovaná atómom halogénu alebo hydroxylovou skupinou, alebo R a R spoločne s atómom uhlíka, na ktorý sú naviazané, tvoria cyklopentánový alebo cyklohexánový kruh,

R^ a R⁴ znamenajú spoločne dalšiu väzbu medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané, v tomto prípade R$ znamená

R' znamenajú alebo atóm vodíka alebo dalšiu dvojitú väzbu medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané, alebo r5 a R⁴ spoločne znamenajú dalšiu väzbu medzi atómami q uhlíka, na ktoré sú naviazané, v tomto prípade R znamená r 7 atóm vodíka a R a R znamenajú alebo atóm vodíka alebo atóm vodíka a R° a spoločne znamenajú spoločne znamenajú dalšiu väzbu medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané, alebo r6 a R⁴ spoločne znamenajú dalšiu väzbu medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané, v tomto prípade R, R a R znamenajú atóm vodíka,

O Q

R° a R^{6 7} znamenajú atóm vodíka alebo spoločne znamenajú dalšiu väzbu medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané, a rIO znamená alebo atóm vodíka alebo acylovú skupinu, vrátane sulfonylovej alebo fosfonylovej skupiny, alebo skupinu, ktorá so zostávajúcou častou molekuly tvorí éter, pre prípravu liečebného prostriedku na použitie pre regulovanie miózy.
2. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá nároku 1, v ktorom R^ znamená atóm vodíka alebo metylovú skupinu.
3. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá nároku 1, v ktorom R^ znamená skupinu, ktorá je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z etylovej skupiny a nerozvetvenej a rozvetvenej alkylovej skupiny s 3 až 6 atómami uhlíka.
4. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá nároku 1 , v ktorom R¹ znamená nerozvetvenú alebo rozvetvenú hydroxyalkylovú skupinu s až 6 atómami uhlíka.
5. Použitie sterolových deriváte'·· všeobecného vzorca I podlá nároku 1, v ktorom R^ znamená nerozvetvenú alebo rozvetvenú α-hydroxyalkylovú skupinu s až 6 atómami uhlíka.
6. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podía nároku 1, v ktorom R^ znamená nerozvetvenú alebo rozvetvenú alkylovú skupinu substituovanú atómom halogénu.
7. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podľa nároku 1, v ktorom R^ znamená t r i f 1uormety 1ovú skupinu.
8. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá p

nároku 1, v ktorom R znamená atóm vodíka alebo metylovú skupinu.
9. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá nároku 1 , v ktorom R znamená skupinu, ktorá je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z etylovej skupiny a nerozvetvenej a rozvetvenej alkylovej skupiny s 3 až 6 atómami uhlíka.
10. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá nároku 1, v ktorom R“ znamená nerozvetvenú alebo rozvetvenú hydroxyalkylovú skupinu s až 6 atómami uhlíka.
11. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá n

nároku 1, v ktorom R znamená nerozvetvenú alebo rozvetvenú α-hydroxyalkylovú skupinu s až 6 atómami uhlíka.
12. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá nároku 1, v ktorom R znamená nerozvetvenú alebo rozvetvenú alkylovú skupinu substituovanú atómom halogénu.
13. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca 1 podlá nároku 1, v ktorom R znamená tri fluormetylovú skupinu.
14. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá

1 9 nároku 1, v ktorom R¹ a R spoločne s atómom uhlíka, na ktorý sú naviazané, tvoria cyk1opentánový kruh.
15. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá

1 2 nároku 1, v ktorom R¹ a R spoločne s atómom uhlíka, na ktorý sú naviazané, tvoria cyk1ohexánový kruh.
16. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podía nároku 1, v ktorom K³ a R⁴ spoločne znamenajú dalšiu väzbu medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané a R^ znamená atóm vodíka.
17. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca 1 podía nároku 1, v ktorom R⁵ a R⁴ spoločne znamenajú dalšiu väzbu

Q medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané, a R znamená atóm vodíka.
18. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá nároku 1, v ktorom R^ a R⁴ spoločne znamenajú dalšiu väzbu medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané, a R , R a R' znamenajú atóm vodíka.
19. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podía r 7 nároku 1, v ktorom R a R znamenajú atóm vodíka.

'
20.Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá nároku 1, v ktorom R a R' spoločne znamenajú dalšiu väzbu medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané.
21. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podía o Q nároku 1, v ktorom R a R⁷ znamenajú atóm vodíka.
22. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podía o q nároku 1, v ktorom R a R⁷ spoločne znamenajú dalšiu väzbu medzi atómami uhlíka, na ktoré sú naviazané.
23. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podía nároku 1, v ktorom R^ znamená atóm vodíka.
24. Použi tie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá nároku 1, v ktorom znamená acylovú skupinu odvodenú od kyseliny s 1 až 20 atómami uhlíka.
25. Použitie stcrolo'ých derivátov všeobecného vzorca í podľa nároku 24, v ktorom R^ znamená acylovú skupinu, ktorá je vybraná zo skupiny, pozostávajúcej z acetylovej, benzoylovej , pivaloylovej , butyrylovej, nikotínoylovej, izonikotínoylovej, herni suke inoy1ovej, hemiglutaroylovej, butylkarbamoylovej, feny1karbamoy1ovej, butoxykarbonylove j , terc. butoxykarbonylovej a etoxykarbonylovej skupiny.
26. Použi tie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá nároku 1, v ktorom R^ znamená alkylovú skupinu, aralkylovú skupinu, alkyloxyalkylovú skupinu alebo alkanoy1oxya1ky1ovú skupinu, pričom každá z týchto skupín znamená skupinu s až 10 atómami uhlíka, výhodne s až 8 atómami uhlíka, ktoré spolu so zostávajúcou časťou molekuly tvoria éter.
27. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podlá nároku 26, v ktorom R^ znamená metoxymetylovú skupinu alebo pivaloyloxymetylovú skupinu.
28. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podľa nároku 1, v ktorom R^ znamená sulfonylovú skupinu.
29. Použitie sterolových derivátov všeobecného vzorca I podľa nároku 1, v ktorom R^ znamená fosfonylovú skupinu.
30. Spôsob regulovania miózy v zárobkových bunkách cicavcov, vyznačujúci sa tým, že sa do zárodkovej bunky, ktorá toto liečenie potrebuje, podáva efektívne množstvo zlúčeniny podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 29.
31.. Spôsob regulovania miózy vzárodkovej bunke cicavcov podlá nároku 30, vyznačujúci sa tým, že sa zlúčenina podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 29 podáva do zárodkovej bunky tak, že sa podáva c i cavcov i , kde hosťuje táto bunka.
32. Spôsob regulovania miózy vzárodkovej bunke^:cicavcovpodlá nárokov 30 alebo 31,vyznačujúci sa tým, že zárodková bunka, ktorej sa má regulovať mióza, znamená • oocyt.
33. Spôsob regulovania miózyvzárodkovej bunke c icavcov podlá nároku 30, vyznačujúci s a tým, že sa zlúčenina podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 27 podáva do oocytu ex vivo.
34. Spôsob regulovania miózyv zárodkovej bunke c icavcovpodlá nároku 31,vyznačujúci sa tým, že zárodková bunka, v ktorej sa má regulovať mióza, znamená mužskú , zárodkovú bunku.