HUT74575A

HUT74575A - Methods for preparing pharmaceuticals, suitable for inhibiting bone loss containing, 3,4-diarylchroman

Info

Publication number: HUT74575A
Application number: HU9502624A
Authority: HU
Inventors: Steven D Bain; Virender M Labroo; James R Piggott
Original assignee: Zimogenetics Inc
Priority date: 1993-03-11
Filing date: 1994-01-13
Publication date: 1997-01-28
Also published as: CA2157879A1; NO953542D0; KR100263009B1; EP0688214A1; ES2131678T3; ATE178488T1; NO953542L; JP2834581B2; HU9502624D0; WO1994020098A1; DK0688214T3; DE69417733D1; NZ262569A; GR3030128T3; CZ287603B6; CZ232095A3; JPH08506346A; US5280040A; DE69417733T2; CA2157879C

Description

A csontok újjáalakulása olyan dinamikus folyamat, amelynek révén a csontváz tömege és szerkezete megújul és fennmarad. Ez a megújulás és femnnmaradás a csontfelszívódás és csontképződés egyensúlyának köszönhető; az újjáalakulási folyamatban a két kulcs-résztvevőnek az oszteoklasztokat, vagyis csontlebontó sejteket és az oszteoblasztokat, vagyis csontképző sejteket tekintjük. Az oszteoklasztok indítják be az újjáalakulási körfolyamatokat olyan módon, hogy üreget alakítanak ki a csontban, amely üreg azután betöltődik, amikor az oszteoblasztok új csontállományt szintetizálnak és helyeznek el az üregbe. Az oszteoklasztok és oszteoblasztok aktivitásait a szisztémás hormonok, valamint a növekedési hormonok és citokinek helyi termelése közti komplex kölcsönhatások szabályozzák az aktív újjáalakulási helyeken.

A csontok újjáalakulásánál fellépő kiegyensúlyozatlanságok olyan betegségekkel társulnak, mint az oszteoporózis (csontritkulás), a Paget-kór és a hiperparatiroidizmus (mellékpajzsmirigy-túltengés). A csontritkulás, amelyet a csonttömeg csökkenése jellemez, egyik leggyakoribb betegsége a menopauza után lévő nőknek és gyakran okozhatja a hátgerinc, a csípő és a csukló elgyengülését és fájdalmas töréseit.

A menopauza utáni nők mintegy 25 %-a szenved csontritkulásban; általánosan elfogadott, hogy a betegség kóroktana a keringő ösztogének csökkenésével függ össze [Komm és munkatársai: Science 241,81-84 (1988)]. Komm és munkatársai arról is beszámolnak, hogy az Amerikai Egyesült Államokban a fehér nőknél a csípőtörés kockázati aránya 15%, amely évenként 247 000 csípötörést jelent a 45 év feletti nők körében.

A csontritkulás költségei óriásiak, mind személyes szempontból, mind a költségvetés szempontjából. 1984-ben 145 000 kórházi kezelés vált szükségessé csontritkulás miatt és 107 000 csípő csontplasztikát és csontpótlást kellett végezni a 65 év feletti amerikai nők körében. Azon betegek körében, akik a csípőtörés előtt egyedül éltek, 15-20 % hosszútávú gondoskodást igényelt a törés eredményeképpen és a törés után egy évvel sem nyerték vissza teljes függetlenségüket. A csontritkulások kezelésének teljes költségei, beleértve a töréseket is, az Amerikai Egyesült Államokban 1986-ban 7-10 milliárd dollárt tettek ki [Peck és munkatársai: Am. J. Med. 84, 275-282 (1988)].

A csontveszteséggel járó csontritkulás külső ösztrogén beadásával feltartóztatható. Hogy ez a kezelés hatásos legyen, az ösztrogén-terápiát el kell kezdeni a menopauza jelentkezésétől számított néhány éven belül és 10-15 éven át kell folytatni [Thomeycroft: Am. J. Obstet. Gynecol. 160, 1306-1310 (1989)]. Bár sokféle ösztrogén létezik, a 17-β- ösztradiol az elsődleges ösztrogén, amelyről úgy találták, hogy természetben is előfordul a menopauza előtti nőknél, így ezt a vegyületet gyakran választják terápiás célra. Ezek azonban az ajánlott dózisban jelentős mellékhatásokkal bírnak, amelyek közül a legkellemetlenebb az a határozottan megállapítható korreláció, amely az ösztrogén terápia, valamint a méhrák és a mellrák közöt fennáll. A karcióma gyakorisága függ mind az adagok hagyságától, mind az időtartamtól.

A rák kockázatát el lehet kerülni olyan módon, hogy az ösztrogénnel egyidejűleg progesztogént is adnak. Ez a kombináció azonban a menstruáció visszatérését okozhatja, amelyet a legtöbb nő elfogadhatatlannak tart. További hátrány az is, hogy a progesztogén hosszútávú hatásai még nincsenek teljes mértékben meghatározva, így nők nagy tömege igényli a hormon-helyettesítő terápiák valamely olyan alternatíváját, amely biztosan megakadályozza a menopauzához társuló gyors csontveszteséget.

A centkromán (centchroman) olyan nem-szteroid vegyület, amelyről ismert, hogy antiösztogén aktivitása van. Ez Indiában orális fogamzásgátlóként használatos

-4 [ lásd pl. Salman és munkatársai: 4, 447,622 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Singh és munkatársai: Acta Endoceinol (Copenh.) 126, 444-450 (1992); Grubb: Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 3, 491-495 (1991); Sankaran és munkatársai: Contraception 9, 279-289 (1974); 129.187 lajstromszámú indiai szabadalmi leírás]. A centkrománt vizsgálták rákellenes szerként is, kifejlődött mellrák kezelésére [ Misra és munkatársai: Int. J. Cancer, 43, 781-783 (1989)], de mindeddig nem mutattak ki ezzel a vegyülettel kapcsolatban hatást a csontfelszívódásra.

Továbbra is igény van a szakterületen olyan kompozíciókra és eljárásokra, amelyek alkalmasak a csontveszteség csökkentésére, különösen a csontritkulással járó csontveszteségek esetében. Igény van továbbá olyan kompozíciókra is, amelyek nélkülözik az ösztrogének nem kívánatos mellékhatásait is. A jelen találmány szolgáltat ilyen kompozíciókat és eljárásokat, sőt további idevágó előnyöket is biztosít.

Az alábbiakban röviden bemutatjuk az ábrákat

Az 1. ábra a centkromán hatásait ábrázolja petefészek-irtott egerek csontveszteségére.

A 2. ábra a centkromán hatásait ábrázolja a szivacsos csonttérfogatokra petefészek-irtott patkányok proximális sípcsontjában.

A 3. ábra a cenkromán hatásait ábrázolja a csontfelszívódásra (balra) és a méh súlyára (jobbra) petefészek-irtott patkányokban.

Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmányt

A jelen találmány részben azon a felismerésen alapul, hogy a 3,4-diazil-krománok egyik képviselője, a cenkromán (3,4-transz-2,2-dimetil-3-fenil-4-[p-(béta• ·

- 5 -pirrolidino-etoxi)-fenil]-7-metoxi-kromán) hatásos inhibitora a csontveszteségnek petefészek-irtott egerekben és patkányokban. Ezek az állati modellek utánozzák a menopauza utáni körülményeket és általában elismert modelljei a csontritkulásnak. Ezek az adatok így azt jelzik, hogy a 3,3-diazil-krománok hasznos gyógyászati szerek lehetnek a csontveszteség csökkentésében emlősökben, ideértve a főemlősöket is, és emberekben.

A jelen találmány szerint az (I) általános képletü vegyületek vagy gyógyászatilag elfogadható sóik alkalmazhatók a betegben a csontveszteség csökkentésére.

Az (I) általános képleten belül

R1, R⁴ és R5 jelentése egyenként hidrogén- vagy halogénatom vagy trifluor-metil, kis szénatomszámú alkoxi- vagy tercier-amino kis szénatomszámú alkoxi-csoport; R2 és r3 jelentése egyenként hidrogénatom vagy kis szénatomszámú alkilcsoport. Ahogyan itt használjuk, a kis szénatomszámú alkilcsoport egyenes- vagy elágazó, 1-6 szénatomszámú alkilcsoportot jelent, pl. metil-, etil-, η-propil-, izopropil-, n-butil-, terc-butil, n-amil, szek-amil-, η-hexil-, 2-etil-butil-, 2,3-dimetil-butil- és hasonló csoportokat. A kis szénatomszámú alkoxicsoport egyenes- vagy elágazó, 1-6 szénatomszámú alkoxicsoportot jelent, pl. metoxi-, etoxi-, η-amil-oxi-, szek-amil-oxi-, η-hexil-oxi-, 2-etil-butoxi-, 2,3-dimetil-butoxi- és hasonló csoportokat. A halogénatomok kifejezés magában foglalja a klór-, fluor-, bróm- és jódatomokat. A tercier-amino-csoport lehet valamely dialkil-amincsoport, mint pl. dimetil-, dietil-, dipropil- vagy dibutil-amincsoport, vagy lehet valamely polimetilén-imincsoport, mint pl. piperidin-, pirrolidin-, N-metil-piperazin vagy morfolincsoport. Az előnyös vegyületek azok, amelyekben R¹ jelentése kis szénatomszámú alkoxicsoport; R^ és R^ jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport, elsősorban metilcsoport; R⁴ jelentése hidrogénatom; és r5 jelentése polimetilénimin típusú tercier-amino-kis szénatomszámú alkoxicsoport. A különösen előnyös kiviteli módokban R’' a 7. helyzetben van és jelentése

- 6 kis szénatomszámú alkoxicsoport, elsősorban metoxicsoport; az R² és r3 mindegyike metil-csoport; R⁴ jelentése hidrogénatom, R⁵ a 4. helyzetben van és jelentése tercier-amino-kis szénatomszámú alkoxicsoport, mint pl. pirrolidino-etoxicsoport.

Az (I) általános képletű vegyületek közül előnyösek azok, amelyek transz konfigurációban vannak. Ezeket a vegyületeket alkalmazhatjuk racém keverékként, vagy alkalmazhatjuk az izolált d- vagy I enantiomereket.

A jelen találmány szempontjából különösen előnyös a (II) képletű centkromán.

Bár csak egy enantiomert mutatunk be, világosan érthető, hogy az itt bemutatott (II) szerkezetben a 3- és 4-fenilcsoportok transz konfigurációjúak és ide értendők mind a d-, mind az l-enantiomerek, valamint a racém keverék is.

A 3,4-diazil-krománok ismert eljárásokkal állíthatók elő; ilyenek taklálhatók pl. a 3,340,276 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (Bolger), valamint a J. Med. Chem. 19, 276-279 (1976) irodalmi helyen (Ray és munkatársai); az említettek referenciaként épülnek be a jelen szabadalmi leírásba. A cisz izomer átalakulását transz konfigurációjúvá szerves fém bázissal katalizált átrendeződéssel a 3,822,287 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti. Az optikailag aktív d- és l-enantiomereket úgy lehet előállítani, ahogyan ezt Salman és munkatársai a 4,447,622 lajstromszámú szabadalmi leírásban ismertetik (amely irodalmi hely referenciaként beépül a jelen bejelentésbe); eszerint optikailag aktív savas sót képeznek, amelyet alkálikus hidrolízisnek vtnek alá, hogy a kívánt enantiomert megkapják.

A jelen találmány szerint a 3,4-diazil-krománok készíthetők gyógyászatilag elfogadható sók, elsősorban savaddíciós sók formájában, ideértve a szerves savak és az ásványi savak sóit egyaránt. Az ilyen sókra példák lehetnek a szerves savak, mint a hangyasav, ecetsav, propionsav, glikolsav, tejsav, piroszölösav, oxálsav, borostyánkösav, malonsav, borkösav, citromsav, benzoesav, szalicilsav és hasonlók

sói. A megfelelő szervetlen savaddíciós sókra példák lehetnek a sósav, bróm-hidrogén, kénsav, foszforsav és hasonlók sói. A savaddíciós sókat megkaphatjuk a vegyület szintézisének közvetlen termékeként. Egy másik eljárás szerint a szabad bázist olyan megfelelő oldószerben oldjuk fel, amely tartalmazza a megfelelő savat, majd a sót az oldószer lepárlásával izoláljuk, vagy a sót és az oldószert valamely más módon különítjük el egymástól.

A 3,4-diazil-krománok és sóik alkalmasak ember- és állatgyógyászati célra a csont-metabolizmus szabályozására. Ezeket a vegyületeket alkalmazhatjuk pl. olyan betegek kezelésére, akik csontveszteségben szenvednek, amely csontveszteség tulajdonítható csontritkulásnak (ideértve a menopauza utáni csontritkulást és a glikokortikoid-szinttel összefüggő csontritkulást), Paget-kórnak, mellékpajzsmirigytúltengésnek, rosszindulatú hiperkolcémiának és minden olyan más kóros állapotnak, amelyet a csontfelszívódás túlzott aránya és/vagy a csontképzödés csökkent aránya jellemez.

A jelen találmány szerinti felhasználáshoz a 3,4-diazii-krománokat és gyógyászatilag elfogadható sóikat hagyományos módon valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt szerelhetjük ki, hogy parenterális, orális, nazális, rektális, szubdermális vagy transzdermális beadáshoz alkalmas gyógyszereket kapjunk. A kiszereléshez ezenkívül alkalmazhatunk egy vagy több hígítót, töltőanyagot, emulgeálószert, tartósítószert, puffért, kötőanyagot stb. és a kiszerelés történhet folyadék, por, emulzió, végbélkúp, liposzóma, transzdermális flastrom, szabályozott szubdermális implantátum, tabletta, stb. formájában. Azok, akik a szakterületen járatosak, képesek ezeket a vegyületeket megfelelő módon kiszerelni az elfogadott gyakorlat szerint; ilyen célra találhatók megfelelő utalások az alábbi szakkönyvben; Remington's Pharmaceutical Sciences (szerkesztő: Gennaro; kiadó: Mack Publishing Co., • · · ·

- 8 Easton, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok, 1990). (Ez az irodalmi hely referenciaként teljes egészében beépül a jelen bejelentésbe).

Az orális beadási forma az előnyös. így az aktív vegyületet elsősorban olyan formában állítjuk elő, amely orális beadásra alkalmas, tehát főleg tabletta vagy kapszula formájában. Tipikusan a vegyület gyógyászatilag elfogadható sóját egyesítjük valamely hordozóval és tabletta formára alakítjuk. E célra megfelelő hordozók lehetnek a keményítő, cukrok, dikalcium-foszfát, kalcium-sztearát, magnézium-sztearát és hasonlók. Az ilyen kompozíciók tartalmazhatnak továbbá egy vagy több kiegészítő anyagot, pl. nedvesítőszereket, emulgeátorokat, tartósítószereket, stabilizálószereket, színezékeket, stb.

A gyógyászati kompozíciók napi-heti időközökben adhatók be. Az ilyen gyógyászati kompozíciók hatékony mennyiség-e az a mennyiség, amely a csontveszteség klinikailag szignifikáns csökkenését idézi elő. Ez a mennyiség részben függhet az adott kezelés körülményeitől, a beteg korától, súlyától és általános egészségügyi állapotától, valamint más olyan tényezőktől, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen járatosak. A csontveszteség gátlása általában úgy mutatkozik meg, mint statisztikailag szignifikáns különbség a szivacsos csonttérfogatban a kezelt és a kontroll csoportok között. Ez megmutatkozhat pl. 5-10% vagy nagyobb különbségekben a gerinc-csonttömegben vagy a csont ásványi anyag tartalmában két éven belül. Az elfogadott állati modellekben, pl. a csontritkulás petefészek-irtott egér- vagy patkány modelljeiben kapott eredmények alapján egy nagyságrenden belül felbecsülhető az emberekben szükséges dózis. így pl. a csontritkulás kezeléséhez szükséges dózis általában a 0,01-50 mg/kg/nap tartományban van. A ciszizomerek vagy racém keverékek alkalmazása esetén a szükséges dózis az előbb megadott tartományok felső részében lehet.

A gyógyászati kompozíciók beadhatók olyan egységdózisok formájában, amelyek a napi-heti szükségletet fedezik. Egy másik megoldás szerint ezeket a gyógyszereket szabályozott kibocsátású kiszerelésben adhatjuk be, amelyek bőr alatti implantációra alkalmasak. Az ilyen implantátumok úgy vannak kialakítva, hogy a kívánt időtartamon át bocsássák ki az aktív vegyületet - ez a kívánt időtartam akár több év is lehet.

A szabályozott kibocsátású kiszerelésekről ismertetés található az alábbi irodalmi helyeken: Sanders és munkatársai J. Pharm. Sci. 73, 1294-1297 (1984); 4, 489,056 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, (ezek az irodalmi helyek referenciaként épülnek be a jelen bejelentésbe.)

Az alábbi kiviteli példák a jobb bemutatás céljait szolgálják, de a szabadalom nemcsak ezekre korlátozódik.

1. példa

A centkrománnak azt a képességét, hogy megakadályozza az ösztrogénhiány által indukált oszteopéniát, petefészek-irtott egér modellben értékeltük. Huszonnégy nőstény Swiss-Webster egér (8 hetes) vagy petefészek-irtáson vagy ál-sebészeti eljáráson esett át egy négy hetes kezelési munkamenet megkezdése előtt. A petefészek-irtáshoz lágyék-bemetszést végeztünk a bőrön, izmon és hashártyán keresztül mindkét oldalon, a petefészkeket kipreparáltuk és szabaddá tettük a rátapadt zsírszövettől, majd kimetszettük. Az ál-munkamenetben a petefészkeket kiemeltük, majd visszahelyeztük. A hashártyát és izmokat minden állatban együtt öltöttük össze, és a bőrbemetszést sebkapcsokkal zártuk.

A centkrománt minimális mennyiségű dimetil-szulfoxidban feloldottuk és olajos hordozóval hígítottuk 50 mg/100 ml koncentrációra. Az egereket hetenként kétszer kezeltük négy héten át centkromán vagy csak az olajos hordozó szubkután injekt ‘ ’ λ • ♦· * · · · ·· • · • · ·«

- 10 dójával, akövetkező kísérleti vázlat szerint: sebészetileg álkezelt állat (sham) / olajos hordozó (SV); petefészek-irtott állat (ovx) / olajos hordozó; petefészek-irtott állat (ovx) / 50 mg centkromán, hetenként kétszer. Minden csoportban 8-8 állat volt.

A négy hetes centkromán kezelés befejezésekor az egereket éterrel érzéstelenítettük és nyakkicsavarással megöltük. Közvetlenül a megölés után a combcsontot kiemeltük, 70%-os etilalkoholban (EtOH) fixáltuk, majd dehidráltuk fokozatosan növekvő alkoholkoncentráció-sorozatot alkalmazva: 95% EtOH 24 órán át, majd háromszor váltva 100% EtOH 24-24 órán át. Az utolsó 100% EtOH-s kezelés után a combcsontokat kétszer letisztítottuk xilollal, majd mésztelenítés nélkül feldolgoztuk és metakrilát műanyagba ágyaztuk egy korábban leírt eljárás szerint [ Bain és munkatársai: Stain Technology, 65, 159-163 (1990)]. A combcsont disztális metafíziséből 5 mm vastag frontális metszetet vágtunk ki wolfram-karbid késsel ellátott Reichert-Jung 2050 forgó mikrotom segítségével. Az 5 mm-es metszeteket üveglemezekre helyeztük fel és Goldner-féle trikróm-festéssel megfestettük.

A disztális metafízis hisztomorfometrikus mérését a Bioquant Boné Morphometry Program (Biometrics, Inc., Nashville, Tenessee) segítségével végeztük; ez egy camera lucida révén össze volt kötve egy Olympus BH-2 fény/epifluoreszcens mikroszkóppal (Scientific Instruments, Inc., Redmond, Washington). A szivacsos csonttérfogat (BV/TV) morfometrikus mérését abban a szövettérben végeztük, amely több mint 0,25 mm-re van a növekedési lemez/metafízis elágazástól, hogy kizárjuk a primer elszivacsosodás mérését.

Az 1. ábrában bemutatott adatokra az átlagot +_standard eltérést (SD) jelentenek mindegyik csoportnál. A disztális combcsont szivacsos csonttérfogatainak összehasonlítása varianciaelemzésen alapult, a Statview statisztikai programot alkalmazva (Abacus Concepts, Inc., Berkely, Kalifornia). Az ANOVA-val jelzett kezelési különbségeket összehasonlítottuk a Dunnett-féle többszörös összehasonlítási • · 9

- 11 munkamenettel is. Azokat a P értékeket, amelyek 0,05-nél kisebbek voltak, tekintettük szignifikánsnak.

Az olajos hordozóval kezelt, petefészek-irtott egerekben a disztális combcsont szivacsos csonttérfogatában 50% csökkenés volt megfigyelhető a hordozóval kezelt, ál-sebészeti eljáráson átesett állatokkal összehasonlítva.A hetenként kétszer 50 pg centkrománnal kezelt, petefészek-irtott állatokban ez a csontveszteség teljes mértékben kiküszöbölődött.

2. példa

Abból a célból, hogy értékelni tudjuk a centkromán hatását a csontfelszívódásra és csonttömegre, 54 nőstény Sprague-Dawley patkányt előjeleztünk négy egymást követő héten át triciált tetraciklinnel (^H-T; ezt a Dupont NEW Research Products, Boston, Massachussets cégtől szereztük be). Az állatoknak 12-15 injekciót adtunk, amelyek mindegyike 15 pCi-s volt; összesen állatonként mintegy 200 pCi-t adtunk be. Az utolsó ³H-T injekció beadása után három nappal nyolc állatot leöltünk, ezek lettek az alapvonal-kontrollok, a további állatokat véletlenszerűen kiválasztva ösztrogénnel (E2) vagy centkrománnal kezeltük az alábbi kísérleti vázlat szerint: sham/placebo; petefészek-irtott állat (ovx)/ placebo; petefészek-irtott állat (ovx)/ E2 (0,05 mg/kg/nap); petefészek-irtott állat (ovx)/ C (0,05 mg/kg/nap); petefészek-irtott állat/ C (0,5 mg/kg/nap); petefészek-irtott állat / C (5,0 mg/kg/nap). A hormonkezelést szubkután szemcsés implantátum segítségével végeztük, amely koleszterinből, laktózból, cellulózokból, foszfatázokból és sztearázokból álló mátrixot tartalmaz (Innovative Research, Toledo, Ohio); számítások szerint ez a fentebb jelzett dózisokat szolgáltatja. A csontfelszívódás ^H-T mérést alkalmazó mennyiségi vizsgálatán kívül meghatároztuk a combcsont és a hátgerinc csonttömegét is, hogy dokumentálni tudjuk a változásokat a csont fizikai tulajdonságaiban, valamint mennyiségi hiszto····

- 12 morfometriát alkalmaztunk, hogy összehasonlíthassuk a változásokat a proximális sípcsont szivacsos csonttérfogatában.

Hatvan nappal a kezelési munkamenet beindítása után az állatokat éterrel érzéstelenítettük és nyakkicsavarással megöltük. Közvetlenül megölés után a méheket kiemeltük és tömegüket rögzítettük; mindkét combcsontot és három hátcsigolyát (T11-T13) kimetszettünk a csontfelszívódási vizsgálatokhoz; egy sípcsontot és az első ágyékcsigolyát összegyűjtöttük a csont fizikai tulajdonságainak meghatározása céljából; a második sípcsontot kimetszettük és feldolgoztuk a csont hisztomorfometriához. Minden szövetet rögzítettünk, először 70%-os etilalkoholban (EtOH), majd dehidráltuk EtOH növekvő koncentrációi segítségével egészen 100% EtOH-ig. A 100% EtOH utolsó cseréje után a mintákat az alább ismertetett vizsgálati munkamenet szerint feldolgoztuk.

A teljes csontfelszívódás vizsgálata az előjelzett combcsontok és csigolyák megmaradt ^H-T szintjein alapult, lényegében olyan módon, ahogyan azt Kiéin és Jackman leírták [Calcified Tissue Research, 20, 275-290 (1976)]. Az eljárást röviden ismertetve: a mintákat három váltás kloroformmal (egyenként 24-24 óra) zsírtalanítottuk és 100 °C hőmérsékleten 24 órán át szárítottuk, majd a tömeget mértük és feljegyeztük. A 3h-T kivonása érdekében a combcsontokat és csigolyákat ásványmentesítettük 15 ml 0,5 n sósavoldattal (HCI), majd a felülúszókat dekantáltuk és tároltuk. A tríciumszint mérésére 625 ml-es alikvotokat pipettáztunk üveg szcintillációs ampullákba, amelyek 10 ml Optiflor szcintillációs folyadékot (Packard Instrument, Meriden, Connecticut, Amerikai Egyesült Államok), és a ^H-T szinteket folyadékszcintillációs spektrométeren (Beckman LS 1800) mértük.

Az EtOH-s vízmentesítés után a csonttömeg-mérésre kiválasztott mintákat zsírmentesítettük három váltás kloroformmal (egyenként 24-24 óra) és 60 °C hőmér- 13,; «... ..

• · · · * · · • » .· ·· · ··· ·· X * · *· • ♦ί sékletű kemencékben szárítottuk egy éjszakán át. A csonttömeget úgy fejeztük ki, mint a testtömeg grammra vonatkozó száraztömeg mg-ot.

Az utolsó 100% EtOH kezelés után a sípcsontokat letisztítottuk két váltás xilollal, majd mésztelenítés nélkül feldolgoztuk és metakrilát műanyagba ágyaztuk egy korábban leírt eljárás szerint [Bain és munkatársai: Stain Technology 65, 159163 (1990)]. A proximális sípcsontból 5 mm vastag frontáális metszeteket vágtunk ki wolfram-karbid késsel ellátott Reichert-Jung 2050 forgó mikroton (Leica Instruments, Nusslock, Németország) segítségével. Az 5 mm-es metszeteket Goldner-féle trikróm-festékkel festettük meg.

A proximális sípcsontok hisztomorfometrikus mérését a Bioguard Boné Morphometry Program (Biometrics, Inc., Nashville, Tenessee) segítségével végeztük: ez egy camera lucida révén össze volt kötve egy Olympus BH-2 fény/epifluoreszcens mikroszkóppal (Scientific Instruments, Inc., Redmond, Washington). A szivacsos csonttérfogat mérését egy 3,0 mm2 nagyságú szövettérben végeztük, 1,5 mm-re a növekedési lemez/metafízis elágazástól, hogy kizárjuk a primer elszivacsosodás mérését. Minden állatról legalább négy külön metszetet vizsgáltunk.

A méh tömegek, csontfelszívódási vizsgálatok, csont fizikai tulajdonságok és csont hisztomorfometria elemzése varianciaanalízisen (ANOVA) alapult, a Statview statisztikai programot alkalmazva (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok). Amikor az ANOVA által szignifikancia mutatkozott, a kontroll és a kezelt átlagokat Dunnet-féle többszörös összehasonlító munkamenettel hasonlítottuk össze. Akkor tekintettük szignifikánsnak a P értékeket, ha ez kevesebb volt, mint 0,05.

Az ál-sebészeti eljáráson átesett (sham)-hordozóval kezelt állatokkal összehasonlítva a petefészek-irtás szignifikáns csökkenéshez vezetett a méhek nedves súlyában. Az ösztrogén-pótlás helyreállította a méh tömegeket az ál-sebészeti el- 14 járáson átesett (sham) értékre, a centkromán kezelésnek azonban nem volt statisztikailag szignifikáns hatása a méh tömegre, még a legmagasabb, 5,0 mg/nap dózisoknál sem. A megnövekedett csontfelszívódás jelzéseként a petefészekirtás csökkentette a ^H-T csontváz-visszatartását a combcsontokban és a csigolyákban (1., illetve 2. táblázat). Amint ez várható volt, az ösztrogén kezelés megnövelte a ³HT csontváz-visszatartását. A centkromán utánozta az ösztrogén hatását a csontfelszívódásra olyan módon, hogy dózisfüggő növekedést idézett elő a ^H-T csontvázvisszatartásában a csontváz mindkét szóban forgó helyén (r^ értékek: 0,96 a combcsontoknál, illetve 0,29 a csigolyáknál).

1. táblázat

A 3h-T visszatartása combcsontokban

Beütés/perc (cpm) (ezer)

Csoport	Szám	Átlag	Standard eltérés
sham/placebo	8	3832.25	928.975
ovx/placebo	8	3184.375	680.598
ovx/0,05 mg E2	10	4782	1501.813
ovx/0,05 mg C	9	3373.556	733.896
ovx/0,5 mg C	10	3405.1	1107.792
ovx/5,0 mg C	9	4192.222	1107.3

Beütés/perc (cpm) (ezer)

2. táblázat

A ^H-T visszatartása csigolyákban

Csoport	Szám	Átlag	Standard eltérés
sham/placebo	8	1876.75	481.552
ovx/placebo	8	1531.625	416.205
ovx/0,05 mg E2	9	2467.556	733.064
ovx/0,05 mg C	9	1523.333	406.635
ovx/0,5 mg C	10	1616	509.954
ovx/5,0 mg C	10	2156.7	495.741

A centkrománnak azt a képességét, hogy gátolja a csontfelszívódást és megakadályozza a csontveszteséget, a szivacsos csonttérfogat mérésével igazoltuk a combcsontokban és a csigolyákban.A hordozóval kezelt, petefészek-irtott patkányokkal összehasonlítva a centkromán dózisfüggő növekedést okozott a proximális sípcsontok szivacsos csonttérfogatában (2. ábra r2 = 0,99). Hasonlóképpen a centkrománnak dózisfüggő hatása volt a csonttömegre mind a combcsontban, mind a csigolyákban.

Összefoglalva: ezek az adatok azt jelzik, hogy a centkromán képes megakadályozni a csontveszteséget a petefészek-irtott patkányokban és ez független bármiféle látszólagos uterotróf aktivitástól. Ez világosan kiderül a 3. ábrából amely összeveti a méh tömeg adatokat a combcsontokból kapott csontfelszívódási adatokkal, így érzékelteti a centkromán független hatását erre a két szövetre.

Bár a jelen találmánynak több részletes megoldását ismertettük az előzőekben a jobb és világosabb megértés céljából, nyilvánvaló, hogy a gyakorlatban bizonyos változások és módosítások alkalmazhatók, amelyek az itt következő iglnypontok oltalmi körén belül vannak.

Claims

1. Eljárás betegekben csontveszteség csökkentésére, azzal jellemezve, hogy csontritkulás, Paget-kór vagy mellékpajzsmirigy-túltengés következtében fellépő csontveszteségben szenvedő betegeknek valamely (I) általános képletű, csontveszteséget gátló vegyületet vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazó kompozíció hatásos mennyiségét adjuk be, valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval együt, ahol az (I) általános képletben

RÁ és r5 jelentése egyenként hidrogén- vagy halogénatom vagy hidroxi-, trifluor-metil, kis szénatomszámú alkil-, kis szénatomszámú alkoxi-, vagy tercier amino kis szénatomszámú alkoxicsoport.

R² és jelentése egyenként hidrogénatom vagy kis szénatomszámú alkilcsoport.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet adunk be, amelyben

R1 jelentése kis szénatomszámú alkoxicsoport;

R² és R³ jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport;

R⁴ jelentése hidrogénatom; és

Rb jelentése tercieramino kis szénatomszámú alkoxicsoport.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet adunk be, amelyben

R1 jelentése metoxicsoport

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet adunk be, amelyben R² és r3 jelentése metilcsoport.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletü vegyületet adunk be, amelyben jelentése hidrogénatom.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletü vegyületet adunk be, amelyben r5 jelentése (III) képletü csoport.

7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletü vegyületet adunk be, amelyben a vegyület izolált d- vagy l-enantiomer

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy valamely, az (I) általános képlet körébe tartozó (IV) általános képletü vegyületet adunk be.

9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képlet körébe tartozó (II) képletü vegyületet adunk be.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) képletü vegyület izolált d- vagy l-enantiomerjét adjuk be.

11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy valamely (I) általános képletü vegyületet menopauza utáni nőknek adjuk be.

12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletü vegyületet orális beadásra alkalmas formában adjuk be.

13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletü vegyületet 0,5-5,0 mg/beteg kg/nap dózisban adjuk be.

14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletü vegyületet tartalmazó kompozíciót napi-heti időközönként adjuk be.

15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletü vegyületet bőr alatti implantátum formájában adjuk be.

16. Eljárás csontritkulás kezelésére, azzal jellemezve, hogy a betegnek a csontfelszívódás gátlására elegendő mennyiségben valamely (I) általános képletű vegyületnek vagy gyógyászatilag elfogadható sójának valamely izolált d- vagy Ienantiomerjét adjuk be, ahol az (I) általános képletben

Fd, R^ és R5 jelentése egyenként hidrogén- vagy halogénatom vagy hidroxi, trifluor-metil, kis szénatomszámú alkil-, kis szénatomszámú alkoxi-, vagy tercier amino kis szénatomszámú alkoxicsoport.

r2 és R^ jelentése egyenként hidrogénatom vagy kis szénatomszámú alkilcsoport.

17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemzve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet adunk be, amelyben

R1 jelentése kis szénatomszámú alkoxicsoport;

R2 és R3 jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport;

R^ jelentése hidrogénatom; és

R5 jelentése tercieramino kis szénatomszámú alkoxicsoport.

18. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet adunk be, amelyben

R¹ jelentése metoxicsoport.

19. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet adunk be, amelyben

R2 és R^ jelentése metilcsoport.

20. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet adunk be, amelyben

R4 jelentése hidrogénatom.

• ·

21. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületet adunk be, amelyben r5 jelentése (III) képletű csoport.

22. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy valamely, az (I) általános képlet körébe tartozó (IV) általános képletű vegyületet adunk be.

23. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemzve, hogy az (I) általános képlet körébe tartozó (II) képletű vegyületet adjuk be.

24. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemzve, hogy valamely (I) általános képletű vegyületet menopauza utáni nőknek adjuk be.

25. Az (I) általános képletű vegyületek alkalmazása csontritkulás, Paget-kór vagy mellékpajzsmirigy-túltengés következtében fellépő csontveszteség kezelésére alkalmas gyógyászati kompozíciók előállítására, ahol a képletben

R1, R^ és R5 jelentése egyenként hidrogén- vagy halogénatom vagy hidroxi-, trifluor-metil, kis szénatomszámú alkil-, kis szénatomszámú alkoxi-, vagy tercier amino kis szénatomszámú alkoxicsoport.

R² és R² jelentése egyenként hidrogénatom vagy kis szénatomszámú alkilcsoport.

26. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az abban alkalmazott vegyület egy izolált l-enantiomer.