HUT69769A - Recombinant dna compounds and expression vectors encoding para-nitrobenzyl esterase activity from bacillus - Google Patents

Description

Α találmány a rekombináns DNS technológiához kapcsolódik. Elsősorban a Bacillus genuszból származó paranitro-benzil-észteráz (PNB-észteráz) enzimet kódoló DNS vegyűletekhez kapcsolódik. Az észtereket szabad savas formájukban általánosan a cefalosporin és az 1-karbacefalosporin antibiotikumok szintézisének intermediereként alkalmazzák. A cefalosporin készítmények általános ismertetését Chauvette adta a 4.064.343 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Az 1-karbacefalosporint Christensen és társai ismertetik a 4.226.866 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, Munroe a 4.791.106 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, valamint Hirata és társai a 4.708.956 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.

A PNB-észter funkciót általánosan a molekula savas karboxil-sav funkciójának védelmére alkalmazzák, míg a reakció a molekula egyéb részein folyamatban van. így például Garbrecht a 3.362.850 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban a p-nitro-benzil-észtercsoport alkalmazását ismerteti a cefalexin szintézis során. A szintézis első lépése során ezt az észtert savas körülmények között hidrogenolízissel hasítják el. A 3.781.282 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Garbrecht a cefalosporinok p-nitro-benzilésztereinek dezészterezését ismerteti, cink és sav alkalmazásával, amid-típusú oldószerben, például dimetilformamidban. A 3.799.924 számú amerikai egyesült államokbeli

-3szabadalmi leírásban Jackson a cefalosporin-észterek p-nitro-benzil-észter-csoportjainak az eltávolítását ismerteti, nátrium-, vagy kálium-ditionátos kezelés alkalmazásával, pH 7 felett. A 4.091.214 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Hatfield a cefalosporin vegyületek dezészterezését ismerteti, ami egy reduktív hasítás semleges oldószerben, cink és a-hidroxikarboxil-sav alkalmazásával. A 4.708.956 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Hirata és társai az 1-karbacefalosporin vegyületek para-nitro-benzil védőcsoportjainak eltávolítását ismertetik. Ezek az eljárások az oldószer visszanyerésének magas költségeivel járnak, valamint komoly problémát jelent a szerves oldószerek által okozott szennyeződés.

A cefalosporin és az 1-karbacefalosporin antibiotikumok szintézise során a PNB blokkoló-csoportok eltávolítására alkalmas enzimes eljárás számos előnnyel rendelkezik. Ilyen, enyhe körülmények között kivitelezett eljárást vizes oldatban, szerves oldószer és fém katalizátor alkalmazása nélkül hajthatunk végre. A 3.972.774 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Brannon eljárást ismertet a cefalosporin-észterekből a PNB-észter eltávolítására, melynek során az észtert egy, a Bacillus mikroorganizmus genuszból származó nyers készítménnyel reagáltatják. Ugyanakkor az ezért a hasításért felelős enzimet nem izolálták.

Eddig még nem volt lehetséges a Bacillusból izolált PNB-észteráz enzim üzemi méretekben történő alkalmazása,

-4mivel a Bacillus subtilis az enzimet csak kis mennyiségben termelte. A jelen találmány ezt a korlátozó tényezőt azzal küszöböli ki, hogy rekombináns DNS vegyületeket, és egy, a Bacillus subtilisből származó para-nitro-benzil-észterázt kódoló vektorokat biztosít. Az itt bemutatásra kerülő, újonnan izolált DNS szekvenciákat nagy mennyiségű PNBészteráz aktivitás rekombináns gazdasejtekben történő előállítására alkalmazhatjuk. Ez a PNB-észteráz a cefalosporin és az 1-karbacefalosporin antibiotikumok előállítása során alkalmazott PNB-észter eltávolítására alkalmas.

A találmány tehát egy enzimes hasítási eljárást nyújt a p-nitro-benzil-csoportnak a cefalosporin észterekből és az 1-karbacefalosporin észterekből történő eltávolítására, így biztosítva a megfelelő cefalosporin-savat vagy 1karbacefalosporin-savat. Az eljárás egy cefalosporin-észter vagy egy 1-karbacefalosporin-észter rekombináns úton termelt PNB-észterázzal történő reagáltatásából áll, előnyösen vizes oldatban, 25-40°C közötti hőmérsékleten, majd az így keletkezett cefalosporin-sav vagy 1-karbacefalosporin-sav visszanyeréséből. Az eljárás különösen értékes a cefaklór és a lorakarbef (loracarbef) előállítása során, amikor az említett antibiotikumok 4-karboxiles csoportját a szintézis során para-nitro-benzil-csoporttal védjük.

A lorakarbef nukleusz mentes sav (loracarbef nucleus free acid) a penicillin G amidáz egy szubsztrátja abban a reakcióban, melynek során a fenil-glicin-metil-észter ezzel a vegyülettel reagál, és ennek eredményeképpen lorakarbef és

-5metanol keletkezik. Hasonlóképpen a penicillin G amidáz a fenil-glicin-metil-észter és a cefaklor nukleusz mentes sav (cefaclor nucleus free acid) metanollá és cefaklorrá vagy cefalexinné történő átalakulását katalizálja.

A találmányban ismertetett gazda-vektor rendszerek rendkívül hatékonyan termelnek PNB-észterázt, úgy hogy a rekombináns Escherichia coliban a PNB-észteráz az oldható fehérjéknek megközelítőleg 10-20 %-át teszi ki. Az aktív PNB-észteráz gén kifejezés ilyen szintje, amit a blokkolócsoportnak a lorakarbef-PNB kémiai intermedierekből történő eltávolításával mértek, megközelítőleg 19Ox nagyobb a Bacillus subtilis NRRL B8079 esetében kapott értéknél. Továbbá, a termelt nagy mennyiség következtében, az enzimet jóval egyszerűbb, és kevésbé költséges eljárással tisztíthatjuk meg, mint amit a Bacillus subtilis NRRL B8079 alkalmazhattunk.

A jelen találmány szerinti DNS vegyületek a PNBészteráz aktivitást egy egyedülálló nyílt leolvasási keretben (open reading frame; orf) kódolják. A nyílt leolvasási keret transzkripciója majd a keletkező mRNS transzlációja egy PNB-észteráz aktivitással rendelkező egyedülálló polipeptid láncot eredményez. A PNB-észteráz aktivitást kódoló DNS vegyületeket a Bacillus subtilis genomikus DNS-éből izoláltuk, és rekombináns DNS kifejezési vektorok létrehozására alkalmaztuk. A találmány szerinti PNB-észterázt kódoló DNS vegyületeket számos kifejezési vektor létrehozására alkalmazhatjuk, melyek a PNB-észterázok létrehozására alkalmazhatók.

» 4 • 4 * · 4 4 4 f ·*·····«

4 4 ···» 4444 4«

-6A találmányba DNS vektorok tartoznak, melyek a Bacillus subtilis PNB-észteráz aktivitását kódoló DNS szekvenciákat tartalmaznak. A találmány továbbá rekombináns DNS vektorokat és rekombináns gazdasejteket nyújt, így például a pNB106R és a pNB106RM plazmidokat. Ezek a vektorok a PNB-észteráz kifejezésére képes rekombináns gazdasejtek létrehozására alkalmasak, ahol az említett eljárás során a gazdasejtet egy rekombináns DNS kifejezési vektorral transzformáljuk, ami az alábbiakat tartalmazza:

(a) egy, az említett gazdasejtben működő promoter és egy transzlációs aktiváló szekvenciát; és (b) egy, a Bacillus subtilisből származó PNB-észteráz aktivitást kódoló DNS szekvenciát, az említett promoter és egy transzlációs aktiváló szekvencia kifejezésére.

A találmány szerinti másik eljárás során egy, a fenti eljárással előállított gazdasejtet alkalmazunk a PNBészteráz aktivitás kifejezésére, ahol az eljárás során az említett gazdasejtet a gén kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztjük.

A jelen találmány során, melyet itt, és az igénypontokban ismertetünk, az alábbi kifejezéseket definiáltuk.

Amp - az ampicillin rezisztenciát adó gén; az ampicillin rezisztens fenotipus megjelölésére is alkalmaztuk.

cI857 - a bakteriofág lambdfa pL promoter hőérzékeny represszorját kódoló gén.

Klónozás - eljárás egy DNS szegmens rekombináns DNS • ·»·····<

«·· · ·♦·· ···· ««

-7klónozó vektorba történő beillesztésére.

Kódoló szekvencia - egy génben levő DNS szekvencia, ami a gén által kifejezett fehérje aminosav-gyökének szekvenciáját kódolja.

Gén - a DNS szegmense, mely egy promotert, egy transzlációs aktiváló szekvenciát, egy kódoló szekvenciát, és egy, a géntermék kifejezését irányító 3' regulátor szekvenciát tartalmaz.

Genom könyvtár - rekombináns DNS klónozó vektorok sorozata, melyek a speciális organizmus teljes genomját mutatják be, és melyek DNS szegmensei klónozva vannak.

Hibridizáció - két egyedülálló DNS és/vagy RNS molekula temperálásának (annealing) eljárása, melynek során kétszálú DNS molekula keletkezik, melynek bázispárosodása teljes vagy nem teljes lehet.

Lorakarbef - (7B)-7-<D-(aminofenil-acetil)amino>-3kloro-8-oxo-l-azabiciklo<4.2.0 >okt-2-én-2-karboxilsav.

Lorakarbef nukleusz - transz-7-amino-3-kloro-8-oxo-lazabiciklo<4.2.0>okt-2-én-2-karboxilsav monohidroklorid.

Lorakarbef PNB észter - 7-(aminofenil-acetil)amino>-3kloro-8-oxo-l-azabiciklo<4.2.0>okt-2-én-2-karboxilsav(4nitrofenil)metilészter.

mRNS - messenger ribonukleinsav.

ŐRI - plazmid vagy vektor replikációs origin, az a DNS szekvencia, ami a DNS polimeráznak biztosít egy kapcsolódási vagy kiindulási helyet.

pL - a lambda bakteriofág baloldali promotere.

pnbA - egy PNB-észteráz aktivitást kódoló gén.

-8Promoter - egy, a DNS transzkripcióra irányuló vagy azt iniciáló DNS szekvencia.

Rekombináns klónozó vektor - egy önálló replikáló vagy beépülő (integrating) anyag, mely, korlátozások nélkül, plazmid lehet, így egy DNS molekula, melyhez egy vagy több további DNS molekulát adhatunk.

Rekombináns DNS kifejezési vektor - egy önálló replikáló vagy beépülő (integrating) anyag, mely, korlátozások nélkül, plazmid lehet, így egy promoter vagy más regulátor szekvencia, ami a polipeptidet vagy az RNS-t kódoló DNS szegmens kifejezését irányítja.

Rekombináns DNS szekvencia - egy DNS szekvencia, kivéve azt a gazda kromoszómát, melyből a DNS származik, ami az izolált, a szintetizált, vagy a részlegesen szintetizált DNS szekvenciát tartalmazza.

Restrikciós fragmentum - lineáris DNS molekula, mely egy vagy több enzim hatására jön létre.

rop - DNS régió, mely az Escherichia coliból származó, plazmid másolat ellenőrző elemeket kódolja.

TetR - a tetraciklin rezisztenciát adó gén; a tetraciklin rezisztens fenotipus megjelölésére is alkalmaztuk.

Transzkripciós aktiváló szekvencia - egy promoter.

Transzkripciós terminátor - egy DNS szekvencia, mely a DNS transzkripció RNS polimeráz által történő terminációját j elzi.

Transzformáns - egy befogadó gazdasejt, melyet transzformációnak vetettünk alá.

Transzformáció - a DNS bevitele a befogadó gazdasejtbe, ami által a befogadó sejt genotípusa megváltozik.

Transzlációs aktiváló szekvencia - egy regulátor DNS szekvencia mely - a mRNS-sé történő átíródás során - az mRNS fehérjévé való transzlációját segíti elő.

Az ábrákon bemutatott restrikciós enzim és funkciós térképek hozzávetőlegesen az itt bemutatott rekombináns DNS vektorokat szemléltetik. A restrikciós helyekről adott információ nem teljes, az adott típus az ábrán bemutatott restrikciós helyeken kívül további restrikciós enzim helyekkel is rendelkezhet.

1. ábra a pNBEl plazmid restrikciós enzim helye és funkciós térképe.

2. ábra a pNBE106R plazmid restrikciós enzim helye és funkciós térképe.

3. ábra a pNBE106RM plazmid restrikciós enzim helye és funkciós térképe.

A jelen találmány izolált DNS vegyületeket és rekombináns DNS klónozó és kifejezési vektorokat nyújt, melyek a Bacillus subtilis eredetű PNB-észterázt kódolják. A B. subtilis PNB-észteráz kódoló DNS-t SEQ ID NO: 1-el jelöltük. A SEQ ID NO: 1-et, valamint a többi SEQ ID NO:~t a szekvencia jegyzékben ismertetjük.

A PNB-észteráz SEQ ID NO: 1 által kódolt aminosav • · • ♦ · · · · · ·*··«··

-10szekvenciáját SEQ ID NO: 2-ként jelöltük.

A SEQ ID NO: 1-et hagyományos úton, módosított triészteres eljárással, teljesen védett dezoxiribonukleotid építő blokkok (building blocks) alkalmazásával szintetizálhatjuk meg. Ezek a szintetizáló eljárások a szakmában általánosan ismertek, kivitelezésük például Itakura és társai (1977, Science 918:1056), és Crea és társai (1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5765) eljárása szerint történhet. Rendkívül kedvező eljárást ismertetnek még Hsiung és társai, 1983, Nucleic Acid Research 11:3227, valamint Narang és társai, 1980, Methods in Enzymology 68:90. A fent említett eljárásokon túl a SEQ ID NO: 1-et automata DNS szintetizátor, például ABS (Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404) 380A DNS szintetizátor alkalmazásával is létrehozhatjuk. A SEQ ID NO: 1-et polimeráz láncreakcióval is létrehozhatjuk. Lásd 4.800.159, és 4.683.202 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, és 0258017 számú európai szabadalmi leírás, melyet 1987. március 2-án jegyeztek be.

A SEQ ID NO: 2~t különböző DNS szekvenciák sokasága is kódolhatja, mivel a legtöbb aminosav-gyököt egynél több DNS hármas kódolja. Mivel ezek a különböző DNS szekvenciák ugyanazt a találmány szerinti aminósav szekvenciát kódolhatják, a jelen találmány ezeket a különböző DNS szekvenciákat is tartalmazza.

Amint a szakmai gyakorlattal rendelkezők látni fogják, a jelen találmány lehetővé teszi a PNB-észteráz gén kodonjainak kívánság szerinti cseréjét. A PNB-észteráz gén • » ·· · · ·· • · · «··*· « ♦ * · · fc · f · *·♦· 9 9 * ♦·· · ···*««·« ··

-11DNS szekvenciájának megadásával a szakmában jól ismert eljárásokat alkalmazhatunk mutáns PNB-észteráz enzimek létrehozására, melyek a természetes enzimtől néhány aminosav-gyök elhelyezkedésében különböznek. Ilyen mutáns enzimeket mutáns PNB-észteráz kódoló szekvenciák kódolhatnak, például azok a szekvenciák, melyekben az aminosav kodonokat eltávolítottuk a természetes PNB-észteráz kódoló szekvenciából, illetve abba beillesztettük. Ezek a mutáns enzimek a találmány tárgykörébe tartoznak, mivel nem láthatjuk előre, hogy az adott mutáció a kódolt PNB-észteráz aktivitását tönkreteszi-e, és így az itt nyújtott eljárás a mutáns szekvenciák egyedüli kifejezését teszi szükségessé a PNB-észteráz aktivitás hatásának megállapításához.

A jelen találmány nincs korlátozva az egyes itt felsorolt vektorok által. A jelen találmány a Bacillus subtilis PNB-észteráz aktivitást kódoló DNS vegyületeket tartalmazza. A jelen találmány szerinti DNS vegyületeket az egyes gazdasejtek - amelyekben a kifejezési vektor replikálódik illetve kifejeződik, és amelyekben a promoter és a transzlációs aktiváló szekvencia működőképes - észteráz aktivitása kifejezését irányító kifejezési vektorok létrehozására alkalmazhatjuk.

így a jelen találmány Escherichia coli plazmidot, vagy más, az E. coliban a PNB-észteráz aktivitás kifejezését irányító plazmidot tartalmaz. A jelen találmány a PNBészteráz aktivitás kifejezését irányító vektorokat tartalmaz, és egy az E. coliban működő replikont alkalmaz, így például a pBR322, a pACYC184, az F, a CO1V-K94, az RÍ, ··

-12az R6-5, vagy az R100 plazmidot. A jelen találmányt nem kizárólag a plazmid vektorokra korlátoztuk, a jelen találmány más, a PNB-észteráz aktivitást kifejező, és a gazdasejtben a replikációt és a fennmaradást biztosító integrációt és virális replikációt alkalmazó vektorokat is tartalmaz.

A jelen találmányt nem korlátoztuk az egyes promoterekre és transzlációs aktiváló szekvenciákra, melyek a PNB-észteráz aktivitást kódoló DNS kifejezését irányítják. A jelen találmány az E. coliban működő, és az E. coliban a PNB-észteráz aktivitás kifejezésének irányítására alkalmas promotereket és transzlációs aktiváló szekvenciákat tartalmazza. Számos, az E. coliban működő promotert, és transzlációs aktiváló szekvenciát ismerünk, melyek az E. coliban a PNB-észteráz aktivitás kifejezésének irányítására alkalmasak. Ilyen transzkripciós és transzlációs aktiváló szekvenciák lehetnek, korlátozások nélkül, a lpp, a lac, a trp, a tac, a lambdapL, és a lambdapR promoterek, és transzlációs aktiváló szekvenciák.

A más szervezetekből származó transzkripciós és transzlációs aktiváló szekvenciákat a jelen találmány szerinti PNB-észteráz aktivitást kódoló DNS vegyületekhez ligálhatjuk, így kifejezési vektorokat hozhatunk létre, melyek a PNB-észteráz aktivitást irányítják azokban a gazdasejtekben, amelyekben az aktiváló szekvencia működik. Bár a PNB-észteráz termelés majd az in vitro alkalmazás céljából történő tisztítás céljából az Escherichia coli gazdát alkalmaztuk, az E. colitól eltérő PNB-észteráz • · · ♦ · · ·· • 4 · *···« « · · · · · * _r · ♦ ··· · · * ««· · ··*» «··· ··

-13aktiváció kifejezést irányító vektorok is alkalmazhatók.

A vektor az adott gazdasejtben, melybe a vektort transzformáltuk, a PNB-észteráz aktivitás intracelluláris koncentrációját az alábbi elemek igénye mellett fokozhatja: 1.) a jelen találmány szerinti PNB-észteráz aktivitást kódoló DNS vegyület; és 2.) egy promoter vagy egy transzlációs aktiváló szekvencia, mely a transzformált gazdasejtben nem csak működik, hanem a megfelelő irányban helyezkedik el, és a megfelelő helyzetben van a PNB-észteráz aktivitást kódoló DNS kifejezésének irányításához. Stabil transzformánsokat természetesen csak akkor kaphatunk, ha a vektor mint egy extrakromoszomális elem replikálódik, vagy beépül a gazdasejt genomikus DNS-ébe. Ugyanakkor az ilyen speciális replikációs vagy integrációs szekvenciák nem feltétlenül szükségesek, mivel, amennyiben a DNS-t bevisszük a gazdasejtbe, nem-specifikus integráció is előfordulhat.

Egy PNB-észteráz kifejezési vektor antibiotikum rezisztenciát tartalmazó gént vagy más más elemet is tartalmazhat, ami eljárást biztosíthat a vektort tartalmazó gazdasejtek szelektálására, de ezek a szelektálható elemek se nem szükségesek, se nem kívánatosak, ha a vektor beépül a gazdasejt kromoszóma DNS-ébe.

A Bacillus subtilis PNB-észteráz gén kódoló szekvenciájának létrehozásával a jelen találmány PNBészteráz kifejezési vektort biztosít minden, a transzformációra érzékeny organizmusnak. Az itt bemutatott Escherichia coli PNB-észteráz kifejezési vektor széles körben szemlélteti a jelen találmány szerinti kifejezési

-14vektorokat. Ugyanakkor számos, a jelen találmány szerinti vektort jelöltünk meg, melyek a PNB-észteráz kifejezését irányítj ák.

Az alábbi példák a találmány megértését biztosítják. Az alkalmazott speciális anyagok, fajok, és körülmények tovább szemléltetik a jelen találmányt, de nem korlátozzák azt. A DNS analízis eljárását Sambrook és társai ismertetik (1989, Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

A restrikciós enzimes reakciók körülményeit a gyártók ajánlása szerint állítottuk be (Boehringer Mannenheim (BM) , Indianapolis, IN; New England Biolabs (NEB), Beverly, MA; Bethesda Research Labs (BRL), Gaithersburg, MD).

1. példa

A PNB-észteráz gén izolálása a Bacillus subtilis (NRRL B8079) DNS genom könyvtárából

A. A törzsek genotípusának ismertetése

A Bacillus subtilis NRRL B8079 törzset úgy izoláltuk, hogy azonosítottuk a para-nitrobenzil-észter a cefalosporin történő eltávolítására alkalmas mikroorganizmust (Brannon és társai, J. Antibiotics XXIX No. 2:121-124, 1976). A Bacillus subtilist (NRRL B8079) folyamatos tenyészet gyűjteményben helyeztük el az alábbi helyen: Northern Régiónál Research Laboratory (NRRL), United States Department of Agriculture

-15» · ·4 · · »· •«4 · ·· ·· • · « · · « « ·«*··· « · ··· · ···· ·*·· ··

Service, Peoria, IL 61604, B-8079 számon. Az Escherichia coli K12 DH5a™ törzset (MAX Efficiency DH5ct™ Competent Cells; GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), ami egy recA- törzs, mely rendkívül jól transzformálható, és stabilis környezetet nyújt a plazmidok fenntartásához, a Bacillus subtilis NRRL B8079 genom könyvtár gazdatörzseként alkalmaztuk (lásd ÍJ. példa). A recA+ E. coli K12 RV308 törzset a klónozott PNB észteráz gén nagy hatékonyságú kifejezésére alkalmaztuk, és az E. coli heterológ fehérjéi kifejezésének előnyös gazdájaként, üzemi méretek között. Az E. coli K12 RV308 törzset az NRRL-nél helyeztük el, B-15624 számon. Az E. coli W ATCC 11105-öt szintén a heterológ fehérjék kifejezése során alkalmaztuk gazdaként. Ez a gazdatörzs az American Type Culture Collection-tói (ATCC) (Rockville, MD 20852) szerezhető be, ATCC 11105 számon.

B. A törzsek tenyésztése

Trypticase^R-Soy tápközeget (TSB; Becton Dickinson Microbiology Systems) és Luria tápközeget (L-tápközeg; 10 g Difco Bacto-Tryptone^R, 10 g NaCl, és 5 g élesztő extraktum per liter) alkalmaztunk a folyékony tenyészetekhez. A szilárd tenyészeteket 2 % W/v agarral kiegészített Ltápközegen tenyésztettük (L-agar). Az antibiotikumokat az alábbi koncentrációkban adtuk a közeghez: ampicillin 50 μg/ml·, és tetraciklin 5 ^g/ml. A β-galaktozid detektálása céljából a közeghez 20 ^g/ml koncentrációjú

5-bróm-4-klór-3-indolil-D-galaktozidot (X-gal; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 631787) adtunk.

C. Az Escherichia coli K12 DH5ct™, az E. coli K12 RV308, és az E. coli W ATCC 1105 transzformálása

Az Escherichia coli K12 DH5a™ kompetens sejteket a gyártó utasításai szerint transzformáltuk. A DH5a™, az RV308, illetve az ATCC 11105 Escherichia coli törzsek 50 ml-es tenyészeteit L-tápközegen megközelítőleg 0.5 abszorbancia egységű OD^gg értékig tenyésztettük, majd a sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze. A sejt pelletet 25 ml hideg 100 mM CaCl₂-ben felszuszpendáltuk, és jégen 25 percig inkubáltuk. A sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze. A sejteket 2.5 ml mennyiségű, hideg 100 mM CaCL₂~ben felszuszpendáltuk, és egy éjszakán keresztül jégen inkubáltuk. A megfelelő (competent) sejteket közvetlenül alkalmaztuk, vagy a transzformációig ~70°C-on tároltuk.

A megfelelő (competent) Escherichia coli sejtek transzformálása céljából a -70°C-on tárolt kompetens sejtszuszpenzióból 100 μΐ-t eltávolítottunk, és jégen megolvasztottuk. A sejteket 5 μΐ térfogatú plazmid DNS (1 ng/ml) eleggyel polipropilén csőben óvatosan össszeráztuk, és az így kapott oldatot jégen 30 percig inkubáltuk. A csövet 42°C-os vízfürdőbe helyeztük, és rázás nélkül 45 percig inkubáltuk. Ezután a hősokk kezelés után a csöveket 2 percre jégbe helyeztük. A csöveket a jégből eltávolítottuk, és 0.9 ml térfogatú, szobahőmérsékleten előinkubált S.O.C. közegét (2 % Bacto-Tryptone^R; 0.5 % élesztő extraktum; 10 mM NaCl; 2.5 mM KC1; 10 mM MgCl₂; 10 MM MgSO₄; és 20 mM glükóz) adtunk hozzá. A sejtszuszpenziót 225 rpm mellett, 37°C~on • · • · · · 9 ·· ' *1 4 ·4 * « «· • *· 9 ··»» ······

- 17ráztuk, és aliquot mennyiségeket ampicillint tartalmazó Lagar lemezekre oltottunk. A megfelelőnek vélt (putative) transzformánsokat 37°C-on való inkubálás után kiszúrtuk a lemezekről, és azonosságukat plazmid DNS-ük alapján, horizontális gélelektroforézissel (Sambrook és társai, 1989) igazoltuk. A szelektált kiónok plazmid DNS-ét restrikciós enzimes analízissel jellemeztük.

D. A plazmid DNS izolálása

Az Escherichia coli törzsekből a plazmid DNS-t standard alkalin-SDS eljárással izoláltuk (Sambrook és társai, 1989). A plazmid DNS izolálását az alábbiak szerint végezhettük el. Az L-agaron 50 mg/ml ampicillin jelenlétében növekedett transzformáns tenyészet egy részét 1 liter térfogatú, 50 mg/ml ampicillint tartalmazó L-tápközegbe vittük, és egy levegővel ellátott rázókészülékben (air shaker) 37^C-on 16 órát inkubáltuk. A sejteket Beckman JA-10 rotorban (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA 92634) 10 perces centrifugálással gyűjtöttük össze, 4°C-on. A sejt pelletet TE-vel (pH 8.0; 10 mM Trisz-HCl, 1 mM etilén-diamintetraecetsav [EDTA]) mostuk, centrifugálással összegyűjtöttük, és 50 mM Trisz-HCl-el, pH 8.0, illetve 25 % szukrózzal 10 ml össztérfogatra szuszpendáltuk. Keverés mellett 1 ml térfogatú, 20 mg/ml-es lizozimot (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) 25 mM Trisz-HC-ban, pH 8.0, adtunk hozzá, és az elegyet 30 percig jégen inkubáltuk.

Jégen történő 10 perces inkubálás mellett 4 ml 200 mM EDTAt, majd 15 ml Brij/DOC lizáló oldatot (1 % Brij 58; 0.4 % « · «· ·« ·♦ «· · W # ♦·« * · · · 9 ·· « · ···· 9 ·9 ♦ ♦· * ···· ·*·· ··

-18dezoxikolát; 50 mM Trisz-HCl, pH 8.03 60 mM EDTA) adtunk hozzá. A csöveket az elegyedés céljából óvatosan megfordítottuk, majd jégen 15-30 percig inkubáltuk. A sejttörmeléket 18.000 rpm mellett, Beckman JA-20 rotorban 1 órás centrifugálással eltávolítottuk. A megközelítőleg 30 ml térfogatú felülúszót dekantáltuk, és 150 ml térfogatú 10 mg/ml RNS-áz-t (Sigma Chemical Co.) adtunk hozzá. Egy órán keresztül 37°C-on inkubáltuk, majd 150 ml 10 mg/ml Proteináz K-t (Boehringer Mannenheim) adtunk hozzá, és ezzel ismét egy órán keresztül 37°C-on inkubáltuk. A DNS-t 1/10 térfogatnyi 3 M Na-acetát, pH 7.0, majd 3-szoros térfogatnyi jéghideg abszolút etanol hozzáadásával csaptuk ki. A DNS-t Beckman JA-14 rotorban (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA 92634), 8000 rpm mellett, 30 perces centrifugálással nyertük vissza. A levegőn megszárított pelletet TE-ben, pH 8.0, 9 ml össztérfogatúra szuszpendáltuk, ehhez 9 g céziumot (Boehringer Mannenheim), és 0.5 ml 10 mg/ml etidium-bromidot adtunk. Az így kapott elegyet két 5.1 ml térfogatú quickseal csőbe (Beckman Instruments Inc.) vittük, és 65.000 rpm mellett Beckman VTÍ65.2 rotorban 6 órán keresztül ultracentrifugáltuk. A plazmid sávokat ultraviola fénnyel tettük láthatóvá, és fecskendővel· távolitottuk el. A kapott DNS elegyet az etidium-bromid eltávolítása céljából sóval telített izopropanollal extraháltuk, és 16 órán keresztül lOOOx térfogatnyi TE-vel, pH 8.0, szemben dializáltuk. A DNS elegyet a felhasználásig -20°C-on tároltuk.

E. A polimeráz láncreakcióval (PCR) végrehajtott • · · * 4 · · • ···· · · « • · ···« ···* «·

-19amplifikáció

DNS Thermal Cycler ™ és Gene-Amp™ reagens kit (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT 06859) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint polimeráz láncreakciót hajtottunk végre. Harminc amplifikációs ciklust hajtottunk végre, minden ciklus során az alábbi inkubálásokat végeztük: 1 perc 93°C-on, majd 2 perc 40°C-on, majd 4 perc 72°C-on. A szintézist 72°C-on, 10 perces inkubálással fejeztük be.

F. A nukleotid szekvencia analízis

A szekvenálás céljából a túlságosan felcsavarodott (supercoiled) plazmád DNS templátokat Quiagen DNS kötő oszlopokon (Quiagen, Inc., Chatsworth, CA) a gyártó utasításai szerint megtisztítottuk az Escherichia coli alkalin-lizátumtól. A didezoxi-nukleotid lánc-terminációs szekvenálási reakciókat a szekvenáló eljárás ciklusának leírása szerint (Applied Biosystems, Inc. (ABI), Foster City, CA 94404) hajtottuk végre, fluoreszcens festékkel jelzett didezoxi-nukleotidok, túlságosan felcsavarodott (supercoiled) plazmid templátok, és szekvencia-specifikus oligonukleotid primerek alkalmazásával. A szekvenálási reakciókat ABI model 373A automata DNS szekvenálón analizáltuk. A nukleotid szekvenciákat összeállítottuk, megszerkesztettük, és GCG számítógépes programokkal (Devereux és társai, 1985, Nucleic Acids Rés. 12:387-395) analizáltuk.

G. Az oligonukleotid szondák szintézise és vég-jelzése

-20A Bacillus subtilis NRRL B8079~ből tisztított PNBészteráz aminoterminális szekvenciáját (a 7. példa eljárásával tisztítva) úgy kaptuk meg, hogy 25 pM tisztított PNB-észterázt (molekulatömeg 54.000), melynek fajlagos aktivitása megközelítőleg 2.2 U/mg volt (a lorakarbef PNB észter megfelelő szabad savhoz viszonyított hidrolízise alapján), automata gáz fázisú szekvenátorban (Hewick és társai, 1981, J. Bioi. Chem. 256:7990; Hunkapiller és Hood, 1978, Biochemistry 17:2124) analizáltunk. A kapott aminoterminális szekvencia a SEQ ID NO:3.

A SEQ ID NO:3, és a Bacillus subtilis ismert kodonjai alapján (Harwood és társai, Molecular Biological Methods fór Bacillus, John Wiley and Sons Ltd., West Sussex, England (1990)) két oligonukleotid szondát szintetizáltunk egy model 380B DNS szintetizátoron (Applied Biosystems Inc.), a βcianoetil-foszforamidit kémia alapján, a gyártó cég útmutatása szerint. Ezeket az oligonukleotid szondákat a SZEKVENCIA LISTÁBAN mint SEQ ID NO:4, és SEQ ID NO:5 adtuk meg.

A SEQ ID NO:4, és SEQ ID NO:5 először oszlopon lett megtisztítva (oligonukleotid tisztító feltétek; Applied Biosystems, Inc.), majd a vég-jelzés az alábbiak szerint történt. Az egyes szondákból 10 pM-t egy 20 μΐ-es reakcióelegyhez adtunk, mely 12 μΐ (τ-32Ρ) adenozintrifoszfátot (ATP; 5000 Ci/ml), és 8 egység T4 polinukleotid kinázt tartalmazott kináz pufferben (50 mM Trisz-HCl, Ph

7.6, 10 mM MgC12)· A reakciót 37°C-on 35 percig hagytuk lejátszódni, majd 5 perces 70°C-os inkubálás következett a • · · · · · · • ·♦·· · · · ♦ ·· · ···· »··· ·.»

-21kináz inaktiválása céljából, végül a nem inkorporálódott (τ-32Ρ) ATP-t a reakcióelegyből Sephadex G-50 Nick oszlop alkalmazásával (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ 08854) távolítottuk el.

H. A Bacillus subtilis NRRL B8079-ből származó genomikus DNS izolálása

Az összes DNS-t a növekedés középső logaritmikus fázisában, TSB-ben, 25°C-on levő, 16 órás Bacillus subtilis NRRL B8079 kétliteres tenyészetéből izoláltuk. A sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze, és 20 ml pufferben (50 mM Trisz-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA) felszuszpendáltuk. A sejtek lizálását két lépésben hajtottuk végre: (i) 1 mg/ml lizozim hozzáadása (tojásfehérjéből; Calbiochem, La Jolla, CA) és a szuszpenzió inkubálása 37°C-on 20 percig, és (ii) 4 ml lizáló puffer hozzáadása (0.5 % nátrium-dodecil-szulfát [SDS], 50 mM Trisz-HCl, pH 7.5, 0.4 mM EDTA, 1 mg/ml proteináz K), és inkubálás 50°C-on 30 percig. A DNS-t két fenolos extrakcióval, majd kloroformos extrakcióval tisztítottuk meg, majd etanolos lecsapással, és üveg pálcára felcsavarva nyertük vissza. Az RNS-t a készítményből a DNS 1 mM EDTA-t és 0.2 mg/ml ribonukleázt (szarvasmarha hasnyálmirigy; SDigma Chemical Co.) tartalmazó 40 mM TriszHCl pufferben, pH 7.5, történő óvatos felszuszpendálásával, és a készítmény 25°C-on 30 percig történő inkubálásával távolítottuk el. A további tisztítás ismételt fenolos és kloroformos extrahálással, etanolos csapadékképzéssel, és TE-ben, pH 7.5, történő felszuszpendálással történt.

• « · · · · · • ···· · · · ··· · ···· ·*·· ··

I. Az EcoRI restrikciós fragmentumok Southern hibridizációja oiigonukleotid szondák alkalmazásával

A Bacillus subtilis NRRL B8079-ből származó genomikus DNS-t EcoRI-el feltártuk és 1 %-os agaróz-TBE gélen elektroforézissel kezeltük (Sambrook és társai, 1989) . A méret szerint frakcionált DNS-t ezután Hybond-N+ nylon membránra vittük (Amersham, Arlington Heights, IL, U.S.A.) Southern biot eljárással (Sambrook és társai, 1989), és ultraviola fénnyel történő öt perces kezeléssel keresztkötésekkel rögzítettük a mátrixhoz. A DNS-t a 70°C-on 1-2 órán keresztül, 6 x SSC-t (1 x SSC, pH 7.0, mely 0.15 M NaCl-t, és 0.015 M Na-citrátot tartalmaz), 5 x Denhardt-féle oldatot (lx Denhardt-féle oldat, mely 0.2 g/1 Ficoll 400-t, 0.2 g/1 polivinil-pirollidont, és 0.2 g/1 szarvasmarha szérum albumint (V. frakció) tartalmaz), 0.25 % SDS-t, és 20 /^g/rnl borjú timusz DNS-t tartalmazó hibridizációs pufferben történő előhibridizálás után ultrahangos kezeléssel fragmentáltuk. Ezután az elegyhez (az l.G. példa szerint előállított) [3²p]-vel jelzett oligonukleotidot adtunk, így 0.5 pM/ml végső szonda koncentrációt hoztunk létre. Az inkubáló elegy hőmérsékletét az egy éjszakás inkubálás során 45°C-ra hagytuk lecsökkenni. A membránokat ezután, az egyes szondáknál alkalmazott szigorú körülmények alkalmazásával lemostuk. A SEQ ID NO: 4-hez hibridizált membránokat 25 percig mostuk, egymás után háromszor, 45°C-on 4 x SSC és 0.25 % SDS elegyében. A SEQ ID NO: 5-hőz hibridizált membránokat hasonlóan mostuk, 4 x SSC és 0.25 % SDS elegyében. Mosás után a membránokat szobahőmérsékleten szárítottuk meg, és lefényképeztük.

A fenti eljárás alkalmazásával a SEQ ID NO: 4-hez, és a SEQ ID NO: 5-höz hibridizált hibridizált megközelítőleg 6 kb méretű EcoRI fragmentumokat egy sáv szemléltette.

J. Az EcoRI DNS fragmentumok feldúsított könyvtárának létrehozása, és a pNBEl izolálása

A Bacillus subtilis NRRL B8079 genomikus DNS-t EcoRI-el teljesen feltártuk, és horizontális 1.2 %-os agaróz gélen (40 mM Trisz-acetátot, és 1 mM EDTA-t tartalmazó 1 x TAE pufferben) 16 órás elektroforézist (2 V/cm) végeztünk. A gélt hígított (1 mg/ml) etidium-bromid oldatai festettük meg, és a DNS sávokat hosszú hullámhosszú ultraviola fénnyel tettük láthatóvá. Egy körülbelül 6 kb méretű DNS-nek megfelelő darabot, mely áthidalta azt a sávot, amelyet előzőleg mint a SEQ ID NO: 4-hez, és a SEQ ID NO: 5-höz hibridizálódó darabot mutattunk be, eltávolítottunk a gélből. A géldarabból a DNS fragmentum elúcióját Sambrook és társai eljárása szerint hajtottuk végre (1989), kisebb módosításokkal. Röviden, a kihasított géldarabot 200 μΐ 0.2 x TAE pufferrel dialízáló zacskóba vittük, kapoccsal lezártuk, és 0.2 x TAE pufferrel körülbelül három órán keresztül elektroforelizáltuk. A dialízáló zacskó tartalmát, beleértve a 400 μΐ mennyiségű, 0.2 x TAE pufferrel végzett mosás eredményeként kapott anyagot, 2.4 ml híg só-puferrel (0.2 M NaCl; 20 mM Trisz-HCl, pH 7.5; 1.5 mM EDTA) elegyítettük, és ELUTIP-d oszlopra vittük (Schleier &

• · ·

-24Schuell, Keene, NH), melyet a gyártó utasítása szerint készítettünk elő. Híg só-puferrel mostuk az oszlopot, majd a DNS-t 400 pl tömény só-puferrel (1.0 M NaCl; 20 mM TriszHC1, pH 7.5; 1.0 mM EDTA) eluáltuk, és 800 pl mennyiségű jéghideg etanollal csaptuk ki, majd ezután 14.000 rpm mellett Eppendorf 5415C mikrocentrifugacsőben 40 percig centrifugáltuk. A két adag levegőn megszáritott pelletet 20 ml TE-ben (pH 7.5) történő feloldással elegyítettük, és a kapott elegyet a ligálásig -20°C-on tároltuk. A fragmentumokat pUC19 vektorba ligáltuk (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), melyet EcoRI feltárással, majd az 5'foszfát-csoportok borjú intesztinális alkálin-foszfatázos (Calbiochem; La Jolla, CA) eltávolításával előkezeltünk.

Az így kapott plazmidokat alkalmaztuk a kompetens Escherichia coli K12 DH5a™ sejtek transzformálására, melyeket ezután ampicillint és X-Gal-t tartalmazó L-agar lemezekre oltottunk. A pUC19 plazmid, mint vektor alkalmazása lehetővé tette a DNS beillesztést tartalmazó kiónok kék/fehér szelekció alkalmazásával történő specifikus szelekcióját. A csak. pUC19 vektort tartalmazó transzformánsokat, melyek a β-galaktozidáz a-peptidjének lacZ génje egy részét tartalmazták, és melyek aktív enzimet termeltek, kék fényt létrehozó X-Gal hasítással detektáltuk. Ezzel szemben az EcoRI helyen beillesztést tartalmazó izolátumok lebontják az α-peptid leolvasási keretét, és így az X-Gal-t tartalmazó közegben színtelenek maradnak. A fenotipusos stabilitás vizsgálata céljából több mint száz fehér, ampicillin rezisztens kolóniát szelektáltunk és • ·

-25hoztunk ismét létre (replace) ugyanazon az agaron.

A plazmid DNS-t izoláltuk a fehér tenyészetekből, és gélelektroforézissel analizáltuk. A kívánt 9 kb méretű (2.686 kb pUC19 DNS és egy megközelítőleg 6 kb méretű DNS beillesztés) plazmid DNS-t tartalmazó hét tenyészetet a további vizsgálatok céljából szelektáltuk. A SEQ ID NO: 4 szondát, egy plazmidot, és pNBEl-et alkalmazó Southern-féle hibridizáció során erős hibridizációs jelt kaptunk. A pNBEl plazmid EcoRI-el történő feltárása eredményeképpen két fragmentumot katunk, az előre várt mérettel: az egyik a linearizált pUC19-nek (2.686 kb) felelt meg, és a másik, mely megközelítőleg 6 kb méretű volt, a beillesztett fragmentumnak felelt meg.

K. A pnbA pNBEl-en történő transzkripciója irányának szemléltetése

A pNBEl alkalmazásával két PCR amplifikációt hajtottunk végre a pnbA transzkripció irányának meghatározása céljából, a pUC19 lacZ génjéhez, és a beillesztés ATG transzkripciós start helyének elhelyezkedéséhez képest. Az első amplifikáció során SEQ ID NO: 5 oligonukleotid szondát, és az előre haladó irányú (-20) M13 DNS szekvenáló prímért alkalmaztuk (New England BioLabs). A második amplifikáció során szintén SEQ ID NO: 5 oligonukleotid szondát, de egy, a(z) (-24) M13 DNS szekvenáló primerrel ellentétes irányban haladó prímért alkalmaztunk. Az eredmények szerint csak a (-20) előre haladó irányú szekvenáló primer hozott létre amplifikált fragmentumot. Ezek szerint a pnbA ATG start

-26helye megközelítőleg 4 kb méretben azonos irányban helyezkedik el· a pUC19 többszörösen klónozott helyével, és ugyanilyen irányban íródik át, mint lacZ gén.

L. A pnbA gén működőképességének igazolása

Annak meghatározására, hogy a teljes pnbA gén jelen van a pNBEl-en, és képes az Escerichia coliban történő kifejezésre, Escherichia coli K12 DH5a™ sejtek extraktumát pNBEl plazmiddal transzformáltuk, és megmértük az észteráz aktivitást. A sejt-extraktumot megközelítőleg 75 ml tenyészetből állítottuk elő, mely az L-közegben a növekedés középső logaritmikus fázisában volt. A sejteket 8.000 rpm mellet 10 perces centrifugálással gyűjtöttük össze, 10 mM nátrium-foszfát pufferben mostuk, pH 7.0, és ismét centrifugáltuk. A sejt pelletet felszuszpendáltuk (1 g sejt/4 ml puffer), és 30 másodperces ultrahangos kezeléssel (Sonicator™ Cell Disruptor Modell W185F, Heat SystemsUltrasonics Inc., Plainview, N.Y.) feltártuk. A sejttörmeléket mikrocentrifugában 20 perc alatt maximális sebességgel végrehajtott centrifugálással távolítottuk el. Mivel a PNB-észteráz katalizálja a p-nitrofenil-acetát elhasítását, továbbá a β-laktám antibiotikumok p-nitrobenzil-észtereinek elhasítását, ez a reakció folyamatosan alkalmas a keletkező p-nitrofenol spektrofotometriás követésére. A reakcióelegy 400 μΐ 0.5 M p-nitrofenil-acetátot (1:99 v:v acetonitril/víz), 600 μΐ 167 mM Trisz-HCl-t, pH 7.0, és 1-20 μΐ sejt-mentes extraktumot tartalmazott. A p-nitrofenol képződését az OD4Q5

-2Ίnövekedésével mértük, Gilford Response II spektrofotométer alkalmazásával. Az enzim mennyiségét kvalitatívan is meg tudtuk határozni, a teljes sejtek alkalmazásával, melyhez a tenyészet reakcióelegyéből pálcikával egy darabot vettünk. A teljes sejtek és a sejt-mentes extraktum ezen eljárásokat alkalmazó mérése azt mutatta, hogy a pNBEl plazmád egy ép pnbA gént tartalmazott, és a gén kifejeződése során aktív enzimet termelt. A plazmidot nem tartalmazó Escherichia coli K12 DH5a™ sejtek, vagy a más, a genomikus könyvtárból nemhibridizálódó plazmidokat tartalmazó Escherichia coli K12 DH5a™ sejtek nem mutattak szignifikáns aktivitást.

M. A pnbA gén szubklónozása

Az l.K. példa szerinti PCR kísérletből kapott információkkal, és a pNBEl egyszeres vagy dupla restrikciós enzimes feltárásainak eredményeiből lehetségessé vált a 6.0 kb méretű EcoRI fragmentum fizikai térképének előzetes megszerkesztése. A pNBEl plazmád restrikciós enzimes és funkciós térképét az 1. ábrán mutatjuk be. A pNBEl szubklónok sorozatát hoztuk létre a plazmidok Hpall-vel történő részleges feltárásával, majd teljes EcoRI feltárással, és a keletkező Hpall-EcoRI fragmentumok AcclEcoRI-el feltárt pUC19-hez liogálásával. A ligálás során a beillesztés Hpall helye és a pUC19 AccI helye nem regenerálódott. A keletkezett plazmidot ezután Escherichia coli K12 DH5a™ sejtekbe transzformáltuk, és az ampicillin rezisztens tenyészeteket kiválasztottuk, majd megmértük észteráz aktivitásukat. A plazmád DNS-t számos pozitív

-28klónból izoláltuk és analizáltuk a Hpall-EcoRI beillesztés méretének meghatározása céljából. A legkisebb méretű aktív enzimet kódoló beillesztés 2.3 kb volt. A plazmid vektort mint pNBHpE2.3 jelöltük.

Egy újabb szubklónozási kísérletet hajtottunk végre, mely azt mutatta, hogy a 2.3 kb méretű beillesztésnek a középtől távol eső (disztális) végén levő Sall-EcoRI fragmentum nem volt szükséges a pnbA gén működéséhez. A pNBHpE2.3-t először Hindin és Sáli alkalmazásával tártuk fel, majd Escherichia coli K12 DH5a™ sejtekbe transzformáltuk. Ebben a szerkezetben a plazmidot mint pNBH3S1.9 jelöltük, mely 1.9 kb méretű Hpall-Sall beillesztést tartalmazott, és aktív PNB észteráz fehérjét kódolt. Az ebből a plazmidból származó beillesztett DNSt pBluescript SK(-)-ba (Stratagene, La Jolla, CA) szubklónoztuk, és a nukleotid szekvencia meghatározása céljából analizáltuk. A Bacillus subtilis eredetű PNB-észteráz gén kódoló szekvenciáját a SZEKVENCIA LISTÁBAN mint SEQ. ID NO 1-et mutatjuk be.

2. példa

A pnbA gén Escherichia coliban történő magas színtű kifej ezése

A klónozott PNB-észteráz gén Escherichia coliban történő kifejezését a pNB106R és a pNB106RM vektorok létrehozásával fokoztuk. A pNB106R plazmid egy működőképes

rop gént tartalmaz, mely a plazmid másolatok, számának ellenőrzéséért felelős (Cesareni és társai, 1982, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 79:6313). A pNB106R restrikciós enzimes és funkciós térképét a 2. ábrán mutatjuk be. A pNB106RM plazmid, melyből hiányzik a rop gén, a pNB106-ból származott, és meghatározta a plazmid másolatok számát a pnbA gén kifejezése során. A pNB106RM restrikciós enzimes és funkciós térképét a 3. ábrán mutatjuk be.

A. Az Escherichia coli K12 DH5a™/pNB106R, az Escherichia coli K12 RV308/pNB106R, és az Escherichia coli W ATCC 11105/pNB106R létrehozása

A pNB106R plazmidot a pNBH3S1.9 plazmidból származó 1.9 kb méretű DNS fragmentum hőmérséklet hatására indukálható magas kifejezési színtű pHKY338 vektorba történő szubklónozásával hoztuk létre, így egy módosított bakteriofág lambda pL promoterből származó heterológ gén hőmérséklet hatására indukálható kifejezését hoztuk létre. Az Escherichia coli K12 RV308/pHKY338 az NRRL-nél 1992. január 31-én lett elhelyezve, NRRL B-18945 szám alatt. A plazmid két különösen fontos DNS régiót tartalmaz: (i) egy a pBR322-ből származó szekvenciát, mely a plazmádnak az Escherichia coliban való replikációját és fennmaradását teszi lehetővé, és melyben a pBR322 ampicillin rezisztencia gént lambda cI857 represszor gén helyettesíti; és (ii) egy olyan szekvenciát, melyben a módosított lambda promoter a pL106 (07/739.280 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) a tetraciklin rezisztencia génnel azonos ·· ·

-30irányban elhelyezkedő kanamicin rezisztencia gén nyílt leolvasási keretével (ORF) közvetlenül szomszédos. A promoter a két cisztronon keresztül ellenőrzi az említett ORF transzkripcióját (Schoner és társai, 1990, Methods in Enzymology 185:94). A pHKY 338 plazmidot úgy szerkesztettük meg, hogy a kanamicin rezisztencia gén nyílt leolvasási kerete Ndel és BamHI feltárásai könnyen eltávolítható legyen. Bármely ORF az ATG transzkripcionális start kodonja Ndel restrikciós helyével, illetve egy BamHI kompatibilis restrikciós hely, mely potenciális transzkripciós terminációs szekvenciájával azonos irányban helyezkedik el, beilleszthető a pHKY338-ba. Az így beillesztett ORF ezután a pL promoter kifejezéséhez megfelelő módon kapcsolódik.

Mivel a klónozott Bacillus subtilis nem tartalmazta a kívánt elhelyezkedésű Ndel helyet, eljárást dolgoztunk ki a pnbA ORF ATG transzkripciós start helyének bevitelére. Az eljárás során külön hoztuk létre a pnbA gén amino-terminális és karboxi-terminális fragmentumait, majd a két fragmentumot egy harmadik fragmentumhoz ligáltuk, melyet a pHKY338 vektorból kaptunk. A három fragmentumot az alábbi módon hoztuk létre:

i) Amino-terminális fragmentum

Egy az ATG transzkripciós start hellyel szomszédos Ndel helyet tartalmazó, a PNB észteráz amino-terminusát kódoló, 261 bp méretű fragmentumot szintetizáltunk PCR eljárás alkalmazásával (lásd l.E. példa). A PCR amplifikációt SEQ ID NO: 6-al, és SEQ ID NO: 7-el jelzett primerekkel hajtottuk • « *»··

-31végre.

A SEQ ID NO: 6 egy Ndel restrikciós helyet tartalmaz. A primer első három, bázisa nem kapcsolódott a klónozot PNBészteráz génhez. A másik primer, a SEQ ID NO: 7, ami az ATG start hellyel azonos irányban, 251 bp távolságra helyezkedett el, megközelítőleg 25 bp távolságra lett temperálva (anneal). Az amplifikáció eredményeként kapott 261 bp méretű fragmentumot Crowe és társai eljárásával (1991, Nuc. Acid Rés. 19:184) proteináz K-val (XXVIII típusú proteináz a Tritirachium albumból) kezeltük, az eljárás kisebb módosításával. A fragmentumot ezután Ndel-el és Accl-el feltártuk, fenollal extraháltuk, és etanollal csaptuk ki standard eljárások alkalmazásával, így 180 bp méretű fragmentumot hoztunk létre, melyet a lent bemutatásra kerülő lígálásos reakcióban használtunk fel.

ii) Karboxi-terminális fragmentum

Mivel a létrehozás során az amino-terminális és a karboxi-terminális fragmentumok összeillesztéséhez az ORF közbenső AccI helyét kellett alkalmazni, az 1.9 bp méretű fragmentumból ki kellett zárni az egyéb AccI helyeket (Sall/AccI). Ez két lépésben történt: (i) a pNBH3S1.9 Hindin és Sáli feltárása az ORF fragmentum kibocsátása céljából; és (ii) a kibocsátott fragmentum ligálása a pBluescript SK(-)-hoz, melyet HindlII-al és Xhol-el tártunk fel. Az 1.9 kb méretű Sall/AccI hely beillesztése a pBluescript SK(-) Xhol helyébe kizárta mind a három helyet.

A ligáló elegy Escherichia coli K12 DH5a™-ba történő

-32transzformációja, és a valódinak vélt kiónok ellenőrzése, valamint a szerkezet restrikciós feltárással végzett igazolása a pNBH3 izolálását eredményezte, ami csak egy AccI hely volt, mely az ORF-ban helyezkedett el. A BamHI hely karboxi-terminusán egy másik szerkezetet kellett bevinni.

Ezt a pNBH3 (SX)sk EcoRI-el és KpnI-el végzett feltárásával hajtottuk végre, az ORF fragmentum kibocsátása céljából, majd ennek a fragmentumnak a szintén EcoRI-el és KpnI-el feltárt pUC19-be ligálásával. A ligáló elegy DH5a™ sejtekbe történő transzformációja, majd a kiónok szelektálása és analízise a pNBEKuc plazmád izolálását eredményezte, mely az ORF-ban egy egyedülálló AccI helyet tartalmazott, és egy, a karboxi-terminussal megközelítőleg azonos irányban elhelyezkedő BamHI helyet.

iii) A pHKY338-ból származó vektor fragment

A továbbiakban bemutatásra kerülő három ligálási reakcióhoz szükséges vektort a pHKY338 Ndel-el és BamHI-el végzett feltárásával - amivel a kanamicin rezisztencia gént távolítottuk el, és a nagy restrikciós fragmentum gélizolálásával hoztuk létre.

A három ligálási reakciót az Ndel-AccI által feltárt

PCR fragmentummal (180 bp), a pNBEKuc AccI-BamHI fragmentumával (1.7 kb), és a pHKY338 Ndel-BamHI fragmentumával (6 kb) hajtottuk végre. így kaptuk a pNB106R plazmid vektort, mely a teljes, a hőmérséklet hatására indukálható lambda pL szintetikus promoter kontollja alatt álló pnbA ORF-ot tartalmazta. Az így kapott DNS-t • ·

-33Escherichia coli K12 DH5a™ gazdasejtbe transzformáltuk. A

PNB106R plazmidot ezután E. coli K12 RV308 és E. coli W ATCC

11105 gazdasejtekbe transzformáltuk.

3. példa

Az Escherichia coli K12 DH5a™/pNB106RM, az Escherichia coli K12 RV308/pNB106RM, és az Escherichia coli W ATCC 11105/pNB106RM létrehozása

Ahhoz, hogy a pNB106R rop gén nélküli (rop-) változatát létrehozzuk, a pNB106R és a pHKY389 (rop-) plazmidokat SphI-el és Ncol-el tártuk fel. Az Escherichia coli K12 RV308/pHKY389-et 1992. október 22-én helyeztük el az NRRLnél, B-21012 szám alatt. A pHKY389 megközelítőleg 4.5 kb méretű SphI-NcoI fragmentumát, és a pNB106R megközelítőleg 3 kb méretű SphI-NcoI fragmentumát gélen izoláltuk, majd alacsony hőmérsékletű agarózon elektroforézissel kezeltük. A fragmentumokat T4 DNS ligáz alkalmazásával ligáltuk, standard reakció körülmények mellett, 37°C-on, 4 óra alatt. A kompetens Escherichia coli K12 DH5a™ sejteket transzformáltuk, és tetraciklint tartalmazó lemezekre vittük. A szelektált klónokat a várt AccI restrikciós enzim minta alapján ellenőriztük, és így azonosítottuk a pNB106RM plazmidot hordozó törzset. A pNB106RM plazmidot ezután Escherichia coli K12 DH5a™ és Escherichia coli K12 RV308 törzsekbe transzformáltuk, és az E. coli W ATCC 11105-öt • · · . .· * ··· -:·'

-34alkalmaztuk az 1. példában bemutatott eljárás során.

4. példa

A pNB106R-el vagy pNB106RM-el transzformált Escherichia coli K12 DH5a™, Escherichia coli K12 RV308, és Escherichia coli W ATCC 11105 szintézise

A PNB-észteráz szintézise a pNB106R-ei vagy pNB106RM-el transzformált Escherichia coli K12 DH5ctT^M, Escherichia coli K12 RV308, és Escherichia coli W ATCC 11105 tenyésztésével történt, az alábbiak szerint. A törzs fagyasztott törzstenyészetét alkalmaztuk az 5 ^g/ml tetraciklint tartalmazó L-tápközeg inokulására. 30°C-on 16 órás növekedés után a sejteket friss, tetraciklint tartalmazó L-tápközegbe oltottuk át (4 % v/v), és a középső logaritmikus fázisig hagytuk növekedni. Az enzimszintézis indukálása a tenyészet hőmérsékletének 40°C-ra emelésével történt. A PNB-észteráz szintézis kinetikáját a tenyészetből történő periodikus mintavétellel végeztük, és a sejt-mentes extraktumban az enzimaktivitást az l.L. példa szerint mértük meg. A sejtmentes extraktumokat SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) is megvizsgáltuk, így lehetővé tettük az ellenőrzött PNB-észteráz fehérje mennyiségének viszonylagos növekedését.

5. példa

A rekombináns Escherichia coliból származó PNB-észteráz tisztítása

Az Escherichia coli K12 DH5a™/pNB106R-ből származó PNB-észteráz tisztítását az 1. táblázatban foglaltuk össze. Ezt az eljárást összehasonlíthatjuk a Bacillus 7. példában bemutatott tisztításával, melyet a 2. táblázatban körvonalaztunk. Meg kell jegyezni, hogy az utóbbi esetben nyolc lépésre volt szükség, és 130.000 mg nyers fehérjéből

2.6 mg tiszta enzimet kaptunk, míg a rekombináns Escherichia coli törzsnél 10 mg tiszta enzimhez csak 200 mg nyers fehérje kellett, és az eljárás mindössze hat lépésből állt, így a tisztításnál egyszerűbb eljárásnak tűnik a rekombináns E. coli forrás alkalmazása, mely 3250x hatásosabb az enzimet természetesen termelő törzs, a Bacillus subtilis alkalmazásánál.

Mivel az új, rekombináns Escherichia coli forrást alkalmazó tisztítási eljárás feltűnően egyszerűbb, így alkalmazása nagyobb mennyiségek termelése esetén kevésbé lenne drága, mint ugyanennek az enzimnek a Bacillus subtilisből származó tisztítási eljárása. Ez a rekombináns Escherichia coli törzs esetén jelentősen kapott fokozott PNB-észteráz közvetlen eredménye (kb. 3250 x/nyers fehérje).

A rekombináns Escherichia coliból tisztított PNB észterázt összehasonlítottuk a natív enzimmel a

-36molekulatömeg, Western biot eljárás, és a szubsztrát specifitás alapján. A molekulatömeg mérése esetén a kétféle forrásból származó érték 54.000 volt, és amennyiben a két enzim-készítményt a natív tisztított észterázzal szemben termelt antitesttel vizsgáltuk, azonosítható csapadék sávokat kaptunk. Mindegyik enzim cefaklor PNB észtert, cefaklor nukleusz PNB észtert, lorakarbef PNB észtert, és lorakarbef nukleusz PNB észtert hidrolizált. A natív PNB észteráz, és a megfelelő, a rekombináns E. coli törzsben termelt PNB-észteráz nagy mennyiségben funkcionálisan és szerkezetileg azonosnak tűnt.

• « *···

-371. táblázat

Az Escherichia coli K12 DH5a™/pNB106R-bol származó PNB-észteráz tisz

Lépés	Feh.	Lorakarbef	β-laktamáz	észteráz/	észteráz Szorzó
	(mg)	nukleuszhoz	aktivitás	β-laktamáz	faji. akt.
		mutatott	(mU)	aktivitás	(mU/mg)
		aktivitás		aránya

(mU) sej t-mentes

extraktum	207.7	39658.7	669.3	59.3	190.9	1
pH 5 kezelés	188.5	41703.2	672.3	62.0	212.2	1.16
ammónium-szulfát
frakcionálás
(45-85 %)	123.5	28200.0	488.5	57.7	228.3	1.2
DE-52	33 . 3	24503.0	3.89	6299	735.8	3.85

p-aminobenzamidin

agaróz	20.57 23813.2	0	1157.6	6.06
Q-Sepharose	10.08 13552.0	0	1344.4	7.04

kiindulási sejttömeg: 5.4 g nedves tömeg szubsztrát: lorakarbef nukleusz PNB észter ··· · • ···

A lorakarbef nukleusz PNB észter hidrolízise részlegesen tisztított PNB-észteráz alkalmazásával

Escherichia coli K12 DH5a™/pNB106R sejtekből részlegesen tisztított PNB-észterázt állítottunk elő (2.5 mg, az enzim fajlagos aktivitása és ciklus-száma (turn-over number) alapján), és N-etil-maleimiddel kezeltük a megmaradó β-laktamáz inaktiválása céljából, majd lorakarbef nukleusz PNB észter (2.2 % w/v) 50 mM Trisz pufferrel, pH 8.0, készült szuszpenziójához adtuk. A reakcióelegyet három órán keresztül 37°C-on tartottuk. A pH 8.0 fenntartása céljából az elegyhez periodikusan nátrium-hidroxid oldatot adtunk. Három óra után a nagy nyomású folyadék kromatográfiás analízis (HPLC) alapján a vegyületben a lorakarbef nukleusz-mentes sav hozama 90 % volt. A további inkubálás nem fokozta a hozamot.

7. példa

A Bacillus subtilisből származó PNB-észteráz izolálása és tisztítása

A. A sejt-mentes extraktum előállítása

Bacillus subtilis NRRL-8079 tenyészetét összegyűjtöttük, és hagyományos eljárással megfagyasztottuk.

A fagyasztott Bacillus subtilis sejteket (760 g) ezután « k • β ·»·· ··» · ··«· kks·,

-39megolvasztottuk, és 2 liter A pufferben (10 mM káliumfoszfát, pH 7.0; 1 mM 2-merkapto-etanol (2-ME); és 0.5 mM EDTA) homogenizáltuk. A sejtmentes extraktumot 24.000g melletti 30 perces centrifugálással kaptuk. Az extraktumhoz 2.0 mg/ml végső koncentrációban protamin-szulfátot adtunk, és az elegyet egy órán keresztül kevertük. A képződött csapadékot centrifugálással távolítottuk el. A következő izolálási eljárás során sejt-mentes extraktumként a felülúszót alkalmaztuk.

B. A nyers PNB-észteráz izolálása

Az extraktumot ammónium-szulfáttal frakcionáltuk. A

45-80 % ammónium-szulfát telítettség mellett képződött csapadékot centrifugálással összegyűjtöttük, és A pufferben feloldottuk, majd ugyanezzel a pufferrel szemben egy éjszakán keresztül dializáltuk. A dializált mintát 1 N ecetsavval pH 5.0 értékre állítottuk be, 10 percig inkubáltuk, majd a csapadék eltávolítása céljából centrifugáltuk. A felülúszó tartalmazta a nyers PNBészterázt.

C. A PNB-észteráz tisztítása

A feülúszó pH értékét 2 N NH4OH alkalmazásával 8.5-re állítottuk be, és a mintát enyhe anionos gyantára vittük fel (DE52 oszlop, 3.7x35 cm; Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ 08854), melyet előzőleg B pufferrel (10 mM Trisz-HCl, pH 8.5; 50 mM NaCl; 1 mM 2-ME; és 0.5 mM EDTA) ekvilibráltunk. Az oszlopot 350 ml B pufferrel mostuk, majd 1.750 ml C * φ • « ·«··

-40pufferrel (10 mM Trisz-HCl, pH 7.0; 50 mM NaCl; 1 mM 2-ME; és 0.5 mM EDTA). A PNB-észterázt 3.500 ml 50-300 mM NaCl gradienssel (C pufferben) eluáltuk. A PNB-észteráz frakciókat pooloztuk, és AMICON PM-10 membránon ultraszűréssel koncentráltuk (Amicon, Danvers, MA 01923). A koncentrált nyers PNB-észteráz oldatot poliszacharid típusú gélen gélszűrést végeztünk (Sephacryl S-200 HR oszlop, 5.0 x 9.5 cm, Pharmacia Inc.), melyet előzőleg D pufferrel (10 mM Trisz-HCl, pH 8.0; 1 mM 2-ME; és 0.5 mM EDTA) ekvilibráltunk. Az enzimaktivitást tartalmazó frakciókat elegyítettük, ultraszűréssel koncentráltuk, és egy éjszakán keresztül B pufferrel szemben dializáltuk. A dializált elegyet anion-cserélő gyantára vittük fel (Q-Sepharose oszlop, 2.6 x 20 cm, Pharmacia Inc.), melyet előzőleg B pufferrel ekvilibráltunk. Az oszlopot 100 ml B pufferrel mostuk, majd 500 ml E pufferrel (10 mM MES-NaOH, pH 6.0; 10 mM NaCl; 1 mM 2-ME; és 0.5 mM EDTA). A PNB-észterázt 1.500 ml 100-300 mM NaCl gradienssel (E pufferben) eluáltuk. A PNB-észterázt tartalmazó frakciókat elegyítettük, ultraszűréssel koncentráltuk, és egy éjszakán keresztül 1 mM 2-ME-t és 0.5 mM EDTA-t tartalmazó 10 mM nátrium-acetáttal, pH 5.0, szemben dializáltuk.

A csapadék centrifugálással történő eltávolítása után az enzim oldatot kálcium-foszfát-cellulóz oszlopra vittük (1.6 x 20), melyet előzőleg 10 mM nátrium-acetátot, pH 5.0, 1 mM 2-ME-t és 0.5 mM EDTA-t tartalmazó pufferrel ekvilibráltunk. A kálcium-foszfát előállítása Jenner eljárása szerint történt, lásd 3.737.516 számú amerikai • · • · · . .· ί ··'. .ű ..:

-41egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Miután az oszlopot ugyanennek a pufférnék 250 ml mennyiségével mostuk, a PNBészterázt 250 ml 10-50 mM kálium-foszfát gradienssel (pH 7.0; mely 1 mM 2-ME-t és 0.5 mM EDTA-t tartalmazott) eluáltuk. A PNB-észterázt tartalmazó frakciókat pooloztuk, ultraszűréssel· koncentráltuk, és egy éjszakán keresztül D pufferrel szemben dializáltuk.

A dializált enzim oldatot p-aminobenzamidin-agaróz oszlopra vittük (1.0 x 20 cm; Pharmacia Inc.), melyet D pufferrel ekvilibráltunk. Miután az oszlopot 50 ml D pufferrel mostuk, a PNB-észterázt 100 ml 0-300 mM NaCl gradienssel (D pufferben) eluáltuk. A megközelítőleg 160-220 mM NaCl D pufferben őszült elegyével eluált PNB-észterázt tartalmazó frakciókat pooloztuk, ultraszűréssel koncentráltuk, és a továbbiakban ezt alkalmaztuk, mint tiszta enzimet.

A fenti tisztítási eljárás minden lépését 0-4°C közötti hőmérsékleten hajtottuk végre. A tisztítás folyamatát az izolálás és a tisztítás egyes lépései során kapott PNBészteráz aktivitás mérésével követtük.

♦ ♦ ··

-422. táblázat

A Bacillus subtilisből származó PNB-észteráz tisztítása

Lépés	Fehérj e	Aktivitás (U)	Faj 1	. aktivitás	Arány
	(mg)			(mU/mg)
		Lóra Cef p-NPA	Lóra	Cef p-NPA	Cef/Lora p-N

Sej t-mentes
extraktum	130000	271	14.8
Ammónium-szülfát (45-80%) 72600	54.0	4.08
pH kezelés (pH 5.0)	29100	54.4	4.53
DE 5 2	3450	181	10.8
Sephacryl S-200	1440	115	11. 3
Q-Sepharose (pH 8.0)	164	122	7.0
Kálcium-főszfátcellulóz 32.	,4 54.8	2.3

18900	2.10	0.114	145	0.054
5320	0.74	0.056	73.5	0.076
5234	1.87	0.155	180	0.083
3710	52.5	3. 13	1080	0.060
4460	79.5	7.87	3170	0.098
3690	742	42.7	22500	0.058
3320	1690	71.0	102000	0.042

• · ····

Lépés	Fehérje	Aktivitás	(U)	Faji	. aktivitás	Arány
	(mg)				(mU/mg)
		Lóra Cef p	-NPA	Lóra	Cef p-NPA Cef/Lora p-N
p-amino~benzamidin-
cellulóz	24.8	33.0 1.46	2580	1330	58.8 104000	0.044
Q-Sepharose
(pH 6.0)	2.67	5.9 0.26	221	2210	97.5 82800	0.044

Az alkalmazott szubsztrátok: Lóra lorakarbef-PNB; Cef cefepmin; pNPA nitrofenil-acetát ····

-44D. A PNB-észteráz aktivitás mérésének eljárása μΜ bisz-tri-propán-HCl-t, pH 6.5, 0.5 μΜ szubsztrátot (lorakarbef PNB észter, vagy cefaklór PNB észter), és megfelelő mennyiségű enzim oldatot tartalmazó reakcióelegy 1 ml-ét inkubáltuk 30°C-on, egy állandó hőmérsékletet tartó rázókészülékben 30 percig. A reakciót azonos térfogatú acetonitril hozzáadásával állítottuk le. Az elegyet ezután a fehérje eltávolítása céljából centrifugáltuk, és a felülúszó oldatban a termék keletkezését és a szubsztrát fogyását nagy nyomású folyadék kromatográfiás analízissel (HPLC) mértük. A HPLC-t C-18 reverz fázisú oszlopon végeztük (Beckman Ultrasphere ODS, Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA 92634), 80 % 1 mM trietil-amin-HCl-t, pH 2.5, és 20 % etanolt tartalmazó A puffer, és metanolt tartalmazó B puffer lineáris gradiensével, 1 ml/perc folyadékráta mellett.

Az alkalmazott HPLC rendszer Varian HPLC rendszer volt, Vista 5560 egységgel (Varian Associates, Sugár Land TX), és model 230-401 autó-sampling injector (Gilson Medical Electronics, Middleton, WI). A PNB-észteráz aktivitás mérése a termék képződés 254 nm-en végzett ellenőrzésével történt.

A p-nitofenil-acetát p-nitrofenil alkohollá és acetáttá történő hidrolízisének abszorpció-változását kihasználva, a PNB észteráz mérésére spektrofotometriás módszert fejlesztettek ki. A mérésben aktivitást mutató enzimfrakciónak nem szükséges PNB észteráz aktivitással rendelkeznie, de a PNB észteráz aktivitást fog mutatni a mérésben. A tisztított PNB-észteráz létrehozása során az fenti mérés eredményei összeegyeztethetők az enzim

-45tisztítása során kapott eredményekkel, amikoris nagy számú mérést hajtottunk végre. A mérést szobahőmérsékleten 1 ml térfogatban hajtottuk végre, amely 100 pM Tris-HCl-t (pH 7.0), 1.6 pM p-nitrofenil-acetátot és 1-20 pl enzim oldatot tartalmazott. Az aktivitást a 405 nm-en mért abszorpció változással követtük egy Cary 219 vagy egy Beckman DU-50 spektrofotométerrel.

Az alábbi SZEKVENCIA LISTA a jelen találmányban szereplő vegyületek DNS és aminósav szekvenciáját tartalmazza. Ezekre a szekvenciákra a specifikációban és az igénypontokban SEQ. ID. NO.-val hivatkozunk. A megfelelő szakmai képzettséggel rendelkező szakemberek számára felismerhető, hogy a DNS szekvenciák az 5'-tői a 3' irányba, és az aminósav szekvenciák az amino-végtől a karboxil-végig vannak listázva. Az aminósav csoportok a következőképpen vannak elnevezve: Alá az alanin-, Arg az arginin-, Asn az aszparagin-csoport, Asp az aszparaginsav-csoport, Cys a cisztein-csoport, Gin a glutamin-csoport, Glu a glutaminsav-csoport, Gly a glicin-csoport, His a hisztidincsoport, Ile az izoleucin-csoport, Leu a leucin-csoport, Lys a lizin-csoport, Met a metionin-csoport, Phe a fenilalanin-csoport, Pro a prolin-csoport, Ser a szerincsoport, Thr a treonin-csoport, Trp a triptofán-csoport, Tyr a tirozin-csoport, és Val a valin-csoport. A DNS szekvenciákban A a deoxiadenil-, G a deoxiguanil-, C a deoxicitidil-, és T a timidil-csoport.

-46SZEKVENCIA JEGYZÉK (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓK:

(i) FELTALÁLÓK: Cantwell és társai (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: BACILLUS EREDETŰ PARA-NITRO-

BENZIL-ÉSZTERÁZ AKTIVITÁST KÓDOLÓ REKOMBINÁNS DNS VEGYÜLETEK ÉS KIFEJEZŐ VEKTOROK (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 7 (iv) PONTOS CÍM:

(A) CÍM: Éli Lilly and Company (B) UTCA: Lilly Corporate Center (C) VÁROS: Indianapolis (D) ÁLLAM: Indiana (E) ORSZÁG: Amerikai Egyesült Államok (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 46285 (v) A SZÁMÍTÓGÉP ÁLTAL OLVASHATÓ FORMÁTUM:

(A) ÁTVITEL TÍPUSA: Floppy disk, 3.5 inch, 1.0Mb (B) KOMPUTER: Macintos (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: MacintOS

(D) SOFTWARE: Microsoft Word (vi) A JELEN TALÁLMÁNY ADATAI:

(A) SZABADALOM SZÁM:

(B) BEJEGYZÉS IDŐPONTJA:

(2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:1-ROL:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:

(A) HOSSZÚSÁG: 1470 nukleotid (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL TÍPUSA: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:1:

ATG

ACT

CAT

CAA

ATA

GTA

ACG

ACT

CAA

TAC

GGC

AAA

GTA

AAA

42

GGC

ACA

ACG

GAA

AAC

GGC

GTA

CAT

AAG

TGG

AAA

GGC

ATC

CCC

84

TAT

GCC

AAG

CCG

CCT

GTC

GGA

CAA

TGG

CGT

TTT

AAA

GCA

CCT

126

GAG

CCG

CCT

GAA

GTG

TGG

GAA

GAT

GTC

CTT

GAT

GCC

ACA

GCG

168

TAC

GGT

CCT

ATT

TGC

CCG

CAG

CCG

TCT

GAT

TTG

CTC

TCA

CTG

210

TCG

TAT

ACA

GAG

CTG

CCC

CGC

CAG

TCC

GAG

GAT

TGC

TTG

TAT

252

GTC

AAT

GTA

TTT

GCG

CCT

GAC

ACT

CCA

AGT

CAA

AAT

CTT

CCT

294

GTC

ATG

GTG

TGG

ATT

CAC

GGA

GGC

GCT

TTT

TAT

CTT

GGA

GCG

336

GGC

AGT

GAG

CCA

TTG

TAT

GAC

GGA

TCA

AAA

CTT

GCG

GCA

CAG

378

GGA

GAA

GTC

ATT

GTC

GTT

ACA

TTG

AAC

TAT

CGG

CTG

GGG

CCG

420

TTT

GGC

TTT

TTG

CAC

TTG

TCT

TCG

TTT

GAT

GAG

GCG

TAT

TCC

462

GAT

AAC

CTT

GGG

CTT

TTA

GAC

CAA

GCC

GCC

GCG

CTG

AAA

TGG

504

GTG

CGG

GAG

AAT

ATC

TCA

GCG

TTT

GGC

GGT

GAT

CCC

GAT

AAC

546

GTA

ACA

GTA

TTT

GGA

GAA

TCC

GCC

GGC

GGC

ATG

AGC

ATT

GCC

588

GCG

CTG

CTC

GCT

ATG

CCT

GCG

GCA

AAA

GGC

CTG

TTC

CAG

AAA

630

GCG

ATC

ATG

GAA

AGC

GGC

GCT

TCC

CGA

ACA

ATG

ACA

AAA

GAA

672

CAA

GCG

GCA

AGC

ACT

GCG

GCT

GCC

TTT

TTA

CAG

GTC

CTT

GGG

714

ATT

AAT

GAG

AGC

CAG

CTG

GAC

AGA

TTG

CAT

ACT

GTA

GCA

GCG

756

GAA

GAT

TTG

CTT

AAA

GCG

GCC

GAT

CAG

CTT

CGG

ATT

GCA

GAA

798

AAA

GAA

AAT

ATC

TTT

CAG

CTG

TTC

TTC

CAG

CCC

GCC

CTT

GAT

840

CCG

AAA

ACG

CTG

CCT

GAA

tGAA-

CCA

GAA

AAA

TCG

ATC

GCA

GAA

882

GGG

GCT

GCT

TCC

GGC

ATT

CCG

CTA

TTG

ATT

GGA

ACA

ACC

CGT

924

GAT

GAA

GGA

TAT

TTA

TTT

TTC

ACC

CCG

GAT

TCA

GAC

GTT

CAT

966

TCT

CAG

GAA

ACG

CTT

GAT

GCA

GCA

CTC

GAG

TAT

TTA

CTA

GGG

1008

AAG

CCG

CTG

GCA

GAG

AAA

GCT

GCC

GAT

TTG

TAT

CCG

CGT

TCT

1050

CTG

GAA

AGC

CAA

ATT

CAT

ATG

ATG

ACT

GAT

TTA

TTA

TTT

TGG

1092

CGC

CCT

GCC

GTC

GCC

TAT

GCA

TCC

GCA

CAG

TCT

CAT

TAC

GCC

1134

CCT

GTC

TGG

ATG

TAC

CGG

TTC

GAT

TGG

CAC

CCG

GAG

AAG

CCG

1176

CCG

TAC

AAT

AAA

GCG

TTT

CAC

GCA

TTA

GAG

CTT

CCT

TTT

GTC

1218

TTT

GGA

AAT

CTG

GAC

GGA

TTG

GAA

CGA

ATG

GCA

AAA

GCG

GAG

1260

ATT

ACG

GAT

GAG

GTG

AAA

CAG

CTT

TCT

CAC

ACG

ATA

CAA

TCC

1302

GCG

TGG

ATC

ACG

TTC

GCT

AAA

ACA

GGA

AAC

CCA

AGC

ACC

GAA

1344

GCT

GTG

AAT

TGG

CCG

GCG

TAT

CAT

GAA

GAA

ACG

AGA

GAG

ACG

1386

GTG

ATT

TTA

GAC

TCA

GAG

ATT

ACG

ATC

GAA

AAC

GAT

CCC

GAA

1428

TCT

GAA

AAA

AGG

CAG

AAG

CTA

TTC

CCT

TCA

AAA

GGA

GAA

TAA

1470

-49(2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:2-ROL:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:

(A) HOSSZÚSÁG: 489 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO: 2:

Met

Thr

His

Gin

Ile

Val

Thr

Thr

Gin

Tyr

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

1

5

10

15

Thr

Thr

Glu

Asn

Gly

Val

His

Lys

Trp

Lys

Gly

Ile

Pro

Tyr

Alá

20

25

30

Lys

Pro

Pro

Val

Gly

Gin

Trp

Arg

Phe

Lys

Alá

Pro

Glu

Pro

Pro

35

40

45

Glu

Val

Trp

Glu

Asp

Val

Leu

Asp

Alá

Thr

Alá

Tyr

Gly

Pro

Ile

50

55

60

Cys

Pro

Gin

Pro

Ser

Asp

Leu

Leu

Ser

Leu

Ser

Tyr

Thr

Glu

Leu

65

70

75

Pro

Arg

Gin

Ser

Glu

Asp

Cys

Leu

Tyr

Val

Asn

Val

Phe

Alá

Pro

80

85

90

Asp

Thr

Pro

Ser

Gin

Asn

Leu

Pro

Val

Met

Val

Trp

Ile

His

Gly

95

100

105

Gly

Alá

Phe

Tyr

Leu

Gly

Alá

Gly

Ser

Glu

Pro

Leu

Tyr

Asp

Gly

110

115

120

Ser

Lys

Leu

Alá

Alá

Gin

Gly

Glu

Val

Ile

Val

Val

Thr

Leu

Asn

125

130

135

Tyr

Arg

Leu

Gly

Pro

Phe

Gly

Phe

Leu

His

Leu

Ser

Ser

Phe

Asp

140

145

150

Glu

Alá

Tyr

Ser

Asp

Asn

Leu

Gly

Leu

Leu

Asp

Gin

Alá

Alá

Alá

155

160

165

Leu

Lys

Trp

Val

Arg

Glu

Asn

Ile

Ser

Alá

Phe

Gly

Gly

Asp

Pro

170

17 5

180

Asp

Asn

Val

Thr

Val

Phe

Gly

Glu

Ser

Alá

Gly

Gly

Met

Ser

Ile

185

190

195

Alá

Alá

Leu

Leu

Alá

Met

Pro

Alá

Alá

Lys

Gly

Leu

Phe

Gin

Lys

200

205

210

Alá

Ile

Met

Glu

Ser

Gly

Alá

Ser

Arg

Thr

Met

Thr

Lys

Glu

Gin

215

220

225

Alá

Alá

Ser

Thr

Alá

Alá

Alá

Phe

Leu

Gin

Val

Leu

Gly

Ile

Asn

230

235

240

Glu

Ser

Gin

Leu

Asp

Arg

Leu

His

Thr

Val

Alá

Alá

Glu

Asp

Leu

245

250

255

Leu

Lys

Alá

Alá

Asp

Gin

Leu

Arg

Ile

Alá

Glu

Lys

Glu

Asn

Ile

260

265

270

Phe

Gin

Leu

Phe

Phe

Gin

Pro

Alá

Leu

Asp

Pro

Lys

Thr

Leu

Pro

275

280

285

Glu

Glu

Pro

Glu

Lys

Ser

Ile

Alá

Glu

Gly

Alá

Alá

Ser

Gly

Ile

290

295

300

Pro

Leu

Leu

Ile

Gly

Thr

Thr

Arg

Asp

Glu

Gly

Tyr

Leu

Phe

Phe

305

310

315

Thr

Pro

Asp

Ser

Asp

Val

His

Ser

Gin

Glu

Thr

Leu

Asp

Alá

Alá

320

325

330

Leu

Glu

Tyr

Leu

Leu

Gly

Lys

Pro

Leu

Alá

Glu

Lys

Alá

Alá

Asp

335

340

345

Leu

Tyr

Pro

Arg

Ser

Leu

Glu

Ser

Gin

Ile

His

Met

Met

Thr

Asp

350

355

360

Leu

Leu

Phe

Trp

Arg

Pro

Alá

Val

Alá

Tyr

Alá

Ser

Alá

Gin

Ser

365

370

375

His

Tyr

Alá

Pro

Val

Trp

Met

Tyr

Arg

Phe

Asp

Trp

His

Pro

Glu

380

385

390

Lys

Pro

Pro

Tyr

Asn

Lys

Alá

Phe

His

Alá

Leu

Glu

Leu

Pro

Phe

395

400

405

Val

Phe

Gly

Asn

Leu

Asp

Gly

Leu

Glu

Arg

Met

Alá

Lys

Alá

Glu

410

415

420

Ile

Thr

Asp

Glu

Val

Lys

Gin

Leu

Ser

His

Thr

Ile

Gin

Ser

Alá

425

430

435

Trp

Ile

Thr

Phe

Alá

Lys

Thr

Gly

Asn

Pro

Ser

Thr

Glu

Alá

Val

440

445

450

-51Leu

465

Arg

480

Asn

Trp

Pro

Alá Tyr 455

His

Glu

Glu

Thr

Arg Glu 460

Thr Val

Asp

Ser

Glu

Ile

Thr

Ile

Glu

Asn

Asp

Pro

Glu

Ser

Glu

470

475

Gin

Lys

Leu

Phe

Pro

Ser

Lys

Gly

Glu

485

489

Ile

Lys (2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:3-RÓL:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:

(A) HOSSZÚSÁG: 22 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris , (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:3:

Met Thr His Gin Ile Val Thr Thr Tyr Gly Lys Lys Val Lys Gly 5 10 15

Thr Gin Glu Asn Gly Val His • ·

-52(2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:4-ROL:

(í) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:

(A) HOSSZÚSÁG: 41 nukleotid (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:4:

ATGACACATC AAATTGTCAC AACATATGGC AAAAAAGTCA A 41 (2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:5-ROL:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:

(A) HOSSZÚSÁG: 41 nukleotid (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS

-53• · «« ·« ·· ··· · · * ·* • 4 · · · 4 · · 4 · · » «·· 4 444* ···· 44 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:5:

TATGGCAAAA AAGTCAAAGG CACACAAGAA AATGGCGTCC A 41 (2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:6~RÓL:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:

(A) HOSSZÚSÁG: 34 nukleotid (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:6:

AAAAAGGGAG AGAACCATAT GACTCATCAA ATAG 34 (2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:7-ROL:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:

(A) HOSSZÚSÁG: 20 nukleotid (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

-54(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:7;

Claims (13)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. A Bacillus subtilis PNB-észteráz aktivitását kódoló DNS szekvenciát tartalmazó izolált DNS vegyület.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti izolált DNS vegyület, azzal jellemezve, hogy az a fenti SEQ. ID. NO: 2-nek megfelelő fehérjét kódolja.
3. 3. A 2. igénypont szerint izolált DNS vegyület, azzal jellemezve, hogy a kódoló szál a fenti SEQ. ID. NO: 1-et tartalmazza.
4. 4. Rekombináns DNS vektor, azzal jellemezve, hogy az az 1.-3. igénypont valamelyikének megfelelő DNS szekvenciát tartalmazza.
5. 5. A 4. igénypont szerinti rekombináns DNS vektor, azzal jellemezve, hogy az továbbá az említett PNB-észteráz aktivitást kódoló DNS expressziója irányításához megfelelő irányban elhelyezkedő promotert tartalmaz.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti rekombináns DNS vektor, azzal jellemezve, hogy az említett promoter az Escherichia coliban működik.
7. 7. A 4.-6. igénypontok valamelyikének megfelelő rekombináns DNS vektorral transzformált gazdasejt.
8. 8. Egy Escherichia coli sejt a 4.-6. igénypontok valamelyikének megfelelő rekombináns DNS vektorral transzformálva.
9. 9. Eljárás rekombináns gazdasejt létrehozására, azzal jellemezve, hogy az képes PNB-észteráz aktivitás kifejezésére, és az eljárás az alábbiakból áll:

   az említett gazdasejtet olyan rekombináns DNS kifejezési vektorral transzformáljuk, mely (a) az említett gazdasejtben működő promotert és transzlációs aktiváló szekvenciát tartalmaz, (b) Bacillus subtilis PNB-észteráz aktivitást kódoló DNS szekvenciát tartalmaz, mely az említett promoter és transzlációs aktiváló szekvencia kifejezéséhez megfeleő irányban helyezkedik el.
10. 10. Eljárás PNB-észteráz aktivitás kifejezésére, azzal jellemezve, hogy az rekombináns DNS kifejezési vektorral transzformált gazdasejt tenyésztéséből áll, amely:

    (a) az említett gazdasejtben működő promotert és transzlációs aktiváló szekvenciát tartalmaz, (b) Bacillus subtilis PNB-észteráz aktivitást kódoló DNS szekvenciát tartalmaz, mely az említett promoter és transzlációs aktiváló szekvencia kifejezéséhez megfeleő • · irányban helyezkedik el, a gén kifejezése céljára megfelelő körülmények között.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett rekombináns DNS kifejezési vektor a 2. vagy a 3. igénypontok valamelyikének megfelelő DNS szekvenciát tartalmazza.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gazdasejt Escherichia coli.
13. 13. Folyamat a p-nitrobenzil-csoport eltávolítására a cefalosporin-PNB-észterből vagy az 1-karbacefalosporin-PNBészterből, azzal jellemezve, hogy az az említett észtének a 10., 11., vagy 12. igénypont szerint előállított PNBészterázzal történő reagáltatásából áll.