DE69219448T2

DE69219448T2 - Rekombinante DNS und Expressionsvektoren die für Para-nitrobenzyl-Esterase Aktivität aus Bacillus kodieren

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Publication number: DE69219448T2
Application number: DE69219448T
Authority: DE
Inventors: Cathleen Alice Cantwell; Roland Lamar Hodges; Derek Mcgilvray; Stephen Wyatt Queener; James Richard Swartling; Joseph Martin Zock
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1991-12-20
Filing date: 1992-12-17
Publication date: 1997-09-04
Anticipated expiration: 2012-12-18
Also published as: MX9207379A; HU9204037D0; EP0551750A2; JPH05276958A; EP0551750A3; KR930013111A; CA2085806A1; DE69219448D1; HUT69769A; BR9205055A; IL104139A0; TW242161B; ATE152482T1; ES2101052T3; EP0551750B1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNA Technologie. Insbesondere betrifft sie DNA Verbindungen, die das Enzym para-Nitrobenzylesterase (PNB-Esterase) der Gattung Bacillus kodieren. Ester sind herkömmlich verwendete Zwischenprodukte bei der Synthese von Cephalosporin- und 1-Carbacephalosporinantibiotika in Form der freien Säure. Die Herstellung von Cephalosporinen wird ausführlich beschrieben von Chauvette, US-A 4 064 343. Die Herstellung der 1-Carbacephalosporine wird ausführlich beschrieben von Christensen et al., US-A 4 226 866, Munroe in US-A 4 791 106 und Hirata et al., US-A 4 708 956.
Die PNB-Esterfunktion wird im allgemeinen zur Blockierung oder zum Schutz der sauren Carboxylsäurefunktion des Moleküls verwendet, während an anderen Stellen des Moleküls Reaktionen durchgeführt werden. Beispielsweise beschreibt Garbecht US-A 3 632 850 die Verwendung der p-Nitrobenzylestergruppe bei der Synthese von Cephalexin. Im ersten Schritt der Synthese wird dieser Ester mittels Hydrolyse unter sauren Bedingungen gespalten. In US-A 3 781 282 beschreibt Garbrecht die Spaltung des Esters von p-Nitrobenzylestern der Cephalosporine mit Zink und Säure in einem Lösemitel vom Amidtyp, wie Dimethylformamid. Jackson beschreibt in US-A 3 799 924 die Entfernung der para-Nitrobenzylestergruppe von Cephalosporinestern durch die Behandlung mit Natrium- oder Kaliumdithionit bei einem pH über etwa 7. Hatfield beschreibt in US-A 4 091 214 ein Verfahren zur Spaltung der Ester von Cephalosporinverbindungen, das gekennzeichnet ist durch eine reduktive Spaltung mittels eines inerten Lösemittels mit Zink und einer α-Hydroxycalbonsäure. Hirata et al beschreiben in US-A 4 708 956 Verfahren zur Entfernung der para-Nitrobenzylschutzgruppen von 1-Carbacephalosporinverbindungen. Diese Verfahren sind mit hohen Kosten zur Lösemittelwiederverwertung und dem potentiellen Problem der durch die organischen Lösemittel verursachten Umweltverschmutzung verbunden.
Ein enzymatisches Verfahren zur Entfernung von PNB Schutzgruppen, die bei der Synthese von Cephalosporin- und 1-Carbacephalosporinantibiotika verwendet werden, hätte bestimmte Vorteile. Eine solche Reaktion, die bei milden Bedingungen abläuft, könnte in einem wäßrigen Reaktionsgemisch ohne Verwendung von organischen Lösemitteln und Metallkatalysatoren durchgeführt werden. Brannon beschreibt in US-A 3 972 774 ein Verfahren zur Entfernung des PNB-Esters von Cephalosporinestern, das gekennzeichnet ist durch die Umsetzung des Esters mit einer Rohpräparation, die von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus stammt. Jedoch wurde das für diese Spaltung verantwortliche Enzym nicht isoliert.
Bis jetzt war eine Verwendung des isolierten PNB Esteraseenzyms, das aus Bacillus isoliert wurde, aufgrund der niedrigen Enzymmenge, die von Bacillus subtilis gebildet wird, in einem Verfähren mit industriellem Maßstab nicht möglich. Die vorliegende Erfindung hebt diese Beschränkung durch die Bereitstellung von rekombinanten DNA Verbindungen und Vektoren auf, die für eine para-Nitrobenzylesterase von Bacillus subtilis kodieren. Die hierin bereitgestellte neu isolierte DNA Sequenz kann zur Herstellung der PNB Esteraseaktivität in großen Mengen in rekombinanten Wirtszellen verwendet werden. Die PNB Esterase ist zur Entfernung der PNB Esterschutzgruppen brauchbar, die bei der Herstellung von Cephalosporin- und 1-Carbacephalosporinantibiotika verwendet werden.
Die Erfindung liefert auch ein enzymatisches Abspaltverfahren zur Entfernung der p-Nitrobenzylgruppe von Cephalosporinestern oder 1-Carbacephalosporinestern unter Bildung der entsprechenden Cephalosporansäure oder 1-Carbacephalosporansäure. Das Verfahren ist gekennzeichnet durch die Umsetzung eines Cephalosporinesters oder eines 1-Carbacephalosporinesters vorzugsweise in einem wäßrigen Medium bei 25ºC bis 40ºC, wobei die PNB Esterase durch rekombinante Mittel hergestellt wird, und die Gewinnung der entstehenden Cephalosporansäure oder 1-Carbacephalosporansäure. Das Verfahren hat einen besonderen Wert bei der Herstellung von Cefaclor und Loracarbef, wenn die 4-Carbonsäuregruppe dieser Antibiotika während der Synthese durch eine para- Nitrobenzylgruppe geschützt ist.
Die freie Säure des Loracarbefkerns ist ein Substrat für die Penicillin G Amidase in einer Reaktion, in der ein Phenylglycinmethylester mit dieser Verbindung unter Bildung von Loracarbef und Methanol umgesetzt wird. Ähnlich katalysiert die Penicillin G Amidase die Umwandlung des Phenylglycinmethylesters und die freie Säure des Cefaclorkerns oder der freien Säure des Cephalexinkerns zu Methanol und Cefaclor oder Cephalexin.
Wirts-Vektorsysteme, die in der Erfindung beschrieben sind, bilden die PNB Esterase sehr effizient, so daß die PNB-Esterase etwa 10 bis 20 % des löslichen Proteins in den rekombinanten Escherichia coli Stämmen ausmachen kann. Diese Genexpressionsstärke ist für die aktive PNB Esterase etwa 190 fäch größer als in Bacillus subtilis NRRL B8079, was durch die Entfernung der Schutzgruppe vom chemischen Zwischenprodukt Loracarbef- PNB gemessen wird. Darüberhinaus kann das Enzym aufgrund der großen Mengen, die gebildet werden, mittels eines Verfahrens gereinigt werden, das beträchtlich einfacher und billiger ist, als die erforderliche Reinigung aus dem Bacillus subtilis Stamm NRRL B8079.
Die erfindungsgemäßen DNA Verbindungen kodieren für die PNB Esteraseaktivität in einem einzigen offenen Leserahmen (ORF). Die Transkription dieses offenen Leserahmens führt gefolgt von der Translation der entstehenden mRNA zu einer einzelnen Polypeptidkette, die die PNB Esteraseaktivität aufeist. Die DNA Verbindung, die für die PNB Esteraseaktivität kodiert, wurde aus der genomischen DNA von Bacillus subtilis isoliert und zur Konstruktion der rekombinanten DNA Expressionsvektoren verwendet. Die für die PNB Esterase kodierenden erfindungsgemäßen DNA Verbindungen können zur Konstruktion einer großen Vielzahl an Expressionsvektoren verwendet werden, die zur Herstellung der PNB Esterase brauchbar sind.
Die Erfindung umfaßt DNA Verbindungen, die eine für PNB Esteraseaktivität kodierende DNA Sequenz von Bacillus subtilis enthalten. Ebenfalls werden rekombinante DNA Vektoren und rekombinante Wirtszellen bereitgestellt, die diese rekombinanten DNA Vektoren enthalten, wie Escherichia coli. Bestimmte Vektoren, die durch diese Erfindung bereitgestellt werden, sind die Plasmide pNB106R und pNB106RM. Diese Vektoren sind in einem Verfahren zur Konstruktion einer rekombinanten Wirtszelle brauchbar, die zur Expression der PNB Esteraseaktivität fähig ist, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch:
Transformation dieser Wirtszelle mit einem rekombinanten DNA Expressionsvektor, der umfaßt:
(a) einen Promotor und eine Translationsaktivierungssequenz, die in dieser Wirtszelle funktionsfahig sind, und
(b) eine DNA Sequenz, die die PNB Esteraseaktivität von Bacillus subtilis zur Expression von diesem Promotor und dieser Translationsaktivierungssequenz positioniert enthält.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren umfaßt ein Verfahren zur Verwendung einer Wirtszelle, die durch das obige Verfahren konstruiert wurde, zur Expression der PNB Esteraseaktivität, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch: Kultivierung dieser Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Genexpression geeignet sind.
Zum Zweck der Erfindung, wie sie hierin beschrieben und beansprucht wird, werden die folgenden Ausdrücke definiert.
Amp - das Ampicillinresistenz-verleihende Gen, wird ebenfalls zur Bezeichnung des Ampicillinresistenten Phänotyps verwendet.
cI857 - ein Gen, das einen Temperatur-empfindlichen Repressor des Bakteriophagen λpL Promotors kodiert.
Klonieren - das Verfahren des Einbaus eines DNA Segments in einen rekombinanten DNA Klonierungsvektor.
Kodierende Sequenz - die DNA Sequenz in einem Gen, die für die Aminosäuresequenz des durch das Gen exprimierten Proteins kodiert.
Gen - ein DNA Segment, das einen Promotor, eine Translationsaktivierungssequenz, eine kodierende Sequenz und 3'-regulatorische Sequenzen enthält, die zur Expressionssteuerung des Genprodukts positioniert sind.
Genbank - ein Satz von rekombinanten DNA Klonierungsvektoren, in die DNA Segmente kloniert wurden, die im wesentlichen das gesamte Genom eines bestimmten Organismus darstellen.
Hybridisierung - das Verfahren zur Anelierung von zwei einzelsträngigen DNA und/oder RNA Molekülen unter Bildung eines doppelsträngigen Moleküls, das vollständig oder nicht vollständig basengepaart sein kann.
Loracarbef - (7B)-7-< D-(Aminophenylacetyl)amino> -3-chlor-8-oxo-1-azibicyclo< 4,2,0> oct-2-en-2- carbonsäure.
Locarbefkern - trans-7-Amino-3-chlor-8-oxo-1-azabicyclo< 4,2,0> oct-2-en-2-carbonsäuremonohydrochlorid.
Locarbef PNB Ester- 7-[(Aminophenylacetyl)amino]-3-chlor-8-oxo-1-azabicyclo< 4,2,0> oct-2-en-2-carbonsäure(4-nitrophenyl)methylester.
mRNA - Botenribonukleinsäure.
ORI - ein Replikationsursprung für ein Plasmid oder einen Vektor, die DNA Sequenz, die als Anheftungsstelle oder Startstelle für die DNA Polymerase dient.
pL - der linksseitige Promotor des Bakteriophagen Lambda.
pnbA - das Gen, das für die PNB Esteraseaktivität kodiert.
Promotor - eine DNA Sequenz, die die Transkription steuert oder initiiert.
Rekombinanter DNA Klonierungsvektor - jedes autonom replizierende oder integrierende Agens, einschließlich aber nicht beschränkt auf Plasmide, das ein DNA Molekül enthält, zu dem ein oder mehrere zusätzliche DNA Moleküle hinzugefügt werden können.
Rekombinanter DNA Expressionsvektor - jedes autonom replizierende oder integrierende Agens, einschließlich aber nicht beschränkt auf Plasmide, das einen Promotor und andere Regulationssequenzen enthält, die zur Expressionssteuerung eines DNA Segments positioniert sind, das ein Polypeptid oder eine RNA kodiert.
Rekombinante DNA Sequenz - jede DNA Sequenz ausschließlich des Wirtschromosoms, von dem die DNA Sequenz stammt, die eine DNA Sequenz umfaßt, welche isoliert, synthetisiert oder teilweise synthetisiert wurde.
Restriktionsfragment - jedes lineare DNA Molekül, das durch die Wirkung von einem oder mehreren Enzymen erzeugt wurde.
rop - DNA Region, die für ein von Escherichia coli stammendes Element zur Plasmidkopienkontrolle kodiert.
TetR- das Tetracyclinresistenz-verleihende Gen, ebenfalls zur Bezeichnung des Tetracyclin-resistenten Phänotyps verwendet.
Transkriptionsaktivierungssequenz - ein Promotor
Transkriptionsterminator - eine DNA Sequenz, die die Termination der Transkription von DNA durch RNA Polymerase anzeigt.
Transformand - eine Empfängerwirtszelle, die einer Transformation unterzogen wurde.
Transformation - die Einführung von DNA in eine Empfängerwirtszelle, die den Genotyp der Empfängerzelle verändert.
Translationsaktivierungssequenz - eine regulatorische DNA Sequenz, die bei einer Transkription in mRNA die Translation der mRNA in Protein fördert.
Die Restriktions- und Funktionskarten, die in den Zeichnungen gezeigt sind, sind ungefähre Darstellungen der hierin diskutierten rekombinanten DNA Vektoren. Die Information über die Restriktionsschnittstellen ist nicht erschöpfend, es können mehrere Restriktionsschnittstellen eines gegebenen Typs vorhanden sein, als tatsächlich auf der Karte gezeigt sind.
Die Figur 1 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pNBE1.
Die Figur 2 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pNB106R.
Die Figur 3 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pNB106RM.
Die vorliegende Erfindung umfaßt isolierte DNA Verbindungen und rekombinante DNA Klonierungs- und Expressionsvektoren, die für die PNB Esterase von Bacillus subtilis kodieren. Die Sequenz der für die B. subtilis PNB Esterase kodierenden DNA wird als SEQ ID Nr: 1 bezeichnet. Die SEQ ID Nr: 1 wie auch alle anderen SEQ ID Nummern sind in der Sequenzliste gezeigt.
Die Aminosäuresequenz der PNB Esterase, die durch die SEQ ID Nr: 1 kodiert wird, wird als SEQ ID Nr: 2 bezeichnet.
Die SEQ ID Nr: 1 kann herkömmlich durch das modifizierte Triesterverfahren mittels voll geschützter Desoxyribonukleotidbausteine synthetisiert werden. Solche synthetischen Verfahren sind in der Technik gut bekannt und können im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Itakura et al., 1977, Science 918:1056 und Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75: 5765 ausgeführt werden. Zusätzlich wird ein besonders bevorzugtes Verfahren beschrieben von Hsiung et al., 1983, Nucleic Acids Research 11: 3227 und Narang et al., 1980, Methods in Enzymology 68: 90. Zusätzlich zu den oben erwähnten Verfahren kann die SEQ ID Nr: 1 mittels automatisierter DNA Synthesegeräte synthetisiert werden, wie dem ABS DNA Synthesegerät (Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404). Die SEQ ID Nr: 1 kann auch durch die Polymerasekettenreaktion erzeugt werden. Siehe beispielswiese US-A 4 800 159 und 4 683 202 und EP-A 0 258 017 vom 2. März 1987.
Die SEQ ID Nr: 2 kann von einer Vielzahl an unterschiedlichen DNA Sequenzen kodiert werden, da die meisten Aminosäurereste von mehr als einem DNA Triplett kodiert werden. Da diese alternativen DNA Sequenzen dieselbe erfindungsgemäße Aminosäuresequenz kodieren wurden, umfaßt die vorliegende Erfindung diese alternativen Sequenzen.
Der Fachmann erkennt, daß es einem die vorliegende Erfindung erlaubt, die Codons für das PNB Esterasegen nach Belieben zu verändern. Mit der gegebenen DNA Sequenz für das PNB Esterasegen werden in der Technik bekannte Verfahren verwendet, um mutierte PNB Esteraseenzyme herzustellen, die sich vom natürlichen Enzym an jeder Position der Aminosäurereste unterscheiden. Solche mutierten Enzyme wurden durch die mutierten für PNB Esterase kodierenden Sequenzen kodiert werden, einschließlich Sequenzen, in denen Aminosäurecodons bezüglich der natürlichen für PNB Esterase kodierenden Sequenz deletiert oder inseriert wurden. Solche mutierten Enzyme liegen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung, da man sogar bei absolut unmöglicher Vorhersage, ob eine gegebene Mutation die Aktivität der kodierten PNB Esterase zerstören wird, nur die mutierte Sequenz durch hierin bereitgestellte Verfahren exprimieren muß, um die Wirkung auf die PNB Esteraseaktivitat zu überprufen.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die hierin beispielhaft dargestellten bestimmten Vektoren beschränkt. Statt dessen umfaßt die vorliegende Erfindung DNA Verbindungen, die die PNB Esteraseaktivität von Bacillus subtilis kodieren. Die erfindungsgemäßen DNA Verbindungen können zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die die Expression der Esteraseaktivität in jeder Wirtszelle steuern, in der der Expressionsvektor repliziert oder integriert und in der der Promotor und die Translationsaktivierungssequenz funktionsfähig sind.
Daher umfaßt die vorliegende Erfindung jedes Escherichia coli Plasmid oder jeden anderen Vektor, der die Expression der PNB Esteraseaktivität in E. coli steuert. Die vorliegende Erfindung umfaßt Vektoren, die die Expression der PNB Esteraseaktivität steuern und die ein in E. coli fünktionsfähiges Replikon verwenden wie beispielsweise ein Replikon von Plasmiden, wie pBR322, pACYC184, F, ColV-K94, R1, R6-5 oder R100. Die Erfindung ist nicht allein auf Plasmidvektoren beschränkt, sondern umfaßt ebenfalls andere Vektoren, die die PNB Esteraseaktivität exprimieren und Integration oder virale Replikation zur Gewährleistung der Replikation und des Erhalts in der Wirtszelle verwenden.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf einen bestimmten Promotor oder eine bestimmte Translationsaktivierungssequenz beschränkt, die die Expression der für PNB Esteraseaktivität kodierenden DNA steuern. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung jedes Promotors und jeder Translationsaktivierungssequenz, die in E. coli funktionsfähig sind und zur Expression der PNB Esteraseaktivität in E. coli verwendet werden. Es sind viele Promotoren und Translationsaktivierungssequenzen bekannt, die in E. coli funktionsfahig sind und zur Expressionssteuerung der Esteraseaktivität in E. coli geeignet sind. Solche Transkriptions- und Translationsaktivierungssequenzen sind unter anderem der lpp, lac, trp, tac, λpL und λpR Promotor und Translationsaktivierungssequenzen.
Zusätzlich können Transkriptions- und Translationsaktivierungssequenzen von anderen Organismen mit den vorliegenden für PNB Esteraseaktivität kodierenden DNA Verbindungen unter Bildung von Expressionsvektoren ligiert werden, die die Expression der PNB Esteraseaktivität in Wirtszellen steuern, in denen die Aktivierungssequenz funktionsfähig ist. Obwohl Escherichia coli der am besten geeignete Wirt für die PNB Esterasebildung und die anschließende Reinigung für die in vivo Verwendung ist, sind Vektoren, die die Expression der PNB Esteraseaktivität in anderen Wirtszellen als E. coli steuern, ebenfalls brauchbar.
Ein Vektor, der die intrazelluläre Konzentration der PNB Esteraseaktivität einer gegebenen Wirtszelle erhöht, in die der Vektor transformiert wurde, benötigt die folgenden Elemente: 1) Eine für PNB Esteraseaktivität kodierende DNA Verbindung der vorliegenden Erfindung und 2) einen Promotor und eine Translationsaktivierungssequenz, die nicht nur in der zu transformierenden Wirtszelle funktionieren, sondern in der korrekten Orientierung und Position zur Steuerung der Expression der für PNB Esteraseaktivität kodierenden DNA positioniert sind. Natürlich können stabile Transformanden nur erhalten werden, wenn der Vektor entweder als extrachromosomales Element oder in die genomische DNA integriert, in der Wirtszelle repliziert. Daher enthält ein bevorzugter Vektor Sequenzen, die spezifisch die Replikation oder Integration des Vektors in der Wirtszelle steuern. Jedoch ist das Vorkommen solcher spezifischer Replikations- oder Integrationssequenzen nicht absolut erforderlich, da eine nicht-spezifische Integration auftreten kann, wenn die DNA in die Wirtszelle eingeführt wird. Ein PNB Esteraseexpressionsvektor könnte auch ein Antibiotikumresistenz-verleihendes Gen oder ein anderes Element enthalten, das ein Mittel zur Selektion auf Wirtszellen liefert, die den Vektor enthalten, aber solche selektierbaren Elemente sind weder notwendig noch erwünscht, wenn der Vektor in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert.
Durch das Bereitstellen der kodierenden Sequenz des PNB Esterasegens von Bacillus subtillis liefert die vorliegende Erfindung PNB Esteraseexpressionsvektoren für jeden Organismus, der für eine Transformation zugänglich ist. Die hierin beschriebenen Escherichia coli PNB Esteraseexpressionsvektoren verdeutlichen die große Vielzahl an erfindungsgemäßen Expressionsvektoren. Jedoch sind viele der bevorzugten erfindungsgemäßen Vektoren entwickelt worden, um die Expression der PNB Esterase zu steuern.
Die folgenden Beispiele sollen weiter zum Verständnis der Erfindung beitragen. Bestimmte verwendete Materialien, Arten und Bedingungen sollen die Erfindung weiter erläutern und den Schutzumfang hiervon nicht beschränken. Verfahren zur Manipulierung und Analyse von DNA werden im wesentlichen durchgeführt, wie dies von Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. beschrieben ist. Bedingungen für die Restriktionsenzymreaktionen sind die, die von den Herstellern (Boehringer Mannheim (BM)), Indianapolis, IN, New England Biolabs (NEB), Beverley, MA, Bethesda Research Labs (BRL), Gaithersburg, MD) empfohlen werden.

BEISPIEL 1

Isolierung des PNB Esterasegens (pnbA) aus einer Genbank aus Bacillus subtilis (NRRL B8079) DNA

A. Beschreibung und Genotypen der Stämme

Der Bacillus subtilis Stamm NRRL B8079 wurde in einem Screening isoliert, das zur Identifizierung von Mikroorganismen entworfen wurde, die zur Entfernung des para-Nitrobenzylesters von Cephalosporinen fähig sind (Brannon et al., J. Antibiotics XXIX Nr. 2: 121-124, 1976). B. subtilis NRRL B-9079 wurde in der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory (NRRL), United States Department of Agriculture Service, Peoria, IL 61604 hinterlegt und ist unter der Hinterlegungsnummer B-8079 erhältlich. Escherichia coli K12 DH5α (MAX Efficiency DH5α Competent Cells, GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), welcher ein recA&supmin; Stamm ist, der entwickelt wurde, um gut transformierbar zu sein und eine stabile Umgebung für den Erhalt von Plasmiden zu liefern, wird als Wirtstamm für die Genbank des B. subtilis Stamms NRRL B8079 verwendet (siehe Beispiel 1J). Der recA+ E.coli K12 Stamm RV308 wird zur starken Expression des klonierten PNB Esterasegens verwendet und ist ein bevorzugter Wirt zur Expression von heterologen Proteinen in E.coli in einem industriellen Maßstab. E.coli K12 RV308 wurde beim NRRL hinterlegt und ist unter der Hinterlegungsnummer B-15624 erhältlich. E. coli W ATCC 11105 kann ebenfalls als Wirt für die Expression von heterologen Proteinen verwendet werden. Dieser Wirtsstamm kann von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD 20852, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 11105 erhalten werden.

B. Kultivierung von Stämmen

Trypticase -Soja Medium (TSB, Becton Dickinson Microbiology Systems) und Luria Medium (L- Medium, 10 g Difco Bacto-Trypton , 10 g NaCl und 5 g Hefeextrakt pro Liter) werden als Wachstumsmedium für Flüssigkulturen verwendet. Kulturen auf festem Medium werden auf L-Medium angezogen, das mit 2 % G/V Agar versetzt ist (L-Agar). Antibiotika werden erforderlichenfalls dem Medium in folgenden Konzentrationen zugesetzt: Ampicillin (50 µg/ml) und Tetracyclin (5 µg/ml). 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-D-galactosid (X-Gal, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178) wird mit 20 µg/ml zu Medien gegen, um die β-Galactosidaseaktivität zu detektieren.

C. Transformation von Escherichia coli K12 DH5α, E.coli K12 RV308 und E. coli W ATCC 11105

Kompetente Escherichia coli K12 DH5α Zellen erhält man von BRL und sie werden mittels des Protokolls des Herstellers transformiert. Alternativ dazu werden 50 ml Kulturen der Escherichia coli Stämme DH5α, RV308 oder ATCC 11105 in L-Medium bis zu einer OD&sub5;&sub9;&sub0; von etwa 0,5 Absorptionseinheiten angezogen und die Zellen werden durch Zentrifugation gewonnen. Das Zellpellet wird in 25 ml kaltem 100 mM CaCl&sub2; resuspendiert und für 25 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation gewonnen, in 2,5 ml kaltem 100 mM CaCl&sub2; resuspendiert und über Nacht auf Eis inkubiert. Die kompetenten Zellen werden direkt verwendet oder bei -70ºC gelagert, bis sie in Transformationen verwendet werden können.
Um kompetente Escherichia coli Zellen zu transformieren, werden hundert Mikroliter der kompetenten Zellsuspension aus der Lagerung bei -70ºC entnommen und können auf Eis auftauen. Die Zellen werden vorsichtig mit 5 µl einer Plasmid DNA Lösung (1 ng/µl) in einem Polypropylenröhrchen gemischt und die entstehende Lösung wird für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Das Röhrchen wird in ein 42ºC Wasserbad überführt und ohne Schütteln für 45 Sekunden inkubiert. Nach dieser Hitzeschockbehandlung wird das Röhrchen für 2 Minuten auf Eis gestellt. Das Röhrchen wird dann aus dem Eis entfernt und 0,9 ml SOC Medium (2 % Bacto-Trypton , 0,5 % Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM MgSO&sub4; und 20 mM Glucose), das bei Raumtemperatur vorinkubiert wurde, werden zugegeben. Die Zellsuspension wird dann bei 225 Upm für 1 Stunde bei 37ºC geschüttelt und Aliquots werden auf L-Agar ausplattiert, der Ampicillin enthält. Die vermutlichen Transformanden werden nach einer Inkubation bei 37ºC von den Platten gepickt und ihre Identität wird durch Größenmessung ihrer Plasmid DNA mittels Horizontalgelelektrophorese bestätigt (Sambrook et al., 1989). Die Plasmid DNA aus ausgewählten Klonen wird durch Restriktionsenzymanalyse charakterisiert.

D. Plasmid DNA Isolierung

Die Plasmid DNA wird aus Escherichia coli Stämmen mittels eines alkalischen SDS-Standardverfahrens isoliert (Sambrook et al., 1989). Alternativ dazu wird die Plasmid DNA folgendermaßen isoliert. Ein Teil einer Transformandenkolonie, die auf 50 µg/ml enthältendem L-Agar wächst, wird in einen Liter 50 µg/ml enthaltendes L-Medium überführt und auf einem Luttschüttler bei 37ºC für etwa 16 Stunden inkubiert. Die Zeilen werden in 500 ml Flaschen in einem Beckman JA-10 Rotor (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA 92634) bei 8 000 Upm für 10 Minuten bei 4ºC geerntet. Das Zellpellet wird mit TE pH 8,0 (10 mM Tris-HCl, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)) gewaschen, durch Zentrifugation gewonnen und in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 und 25 % Saccharose in einem Gesamtvolumen von 10 ml resuspendiert. Ein Milliliter 20 mg/ml Lysozym (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 25 mM Tris-HCl pH 8,0 wird unter Rühren zugegeben und das Gemisch wird für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Vier Milliliter 200 mM EDTA werden mit einer anschließenden Inkubation auf Eis für 10 Minuten zugegeben, wonach eine Zugabe von 15 ml Brij/DOC Lyselösung (1 % Brij 58, 0,4 % Desoxycholat, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 60 mM EDTA) erfolgt. Die Röhrchen werden sanft zum Mischen gekippt und für 15-30 Minuten auf Eis inkubiert. Der Zelldebris wird durch eine Zentrifugation bei 18 000 Upm in einem Beckman JA- 10 Rotor für 1 Stunde entfernt. Der Überstand wird unter Bildung von etwa 30 ml dekantiert, wozu 150 ml 10 mg/ml RNAse A (Sigma Chemical Co.) gegeben werden. Nach einer einer stündigen Inkubation bei 37ºC werden 150 ml 10 mg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim) zugegeben, wonach eine weitere Inkubation für 1 Stunde bei 37ºC erfolgt. Die DNA wird durch die Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 7,0 gefolgt von 3 Volumina eiskaltem absolutem Ethanol gefällt. Die DNA wird durch eine Zentrifugation in einem Beckman JA-14 Rotor (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA 92634) bei 8 000 Upm für 30 Minuten gewonnen. Das luftgerocknete Pellet wird in TE pH 8,0 in einem Gesamtvolumen von 9 ml resuspendiert, wozu 9 g Cäsiumchlorid Boehringer Mannheim) und 0,5 ml einer 10 mg/ml Ethidiumbromidlösung gegeben werden. Die entstehende Lösung wird in zwei 5,1 ml Quik-seal Röhrchen (Beckman Instruments Inc.) gegeben und bei 65 000 Upm in znem Beckman VTi65.2 Ultrazentrifugenrotor für 6 Stunden zentrifugiert. Die Plasmidbande wird unter ultraviolettem Licht sichtbargemacht und durch eine Spritze entfernt. Die entstehende DNA Lösung wird mit salzgesättigtem Isopropanol zur Entfernung des Ethidiumbromids extrahiert und für 16 Stunden gegen 1000 Volumina TE pH 8,0 dialysiert. Die DNA Lösungen werden bei-20ºC gelagert, bis sie benötigt werden.

E. Amplifikationen durch Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Polymerasekettenreaktionen werden mittels eines DNA Thermal Cycle und des Gene-Amp Reagenzkits (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT 06859) gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Dreißig Amplifikationszyklen werden durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus den folgenden Inkubationen besteht: 1 min bei 93ºC, gefolgt von 2 min bei 40ºC, gefolgt von 4 min bei 72ºC. Die Synthesen werden durch eine Inkubation bei 72ºC für 10 min vervollständigt.

F. Nukleotidsequenzanalyse

Supergecoilte Plasmid DNA Matrizen zur Sequenzierung werden aus alkalischen Lysaten von Escherichia coli Kukturen auf Qiagen DNA Bindungssäulen (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) gemäß den Protokollen des Herstellers gereinigt. Sequenzreaktionen durch Didesoxynukleotidkettenabbruch werden gemäß einem Zyklussequenzierungsprotokolls (Applied Biosystems, Inc. (ABI), Foster City, CA 94404) mit fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden, supergecoilten Plasmidmatrizen und sequenzspezifischen Oligonukleotidprimern durchgeführt. Die Sequenzreaktionen werden auf einem automatisierten ABI Modell 373A Sequenziergerät analysiert. Die Nukleotidsequenzen werden zusammengestellt, editiert und mit den GCG Computerprogrammen von Devereux et al., 1985, Nucleic Acids Res. 12: 387-395 analysiert.

G. Synthese und Endmarkierung von Oligonukleotidsonden

Die aminoterminale Sequenz der aus Bacillus subtilis NRRL B8079 gereinigten PNB Esterase (gereinigt durch das Verfahren von Beispiel 7) erhält man, indem 25 Picomol gereinigte PNB Esterase (ca. MW = 54 000) mit einer spezifischen Aktivität von 2,2 E/mg (basierend auf der Hydrolyse von Loracarbef PNB Ester zur entsprechenden freien Säure) einer Analyse auf einem automatisierten Gasphasensequenziergerät unterzieht (Hewick et al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 7990, Hunkapiller und Hood, 1978, Biochemistry 17: 2124). Die aminoterminale Aminosäuresequenz ist die SEQ ID Nr:3.
Aufgrund der SEQ ID Nr:3 und der bekannten Codonverwendung von B. subtilis (Harwood et al., Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley and Sons Ltd., West Sussex, England (1990)) werden zwei Oligonukleotidsonden auf einem Applied Biosystems Inc. Modell 380B DNA Sythesegerät mittels der β- Cyanoethylphosphoramiditchemie gemäßden Angaben des Herstellers synthetisiert. Diese Oligonukleotidsonden sind in der Sequenzliste als SEQ ID Nr: 4 und SEQ ID Nr: 5 angegeben.
Die SEQ ID Nr:4 und SEQ ID Nr: 5 werden zuerst säulengereinigt (Oligonukleotide Purification Cartridges, Applied Biosystems Inc.) und dann folgendermaßen an den Enden markiert. Zehn Picomol jeder Sonde werden zu einem 20 µl Reaktionsgemisch gegeben, das 12 µl [γ³²P] Adenosintriphosphat (ATP, 5000 Ci/ml) und 8 Einheiten T4 Polynukleotidkinase in Kinasepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;) enthält. Nach einer 35 Minuten dauernden Reaktion bei 37ºC und einer Inkubation für 5 Minuten bei 70ºC zur Inaktivierung der Kinase, wird das nicht eingebaute [γ³²P] ATP mittels einer Sephadex G-50 Nick Säule (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ 08854) aus dem Reaktionsgemisch entfernt.

H. Isolierung von genomischer DNA aus Bacillus subtilis NRRL B8079

Die Gesamt DNA wird aus einer zwei Liter Kultur von Bacillus subtilis NRRL B8079 isoliert, die bis zur mittleren logarithmischen Phase bei 25ºC für 16 Stunden in TSB angezogen wurde. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und in 20 ml Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM EDTA) resuspendiert. Die Lyse der Zellen wird in zwei Schritten erreicht durch: (i) Zugabe von 1 mg/ml Lysozym (aus Hühnereiweiß, Calbiochem, La Jolla, CA) und einer Inkubation der Suspension für 20 Minuten bei 37ºC und (ii) der Zugabe von 4 ml Lysepuffer (0,5 % Natriumdodecylsulfat [SDS], 50 mM Tris pH 7,5, 0,4 M EDTA, 1 mg/ml Proteinase K) und einer Inkubation bei 50ºC für 30 Minuten. Die DNA wird durch zwei Phenolextraktionen gefolgt von einer Chloroformextraktion gereinigt und dann durch Fällung mit Ethanol und Aufwickeln auf einem Glasstab gewonnen. Die RNA wird aus der Präparation entfernt durch vorsichtiges Resuspendieren der DNA in 40 mM Tris-HCl Puffer, pH 7,5, der 1 mM EDTA und 0,2 mg/ml Ribonuklease (aus Rinderpankreas, Sigma Chemical Co,) enthält, und einer anschließenden Inkubation der Präparation bei 25ºC für 30 Minuten. Eine weitere Reinigung wird durch eine erneute Extraktion mit Phenol und Chloroform, einer Fällung mit Ethanol und einer Resuspension in TE pH 7,5 erreicht.

I. Southern Hybridisierungen der EcoRI Restriktionsfragmente mittels Oligonukleotidsonden

Die genomische DNA von Bacillus subtilis NRRL B8079 wird mit EcoRI verdaut und auf einem 1 % Agarose-TBE-Gel einer Elektrophorese unterzogen (Sambrook et al., 1989). Die größenfraktionierte DNA wird dann auf Hybond-N+ Nylonmembranen (Amersham, Arlington Heights, IL USA) durch Southernblot (Sambrook et al., 1989) überführt und durch eine Behandlung mit ultraviolettem Licht für 5 Minuten mit der Matrix quervernetzt. Nach einer Vorhybridisierung der DNA bei 70ºC für 1-2 Stunden in Hybridisierungspuffer, der enthält 6 fach SSC (1fach SSC, pH 7,0 enthält 0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumcitrat), 5 fach Denhardts Lösung (einfach Denhardts Lösung enthält 0,2 g/l Ficoll 400, 0,2 g/l Polyvinylpyrrolidon und 0,2 g/l Rinderserumalbumin [Fraktion V], 0,25 % SDS und 20 µg/ml Kalbsthymus DNA, die durch eine Behandlung mit Ultraschall fragmentiert wurde). Ein frischer Hybridisierungspuffer, der [³²P]-markiertes Oligonukleotid enthält (hergestellt wie in Beispiel 1G beschrieben) wird dann zur Herstellung einer Endkonzentration von 0,5 pmol/ml zugegeben. Die Temperatur des Inkubationsgemisches läßt man während der Inkubation über Nacht auf 45ºC fallen. Die Membranen werden dann mittels Stringenzbedingungen gewaschen, die für jede Sonde optimiert wurden. Die mit SEQ ID Nr: 4 hybridisierten Membranen werden für 25 min dreimal nacheinander bei 45ºC mit 4fach SSC, 0,25 % SDS gewaschen. Die mit SEQ ID Nr: 5 hybridisierten Membranen werden ähnlich mit 0,5 fach SSC, 0,25 % SDS gewaschen. Nach dem Waschen werden die Membranen bei Raumtemperatur getrocknet und einem Film ausgesetzt.
Mittels des obigen Verfahrens hybridisiert eine Bande, die EcoRI Fragmente mit einer Größe von etwa 6 kb entspricht, mit der SEQ ID Nr: 4 und SEQ ID Nr: 5.

J. Konstruktion einer angereicherten Genbank von EcoRI DNA Fragmenten und die Isolierung von pNBE1

Die genomische DNA von Bacillus subtilis NRRL B8079 wird vollständig mit EcoRI verdaut und in einem horizontalen 1,2 % Agarosegel (in einfachem TAE Puffer, der 40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA enthält bei 2 V/cm) für 16 Stunden einer Elektrophorese unterzogen. Das Gel wird in einer verdünnten (1 mg/ml) Ethidiumbromidlösung gefärbt und die DNA Banden werden unter langwelligem ultraviolettem Licht sichtbargemacht. Es wird ein Stück aus dem Bereich des Gels entfernt, das einer DNA mit einer Größe von etwa 6 kb entspricht, und das die Bande umfaßt, die vorher mit der SEQ ID Nr: 4 und der SEQ ID Nr: 5 hybridisiert hat. Die Elution des DNA Fragments aus dem Gelstück wird mit kleinen Anpassungen gemäß dem Protokoll von Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Kurz gesagt wird das Gelstück in einen Dialyseschlauch mit 200 µl 0,2 fach TAE Puffer gegeben, mit Clips verschlossen und in 0,2 fachen TAE Puffer für etwa 3 Stunden einer Elektrophorese unterzogen. Der Inhalt des Dialyseschlauchs, einschließlich 400 µl Waschlösung aus 0,2 fachem TAE werden mit 2,4 ml Niedrigsalzpuffer (0,2 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 mM EDTA) gemischt und auf eine ELUTIP-d Säule (Schleicher & Schuell, Keene, NH) aufgetragen, die nach dem Protokoll des Herstellers präpariert wurde. Nach dem Waschen mit Niedrigsalzpuffer wird die DNA mit zwei Volumina von 400 µl Hochsalzpuffer (1,0 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 mM EDTA) eluiert und durch die Zugabe von 800 µl eiskaltem absolutem Ethanol gefällt, wonach eine Zentrifugation bei 14 000 Upm für 40 Minuten in einer Eppendorf 5415C Mikrofuge erfolgt. Die zwei luftgetrockneten Pellets werden durch Auflösen in 20 µl TE, pH 7,5 vereinigt und die Lösungen werden bei -20ºC bis zur Ligation gelagert. Die Fragmente werden in den Vektor pUC19 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) ligiert, der durch einen Verdau mit EcoRI gefolgt von einer Entfernung der 5'-Phosphate mittels alkalischer Phosphatase aus dem Kälberdarm (Calbiochem, La Jolla, CA) vorbehandelt war.
Die entstehenden Plasmide werden zur Transformation von kompetenten Escherichia coli K12 DH5α Zellen verwendet, die dann auf L-Agarplatten plattiert werden, welche Ampicillin und X-Gal enthalten. Die Verwendung des Plasmids pUC19 als Vektor erlaubt durch die weiß/blau-Selektion die spezifische Auswahl der Klone, die eine DNA Insertion enthalten. Transformanden, die nur den pUC19 Vektor enthalten, der den Teil des lacZ Gens enthält, das für das α-Peptid der β-Galactosidase kodiert, bilden ein aktives Enzym, das durch die Spaltung von X-Gal unter Bildung einer blauen Farbe detektiert wird. Im Gegensatz dazu sind Isolate, die eine Insertion in der EcoRI Schnittstelle enthalten, das den Leserahmen des α-Peptids zerstört, nicht zur Umwandlung von X-Gal fähig und bleiben daher auf Medien weiß, die X-Gal enthalten. Mehr als hundert weiße, Ampicillin-resistente Kolonien werden ausgewählt und erneut auf demselben Agar ausplattiert, um die phänotypische Stabilität zu testen.
Die Plasmid DNA wird aus weißen Kolonien isoliert und durch Gelektrophorese analysiert. Sieben Kolonien, die eine Plasmid DNA der erforderlichen Größe von 9 kb (2,686 kb pUC19 DNA plus etwa 6 kb DNA Insertion) enthalten, werden zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Bei einem Test durch Southernhybridisierungen mittels der SEQ ID Nr:4 Sonde ergibt ein Plasmid, nämlich pNBE1, ein starkes Hybridisierungssigual. Ein Verdau des Plasmids PNBE 1 mit EcoRI ergibt zwei Fragmente der erwarteten Größe: Eines, das dem linearisierten pUC19 (2,686 kb) entspricht und das andere mit einer Größe von etwa 6 kb, das dem inserierten Fragment entspricht.

K. Demonstration der Transkriptionsrichtung von pnbA auf dem Plasmid pNBE1

Es werden zwei PCR Amplifizierungen mittels pNBE1 durchgeführt, um die Richtung der Transkription ion pnbA relativ zum lacZ Gen von pUC19 und die ungefähre Position der ATG Transkritionsstartstelle in der Insertion zu bestimmen. Die erste Amplifizierung verwendet die SEQ ID Nr: 5 Oligonukleotidsonde und den Vorwärts (-20) M13 DNA Sequenzierungsprimer (New England BioLabs). Die zweite Amplifizierung verwendet ebenfalls SEQ ID Nr:5, aber der zweite Primer ist der Reverse (-24) M13 Sequenzierungsprimer. Die Ergebnisse zeigen, däß nur die Reaktion mit dem (-20) Vorwärtssequenzierungsprimer ein amplifiziertes Fragment erzeugt. Die Größe des amplifizierten Fragments wird mit 2,0 kb bestimmt. Daher liegt die ATG Startstelle von pnbA etwa 4 Kilobasenpaare (kb) stromabwärts des Starts des Polylinkers von pUC19 und wird in derselben Richtung wie das lacZ Gen transkribiert.

L. Verifizierung eines funktionsfähigen pnbA Gens

Um zu bestimmen, ob das gesamte pnbA Gen auf pNBE1 vorhanden ist und zur Expression in Escherichia coli geeignet ist, werden Extrakte der E. coli K12 DH5α Zellen, die mit dem Plasmid pNBE1 transformiert sind, auf die Esteraseaktivität getestet. Die Zellextrakte werden aus etwa 75 ml einer Kultur hergestellt, die bis zur mittleren logarithmischen Phase in L-Medium angezogen wurde. Die Zellen werden für 10 Minuten bei 8 000 Upm gewonnen, in 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Zellpellet wird resuspendiert (1 g Zellen / 4 ml Puffer) und durch Aussetzen gegenüber vier 30 Sekunden lang dauernden Ultraschallbehandlungen (Sonicator Cell Disruptor Model W185F, Heat Systems-Ultrasonics Inc., Plainview, N.Y.) zerstört. Der Zelldebris wird durch Zentrifugation in einer Mikrofuge für 20 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit entfernt. Da gereinigte PNB Esterase die Spaltung von p-Nitrophenylacetat zusätzlich zu p-Nitrobenzylestern von β-Lactamantibiotika katalysiert, kann diese Reaktion bequemerweise zur spektrometrischen Verfolgung der p- Nitrophenolbildung verwendet werden. Das Reaktionsgemisch enthält 400 µl 0,5 M p-Nitrophenylacetat (1:99 V/V Acetonitril / Wasser), 600 µl 167 mM Tris-HCl, pH 7,0 und 1-20 µl zellfreien Extrakt. Die Bildung von p- Nitrophenol wird spektrophotometrisch durch die Verfolgung der Zunahme der OD&sub4;&sub0;&sub5; mittels eines Gilford Response II Spektrophotometers gemesen. Alternativ dazu kann die Enzymaktivität qualitativ mittels ganzen Zellen durch die Zugabe eines Teils einer Kolonie zum Reaktionsgemisch mittels eines Zahnstochers demonstriert werden. Sowohl der Test mit ganzen Zellen als auch mit zellfreien Extrakten zeigt mittels dieser Verfahren, daß das Plasmid pNBE1 ein intaktes pnbA Gen enthält und daß das Gen unter Bildung eines aktiven Enzyms exprimiert wird. Es wird keine signifikante Aktivität in Escherichia coli K12 DH5α Zellen ohne Plasmid oder in E.coli K12 DH5α Zellen detektiert, die andere nicht-hybridisierende Plasmide aus der Genbank enthalten.

M. Subklonierung des pnbA Gens

Mit der Information, die aus dem in Beispiel 1K beschriebenen PCR Experiment erhalten wurde, und aus einzelnen und doppelten Restriktionsenzymverdaus von pNBE1, ist es möglich, eine vorläufige physikalische Karte des 6,0 kb EcoRI Fragments zu erstellen. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pNBE1 ist in Figur 1 gezeigt. Es werden dann eine Reihe an Subklonen von pNBE1 durch den Partialverdau des Plasmids mit HpaII gefolgt von einem vollständigen Verdau des Plasmids mit EcoRI und einer Ligation der entstehenden HpaII- EcoRI Fragmente mit pUC19 hergestellt, der mit AccI-EcoRI geschnitten ist. Die HpaII Schnittstelle der Insertion und die AccI Schnittstelle von pUC19 werden durch diese Ligation nicht regeneriert. Die entstehenden Plasmide werden dann in Escherichia coli K12 DH5α Zellen transformiert, Ampicillin-resistente Kolonien werden ausgewählt und auf Esteraseaktivität getestet. Die Plasmid DNA wird aus einer Reihe an positiven Klonen isoliert und analysiert, um die Größe der HpaII-EcoRI Insertionen zu bestimmen. Die kleinste Insertion, die für ein aktives Enzym kodiert, beträgt 2,3 kb. Der Plasmidvektor wird als pNBHpE2.3 bezeichnet.
Es wird ein zusätzliches Subklonierungsexperiment durchgeführt, das zeigt, daß das SalI-EcoRI Fragment am distalen Ende der 2,3 kb Insertion nicht für ein funktionsfähiges pnbA Gen erforderlich ist. pNBHpE2.3 wird zuerst mit HindIII und SalI geschnitten, mit HindIII und SalI geschnittenem pUC19 ligiert und dann in Escherichia coli K12 DH5α Zellen transformiert. Das Plasmid aus dieser Konstrukution, als pNBH3S1.9 bezeichnet, enthält eine 1,9 kb HpaII-SalI Insertion und kodiert für ein aktives PNB Esteraseprotein. Die DNA Insertion aus diesem Plasmid wird in pBluescript SK (-) (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert und zur Bestimmung der Nukleotidsequenz analysiert. Die kodierende Sequenz des PNB Esterasegens von Bacillus subtilis ist in der Sequenzliste als SEQ ID Nr: 1 gezeigt.

BEISPIEL 2

Starke Expression des pnbA Gens in Escherichia coli

Die Expression des klonierten PNB Esterasegens in Escherichia coli wird durch die Konstruktion der Vektoren pNB106R und pNB106RM verbessert. Das Plasmid pNB106R enthält ein funktionsfähiges rop Gen, das für die Kontrolle der Plasmidkopiezahl verantwortlich ist (Cesareni et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6313). Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pNB106R ist in Figur 2 gezeigt. Das Plasmid pNB106RM, dem das rop Gen fehlt, leitet sich von pNB106R ab, um die Wirkung der Plasmidkopiezahl auf die Expression des pnbA Gens zu bestimmen. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pNB106RM ist in Figur 3 gezeigt.

A. Konstruktion von Escherichia coli K12 DH5α/pNB 106R, E. coli K12 RV308/pNB106R und E. coli W ATCC 11105/pNB106R

Das Plasmid pNB106R wird durch die Subkionierung des 1,9 kb DNA Fragments von Plasmid pNBH3S1.9 in den temperaturinduzierbaren Hochleistungsexpressionsvektor pHKY338 zur Bereitstellung einer temperaturinduzierbaren Expression eines heterologen Gens von einem modifizierten Bakteriophagen Lambda pL Promotor konstruiert. E. coli K12 RV308/pHKY338 wurde beim NRRL am 31. Januar 1992 hinterlegt und ist unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18945 erhältlich. Das Plasmid enthält zwei DNA Regionen von besonderer Wichtigkeit: (i) Eine von pBR322 abgeleitete Sequenz, die die Replikation und den Erhalt des Plasmids in Escherichia coli erlaubt, und in der das Ampicillinresistenzgen von pBR22 durch ein Lambda cI857 Repressorgen ersetzt ist und (ii) eine Sequenz, in der ein modifizierter Lambda Promotor p1106 (US Patentanmeldung 07/739 280, europäische Patentanmeldung 91307325.0), der stromabwärts des Tetracyclinresistenzgens liegt, sich direkt an den offenen Leserahmen (ORF) eines Kanamycingens anschließt. Der Promotor kontrolliert die Transkription des ORF über eine doppelcitronische Anordnung (Schoner et al., 1990, Methods in Enzymology 185: 94). Das Plasmid pHKY338 wurde so konstruiert, daß der offene Leserahmen des Kanamycinresistenzgens leicht durch einen Verdau mit NdeI und BamHI entfernt werden kann. Jeder ORF mit einer NdeI Restriktionsschnittstelle am ATG Transkriptionsstartcodon und einer mit BamHI kompatiblen Restriktionsschnittstelle stromabwärts der potentiellen Transkriptionsterminationssequenzen kann in pHKY338 inseriert werden. Der entstehende inserierte ORF wird dann korrekt zur Expression vom pL Promotor eingebaut.
Da die klonierte 1,9 kb große Bacillus subtilis DNA keine NdeI Schnittstelle an der gewünschten Stelle enthält, wird eine Strategie entwickelt, um eine an der ATG Transkriptionsstatstelle des pnbA ORF einzuzführen. Die Strategie umfaßt getrennte Konstruktionen, um aminoterminale und carboxyterminale Fragmente des pnbA Gens zu erzeugen, wonach eine Ligation der zwei Fragmente mit einem dritten Fragment erfolgt, das vom pHKY338 Vektor erhalten wird. Die Konstruktion der drei Fragmente wird folgendermaßen erreicht:

i) Aminoterminales Fragment

Ein 261 bp Fragment, das für den Aminoterminus der PNB Esterase kodiert und eine NdeI Schnittstelle benachbart und 5' zur ATG Transkriptionsstartstelle enthält, wird mittels PCR Technologie synthetisiert (siehe Beispiel 1E). Die PCR Amplifizierung wird unter Verwendung der folgenden zwei Primer durchgeführt, die als SEQ ID Nr:6 und SEQ ID Nr: 7 bezeichnet werden.
Die SEQ ID Nr: 6 enthält eine NdeI Schnittstelle. Die ersten drei Basen des Primers passen nicht zum klonierten PNB Esterasegen. Der andere Primer, SEQ ID Nr: 7 aneliert etwa 25 bp stromabwärts der AccI Schnittstelle, die 215 bp stromabwärts der ATG Startstelle liegt. Das 261 bp Fragment, das aus der Amplifizierung resultiert, wird mit geringen Modifizierungen gemäß dem Verfahren mit Proteinase K (Protease Typ XXVIII von Tritirachium album) behandelt, das von Crowe et al., 1991, Nuc. Acids. Res. 19: 184 beschrieben wurde. Das Fragment wird anschließend mit NdeI und AccI verdaut, durch Standardverfahren mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt, um das 180 bp Fragment zu erzeugen, das in der unten gezeigten Ligationsreaktion verwendet wird.

ii) Carboxyterminales Fragment

Da die Konstruktionsstrategie die Verwendung der internen AccI Schnittstelle des ORF zum Splicen der aminoterminalen und carboxyterminalen Fragmente erfordert, ist es notwendig, die andere AccI Schnittstelle (SalI/AccI) auf dem 1,9 kb Fragment zu eliminieren. Dies wird in zwei Schritten erreicht: (i) Verdau von pNBH3S1.9 mit HindIII und SalI zur Freisetzung des ORF Fragments und (ii) Ligation des freigesetzten Fragments mit pBluescript SK(-), der mit HindIII und XhoI geschnitten wurde. Die Insertion der SalI/AccI Schnittstelle des 1,9kb Fragments in die XhoI Schnittstelle von pBluescript SK(-) eliminiert alle drei Schnittstellen. Die Transformation des Ligationsgemisches in Escherichia coli K12 DH5α, gefolgt vom Screening nach möglichen Klonen und die Bestätigung der Strukturen durch Restriktionsverdau führt zur Isolierung von pNBH3(SX)sk, der nur eine AccI Schnittstelle im ORF aufweist. Man benötigt eine weitere Konstruktion zur Einführung einer BamHI Schnittstelle am Carboxyterminus. Dies wird durch den Verdau von pNBH3(SX)sk mit EcoRI und KpnI zur Freisetzung des ORF Fragments, gefolgt von der Ligation dieses Fragments in pUC19 erreicht, der ebenfalls mit EcoRI und KpnI geschnitten ist. Die Transformation des Ligationsgemisches in DH5α Zellen, gefolgt von der Selektion und Analyse der Klone führt zur Isolierung von Plasmid pNBEKuc, das eine einzelne AccI Schnittstelle im ORF und eine geeignet positionierte BamHI Schnittstelle stromabwärts des Carboxyterminus enthält.

iii) Vektorfragment von pHKY338

Der Vektor für die im folgenden beschriebene Dreifragmentligation wird durch den Verdau von pHKY338 mit NdeI und BamHI zur Entfernung des Kanamycinresistenzgens und einer Isolierung des großen Restriktionsfragments über ein Gel hergestellt.
Es wird eine Dreifragmentligation durchgeführt, die das NdeI-AccI verdaute PCR Fragment (180 bp), das AccI-BamIII Fragment von pNBEKuc (1,7 kb) und das NdeI-BamHI Fragment von pHKY338 (6 kb) umfaßt. Das bildet den Plasmidvektor pNB106R, der den gesamten pnbA ORF unter der Kontrolle des temperaturinduzierbaren synthetischen Lambda pL Promotors enthält. Die entstehende DNA wird in den Wirtsstamm Escherichia coli K12 DH5α transformiert. Das Plasmid pNB106R wird anschließend in die Wirtszellen E.coli K12 RV308 und E.coli W ATCC 11105 transformiert.

BEISPIEL 3

Konstruktion von Escherichia coli K 12 DH5α/pNB106RM, E. coli K12 RV308/pNB106RM und E. coli W ATCC 11105/pNB106RM

Um eine Version von pNB106R ohne des rop Gens (rop&supmin;) zu konstruieren, werden die Plasmide pNB106R und pHKY389 (rop&supmin;) beide mit SphI und NcoI verdaut. Escherichia coli K12 RV308/pHKY389 wurde beim NRRL am 22. Oktober 1992 hinterlegt und ist unter der Hinterlegungsnummer B-21012 erhältlich. Das 4,5 kb SphI- NcoI Fragment von pHKY389 und das 3 kb SphI-NcoI Fragment von pNB106R werden nach einer Elektrophorese mittels bei niedrigen Temperaturen schmelzender Agarose über ein Gel isoliert. Diese Fragmente werden mittels T4 DNA Ligase und Standardreaktionsbedingungen bei 37ºC für 4 Stunden ligiert. Kompetente E.coli K12 Dh5α Zellen werden transformiert und auf Tetracyclin-enthaltendem L-Agar ausplattiert. Ausgewählte Klone werden auf das erwartete AccI Restriktionsenzymmuster untersucht und dabei wird ein Stamm identifiziert, der das Plasmid pNB106RM trägt. Das Plasmid pNB106RM wird anschließend unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens in die Stämme E.coli K12 DH5α, E.coli K12 RV308 und E.coli W ATCC 11105 transformiert.

BEISPIEL 4

Synthese der PNB Esterase in Escherichia coli K12 DH5α, E. coli K12 RV308 und E. coli W ATCC 11105, die mit pNB106R oder pNB106RM transformiert sind.

Die Synthese der PNB Esterase in Kulturen von Escherichia coli K12 DH5α, E. coli K12 RV308 und E. coli W ATCC 11105, die mit Plasmid pNB106R oder pNB106RM transformiert sind, wird folgendermaßen ausgelöst. Eine eingefrorene Vorratskultur des Stamms wird zum Beimpfen von L-Medium verwendet, das 5 µg/ml Tetracyclin enthält. Nach einem Wachstum für 16 Stunden bei 30ºC werden die Zellen in frischem L-Medium mit Tetracyclin subkultiviert (4 % V/V) und bis zur mittleren logarithmischen Phase angezogen. Die Induktion der Enzymsynthese wird durch die Erhöhung der Kulturtemperatür auf 40ºC erreicht. Die Kinetik der PNB Esterasesynthese wird durch periodische Probenahme aus der Kultur und dem Test auf Enzymaktivität in zellfreien Extrakten gemessen, wie dies in Beispiel 1L beschrieben ist. Die zellfreien Extrakte werden ebenfalls durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert, um die relative Zunahme der Menge an PNB Esteraseprotein zu verfolgen.

Beispiel 5

Die Reinigung der PNB Esterase aus rekombinanten Escherichia coli Stämmen

Die PNB Esterase wird aus Escherichia coli K12 DH5α/pNB106R durch das in Tabelle 1 angegebene Verfahren gereinigt. Dieses Verfahren kann mit der Reinigung aus Bacillus verglichen werden, die in Beispiel 7 md in Tabelle 2 angegeben ist. Es wird angemerkt, däß im letzteren Fall acht (8) Schritte erforderlich sind und 2,6 mg reines Enzym aus 130 000 mg Rohprotein erhalten werden, während aus dem rekombinanten Escherichia coli Stamm 10 mg reines Enzym aus nur 200 mg Rohprotein mittels lediglich 6 Schritten erhalten werden. Daher ist das einfachere Reinigungsverfahren mittels der rekombinanten E. coli als Quelle 3250 fach effizienter als das ältere komplexere Reinigungsverfahren, bei dem der natürliche Produzent Bacillus subtilis als Enzymquelle verwendet wird.
Da das neue Reinigungsverfahren mit rekombinanten Escherichia coli als Enzymquelle beträchtlich einfacher ist, wäre es bei einer Anwendung im großen Maßstab billiger als das Reinigungsverfahren für dasselbe aus B. subtilis erhaltene Enzym. Dies ist ein direktes Ergebnis der deutlich erhöhten Menge an PNB Esterase, die aus dem rekombinanten E. coli Stamm erhalten wurde (etwa 3250 fach pro Rohproteineinheit).
Die aus rekombinanten Escherichia coli gereinigte PNB Esterase wird mit dem nativen Enzym in Bezug auf Molekulargewicht, Westernblotanalyse und Substratspezifität verglichen. Messungen des Molekulargewichts ergeben Werte von 54 000 für das Enzym aus beiden Quellen und man erhält identische Präzipitinbanden, wenn die beiden Enzympräparationen mittels Antikörper getestet werden, die gegen die native gereinigte Esterase hergestellt wurden. Beide Enzyme hydrolysieren Cefaclor PNB Ester, Cefaclorkern PNB Ester, Loracarbef PNB Ester und Loracarbefkern PNB Ester. Die native PNB Esterase und die entsprechende in rekombinanten E. coli Stämmen gebildete Esterase scheinen funktionell identisch und strukturell makroskopisch gleich zu sein. Tabelle I Reinigung der PNB Esterase aus E.coli K12DH5α/pNB106R
Ausgangszellmasse = 5,4 g Naßgewicht
Substrat = Loracarbefkern PNB Ester

Beispiel 6

Hydrolyse des Loracarbefkern PNB Esters durch partiell gereinigte PNB Esterase

Partiell gereinigte PNB Esterase (2,5 mg basierend auf der spezifischen Aktivität und der bekannten Umsatzrate des Enzyms), die aus Escherichia coli K12 DH5α/pNB106R Zellen gereinigt und mit N-Ethylmaleinimid zur Inaktivierung der restlichen β-Lactamase behandelt wurde, wird zu einer Suspension des Loracarbefkern PNB Esters (2,2 % G/V) in 50 mM Tris Puffer pH 8,0 gegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 3 Stunden auf 37ºC gehalten. Es wird periodisch Natriumhydroxidlösung zugegeben, um den pH auf 8,0 zu halten. Nach 3 Stunden erhält man eine 90 % Ausbeute an freier Säure des Loracarbefkerns auf der Grundlage der Analyse durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) für diese Verbindung. Eine weitere Inkubation erhöht die Ausbeute nicht.

Beispiel 7

Isolierung und Reinigung der PNB Esterase aus Bacillus subtilis

A. Herstellung des zellfreien Extrakts

Eine Kultur von Bacillus subtilis NRRL B-8079 wird geerntet und durch herkömmliche Verfahren eingefroren. Die eingefrorenen B. subtilis Zellen (760 g) werden aufgetaut und in 2 Liter Puffer A (10 mM Kaliumphosphat, pH 7,0, 1 mM 2-Mercaptoethanol (2-ME) und 0,5 mM EDTA) homogenisiert. Der zellfreie Extrakt wird durch eine Zentrifugation bei 24 000 x g für 30 Minuten erhalten. Es wird Protaminsulfat in einer Endkonzentration von 2,0 mg/ml zum Extrakt gegeben und das Gemisch wird für 1 Stunde gerührt. Die gebildeten Präzipitate werden durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wird als zellfreier Extrakt im folgenden Isolierungsverfahren verwendet.

B. Isolierung der rohen PNB Esterase

Der Extrakt wird einer Ammoniumsulfatfraktionierung unterworfen. Die Präzipitate bilden sich zwischen einer Ammoniumsulfatsättigung von 45-80 % und werden durch Zentrifugation gesammelt und in Puffer A gelöst und dann gegen denselben Puffer über Nacht dialysiert. Die dialysierte Probe wird mit 1 N Essigsäure auf pH 5,0 angesäuert, für 10 Minuten inkubiert und zur Entfernung der Präzipitate einer Zentrifugation unterzogen. Der Überstand enthält die rohe PNB Esterase.

C. Reinigung der PNB Esterase

Der Überstand wird mit 2 N NH&sub4;OH auf pH 8,5 eingestellt und auf ein schwaches Anionenaustauscherharz (DE52 Säule, 3,7 x 35 cm, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ 08854) aufgetragen, die mit Puffer B (10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 50 mM NaCl, 1 mM 2-ME und 0,5 mM EDTA) äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 350 ml Puffer 13 gewaschen und erneut mit 1750 ml Puffer C (10 mM Tris-HCl pH 7,0, 50 mM NaCl, 1 mM 2-ME und 0,5 mM EDTA) gewaschen. Die PNB Esterase wird mit einem 3500 ml umfassenden Gradienten von 50-300 mM NaCl in Puffer C eluiert. Die Fraktionen der PNB Esterase werden vereinigt und durch Ultrafiltration mit einer AMICON PM-10 Membran (Amicon, Danvers, MA 01923) konzentriert. Die konzentrierte rohe PNB Esteraselösung wird einer Gelfiltration mittels eines Gels vom Polysaccharidtyp (Sephacryl S-200 HR Säule, 5,0 x 95 cm, Pharmacia Inc.) unterzogen, die mit Puffer D (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM 2-ME und 0,5 mM EDTA) äquilibriert wurde. Die die Enzymaktivität enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, durch Ultrafiltration konzentriert und über Nacht gegen Puffer B dialyisert. Die dialysierte Lösung wird auf ein Anionenaustauscherharz (Q- Sepharosesäule, 2,6 x 20 cm, Pharmacia Inc.) aufgetragen, die mit Puffer B äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 100 ml Puffer B und anschließend mit 500 ml Puffer E (10 mM MES-NaOH, pH 6,0, 10 mM NaCl, 1 mM 2-ME und 0,5 mM EDTA) gewaschen. Die PNB Esterase wird mit einem 1500 ml umfassenden linearen Gradienten von 100-300 mM NaCl in Puffer E eluiert. Die die PNB Esterase enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, durch Ultrafiltration konzentriert und über Nacht gegen 10 mM Natriumacetat pH 5,0 dialysiert, der 1 mM 2-ME und 0,5 mM EDTA enthält.
Nach dem Entfernen des Präzipitats durch Zentrifugation wird die Enzymlösung auf eine Calciumphosphat-Cellulosesäule (1,6 x 20) aufgetragen, die mit einem Puffer äquilibriert wurde, der 10 mM Natriumacetat pH 5,0 und 1 mM 2 -ME und 0,5 mM EDTA enthält. Das verwendete fein verteilte Calciumphosphat kann gemäß Jenner US-A 3 737 516 hergestellt werden. Nachdem die Säule mit 250 ml desselben Puffers gewaschen wurde, wird die PNB Esterase mit einem 250 ml umfassenden linearen Gradienten von 10-50 mM Kaliumphosphat pH 7,0 eluiert, der 1 mM 2-ME und 0,5 mM EDTA enthält. Die die PNB Esteraseaktivität enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, durch Ultrafiltration konzentriert und dann über Nacht gegen Puffer D dialysiert.
Die dialysierte Enzymlösung wird auf eine p-Aminobenzamidin-Agarosesäule (1,0 x 20 cm, Pharmacia Inc.) aufgetragen, die mit Puffer D äquilibriert wurde. Nach dem Waschen der Säule mit 50 ml Puffer D wird die PNB Esterase mit einem 100 ml umfassenden linearen Gradienten von 0-300 mM NaCl in Puffer D eluiert. Die Fraktionen mit der PNB Esteraseaktivität, die etwa zwischen 160 und 220 mM NaCl in Puffer D eluiert, werden vereinigt, durch Ultrafiltration konzentriert und stellen das gereinigte Enzym dar.
Alle Schritte der oben beschriebenen Reinigung werden bei Temperaturen zwischen 0-4ºC durchgeführt. Der Reinigungsfortschritt wird durch Testen des Materials auf PNB Esteraseaktivität verfolgt, das bei jedem Schritt der Isolierung und Reinigung erhalten wird. Tabelle 2 Reinigung der PNB Esterase von B. subtilis
verwendete Substrate: Lora = Loracarbef-PNB
Ceph = Cephalexin-PNB
p-NPA = p-Nitrophenylacetat

D. Testverfahren für die PNB Esteraseaktivität

Ein 1 ml Reaktionsgemisch, das 5 µmol Bis-Tri-Propan-HCl, pH 6,5, 0,5 µmol Substrat (Loracarbef PNB Ester oder Cefaclor PNB Ester) und geeignete Mengen an Enzymlösung enthält, wird bei 30ºC in einem Schüttler mit konstanter Temperatur für 30 Minuten geschüttelt. Die Reaktion wird durch die Zugabe eines gleichen Volumens Acetonitril gestoppt. Das Gemisch wird dann zur Entfernung des Proteins zentrifugiert und die Überstandlosung wird durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) auf Produktbildung und Substratabnahme analysiert. Die HPLC wird in einer C18-Umkehrphasensäule (Beckman Ultrosphere ODS, Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA 92634) mit einem linearen Gradienten durchgeführt, der bei einer Flußrate von 1 ml/min gebildet wird mit Puffer A, der 80 % 1 mM Trimethylamin-HCl, pH 2,5 und 20 % Methanol enthält, und Puffer B, der Methanol enthält.
Das verwendete HPLC System ist ein Varian HPLC System einschließlich einer Vista 5560 Einheit (Varian Assoziates, Sugar Land TX) und eines automatischen Probengebers Modell 230-401 (Gilson Medical Electronics, Middleton, WI). Die PNB Esteraseaktivität wird durch die Verfolgung der Produktbildung bei 254 nm bestimmt.
Unter Ausnutzung der Absorptionsveränderung bei der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat zu p- Nitrophenylalkohol und Acetat wird ein spektrophotometrischer Test für die PNB Esterase entwickelt. Eine Enzymfraktion, die in diesem Test eine Aktivität zeigt, muß nicht unbedingt eine PNB Esteraseaktivität aufweisen, aber die PNB Esterase zeigt in diesem Test eine Aktivität. Für die gereinigte PNB Esterase korrelieren die Ergebnisse dieses Tests gut mit der Reinigung des Enzyms, wo im allgemeinen eine große Anzahl an Tests beteiligt sind. Dieser Test wird bei Raumtemperatur in einem 1 ml Testgemisch durchgeführt, das 100 µM Tris-HCl (pH 7,0), 1,6 µM p-Nitrophenylacetat und 1-20 µl Enzymlösung enthält. Die Aktivität wird durch Messen der Absorptionsveränderung bei 405 nm entweder in einem Cary Spektrophotometer Modell 219 oder einem Beckman DU-50 verfolgt.
Die folgende Sequenzliste liefert die DNA und Aminosäuresequenzen der erfindungsgemäßen Verbindungen. Diese Sequenzen werden in der Beschreibung und in den Ansprüchen durch SEQ ID Nummern bezeichnet. Der Fachmann erkennt, daß die DNA Sequenzen in der 5' nach 3' Richtung angegeben sind und die Aminosäuresequenzen vom Aminoterminus zum Carboxyterminus angegeben sind. Die Aminosäurereste werden folgendermaßen bezeichnet: Ala steht für einen Alaninrest, Arg steht für einen Argininrest, Asn steht für einen Asparaginrest, Asp steht für einen Asparaginsäurerest, Cys steht für einen Cysteinrest, Gln steht für einen Glutaminrest, Glu steht für einen Glutaminsäurerest, Gly steht für einen Glycinrest, His steht für einen Histidinrest, Ile steht für einen Isoleucinrest, Leu steht für einen Leucinrest, Lys steht für einen Lysinrest, Met steht für einen Methioninrest, Phe steht für einen Phenylalaninrest, Pro steht für einen Prolinrest, Ser steht für einen Serinrest, Thr steht für einen Threoninrest, Trp steht für einen Tryptophanrest, Tyr steht für einen Tyrosinrest und Val steht für einen Valinrest. In den DNA Sequenzen steht A für Desoxyadenyl, G für Desoxyguanyl, C für Desoxycytidyl und T für Thymidyl.

Sequenzliste

(1)Allgemeine Information:

(i) Anmelder: Eli Lilly and Company
(ii) Titel der Erfindung: Rekombinante DNA Verbindungen und Expressionsvektoren, die für die para- Nitrobenzylesteraseaktivität von Bacillus kodieren
(iii) Anzahl an Sequenzen: 7
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: Eli Lilly and Company
(B) Street: Erl Wood Manor
(C) Stadt: Windlesham
(D) Staat: Surrey
(E) Land: Vereinigtes Königreich
(F) Postleitzahl: GU20 6PH
(viii) Information über Anwalt/Agent:
(A) Name: Hudson, Christopher Mark
(B) Registriernummer: GA307
(C) Referenz/Aktenzeichennummer; X-8315
(ix) Telekommunikationsinformation:
(A) Telefon: (0276) 478441
(B) Telefax: (0276) 475306

(2) Information für SEQ ID Nr: 1:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 1470 Nukleotide
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Art des Strangs: doppelt
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 1 (2) Information für SEQ D Nr: 2:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 489 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Art des Strangs: einfach
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr:2

(2) Information für SEQ ID Nr:3:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Art des Strangs: einfach
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 3

(2) Information für SEQ ID Nr:4:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Lange: 41 Nukleotide
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Art des Strangs: einfach
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr:4

(2) Information für SEQ ID Nr: 5:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Lange: 41 Nukleotide
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Art des Strangs: doppelt
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 5

(2) Information für SEQ ID Nr: 6:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 34 Nukleotide
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Art des Strangs: einfach
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr:6

(2) Information für SEQ ID Nr: 7:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20 Nukleotide
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Art des Strangs: einfach
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 7

Claims

1. Isolierte DNA Verbindung, die eine DNA Sequenz enthält, welche eine PNB Esteraseaktivität von Bacillus subtilis kodiert.

2. Isolierte DNA Verbindung nach Anspruch 1, die ein Protein der SEQ D Nr:2 kodiert, wie dies hierin vorher beschrieben wurde.

3. Isolierte DNA Verbindung nach Anspruch 2, worin der kodierende Strang die SEQ D Nr: 1 enthält, wie dies vorher beschrieben wurde.

4. Rekombinanter DNA Vektor, der eine DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.

5. Rekombinanter DNA Vektor nach Anspruch 4, der ferner einen Promotor enthält, welcher zur Expressionssteuerung dieser für PNB Esterase kodierenden DNA positioniert ist.

6. Rekombinanter DNA Vektor nach Anspruch 5, worin dieser Promotor in Escherichia coli funktionsfähig ist.

7. Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA Vektor nach einem der Ansprüche 4 bis 6 transformiert ist.

8. Escherichia coli Zelle, die mit einem rekombinanten DNA Vektor nach einem der Ansprüche 4 bis 6 transformiert ist.

9. Verfahren zur Konstruktion einer rekombinanten Wirtszelle, die zur Expression der PNB Esteraseaktivität fähig ist, gekennzeichnet durch

Transformation dieser Wirtszelle mit einem rekombinanten DNA Expressionsvektor, der umfaßt

(a) einen Promotor und eine Translationsaktivierungssequenz, die in dieser Wirtszelle funktionsfähig sind

(b) eine DNA Sequenz, die für eine PNB Esteraseaktivität von Bacillus subtilis kodiert und zur Expression von diesem Promotor und dieser Translationsaktivierungssequenz positioniert ist.

10. Verfahren zur Expression der PNB Esteraseaktivität, gekennzeichnet durch Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA Expressionsvektor transformiert ist, der umfaßt

(b) eine DNA Sequenz, die für eine PNB Esteraseaktivität von Bacillus subtilis kodiert und zur Expression von diesem Promotor und dieser Translationsaktivierungssequenz positioniert ist,

unter zur Genexpression geeigneten Bedingungen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin dieser rekombinante DNA Expressionsvektor eine DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 2 oder 3 umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 10, worin diese Wirtszelle Escherichia coli ist.

13. Verfahren zur Entfernung der p-Nitrobenzylgruppe von einem Cephalosporin-PNB-ester oder einem 1- Carbacephalosporin-PNB-ester, gekennzeichnet durch Umsetzung dieses Esters mit einer PNB Esterase, die durch das Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12 hergestellt wurde.