JPH05276958A - バチルス由来のパラ−ニトロベンジルエステラーゼ活性をコード化する組換えｄｎａ化合物および発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 枯草菌由来のｐ-ニトロベンジルエステラー
ゼ(ＰＮＢエステラーゼ)をコード化する単離されたＤＮ
Ａ化合物、同エステラーゼ遺伝子を含有する組換えＤＮ
Ａクローニングベクターおよび組換えＤＮＡ発現ベクタ
ー、上記ベクターによって形質転換された宿主細胞、並
びにＰＮＢエステラーゼの組換え生産法を提供する。 【効果】 本発明は、セファロスポリン系抗生物質およ
び１-カルバセファロスポリン系抗生物質合成中間体の
脱ｐ-ニトロベンジル反応を触媒するＰＮＢエステラー
ゼの大量かつ簡便な調製を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は組換えＤＮＡ技術の分野
に関する。具体的には、本発明は、バチルス属由来の酵
素パラ-ニトロベンジルエステラーゼ(ＰＮＢエステラー
ゼ)をコード化するＤＮＡ化合物に関する。

【０００２】

【従来の技術】エステルは、遊離酸型のセファロスポリ
ン系抗生物質および１-カルバセファロスポリン系抗生
物質を合成する際によく使用される中間体である。セフ
ァロスポリン類の製造についてはシャウベット(Chauvet
te),米国特許第４０６４３４３号によって広く教示され
ている。１−カルバセファロスポリン類の製造について
はクリステンセン(Christensen)ら,米国特許第４２２６
８６６号、ムンロー(Munroe),米国特許第４７９１１０
６号、およびヒラタ(Hirata)ら,米国特許第４７０８９
５６号によって広く教示されている。

【０００３】ＰＮＢエステル官能基は、セファロスポリ
ンおよび１−カルバセファロスポリンの酸性カルボン酸
官能基を、その分子の他の部位での反応を行う間、遮断
または保護するために一般に使用されている。例えばガ
ルブレヒト(Garbrecht),米国特許第３６３２８５０号
は、セファレキシン合成におけるｐ-ニトロベンジルエ
ステル基の使用について記述している。この合成の第１
段階では、このエステルを酸性条件下での水素化分解に
よって切断する。米国特許第３７８１２８２号において
ガルブレヒトは、ジメチルホルムアミドなどのアミド型
溶媒中の亜鉛および酸によるセファロスポリンのｐ-ニ
トロベンジルエステルの脱エステル化について記述して
いる。ジャクソン(Jackson),米国特許第３７９９９２４
号は、約７以上のｐＨにおいて亜ジチオン酸ナトリウム
または亜ジチオン酸カリウムで処理することによるセフ
ァロスポリンエステルのｐ-ニトロベンジルエステル基
の除去について記述している。ハットフィールド(Hatfi
eld),米国特許第４０９１２１４号は、亜鉛とα-ヒドロ
キシカルボン酸を含有する不活性溶媒を用いて還元的に
切断することからなるセファロスポリン化合物のエステ
ルの脱エステル化法について記述している。ヒラタら,
米国特許第４７０８９５６号は、１-カルボセファロス
ポリン化合物からパラ-ニトロベンジル保護基を除去す
る方法について記述している。これらの脱エステル化法
には、溶媒の再利用コストが高いこと並びに有機溶媒が
汚染を引き起こすという潜在的な問題が伴う。

【０００４】セファロスポリンおよび１-カルバセファ
ロスポリン抗生物質の合成において使用されるＰＮＢ遮
断基を除去するための酵素法には明瞭な利点があろう。
温和な条件下で進行するこのような反応は有機溶媒と金
属触媒を使用することなく水性反応混合物中で完結し得
る。ブラノン(Brannon),米国特許第３９７２７７４号
は、セファロスポリンエステルをバチルス属の微生物か
ら得られる粗調製物と反応させることからなる、セファ
ロスポリンエステルからのＰＮＢエステルの除去法につ
いて記述している。しかしこの切断に寄与する酵素は単
離されなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】バチルスから単離され
る単離ＰＮＢエステラーゼ酵素を工業的規模の工程で使
用することは不可能であった。なぜならバチルス・ズプ
チリス(枯草菌)はこの酵素を低レベルにしか生産しない
からである。本発明は、バチルス・ズプチリス由来のパ
ラ-ニトロベンジルエステラーゼをコード化する組換え
ＤＮＡ化合物およびベクターを提供することにより、こ
の制約を除くものである。本発明が提供する新たに単離
されたＤＮＡ配列を用いることにより、組換え宿主細胞
中で大量のＰＮＢエステラーゼ活性を生産することがで
きる。このＰＮＢエステラーゼは、セファロスポリン系
抗生物質および１-カルバセファロスポリン系抗生物質
を製造する際に使用されるＰＮＢエステル遮断基を除去
するのに有用である。

【０００６】また本発明は、セファロスポリンエステル
または１-カルバセファロスポリンエステルからｐ-ニト
ロベンジル基を除去して対応するセファロスポリン酸ま
たは１-カルバセファロスポリン酸を製造するための酵
素的切断法をも提供する。この方法は、セファロスポリ
ンエステルまたは１-カルバセファロスポリンエステル
を好ましくは水性媒質中２５〜４０℃で、組換え法によ
って生産されたＰＮＢエステラーゼと反応させ、得られ
るセファロスポリン酸または１-カルバセファロスポリ
ン酸を回収することからなる。本方法は、セファクロル
およびロラカルベフを製造するにあたって、その合成中
これらの抗生物質の４-カルボキシル基がパラ-ニトロベ
ンジル基で保護されている場合にとりわけ価値がある。

【０００７】ロラカルベフ核遊離酸は、フェニルグリシ
ンメチルエステルがこの化合物と反応してロラカルベフ
とメタノールを生成する反応において、ペニシリンＧア
ミダーゼの基質である。同様に、ペニシリンＧアミダー
ゼは、セファクロル核遊離酸またはセファレキシン核遊
離酸とフェニルグリシンメチルエステルの、メタノール
とセファクロルまたはセファレキシンへの変換を触媒す
る。

【０００８】本発明が開示する宿主-ベクター系はＰＮ
Ｂエステラーゼを極めて効率的に生産するので、そのＰ
ＮＢエステラーゼは組換え大腸菌株中の可溶性タンパク
質の約１０〜２０％を占め得る。化学的中間体ロラカル
ベフＰＮＢからの遮断基の除去に基づいて測定される活
性なＰＮＢエステラーゼに関するこの遺伝子発現レベル
は、バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０７９中の発
現レベルより約１９０倍高い。さらに、生産レベルが高
いので、バチルス・ズプチリス株ＮＲＲＬ Ｂ−８０７
９から精製する場合よりかなり簡便かつ安価な方法で、
本酵素を精製することができる。

【０００９】本発明のＤＮＡ化合物は単一の読取り枠
（オープンリーディングフレーム,ＯＲＦ)中にＰＮＢエ
ステラーゼ活性をコード化している。この読取り枠の転
写と、それによって得られるｍＲＮＡの翻訳は、ＰＮＢ
エステラーゼ活性を保持する単一のポリペプチド鎖を与
える。ＰＮＢエステラーゼ活性をコード化するＤＮＡ化
合物をバチルス・ズプチリスのゲノムＤＮＡから単離
し、組換えＤＮＡ発現ベクターの構築にこれを使用し
た。本発明のＰＮＢエステラーゼコード化ＤＮＡ化合物
を用いて、ＰＮＢエステラーゼの生産に有用であろう多
種多様な発現ベクターを構築することができる。

【００１０】本発明は、バチルス・ズプチリスのＰＮＢ
エステラーゼ活性をコード化するＤＮＡ配列を含有する
ＤＮＡ化合物を包含する。また、組換えＤＮＡベクター
およびこれらの組換えＤＮＡベクターを含有する組換え
宿主細胞(例えば大腸菌)をも提供する。本発明が提供す
る特定のベクターにはプラスミドｐＮＢ１０６Ｒおよび
ｐＮＢ１０６ＲＭが含まれる。これらのベクターは、Ｐ
ＮＢエステラーゼ活性を発現させることができる組換え
宿主細胞を構築する方法であって、(ａ)該宿主細胞中で
機能するプロモーターおよび翻訳活性化配列、並びに
(ｂ)該プロモーターおよび翻訳活性化配列からの発現に
適した位置に置かれた枯草菌のＰＮＢエステラーゼ活性
をコード化するＤＮＡ配列、を含有する組換えＤＮＡ発
現ベクターで、該宿主細胞を形質転換することからなる
方法、において有用である。

【００１１】本発明のもう１つの有用な方法は、ＰＮＢ
エステラーゼ活性を発現させるために、上記方法によっ
て構築される宿主細胞を使用する方法であって、該宿主
細胞を遺伝子発現に適した条件下で培養することからな
る方法を包含する。

【００１２】本明細書に開示し、特許を請求する本発明
のために、以下の述語を定義する。 Ａｍｐ：アンピシリン耐性付与遺伝子。アンピシリン耐
性表現型を示すためにも使用される。 ｃＩ８５７：バクテリオファージラムダｐＬプロモータ
ーの温度感受性抑制因子をコード化する遺伝子。 クローニング：ＤＮＡの断片を組換えＤＮＡクローニン
グベクター中に組込む工程。 コード化配列：その遺伝子から発現するタンパク質のア
ミノ酸残基配列をコード化する、遺伝子中のＤＮＡ配
列。 遺伝子：その遺伝子産物の発現を制御するに適した位置
に置かれたプロモーター、翻訳活性化配列、コード化配
列および３'調節配列からなるＤＮＡ断片。 ゲノムライブラリー：特定の生物の全ゲノムに実質上相
当する複数のＤＮＡ断片がクローン化されている複数の
組換えＤＮＡクローニングベクターからなる集合。 ハイブリッド形成：２つの一本鎖ＤＮＡおよび／または
ＲＮＡ分子がアニールして、完全な塩基対になったある
いは完全な塩基対になっていない二本鎖分子を形成する
過程。 ロラカルベフ：(７Ｂ)-７-＜Ｄ-(アミノフェニルアセチ
ル)アミノ＞-３-クロロ-８-オキソ-１-アザビシクロ＜
４.２.０＞オクタ-２-エン-２-カルボン酸。 ロラカルベフ核：トランス-７-アミノ-３-クロロ-８-オ
キソ-１-アザビシクロ＜４.２.０＞オクタ-２-エン-２-
カルボン酸・一塩酸塩。 ロラカルベフＰＮＢエステル：７-[(アミノフェニルア
セチル)アミノ]-３-クロロ-８-オキソ-１-アザビシクロ
＜４.２.０＞オクタ-２-エン-２-カルボン酸(４-ニトロ
フェニル)メチルエステル。 ｍＲＮＡ：伝令リボ核酸。 ＯＲＩ：プラスミドまたはベクターの複製起点、即ち、
ＤＮＡポリメラーゼの結合または開始部位として機能す
るＤＮＡ配列。 ｐＬ：バクテリオファージラムダ由来の左方向プロモー
ター。ｐｎｂ Ａ：ＰＮＢエステラーゼ活性をコード化する遺伝
子。 プロモーター：ＤＮＡの転写を指示し、これを開始する
ＤＮＡ配列。 組換えＤＮＡクローニングベクター：１以上の追加ＤＮ
Ａ分子を付加することができるＤＮＡ分子からなる自律
的に複製するかもしくは統合する(組込まれる)物質であ
って、プラスミドを含むがこれに限定されない。 組換えＤＮＡ発現ベクター：ポリペプチドまたはＲＮＡ
をコード化するＤＮＡ断片の発現を制御するに適した位
置に置かれたプロモーターおよび他の調節配列を含有す
る、自律的に複製するかもしくは統合する物質であっ
て、プラスミドを含むがこれに限定されない。 組換えＤＮＡ配列：単離されたＤＮＡ配列、合成された
ＤＮＡ配列、または部分的に合成されたＤＮＡ配列であ
って、そのＤＮＡが由来する宿主染色体を除くあらゆる
ＤＮＡ配列。 制限断片：１またはそれ以上の酵素の作用によって生成
するあらゆる直線状ＤＮＡ分子。 ｒｏｐ：大腸菌から誘導されるプラスミドコピー数制御
要素をコード化するＤＮＡ領域。 ＴｅｔＲ：テトラサイクリン耐性付与遺伝子。テトラサ
イクリン耐性表現型を示すためにも使用される。 転写活性化配列：プロモーター。 転写終止因子：ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの転写
の終止の信号となるＤＮＡ配列。 形質転換体：形質転換を受けた受容宿主細胞。 形質転換：受容細胞の遺伝子型の変化をもたらす、受容
宿主細胞へのＤＮＡの導入。 翻訳活性化配列：ｍＲＮＡに転写された時にｍＲＮＡの
タンパク質への翻訳を促進する調節ＤＮＡ配列。

【００１３】図面に記載した制限酵素および機能地図は
本明細書で議論する組換えＤＮＡベクターの概略図であ
る。制限部位に関する情報は網羅的なものではなく、あ
る型の制限酵素部位は地図上に実際に示されているもの
以外にも存在し得る。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、バチルス・ズ
プチリスのＰＮＢエステラーゼをコード化する単離され
たＤＮＡ化合物、組換えＤＮＡクローニングベクターお
よび組換えＤＮＡ発現ベクターを包含する。バチルス・
ズプチリスＰＮＢエステラーゼコード化ＤＮＡの配列を
配列番号１とした。配列番号１を他の配列番号と共に配
列表中に記載する。

【００１５】配列番号１に記載のＤＮＡ配列によってコ
ード化されるＰＮＢエステラーゼのアミノ酸配列を配列
番号２とする。

【００１６】配列番号１に記載のＤＮＡ配列は、完全に
保護されたデオキシリボヌクレオチド構築ブロックを用
いる改良トリエステル法によって従来法で合成すること
ができる。このような合成法は当該技術分野でよく知ら
れており、実質的にイタクラらの方法(Itakuraら,1977,
Science 918:1056)およびクレアらの方法(Creaら,1978,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:5765)に従って行うことが
できる。さらに、シウングら(Hsiungら,1983,Nucleic A
cid Research 11:3227)およびナラングら(Narangら,198
0,Methods in Enzymology 68:90)には特に好ましい方法
が開示されている。上に挙げた方法に加えて、ＡＢＳ
[アプライド・バイオシステムズ(カリフォルニア州９４
４０４フォスター・シティー，リンカーン・センター・
ドライブ８５０番)]の３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザー
などの自動ＤＮＡ合成装置を用いて、配列番号１に記載
のＤＮＡ配列を合成することもできる。またポリメラー
ゼ連鎖反応によって配列番号１に記載のＤＮＡ配列を作
成することもできる。例えば米国特許第４８００１５９
号、同第４６８３２０２号、および欧州特許公開第０２
５８０１７号(１９８７年３月２日公開)を参照のこと。

【００１７】ほとんどのアミノ酸残基は複数のＤＮＡト
リプレットによってコード化されるので、配列番号２に
記載のアミノ酸配列は多数の異なるＤＮＡ配列によって
コード化され得る。これらの代替ＤＮＡ配列は同じ本発
明のアミノ酸配列をコード化し得るので、本発明はさら
にこれらの代替ＤＮＡ配列をも包含する。

【００１８】当業者には理解されるであろうように、本
発明は、ＰＮＢエステラーゼ遺伝子のコドンを意のまま
に改変することを可能にする。ＰＮＢエステラーゼのＤ
ＮＡ配列が与えられれば、当該技術分野でよく知られた
方法を用いて、天然の酵素とは異なる突然変異型ＰＮＢ
エステラーゼ酵素を、どのアミノ酸残基位置番号におい
ても作成することができる。このような突然変異型酵素
は突然変異型ＰＮＢエステラーゼコード化配列によって
コード化されるであろう。そのような突然変異型ＰＮＢ
エステラーゼコード化配列には、天然のＰＮＢエステラ
ーゼコード化配列からアミノ酸コドンが削除されている
配列や天然のＰＮＢエステラーゼコード化配列中にアミ
ノ酸コドンが挿入されている配列が含まれる。たとえあ
る突然変異がそれによってコード化されるＰＮＢエステ
ラーゼの活性を破壊するかどうかを全く予測することが
できないとしても、ＰＮＢエステラーゼ活性に対するそ
の効果を確かめるためには単に本明細書に記載する方法
によってその突然変異型配列を発現させるだけでよいの
で、このような突然変異型酵素は本発明の範囲に包含さ
れる。

【００１９】本発明は本明細書に例示する特定のベクタ
ーに限定されず、バチルス・ズプチリスのＰＮＢエステ
ラーゼ活性をコード化するＤＮＡ化合物すべてを包含す
る。本発明のＤＮＡ化合物を用いて発現ベクターを構築
し、その発現ベクターが複製するかもしくは統合し、か
つ、そのプロモーターと翻訳活性化配列が機能的であり
得る宿主細胞ならば、どのような宿主細胞中でもその発
現ベクターによってエステラーゼ活性の発現させること
ができる。

【００２０】即ち本発明は、大腸菌中でＰＮＢエステラ
ーゼ活性の発現を制御するあらゆる大腸菌プラスミドま
たは他のベクターを包含する。本発明は、ＰＮＢエステ
ラーゼ活性の発現を制御し、大腸菌中で機能的なレプリ
コン(例えばｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、Ｆ、Ｃ
ｏｌＶ-Ｋ９４、Ｒ１、Ｒ６-５、またはＲ１００など)
を使用するベクターを包含する。本発明はプラスミドベ
クターのみに限定されるのではなく、ＰＮＢエステラー
ゼ活性を発現させ、宿主細胞中での複製と維持に対応す
るために統合またはウイルス複製を使用する他のベクタ
ーをも包含する。

【００２１】本発明は、ＰＮＢエステラーゼ活性コード
化ＤＮＡの発現を制御するための特定のプロモーターお
よび翻訳活性化配列に限定されない。本発明は大腸菌中
で機能し、大腸菌中でＰＮＢエステラーゼ活性を発現さ
せるために使用されるあらゆるプロモーターおよび翻訳
活性化配列の使用を包含する。大腸菌中で機能的な数多
くのプロモーターおよび翻訳活性化配列が知られてお
り、これらは大腸菌中でのエステラーゼ活性の発現を制
御するのに適している。このような転写および翻訳活性
化配列には、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、λｐ
Ｌ、およびλｐＲプロモーターおよび翻訳活性化配列が
含まれるが、これらに限定されない。

【００２２】さらに、他の生物から得られる転写および
翻訳活性化配列を本ＰＮＢエステラーゼ活性コード化Ｄ
ＮＡ化合物に連結し、その活性化配列が機能する宿主細
胞中でＰＮＢエステラーゼ活性の発現を制御する発現ベ
クターを作成することもできる。大腸菌はＰＮＢエステ
ラーゼの生産とそれに続く試験管内で使用するための精
製にとっては最も適した宿主であるが、大腸菌以外の宿
主細胞中でＰＮＢエステラーゼ活性の発現を制御するベ
クターも有用である。

【００２３】ある宿主細胞が与えられた時、その宿主細
胞中に導入されてその宿主細胞内のＰＮＢエステラーゼ
活性の濃度を増大させるであろうベクターは次の要素を
必要とする：１）本発明のＰＮＢエステラーゼ活性コー
ド化ＤＮＡ化合物および２）形質転換される宿主細胞内
で機能するばかりでなく、上記ＰＮＢエステラーゼ活性
コード化ＤＮＡの発現を制御するに適した位置と配向で
置かれたプロモーターおよび翻訳活性化配列。当然のこ
とながら、安定な形質転換体は、ベクターが染色体外要
素として、あるいはゲノムＤＮＡに統合されて、その宿
主細胞中で複製する場合にのみ得ることができる。した
がって、好ましいベクターは宿主細胞におけるそのベク
ターの複製または統合を特異的に指示する配列を含有す
る。しかし、ＤＮＡが宿主細胞中に導入されると非特異
的な統合が起こり得るので、このような特異的複製また
は統合配列が絶対的に必要なわけではない。ＰＮＢエス
テラーゼ発現ベクターは、抗生物質耐性付与遺伝子また
はそのベクターを含有する宿主細胞を選択する手段を提
供する何らかの他の要素を含有することもできる。ただ
し、そのベクターが宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に統合す
る場合にはこのような選択可能な要素は必要ではなく、
また望ましくもない。

【００２４】バチルス・ズプチリスのＰＮＢエステラー
ゼ遺伝子のコード化配列を提供することにより、本発明
は形質転換を受け得るあらゆる生物用のＰＮＢエステラ
ーゼ発現ベクターを提供する。本明細書に記述する大腸
菌ＰＮＢエステラーゼ発現ベクターは多種多様な本発明
の発現ベクターを例示するものである。しかし、ＰＮＢ
エステラーゼの発現を制御するべく設計される本発明の
好ましいベクターは数多くある。

【００２５】本発明のさらなる理解を助けるべく以下に
実施例を記載する。使用した特定の材料、種および条件
は本発明をさらに例示するためのものであって、本発明
の妥当な範囲を制限しようとするものではない。

【００２６】ＤＮＡの操作法と分析法は基本的にサムブ
ルック(Sambrook)ら,1989,“Molecular Cloning：a Lab
oratory Manual"(コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー・プレス,ニューヨーク州コールド・スプリング・
ハーバー)に記述されているように行った。制限酵素反
応の条件はその製造者ら[ベーリンガー・マンハイム(Ｂ
Ｍ)(インディアナ州インディアナポリス)、ニュー・イ
ングランド・バイオラボラトリーズ(ＮＥＢ)(マサチュ
ーセッツ州ベバーリー)、ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ(ＢＲＬ)(メリーランド州ガイサースブルグ)]
の推奨する条件を用いた。

【００２７】実施例１：バチルス・ズプ チリス(ＮＲＲ
Ｌ Ｂ-８０７９)ＤＮＡのゲノムラ イブラリーからのＰ
ＮＢエステラーゼ遺伝子(ｐｎｂＡ)の単離 Ａ．菌株の説明と遺伝子型 バチルス・ズプチリス株ＮＲＲＬ Ｂ-８０７９を、セフ
ァロスポリンからパラ-ニトロベンジルエステルを除去
することができる微生物を同定するべく設計されたスク
リーニング法で単離した(Brannonら,J.Antibiotics XXI
X No.2:121-124,1976)。バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ
Ｂ-８０９７はノーザン・リジョナル・リサーチ・ラボ
ラトリー(ＮＲＲＬ)(米国農務省，イリノイ州６１６０
４ペオリア)の永久保存株に寄託されており、受託番号
Ｂ-８０７９の下で入手可能である。エシェリシア・コ
リ(大腸菌)Ｋ１２ ＤＨ５α^TM[マックス・エフィシェン
シーＤＨ５α^TMコンピテント・セル；ギブコ ＢＲＬ製
(メリーランド州ガイサースブルク)]は、高い形質転換
能と大腸菌プラスミドの維持にとって安定な環境を提供
するために開発されたｒｅｃＡ^-株である。この大腸菌
株を、バチルス・ズプチリス株ＮＲＲＬ Ｂ-８０７９ゲ
ノムライブラリー用の宿主細胞として使用した(実施例
１Ｊを参照のこと)。クローン化したＰＮＢエステラー
ゼ遺伝子の高レベル発現にはｒｅｃＡ⁺大腸菌Ｋ１２株
ＲＶ３０８を使用した。この大腸菌株は、大腸菌中で異
種タンパク質を工業的規模で発現させる際の宿主として
好ましい。大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８はＮＲＲＬに寄託
されており、受託番号Ｂ-１５６２４の下で入手可能で
ある。大腸菌Ｗ ＡＴＣＣ １１１０５も異種タンパク質
発現用の宿主として使用することができる。この宿主株
はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Ａ
ＴＣＣ)(メリーランド州２０８５２ロックビル)から受
託番号ＡＴＣＣ １１１０５の下で入手することができ
る。

【００２８】Ｂ．菌株の培養 トリプチカーゼ^R-ソイ・ブロス(ＴＳＢ；ベクトン・デ
ィッキンソン・マイクロバイオロジー・システムズ製)
およびルリア・ブロス(Ｌ-ブロス；１リットルあたり１
０g ディフコ・バクト-トリプトン^R、１０g ＮａＣｌお
よび５g 酵母エキス)を液体培養用の生育培地として使
用した。固体培地上での培養は２％(ｗ／ｖ)寒天を補足
したＬ-ブロス(Ｌ-寒天)上で生育させた。必要な場合に
は次の濃度で抗生物質を培地に添加した：アンピシリン
(５０μg／ml)、テトラサイクリン(５μg／ml)。β-ガ
ラクトシダーゼ活性を検出するために、５-ブロモ-４-
クロロ-３-インドリル-Ｄ-ガラクトシド[Ｘ-ｇａｌ；シ
グマ・ケミカル・カンパニー製(ミズーリ州６３１７８
セントルイス)]を２０μg／mlの濃度で培地に添加し
た。

【００２９】Ｃ．大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α、大腸菌Ｋ１
２ ＲＶ３０８および大腸菌Ｗ ＡＴＴＣ １１１０５の
形質転換 大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α感応細胞をＢＲＬから入手し、
製造者の実験案を用いてこれを形質転換した。別法とし
て、大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５α、ＲＶ３０８またはＡＴＣ
Ｃ １１１０５の培養５０mlをＬ-ブロス中でＯＤ₅₉₀が
約０.５吸光度単位になるまで生育させ、その細胞を遠
心分離によって集めた。細胞ペレットを冷たい１００mM
ＣａＣｌ₂ ２５mlに再懸濁し、氷上で２５分間インキ
ュベートした。その細胞を遠心分離によって集め、冷た
い１００mM ＣａＣｌ₂ ２.５ml中に再懸濁し、氷上で終
夜インキュベートした。感応細胞を直接使用するか、も
しくは形質転換に使用する準備が調うまで−７０℃で保
存した。

【００３０】感応性大腸菌細胞を形質転換するために、
感応細胞懸濁液１００μｌを−７０℃の貯蔵庫から取り
出し、氷上で融解させる。ポリプロピレン製チューブ中
で細胞をプラスミドＤＮＡの溶液(１ng／ml)５μlと穏
やかに混合し、得られた溶液を氷上で３０分間インキュ
ベートした。このチューブを４２℃の水槽に移し、振盪
せずに４５秒間インキュベートした。この熱ショック処
理後、チューブを氷上に２分間静置した。次に、チュー
ブを氷から取り出し、予め室温にインキュベートしてお
いたＳ.Ｏ.Ｃ.培地(２％バクト-トリプトン^R、０.５％
酵母エキス、１０mM ＮａＣｌ、２.５mM ＫＣｌ、１０m
M ＭｇＣｌ₂、１０mM ＭｇＳＯ₄、２０mMグルコース)
０.９mlを加えた。次に、その細胞懸濁液を３７℃２２
５rpmで１時間振盪し、その一部をアンピシリンの入っ
たＬ-寒天上に植菌した。３７℃でインキュベートした
後、形質転換体と推定される菌をプレートから選び取っ
た。形質転換体と推定される菌の帰属を、水平ゲル電気
泳動を用いてプラスミドＤＮＡのサイズを測定すること
によって確認した(Sambrookら,1989)。選択したクロー
ンから得たプラスミドＤＮＡを制限酵素分析によって特
徴づけた。

【００３１】Ｄ．プラスミドＤＮＡの単離 標準的なアルカリ-ＳＤＳ法(Sambrookら,1989)を用いて
大腸菌株からプラスミドＤＮＡを単離した。別法とし
て、プラスミドＤＮＡを次のように単離した。５０mg／
mlのアンピシリンを含有するＬ-寒天上で生育する形質
転換体コロニーの一部を５０mg／mlのアンピシリンを含
むＬ-ブロス １リットルに移し、これを空気振盪機中３
７℃で約１６時間インキュベートした。ベックマンＪＡ
-１０ローター[ベックマン・インストルメンツ,インコ
ーポレイテッド(カリフォルニア州９２６３４フラート
ン)製]を用いる４℃,８０００rpm,１０分間の遠心分離
によって５００mlチューブ中に細胞を収集した。細胞ペ
レットをｐＨ８.０のＴＥ[１０mMトリス塩酸、１mMエチ
レンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)]で洗浄し、遠心分
離によって集め、５０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)、２５
％ショ糖中に再懸濁して全量を１０mlとした。２５mMト
リス塩酸(ｐＨ８.０)中の２０mg／mlリゾチーム[シグマ
・ケミカル・カンパニー(ミズーリ州セントルイス)]１m
lを撹拌しながら加え、その混合物を氷上で３０分間イ
ンキュベートした。２００mM ＥＤＴＡ４mlを加えた
後、氷上で１０分間インキュベートし、次いでブリージ
／ＤＯＣ溶菌溶液[１％ブリージ５８、０.４％デオキシ
コレート、５０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)、６０mM ＥＤ
ＴＡ]１５mlを添加した。混合するためにチューブを穏
やかに反転させ、氷上で１５〜３０分間インキュベート
した。ベックマンＪＡ-２０ローター中１８０００rpmで
１時間遠心分離することにより細胞残渣を除去した。上
清を静かに移すことにより約３０mlを得、これに１０mg
／mlのＲＮＡｓｅＡ(シグマ・ケミカル・カンパニー製)
１５０mlを加えた。３７℃で１時間インキュベートした
後、１０mg／mlのプロテイナーゼＫ(ベーリンガー・マ
ンハイム製)１５０mlを加え、次いで３７℃でさらに１
時間インキュベートした。１／１０体積の３M酢酸ナト
リウム(ｐＨ７.０)を添加し、次いで３体積の氷冷無水
エタノールを添加することによってＤＮＡを沈殿させ
た。ベックマンＪＡ-１４ローター[ベックマン・インス
トルメンツ,インコーポレイテッド製(カリフォルニア州
９２６３４フラートン)]中８０００rpmで３０分間の遠
心分離によってＤＮＡを回収した。風乾したペレットを
ＴＥ(ｐＨ８.０)に再懸濁して全量を９mlにし、これに
塩化セシウム(ベーリンガー・マンハイム製)９gおよび
１０mg／ml臭化エチジウム ０.５mlを加えた。得られた
溶液を２つの５.１mlクイック-シール(Quik-Seal)チュ
ーブ(ベックマン・インストルメンツ,インコーポレイテ
ッド製)に移し、ベックマンＶＴｉ６５.２超遠心ロータ
ー中６５０００rpmで６時間遠心分離した。紫外光下で
プラスミドバンドを可視化し、これを注射器で取り出し
た。臭化エチジウムを除去するために得られたＤＮＡ溶
液を塩飽和イソプロパノールで抽出し、１０００倍体積
のＴＥ(ｐＨ８.０)に対して１６時間透析した。必要に
なるまで、ＤＮＡ溶液を−２０℃で保存した。

【００３２】Ｅ．ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)増幅 ＤＮＡサーマルサイクラー(ＤＮＡ Thermal Cycler^TM)
とジーン-アンプ(Gene-Amp^TM)試薬キット[パーキン-エ
ルマー・シータス製(コネチカット州０６８５９ノルウ
ォーク)]を用い、製造者の指針に従ってポリメラーゼ連
鎖反応を行った。次のインキュベーションを１サイクル
として３０サイクルの増幅を行った：９３℃で１分、次
いで４０℃で２分、次いで７２℃で４分。７２℃で１０
分間インキュベートすることによって合成を完結させ
た。

【００３３】Ｆ．ヌクレオチド配列の分析 キアゲン(Qiagen)ＤＮＡ結合カラム[キアゲン,インコー
ポレイテッド(カリフォルニア州チャトスワース)]を用
い、製造者が示す実験案に従って、大腸菌培養のアルカ
リ溶菌液から配列決定用の高次コイルプラスミドＤＮＡ
鋳型を精製した。蛍光性色素標識ジデオキシヌクレチ
ド、高次コインプラスミド鋳型および配列特異的オリゴ
ヌクレオチドプライマーを用い、サイクル配列決定法
[アプライド・バイオシステム,インコーポレイテッド
(ＡＢＩ)(カリフォルニア州９４４０４フォスターシテ
ィー)]に従って、ジデオキシヌクレオチド鎖終結(チェ
ーン・ターミネーション)配列決定反応を行った。配列
決定反応液をＡＢＩモデル３７３Ａ自動ＤＮＡシークエ
ンサーで分析した。ヌクレオチド配列を集め、編集し、
デベルックス(Devereux)らのＧＣＧコンピュータープロ
グラム(1985,Nucleic Acids Res.12:387-395)を用いて
分析した。

【００３４】Ｇ．オリゴヌクレオチドプローブの合成と
末端ラベル化 バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０７９から精製し
たＰＮＢエステラーゼ[分子量約５４０００，比活性約
２.２Ｕ／mg（ロラカルベフＰＮＢエステルの対応する
遊離酸への加水分解に基づく)]２５ピコモルを自動気相
シークエネーターでの分析(Hewickら,1981,J.Biol.Che
m.256:7990；HunkapillerおよびHood,1978,Biochemistr
y 17:2124)にかけることにより、この酵素(実施例７の
方法で精製したもの)のアミノ末端配列を得た。ＰＮＢ
エステラーゼのアミノ末端のアミノ酸配列を配列番号３
として記載する。

【００３５】配列番号３とバチルス・ズプチリスに関す
る公知のコドン使用則[Harwoodら,“Molecular Biologi
cal Methods for Bacillus",ジョン・ウィリー・アンド・
サンズ・リミテッド,イングランド,ウエスト・サセックス
(１９９０)]に基づき、β-シアノエチルホスホルアミダ
イト化学を用いるアプライドバイオシステムズ,インコ
ーポレイテッド・モデル３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置で、
製造者の指針に従って、２つのオリゴヌクレオチドプロ
ーブを合成した。これらのオリゴヌクレオチドプローブ
を配列表に配列番号４および配列番号５として記載す
る。

【００３６】配列番号４および配列番号５に記載のオリ
ゴヌクレオチドをまずカラム精製(オリゴヌクレオチド
・ピュリフィケーション・カートリッジ；アプライド・
バイオシステムズ,インコーポレイテッド製)し、次に以
下のように末端ラベル化した。キナーゼ緩衝液[５０mM
トリス塩酸(ｐＨ７.６)、１０mM ＭｇＣｌ₂]中のＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ ８単位および[γ-³²Ｐ]アデノ
シン三リン酸(ＡＴＰ；５０００Ci／ml)１２μlを含有
する２０μｌの反応混合物に、各プローブ１０ピコモル
を添加した。３７℃で３５分間反応させ、キナーゼを不
活化するために７０℃で５分間インキュベートした後、
セファデックスＧ-５０ニックカラム[ファルマシア,イ
ンコーポレイテッド製(ニュージャージー州０８８５４
ピスカタウェイ)]を用いて、取り込まれなかった[γ-³²
Ｐ]ＡＴＰを反応混合物から除去した。

【００３７】Ｈ．バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８
０７９からのゲノムＤＮＡの単離 ＴＳＢ中２５℃で１６時間生育して対数増殖中期に達し
たバチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０７９の培養２
リットルから全ＤＮＡを単離した。遠心分離によって細
胞を収集し、緩衝液[５０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)、５
０mM ＥＤＴＡ]２０ml中に再懸濁した。細胞の溶解を次
の２工程で達成した：(ｉ)１mg／mlのリゾチーム[卵白
由来：カルバイオケム製(カリフォルニア州ラ・ジョ
ラ)]を添加し、その懸濁液を３７℃で２０分間インキュ
ベートし、次いで(ii)溶菌緩衝液[０.５％ドデシル硫酸
ナトリウム(ＳＤＳ)、５０mMトリス(ｐＨ７.５)、０.４
M ＥＤＴＡ、１mg／mlプロテイナーゼＫ]４mlを添加
し、５０℃で３０分間インキュベートする。２回フェノ
ール抽出し、次いで１回クロロホルム抽出することによ
ってＤＮＡを精製した後、エタノールで沈殿させ、これ
をガラス棒に巻き取ることによって回収した。１mM Ｅ
ＤＴＡと０.２mg／mlリボヌクレアーゼ(ウシ膵臓由来；
シグマ・ケミカル・カンパニー製)を含有する４０mMト
リス塩酸緩衝液(ｐＨ７.５)中にＤＮＡを穏やかに再懸
濁し、その調製物を２５℃で３０分間インキュベートす
ることによって、上記調製物からＲＮＡを除去した。フ
ェノールとクロロホルムで再抽出し、これをＴＥ(ｐＨ
７.５)に再懸濁することによってさらなる精製を達成し
た。

【００３８】Ｉ．オリゴヌクレオチドプローブを用いる
ＥcoＲＩ制限断片のサザンハイブリッド形成 バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０７９から得たゲ
ノムＤＮＡをＥcoＲＩで消化し、１％アガロス-ＴＢＥ
ゲル(Sambrookら,1989)での電気泳動にかけた。次に、
サイズ分画したＤＮＡをサザンブロッティング(Sambroo
kら,1989)によってハイボンド-Ｎ＋ ナイロン膜[アマシ
ャム製(米国イリノイ州アルリングトン・ハイツ)]に転
写し、紫外光で５分間処理することによって上記基盤に
架橋させた。そのＤＮＡを、６×ＳＳＣ[１×ＳＳＣ(ｐ
Ｈ７.０)は０.１５M ＮａＣｌ、０.０１５Mクエン酸ナ
トリウムを含有する]、５×デンハルト溶液[１×デンハ
ルト溶液は０.２g／l フィコール４００、０.２g／l ポ
リビニルピロリドンおよび０.２g／ｌ ウシ血清アルブ
ミン(フラクションＶ)を含有する]、０.２５％ＳＤＳ、
および超音波処理によって断片化した２０μg／mlウシ
胸腺ＤＮＡを含有するハイブリッド形成緩衝液中７０℃
で１〜２時間予備ハイブリッド形成させた後、[³²Ｐ]-
標識オリゴヌクレオチド(実施例１Ｇに記述するように
調製したもの)を含有する新鮮なハイブリッド形成緩衝
液を加えて最終プローブ濃度を０.５ピコモル／mlにし
た。このインキュベーション混合物の温度を終夜インキ
ュベーションの間に４５℃に低下させた。次に、各プロ
ーブについて最適化した厳密度条件を用いてこの膜を洗
浄した。配列番号４に記載のプローブにハイブリッド形
成させた膜は、４×ＳＳＣ、０.２５％ＳＤＳ中４５℃
で３回連続して２５分間洗浄した。配列番号５に記載の
プローブにハイブリッド形成させた膜は、０.５×ＳＳ
Ｃ、０.２５％ＳＤＳを用いて同様に洗浄した。洗浄
後、膜を室温で乾燥し、フィルムにさらした。

【００３９】上記の方法を用いることによって、約６kb
の大きさのＥc oＲＩ断片を示すバンドが配列番号４およ
び配列番号５に記載のプローブとハイブリッド形成する
ことがわかった。

【００４０】Ｊ．ＥcoＲＩ断片の濃縮ライブラリーの構
築とｐＮＢＥ１の単離 バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０９７ゲノムＤＮ
ＡをＥcoＲＩで完全に消化し、水平１.２％アガロース
ゲル(４０mMトリス酢酸および１mM ＥＤＴＡからなる１
×ＴＡＥ緩衝液中，２Ｖ／cm)中で１６時間電気泳動に
かけた。このゲルを臭化エチジウム希釈液(１mg／ml)中
で染色し、長波長紫外光下でＤＮＡバンドを可視化し
た。大きさが約６kbのＤＮＡに対応するゲルの領域であ
って、かつ、配列番号４および配列番号５に記載のプロ
ーブとハイブリッド形成することが既にわかっているバ
ンドをまたぐゲルの領域から切片を取り出した。サムブ
ルックらの手法(Sambrook,1989)に従い、これにわずか
な調整を加えて、ゲル切片からＤＮＡ断片を溶出させ
た。簡単に述べると、ゲル切片を０.２×ＴＡＥ緩衝液
２００μlと共に透析袋中に入れ、クリップで封印し、
０.２×ＴＡＥ緩衝液中で約３時間電気泳動した。透析
袋の内容物を０.２×ＴＡＥによる洗浄液４００μｌと
共に低塩緩衝液［０.２M ＮａＣｌ、２０mMトリス塩酸
(ｐＨ７.５)、１.０mMＥＤＴＡ]２.４mlと混合し、これ
を製造者の実験案に従って調製したエルーチップ-ｄカ
ラム[シュライシャー・アンド・シュネル製(ニューハン
プシャー州キーン)]に充填した。低塩緩衝液で洗浄した
後、４００μlの高塩緩衝液[１.０M ＮａＣｌ、２０mM
トリス塩酸(ｐＨ７.５)、１.０mM ＥＤＴＡ]を２回用い
てＤＮＡを上記カラムから溶出させ、そのＤＮＡを氷冷
無水エタノール８００μlの添加によって沈殿させ、次
いでエッペンドルフ５４１５Ｃ微量遠心機中１４０００
rpmで４０分間遠心分離した。風乾した２つのペレット
をＴＥ(ｐＨ７.５)２０mlに溶解することによって合わ
せ、その溶液を連結操作まで−２０℃で保存した。これ
らの断片を、ＥcoＲＩ消化とそれに続くウシ腸アルカリ
性ホスファターゼ[カルバイオケム製(カリフォルニア州
ラ・ジョラ)]での５'リン酸基除去によって予備処理し
たベクターｐＵＣ１９[ギブコ ＢＲＬ製(メリーランド
州ガイサースブルク)]中に連結した。

【００４１】得られたプラスミドを用いて感応性大腸菌
Ｋ１２ ＤＨ５α細胞を形質転換し、次いでそれらの細
胞をアンピシリンとＸ-Ｇａｌの入ったＬ-寒天プレート
に植菌した。ベクターとしてプラスミドｐＵＣ１９を使
用することにより、青／白選択を用いて、挿入ＤＮＡを
含有するクローンを特異的に選択することができる。β
-ガラクトシダーゼのα-ペプチドをコード化するｌａｃ
Ｚ遺伝子の一部を含むｐＵＣ１９ベクターのみを含有す
る形質転換体は、Ｘ-Ｇａｌの切断で生じる青色によっ
て検出される活性な酵素を生産する。対照的に、ＥcoＲ
Ｉ部位に挿入物を含有する単離体は上記α-ペプチドの
読み枠を破壊し、Ｘ-Ｇａｌを変換することができない
ので、この単離体はＸ-Ｇａｌを含有する培地上で白色
のままである。１００以上の白いアンピシリン耐性コロ
ニーを選択し、表現型の安定性を試験するために同寒天
上に再植菌した。

【００４２】白コロニーからプラスミドＤＮＡを単離
し、これをゲル電気泳動によって分析した。必要な９kb
の大きさ(２.６８６kbのｐＵＣ１９ＤＮＡ＋約６kbの挿
入ＤＮＡ)のプラスミドＤＮＡを含有する７つのコロニ
ーをさらなる研究のために選択した。配列番号４に記載
のプローブを用いるサザンハイブリッド形成によって試
験したところ、１つのプラスミドｐＮＢＥ１が強いハイ
ブリッド形成信号を示した。プラスミドｐＮＢＥ１をＥ
coＲＩで消化すると予期される大きさの２つの断片、即
ち、直線化したｐＵＣ１９(２.６８６kb)に対応する１
断片と挿入断片に対応する約６kbの大きさのもう１つの
断片が得られた。

【００４３】Ｋ．プラスミドｐＮＢＥ１上のｐｎｂＡの
転写の方向の解明 ｐＵＣ１９のｌａｃＺ遺伝子に対するｐｎｂＡの転写の
方向と、ｐＮＢＥ１挿入物中のＡＴＧ転写開始部位のお
よその位置を決定するために、ｐＮＢＥ１を用いて２回
のＰＣＲ増幅を行った。第１の増幅では配列番号５に記
載のオリゴヌクレオチドプローブと順方向(−２０)Ｍ１
３ＤＮＡ配列決定用プライマー(ニュー・イングランド
・バイオラブス製)を使用した。第２の増幅でも配列番
号５に記載のオリゴヌクレオチドを使用したが、もう１
つのプライマーは逆方向(−２４)Ｍ１３配列決定用プラ
イマーであった。その結果、(−２０)順方向配列決定用
プライマーを用いた反応のみが増幅した断片を与えるこ
とがわかった。増幅された断片の大きさを決定したとこ
ろ、２.０kbであった。したがって、ｐｎｂＡのＡＴＧ
開始部位はｐＵＣ１９のマルチクローニング部位の開始
部位から約４キロ塩基対(kb)下流に位置し、ｌａｃＺ遺
伝子と同じ方向に転写される。

【００４４】Ｌ．機能的ｐｎｂＡ遺伝子の確認 全ｐｎｂＡ遺伝子がｐＮＢＥ１上に存在するかどうか、
また、それが大腸菌中で発現することができるかどうか
を決定するために、プラスミドｐＮＢＥ１で形質転換し
た大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α細胞の抽出物をエステラーゼ
活性について検定した。Ｌ-ブロス中で対数増殖中期ま
で生育した培養約７５mlから細胞抽出物を調製した。８
０００rpmで１０分間の遠心分離によって細胞を収集
し、１０mMリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.０)中で洗
浄し、再度遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁(１g細
胞／４ml緩衝液)し、３０秒間の超音波破砕[ソニケータ
ー(Sonicator^TM)セル・ディスラプター・モデルＷ１８５
Ｆ；ヒート・システムズ-ウルトラソニックス,インコー
ポレイテッド製(ニューヨーク州プラインビュー)]に４
回さらすことによって破壊した。微量遠心機中最大速度
で２０分間の遠心分離によって細胞残渣を除去した。精
製ＰＮＢエステラーゼはβ-ラクタム系抗生物質のｐ-ニ
トロベンジルエステルだけでなく酢酸ｐ-ニトロフェニ
ルの切断をも触媒するので、この反応を利用してｐ-ニ
トロフェノールの生成を分光光度測定法で都合よく監視
することができた。０.５M 酢酸ｐ-ニトロフェニル[１:
９９(ｖ／ｖ)アセトニトリル／水中]４００μl、１６７
mMトリス塩酸(ｐＨ７.０)６００μlおよび無細胞抽出物
１〜２０μlを含有する反応混合物を用いた。ギルフォ
ード・レスポンスII分光光度計を用いてＯＤ₄₀₅の増大
を監視することにより、ｐ-ニトロフェノールの生成を
分光光度測定法で測定した。別法として、爪楊枝を用い
てコロニーの一部を上記反応混合物中に添加することに
より、全細胞を使って酵素活性を定性的に明らかにする
こともできた。これらの方法による全細胞と無細胞抽出
物の検定は共に、プラスミドｐＮＢＥ１が無傷のｐｎｂ
Ａ遺伝子を含有すること並びに該遺伝子が発現して活性
な酵素を生産したことを立証した。プラスミドを保持し
ない大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α細胞中、あるいは上記ゲノ
ムライブラリーから得られる他の非ハイブリッド形成性
プラスミドを保持する大腸菌Ｋ１２ＤＨ５α細胞中には
有意な活性が検出されなかった。

【００４５】Ｍ．ｐｎｂＡ遺伝子のサブクローニング 実施例１Ｋに記述したＰＣＲ実験から得られた情報およ
びｐＮＢＥ１の一制限酵素消化および二重制限酵素消化
の結果を用いて、上記６.０kbＥcoＲＩ断片の予備的な
物理的地図を作成することができた。プラスミドｐＮＢ
Ｅ１の制限酵素および機能地図を図１に示す。次に、ｐ
ＮＢＥ１をＨpaIIで部分消化した後、ＥcoＲＩで完全消
化し、得られたＨpaII-ＥcoＲＩ断片をＡccＩ-ＥcoＲＩ
で消化したｐＵＣ１９に連結することによって、このプ
ラスミドの一連のサブクローンを作成した。上記挿入物
のＨpaII部位とｐＵＣ１９のＡccＩ部位はこの連結によ
って再生されなかった。次に、得られたプラスミドを大
腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α細胞中に導入し、アンピシリン耐
性コロニーを選択し、それらをエステラーゼ活性につい
て試験した。いくつかの陽性クローンからプラスミドＤ
ＮＡを単離し、それらを分析してそのＨpaII-ＥcoＲＩ
挿入物の大きさを決定した。活性な酵素をコード化する
最も小さい挿入物は２.３kbであった。このプラスミド
ベクターをｐＮＢＨｐＥ２.３と命名した。

【００４６】さらにサブクローニング実験を行ったとこ
ろ、上記２.３kb挿入物の遠位末端にあるＳalＩ-ＥcoＲ
Ｉ断片が機能的なｐｎｂＡ遺伝子にとっては必要ないこ
とがわかった。ｐＮＢＨｐＥ２.３をまずＨindIIIとＳa
lＩで消化し、これをＨindIIIとＳalＩで消化したｐＵ
Ｃ１９に連結した後、大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α細胞中に
導入した。この構築によって得られたプラスミドをｐＮ
ＢＨ３Ｓ１.９と命名した。ｐＮＢＨ３Ｓ１.９は１.９k
bのＨpaII-ＳalＩ挿入物を含有し、活性なＰＮＢエステ
ラーゼタンパク質をコード化していた。このプラスミド
から得られる挿入ＤＮＡをｐＢluesript ＳＫ(−)[スト
ラタジーン製(カリフォルニア州ラ・ジョラ)]中にサブ
クローニングし、そのヌクレオチド配列を決定するべく
分析した。バチルス・ズプチリスから得られるＰＮＢエ
ステラーゼのコード化配列を配列表に配列番号１として
記載する。

【００４７】実施例２：大腸菌における ｐｎｂＡ遺伝子
の高レベル発現 クローン化したＰＮＢエステラーゼ遺伝子の大腸菌にお
ける発現を、ベクターｐＮＢ１０６ＲおよびｐＮＢ１０
６ＲＭを構築することによって改善した。プラスミドｐ
ＮＢ１０６Ｒはプラスミドコピー数の制御に寄与するｒ
ｏｐ遺伝子を含有する(Cesareniら,1982,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 79:6313)。プラスミドｐＮＢ１０６Ｒの制限
酵素および機能地図を図２に示す。プラスミドコピー数
がｐｎｂＡ遺伝子の発現に与える効果を決定するため
に、ｒｏｐ遺伝子を欠くプラスミドｐＮＢ１０６ＲＭを
プラスミドｐＮＢ１０６Ｒから誘導した。プラスミドｐ
ＮＢ１０６ＲＭの制限酵素および機能地図を図３に記載
する。

【００４８】Ａ．大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α／ｐＮＢ１０
６Ｒ、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＮＢ１０６Ｒおよ
び大腸菌Ｗ ＡＴＣＣ１１１０５／ｐＮＢ１０６Ｒの構
築 異種遺伝子を改良型バクテリオファージラムダｐＬプロ
モーターから温度誘導的に発現させるべく、プラスミド
ｐＮＢＨ３Ｓ１.９から得られる１.９kbのＤＮＡ断片を
温度誘導性高レベル発現ベクターｐＨＫＹ３３８中にサ
ブクローニングすることによってプラスミドｐＮＢ１０
６Ｒを作成した。大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＨＫＹ
３３８はＮＲＲＬに１９９２年１月３１日付けで寄託さ
れており、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ-１８９４５の下で入手
することができる。このプラスミドは特に重要な２つの
ＤＮＡ領域、即ち(ｉ)大腸菌中での該プラスミドの複製
と維持を可能にするｐＢＲ３２２から誘導された配列で
あって、その中のｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝
子がラムダｃＩ抑制遺伝子で置換されている配列および
(ii)テトラサイクリン遺伝子の下流に位置する改良型ラ
ムダプロモーターｐＬ１０６(米国特許出願第０７／７
３９２８０号)がカナマイシン耐性遺伝子の読取り枠(Ｏ
ＲＦ，オープンリーディングフレーム)に直に隣接して
いる配列、を含有する。上記プロモーターは２シストロ
ン集合を介して上記ＯＲＦの転写を制御する(Schoner
ら,1990,Methods in Enzymology 185:94)。プラスミド
ｐＨＫＹ３３８は、ＮdeＩとＢamＨＩでの消化によって
カナマイシン耐性遺伝子の読取り枠を容易に除去できる
ように構築された。ＡＴＧ転写開始コドンの部位にＮde
Ｉ制限部位を有し、かつ、潜在的転写終止配列の下流に
ＢamＨＩ互換性制限部位を有するＯＲＦはすべてｐＨＫ
Ｙ３３８中に挿入することができる。そうすれば、これ
によって得られる挿入されたＯＲＦは上記ｐＬプロモー
ターからの発現にとって適正に並ぶことになる。

【００４９】クローン化した１.９kbのバチルス・ズプ
チリスＤＮＡはＮ deＩ部位を所望の位置に含有していな
かったので、ｐｎｂＡ ＯＲＦのＡＴＧ転写開始部位に
それを導入する方法を開発した。この方法には、ｐｎｂ
Ａ遺伝子のアミノ末端断片とカルボキシ末端断片を作成
するために別個の構築を行い、次にそれら２つの断片を
ｐＨＫＹ３３８ベクターから得られる第３の断片に連結
することが含まれる。上記３断片の構築を以下のように
達成した。

【００５０】ｉ）アミノ末端断片 ＰＮＢエステラーゼのアミノ末端部をコード化し、か
つ、そのＡＴＧ転写開始部位の５'側に隣接するＮdeＩ
部位を含有する２６１bpの断片をＰＣＲ技術(実施例１
Ｅを参照のこと)を用いて合成した。このＰＣＲ増幅
は、配列番号６および配列番号７に記載の２つのプライ
マーを用いて行った。

【００５１】配列番号６に記載の配列はＮdeＩ制限部位
を含有する。このプライマーの最初の３塩基はクローン
化したＰＮＢエステラーゼ遺伝子と合致しない。他方の
プライマー(配列番号７)はＡＴＧ開始部位から２１５bp
下流に位置するＡccＩ部位の下流約２５塩基対(bp)にア
ニールする。上記増幅がもたらした２６１bpの断片を、
クロウ(Crowe)らが記述した方法(1991,Nuc.Acid Res.1
9:184)に従い、これにわずかな変更を加えてプロテイナ
ーゼＫ(トリチラチウム・アルブム由来のプロテアーゼ
・タイプXXVIII)で処理した。次いでその断片を標準的
な方法を用いてＮ deＩおよびＡccＩで消化し、フェノー
ル抽出し、エタノール沈殿することによって、後述の連
結反応で使用する１８０bpの断片を作成した。

【００５２】ii）カルボキシ末端断片 本構築法ではアミノ末端断片とカルボキシ末端断片を接
合するために上記ＯＲＦの内部にあるＡccＩ部位を使用
する必要があったので、該１.９kb断片上の他のＡccＩ
部位(ＳalＩ／ＡccＩ)を除去する必要があった。これを
次の２工程で達成した：(ｉ)ＯＲＦの断片を放出させる
ためのＨindIIIおよびＳ alＩによるｐＮＢＨ３Ｓ１.９
の消化、および(ii)上記放出断片の、ＨindIIIおよびＸ
hoＩで消化したｐＢluescript ＳＫ(−)への連結。該
１.９kb断片のＳalＩ／ＡccＩ部位をｐＢluescript Ｓ
Ｋ(−)のＸhoＩ部位に挿入することによって３部位すべ
てが除去された。この連結混合物を大腸菌Ｋ１２ ＤＨ
５α中に導入し、推定のクローンをスクリーニングし、
制限消化によって構造を確認することによって、該ＯＲ
Ｆ上にＡccＩ部位が１つしかないｐＮＢＨ３(ＳＸ)ｓｋ
を単離した。カルボキシ末端にＢamＨＩを導入するには
もう１つの構築が必要であった。ｐＮＢＨ３(ＳＸ)ｓｋ
をＥcoＲＩおよびＫpnＩで消化してＯＲＦの断片を放出
させ、次いでこの断片を、やはりＥcoＲＩとＫpnＩで消
化したｐＵＣ１９中に連結することによって、これを達
成した。この連結混合物をＤＨ５α細胞中に導入し、次
いでクローンの選択と分析を行うことによって、該ＯＲ
Ｆ中に単一のＡccＩ部位を持ち、かつ、そのカルボキシ
末端の下流に適切に位置するＢamＨＩ部位を含有するプ
ラスミドｐＮＢＥＫｕｃを単離した。

【００５３】iii）ｐＨＫＹ３３８から得られるベクタ
ー断片 ｐＨＫＹ３３８をＮdeＩとＢamＨＩで消化してそのカナ
マイシン耐性遺伝子を除去し、その大制限断片をゲル単
離することによって、以下に記述する３断片連結反応用
のベクターを調製した。

【００５４】ＮdeＩ-ＡccＩ消化ＰＣＲ断片(１８０b
p)、ｐＮＢＥＫｕｃのＡccＩ-ＢamＨＩ断片(１.７kb)お
よびｐＨＫＹ３３８のＮdeＩ-ＢamＨＩ断片(６kb)を用
いて、３断片連結を行った。これによって、温度誘導性
ラムダｐＬ合成プロモーターの制御下にある全ｐｎｂＡ
ＯＲＦを含有するプラスミドベクターｐＮＢ１０６Ｒ
が生成した。得られたＤＮＡを宿主株大腸菌Ｋ１２ Ｄ
Ｈ５α中に導入した。次いで、プラスミドｐＮＢ１０６
Ｒを宿主細胞大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８および大腸菌Ｗ
ＡＴＣＣ １１１０５中に導入した。

【００５５】実施例３：大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α／ｐＮ
Ｂ１０６ＲＭ、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＮＢ１０
６ＲＭおよび大腸菌Ｗ ＡＴＣＣ １１１０５／ｐＮＢ１
０６ＲＭの構 築 ｒｏｐ 遺伝子を欠くｐＮＢ１０６Ｒの変種(ｒｏｐ^-)を
構築するために、ｐＮＢ１０６ＲとｐＨＫＹ３８９(ｒ
ｏｐ^-)の両方をＳphＩおよびＮcoＩで消化した。大腸菌
Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＨＫＹ３８９はＮＲＲＬに１９
９２年１０月２２日付けで寄託されており、受託番号Ｂ
-２１０１２の下で入手可能である。ｐＨＫＹ３８９か
ら得られる約４.５kbのＳphＩ-ＮcoＩ断片とｐＮＢ１０
６Ｒから得られる約３kbのＳphＩ-ＮcoＩ断片を低融点
アガロースを用いて電気泳動した後、ゲル単離した。Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼと３７℃で４時間の標準的な反応条
件を用いてこれらの断片を連結した。感応性大腸菌Ｋ１
２ ＤＨ５α細胞を形質転換し、これをテトラサイクリ
ンの入ったＬ-寒天に植菌した。選択したコロニーを予
期されるＡccＩ制限酵素様式についてスクリーニングす
ることによって、プラスミドｐＮＢ１０６ＲＭを保持す
る株を同定した。次いで、プラスミドｐＮＢ１０６ＲＭ
を、実施例１に記述した手法を用いて大腸菌Ｋ１２ Ｄ
Ｈ５α、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８および大腸菌Ｗ ＡＴ
ＣＣ １１１０５中に移入した。

【００５６】実施例４：プラスミドｐＮ Ｂ１０６Ｒまた
はｐＮＢ１０６ＲＭで形質転換した大腸菌Ｋ１２ ＤＨ
５α、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８および大腸 菌Ｗ ＡＴＣ
Ｃ１１１０５におけるＰＮＢエステラーゼの 合成 プラスミドｐＮＢ１０６ＲまたはｐＮＢ１０６ＲＭで形
質転換した大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ
３０８および大腸菌Ｗ ＡＴＣＣ１１１０５の培養によ
るＰＮＢエステラーゼの合成を以下のように誘導した。
上記株の凍結保存培養を５μg／mlテトラサイクリンの
入ったＬ-ブロスに植菌した。３０℃で１６時間生育さ
せた後、細胞を新鮮なＬ-ブロス＋テトラサイクリンに
継代(４％ｖ／ｖ)し、対数増殖中期まで生育させた。培
養の温度を４０℃に上げることによって酵素合成の誘導
を達成した。定期的に培養から試料を採取し、無細胞抽
出物中の酵素活性を実施例１Ｌに記述したように検定す
ることによってＰＮＢエステラーゼ合成の速度を測定し
た。また、ＰＮＢエステラーゼタンパク質量の相対的増
大を監視することができるよう、無細胞抽出物をＳＤＳ
-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)で
も分析した。

【００５７】実施例５：ＰＮＢエステラ ーゼの組換え大
腸菌株からの精製 表１に要約する方法によって大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α／
ｐＮＢ１０６ＲからＰＮＢエステラーゼを精製した。

【表１】

【００５８】この方法を、実施例７に記述し表２に要約
したバチルスからの精製と比較することができる。バチ
ルスからの精製が８工程を必要とし、１３００００mgの
粗タンパク質から２.６mgの純粋な酵素が得られたのに
対し、組換え大腸菌株からはわずか６工程でわずか２０
０mgの粗タンパク質から１０mgの純粋な酵素が得られた
ことに気付くであろう。このように組換え大腸菌を供給
源として使用した場合、より簡単なこの精製工程が、天
然の生産菌バチルス・ズプチリスを酵素供給源として使
用する、より複雑な従来の精製工程より３２５０倍効率
的であった。

【００５９】組換え大腸菌を酵素供給源として用いるこ
の新しい精製法はかなり簡単であるから、大規模生産に
これを適用した場合、同じ酵素をバチルス・ズプチリス
から得るのに必要な精製法より安価であろう。これは、
組換え大腸菌株中で得られるＰＮＢエステラーゼの量が
かなり増大していること(単位粗タンパク質あたり約３
２５０倍)の直接的な結果である。

【００６０】分子量、ウエスタンブロット分析および基
質特異性について、組換え大腸菌から精製したＰＮＢエ
ステラーゼを天然の酵素と比較した。分子量の測定は上
記２つの供給源から得られる酵素について５４０００の
値を与え、またこれら２つの酵素調製物を天然精製エス
テラーゼに対して調製した抗体を用いて試験したとこ
ろ、同一の沈降素バンドが得られた。両酵素はセファク
ロルＰＮＢエステル、セファクロル核ＰＮＢエステル、
ロラカルベフＰＮＢエステル、およびロラカルベフ核Ｐ
ＮＢエステルを加水分解した。天然のＰＮＢエステラー
ゼと組換え大腸菌株中で生産される対応するＰＮＢエス
テラーゼは機能的に同一であり、構造的にも巨視的には
同一物であると思われる。

【００６１】実施例６：部分精製したＰ ＮＢエステラー
ゼによるロラカルベフ核ＰＮＢエステルの加水分解 大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５α／ｐＮＢ１０６Ｒ細胞から調製
した部分精製ＰＮＢエステラーゼ(比活性と本酵素の既
知の触媒回転数に基づき２.５mg)をＮ-エチルマレイミ
ドで処理することにより残存するβ-ラクタマーゼを不
活化し、これを５０mMトリス緩衝液(ｐＨ８.０)中のロ
ラカルベフ核ＰＮＢエステルの懸濁液(２.２％ｗ／ｖ)
に添加した。この反応混合物を３時間３７℃に保った。
ｐＨを８.０に保つために水酸化ナトリウム溶液を定期
的に加えた。３時間後、ロラカルベフ核遊離酸について
高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)で分析したと
ころ、この化合物が９０％の収率で存在した。さらにイ
ンキュベーションを続けても収率は増大しなかった。

【００６２】実施例７：バチルス・ズプ チリスからのＰ
ＮＢエステラーゼの単離と精製 Ａ．無細胞抽出物の調製 バチルス・ズプチリスＮＲＲＬ Ｂ-８０７９の培養を従
来法で収集し、凍結した。凍結バチルス・ズプチリス
(７６０g)を融解し、２リットルの緩衝液Ａ[１０mMリン
酸カリウム(ｐＨ７.０)、１mM ２-メルカプトエタノー
ル(２-ＭＥ)、０.５mM ＥＤＴＡ]中でホモジナイズ(均
質化)した。２４０００×ｇで３０分間遠心分離するこ
とにより無細胞抽出物を得た。この抽出物に最終濃度
２.０mg／mlで硫酸プロタミンを加え、その混合物を１
時間撹拌した。生成した沈殿を遠心分離によって除去し
た。以下の単離操作ではその上清を無細胞抽出物として
使用した。

【００６３】Ｂ．粗ＰＮＢエステラーゼの単離 上記抽出物の硫酸アンモニウム分画を行った。４５〜８
０％硫酸アンモニウム飽和度で生成した沈殿を遠心分離
によって集め、緩衝液Ａに溶解した後、同緩衝液に対し
て終夜透析した。透析した試料を１Ｎ酢酸でｐＨ５.０
に酸性化し、１０分間インキュベートし、これを遠心分
離にかけることによって沈殿物を除去した。その上清に
は粗ＰＮＢエステラーゼが含まれていた。

【００６４】Ｃ．ＰＮＢエステラーゼの精製 上記上清を２Ｎ ＮＨ₄ＯＨでｐＨ８.５に調節し、緩衝
液Ｂ[１０mM トリス塩酸(ｐＨ８.５)、５０mM ＮａＣ
ｌ、１mM ２-ＭＥ、０.５mM ＥＤＴＡ]で平衡化した弱
アニオン性樹脂[ＤＥ５２カラム、３.７×３５cm、ファ
ルマシア,インコーポレイテッド製(ニュージャージー州
０８８５４ピスカタウェイ)]に充填した。このカラムを
３５０mlの緩衝液Ｂで洗浄し、１７５０mlの緩衝液Ｃ
[１０mMトリス塩酸(ｐＨ７.０)、５０mM ＮａＣｌ、１m
M ２-ＭＥ、０.５mM ＥＤＴＡ]で再度洗浄した。緩衝液
Ｃ中のＮａＣｌ勾配(５０〜３００mM、３５００ml)を用
いてＰＮＢエステラーゼを溶出させた。ＰＮＢエステラ
ーゼの分画を合し、アミコンＰＭ-１０膜[アミコン製
(マサチューセッツ州０１９２３ダンバース)]での限外
濾過によって濃縮した。濃縮した粗ＰＮＢエステラーゼ
溶液を、緩衝液Ｄ[１０mMトリス塩酸(ｐＨ８.０)、１mM
２-ＭＥ、０.５mM ＥＤＴＡ]で平衡化した多糖型ゲル
(セファクリルＳ-２００ＨＲカラム、５.０×９５cm、
ファルマシア,インコーポレイテッド製)を用いるゲル濾
過にかけた。酵素活性を含有する分画を合わせ、限外濾
過によって濃縮し、緩衝液Ｂに対して終夜透析した。透
析した溶液を、緩衝液Ｂで平衡化したアニオン交換樹脂
(Ｑ-セファロースカラム、２.６×２０cm、ファルマシ
ア,インコーポレイテッド製)に充填した。このカラムを
１００mlの緩衝液Ｂで洗浄し、次いで５００mlの緩衝液
Ｅ[１０mM ＭＥＳ-ＮａＯＨ(ｐＨ６.０)、１００mM Ｎ
ａＣｌ、１mM ２-ＭＥ、０.５mM ＥＤＴＡ]で洗浄し
た。緩衝液Ｅ中の直線的ＮａＣｌ勾配(１００〜３００m
M、１５００ml)を用いてＰＮＢエステラーゼを溶出させ
た。ＰＮＢエステラーゼを含有する分画を合わせ、限外
濾過によって濃縮し、１mM ２-ＭＥと０.５mMエチレン
ジアミンテトラ酢酸を含む１０mM 酢酸ナトリウム(ｐＨ
５.０)に対して終夜透析した。

【００６５】沈殿物を遠心分離によって除去した後、そ
の酵素溶液を、１mM ２-ＭＥと０.５mM ＥＤＴＡを含む
１０mM酢酸ナトリウム(ｐＨ５.０)で平衡化したリン酸
カルシウム-セルロールカラム(１.６×２０cm)に充填し
た。ここで使用する細かく粉砕されたリン酸カルシウム
はイェナー(Jenner),米国特許第３７３７５１６号に従
って調製することができる。このカラムを２５０mlの同
緩衝液で洗浄した後、１mM ２-ＭＥと０.５mM ＥＤＴＡ
を含む１０〜５０mMの直線的リン酸カリウム(ｐＨ７.
０)勾配(２５０ml)を用いてＰＮＢエステラーゼを溶出
させた。ＰＮＢエステラーゼ活性を含有する分画を合
し、限外濾過によって濃縮した後、緩衝液Ｄに対して終
夜透析した。

【００６６】透析した酵素溶液を、緩衝液Ｄで平衡化し
たｐ-アミノベンズアミジン-アガロースカラム(１.０×
２０cm、ファルマシア,インコーポレイテッド製)に充填
した。このカラムを５０mlの緩衝液Ｄで洗浄した後、緩
衝液Ｄ中の直線的ＮａＣｌ勾配(０〜３００mM、１００m
l)を用いてＰＮＢエステラーゼを溶出させた。緩衝液Ｄ
中のほぼ１６０〜２２０mM ＮａＣｌで溶出したＰＮＢ
エステラーゼ活性を伴う分画を合し、限外濾過によって
濃縮したところ、これは精製酵素であった。

【００６７】上述の精製におけるすべての工程を０〜４
℃の温度で行った。この単離および精製の各工程で得ら
れたＰＮＢエステラーゼ活性について試料を検定するこ
とにより、精製の進行を追跡した。

【表２】

【００６８】Ｄ．ＰＮＢエステラーゼ活性の検定法 ５μmolのビストリスプロパン塩酸(ｐＨ６.５)、０.５
μmolの基質(ロラカルベフＰＮＢエステルまたはセファ
クロルＰＮＢエステル)および適量の酵素溶液を含有す
る１mlの反応混合物を恒温振盪機中３０℃で３０分間イ
ンキュベートした。等体積ののアセトニトリルを添加す
ることによって反応を停止させた。次に、この混合物を
遠心分離することによってタンパク質を除去し、その上
清溶液を、生成物の生成と基質の消失について高性能液
体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)で分析した。８０％の
１mMトリエチルアミン塩酸(ｐＨ２.５)と２０％のメタ
ノールを含有する緩衝液Ａおよびメタノールを含有する
緩衝液Ｂによって形成される直線的勾配を１ml／分の流
速で用いて、Ｃ-１８逆相カラム[ベックマン・ウルトロ
スフェアーＯＤＳ(ベックマン・インストルメンツ,イン
コーポレイテッド(カリフォルニア州９２６３４フラー
トン)製)]でＨＰＬＣを行った。

【００６９】使用したＨＰＬＣ系はビスタ５５６０ユニ
ット[バリアン・アソシエーツ製(テキサス州シュガーラ
ンド)]とモデル２３０-４０１自動試料採取注入器[ギル
ソン・メディカル・エレクトロニクス製(ウィスコンシ
ン州ミドルトン)]を含むバリアンＨＰＬＣシステムであ
った。生成物の形成を２５４nmで監視することによって
ＰＮＢエステラーゼ活性を決定した。

【００７０】酢酸ｐ-ニトロフェニルが加水分解してｐ-
ニトロフェニルアルコールとアセテートに変化する際の
吸収変化を利用して、ＰＮＢエステラーゼの分光光度測
定検定法を開発した。この検定法で活性を示す酵素分画
は必ずしもＰＮＢエステラーゼ活性を有するわけではな
いが、ＰＮＢエステラーゼはこの検定法で活性を示すで
あろう。精製ＰＮＢエステラーゼに関するこの検定法の
結果は、ＨＰＬＣ検定法の結果と十分な相関関係にあっ
た。したがってこの検定法は、一般に多数の検定を伴う
本酵素の精製に有益である。この検定を、１００μMト
リス塩酸(ｐＨ７.０)、１.６μM酢酸ｐ-ニトロフェニル
および１〜２０μｌの酵素溶液を含有する１mlの検定混
合物中室温で行った。カリー(Cary)分光光度計モデル２
１９もしくはベックマンＤＵ-５０で４０５nmの吸収変
化を測定することにより活性を追跡した。

【００７１】次の配列表に本発明の化合物のＤＮＡ配列
およびアミノ酸配列を記載する。本明細書ではこれらの
配列をその配列番号を示して引用する。当業者には理解
されるあろうが、ＤＮＡ配列は５'から３'の方向に記載
されており、アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシ
末端に向かって記載されている。アミノ酸残基は次のよ
うに記載されている：Alaはアラニン残基、Argはアルギ
ニン残基、Asnはアスパラギン残基、Aspはアスパラギン
酸残基、Cysはシステイン残基、Glnはグルタミン残基、
Gluはグルタミン酸残基、Glyはグリシン残基、Hisはヒ
スチジン残基、Ileはイソロイシン残基、Leuはロイシン
残基、Lysはリジン残基、Metはメチオニン残基、Pheは
フェニルアラニン残基、Proはプロリン残基、Serはセリ
ン残基、Thrはスレオニン残基、Trpはトリプトファン残
基、Tyrはチロシン残基、Valはバリン残基をそれぞれ表
す。ＤＮＡ配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキ
シグアニル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルをそ
れぞれ表す。

【００７２】

【配列表】

【００７３】配列番号：１ 配列の長さ：１４７０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATG ACT CAT CAA ATA GTA ACG ACT CAA TAC GGC AAA GTA AAA 42 GGC ACA ACG GAA AAC GGC GTA CAT AAG TGG AAA GGC ATC CCC 84 TAT GCC AAG CCG CCT GTC GGA CAA TGG CGT TTT AAA GCA CCT 126 GAG CCG CCT GAA GTG TGG GAA GAT GTC CTT GAT GCC ACA GCG 168 TAC GGT CCT ATT TGC CCG CAG CCG TCT GAT TTG CTC TCA CTG 210 TCG TAT ACA GAG CTG CCC CGC CAG TCC GAG GAT TGC TTG TAT 252 GTC AAT GTA TTT GCG CCT GAC ACT CCA AGT CAA AAT CTT CCT 294 GTC ATG GTG TGG ATT CAC GGA GGC GCT TTT TAT CTT GGA GCG 336 GGC AGT GAG CCA TTG TAT GAC GGA TCA AAA CTT GCG GCA CAG 378 GGA GAA GTC ATT GTC GTT ACA TTG AAC TAT CGG CTG GGG CCG 420 TTT GGC TTT TTG CAC TTG TCT TCG TTT GAT GAG GCG TAT TCC 462 GAT AAC CTT GGG CTT TTA GAC CAA GCC GCC GCG CTG AAA TGG 504 GTG CGG GAG AAT ATC TCA GCG TTT GGC GGT GAT CCC GAT AAC 546 GTA ACA GTA TTT GGA GAA TCC GCC GGC GGC ATG AGC ATT GCC 588 GCG CTG CTC GCT ATG CCT GCG GCA AAA GGC CTG TTC CAG AAA 630 GCG ATC ATG GAA AGC GGC GCT TCC CGA ACA ATG ACA AAA GAA 672 CAA GCG GCA AGC ACT GCG GCT GCC TTT TTA CAG GTC CTT GGG 714 ATT AAT GAG AGC CAG CTG GAC AGA TTG CAT ACT GTA GCA GCG 756 GAA GAT TTG CTT AAA GCG GCC GAT CAG CTT CGG ATT GCA GAA 798 AAA GAA AAT ATC TTT CAG CTG TTC TTC CAG CCC GCC CTT GAT 840 CCG AAA ACG CTG CCT GAA GAA CCA GAA AAA TCG ATC GCA GAA 882 GGG GCT GCT TCC GGC ATT CCG CTA TTG ATT GGA ACA ACC CGT 924 GAT GAA GGA TAT TTA TTT TTC ACC CCG GAT TCA GAC GTT CAT 966 TCT CAG GAA ACG CTT GAT GCA GCA CTC GAG TAT TTA CTA GGG 1008 AAG CCG CTG GCA GAG AAA GCT GCC GAT TTG TAT CCG CGT TCT 1050 CTG GAA AGC CAA ATT CAT ATG ATG ACT GAT TTA TTA TTT TGG 1092 CGC CCT GCC GTC GCC TAT GCA TCC GCA CAG TCT CAT TAC GCC 1134 CCT GTC TGG ATG TAC CGG TTC GAT TGG CAC CCG GAG AAG CCG 1176 CCG TAC AAT AAA GCG TTT CAC GCA TTA GAG CTT CCT TTT GTC 1218 TTT GGA AAT CTG GAC GGA TTG GAA CGA ATG GCA AAA GCG GAG 1260 ATT ACG GAT GAG GTG AAA CAG CTT TCT CAC ACG ATA CAA TCC 1302 GCG TGG ATC ACG TTC GCT AAA ACA GGA AAC CCA AGC ACC GAA 1344 GCT GTG AAT TGG CCG GCG TAT CAT GAA GAA ACG AGA GAG ACG 1386 GTG ATT TTA GAC TCA GAG ATT ACG ATC GAA AAC GAT CCC GAA 1428 TCT GAA AAA AGG CAG AAG CTA TTC CCT TCA AAA GGA GAA TAA 1470

【００７４】配列番号：２ 配列の長さ：４８９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Thr His Gln Ile Val Thr Thr Gln Tyr Gly Lys Val Lys Gly 1 5 10 15 Thr Thr Glu Asn Gly Val His Lys Trp Lys Gly Ile Pro Tyr Ala 20 25 30 Lys Pro Pro Val Gly Gln Trp Arg Phe Lys Ala Pro Glu Pro Pro 35 40 45 Glu Val Trp Glu Asp Val Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Gly Pro Ile 50 55 60 Cys Pro Gln Pro Ser Asp Leu Leu Ser Leu Ser Tyr Thr Glu Leu 65 70 75 Pro Arg Gln Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Val Asn Val Phe Ala Pro 80 85 90 Asp Thr Pro Ser Gln Asn Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly 95 100 105 Gly Ala Phe Tyr Leu Gly Ala Gly Ser Glu Pro Leu Tyr Asp Gly 110 115 120 Ser Lys Leu Ala Ala Gln Gly Glu Val Ile Val Val Thr Leu Asn 125 130 135 Tyr Arg Leu Gly Pro Phe Gly Phe Leu His Leu Ser Ser Phe Asp 140 145 150 Glu Ala Tyr Ser Asp Asn Leu Gly Leu Leu Asp Gln Ala Ala Ala 155 160 165 Leu Lys Trp Val Arg Glu Asn Ile Ser Ala Phe Gly Gly Asp Pro 170 175 180 Asp Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Met Ser Ile 185 190 195 Ala Ala Leu Leu Ala Met Pro Ala Ala Lys Gly Leu Phe Gln Lys 200 205 210 Ala Ile Met Glu Ser Gly Ala Ser Arg Thr Met Thr Lys Glu Gln 215 220 225 Ala Ala Ser Thr Ala Ala Ala Phe Leu Gln Val Leu Gly Ile Asn 230 235 240 Glu Ser Gln Leu Asp Arg Leu His Thr Val Ala Ala Glu Asp Leu 245 250 255 Leu Lys Ala Ala Asp Gln Leu Arg Ile Ala Glu Lys Glu Asn Ile 260 265 270 Phe Gln Leu Phe Phe Gln Pro Ala Leu Asp Pro Lys Thr Leu Pro 275 280 285 Glu Glu Pro Glu Lys Ser Ile Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly Ile 290 295 300 Pro Leu Leu Ile Gly Thr Thr Arg Asp Glu Gly Tyr Leu Phe Phe 305 310 315 Thr Pro Asp Ser Asp Val His Ser Gln Glu Thr Leu Asp Ala Ala 320 325 330 Leu Glu Tyr Leu Leu Gly Lys Pro Leu Ala Glu Lys Ala Ala Asp 335 340 345 Leu Tyr Pro Arg Ser Leu Glu Ser Gln Ile His Met Met Thr Asp 350 355 360 Leu Leu Phe Trp Arg Pro Ala Val Ala Tyr Ala Ser Ala Gln Ser 365 370 375 His Tyr Ala Pro Val Trp Met Tyr Arg Phe Asp Trp His Pro Glu 380 385 390 Lys Pro Pro Tyr Asn Lys Ala Phe His Ala Leu Glu Leu Pro Phe 395 400 405 Val Phe Gly Asn Leu Asp Gly Leu Glu Arg Met Ala Lys Ala Glu 410 415 420 Ile Thr Asp Glu Val Lys Gln Leu Ser His Thr Ile Gln Ser Ala 425 430 435 Trp Ile Thr Phe Ala Lys Thr Gly Asn Pro Ser Thr Glu Ala Val 440 445 450 Asn Trp Pro Ala Tyr His Glu Glu Thr Arg Glu Thr Val Ile Leu 455 460 465 Asp Ser Glu Ile Thr Ile Glu Asn Asp Pro Glu Ser Glu Lys Arg 470 475 480 Gln Lys Leu Phe Pro Ser Lys Gly Glu 485 489

【００７５】配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Thr His Gln Ile Val Thr Thr Tyr Gly Lys Lys Val Lys Gly 5 10 15 Thr Gln Glu Asn Gly Val His 20

【００７６】配列番号：４ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATGACACATC AAATTGTCAC AACATATGGC AAAAAAGTCA A 41

【００７７】配列番号：５ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TATGGCAAAA AAGTCAAAGG CACACAAGAA AATGGCGTCC A 41

【００７８】配列番号：６ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 AAAAAGGGAG AGAACCATAT GACTCATCAA ATAG 34

【００７９】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TTGACATACA AGCAATCCTC 20

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドｐＮＢＥ１の制限酵素部位および
機能地図。

【図２】 プラスミドｐＮＢ１０６Ｒの制限酵素部位お
よび機能地図。

【図３】 プラスミドｐＮＢ１０６ＲＭの制限酵素部位
および機能地図。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ローランド・レイマー・ホッジィズ アメリカ合衆国46205インディアナ州イン ディアナポリス、イースト・フォール・ク リーク・パークウェイ・ノース・ドライブ 4340ビー番 (72)発明者 デレク・マックギルブレイ アメリカ合衆国46151インディアナ州マー ティンズビル、フォックスクリフ・ノース 2126番 (72)発明者 スティーブン・ワイアット・クウィーナー アメリカ合衆国46208インディアナ州イン ディアナポリス、メルボルン・ロード・イ ースト・ドライブ4270番 (72)発明者 ジェイムズ・リチャード・スワートリング アメリカ合衆国46220インディアナ州イン ディアナポリス、ハーバーフォード・アベ ニュー5931番 (72)発明者 ジョゼフ・マーティン・ゾック アメリカ合衆国46143インディアナ州グリ ーンウッド、ウエスト・スモーキー・ロ ー・ロード5755番

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 枯草菌のＰＮＢエステラーゼ活性をコー
   ド化するＤＮＡ配列を含有する単離されたＤＮＡ化合
   物。
2. 【請求項２】 配列番号２に記載の配列を有するタンパ
   ク質をコード化する請求項１の単離されたＤＮＡ化合
   物。
3. 【請求項３】 コード鎖が配列番号１に記載の配列を含
   有する請求項２の単離されたＤＮＡ化合物。
4. 【請求項４】 請求項１から請求項３までのいずれかの
   ＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡベクター。
5. 【請求項５】 該ＰＮＢエステラーゼ活性コード化ＤＮ
   Ａの発現を制御するのに適した位置に置かれたプロモー
   ターをさらに含有する請求項４の組換えＤＮＡベクタ
   ー。
6. 【請求項６】 該プロモーターが大腸菌中で機能する請
   求項５の組換えＤＮＡベクター。
7. 【請求項７】 請求項４から請求項６までのいずれかの
   組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項４から請求項６までのいずれかの
   組換えＤＮＡベクターで形質転換された大腸菌細胞。
9. 【請求項９】 ＰＮＢエステラーゼ活性を発現させ得る
   組換え宿主細胞を構築する方法であって、(ａ)該宿主細
   胞中で機能するプロモーターおよび翻訳活性化配列、並
   びに(ｂ)該プロモーターおよび翻訳活性化配列からの発
   現に適した位置に置かれた枯草菌のＰＮＢエステラーゼ
   活性をコード化するＤＮＡ配列、を含有する組換えＤＮ
   Ａ発現ベクターで該宿主細胞を形質転換することからな
   る方法。
10. 【請求項１０】 ＰＮＢエステラーゼ活性を発現させる
    方法であって、(ａ)使用する宿主細胞中で機能するプロ
    モーターおよび翻訳活性化配列、並びに(ｂ）該プロモ
    ーターおよび翻訳活性化配列からの発現に適した位置に
    置かれた枯草菌のＰＮＢエステラーゼ活性をコード化す
    るＤＮＡ配列、を含有する組換えＤＮＡ発現ベクターで
    形質転換された宿主細胞を遺伝子発現に適した条件下で
    培養することからなる方法。
11. 【請求項１１】 該組換えＤＮＡ発現ベクターが請求項
    ２または請求項３のいずれかのＤＮＡ配列を含有する請
    求項１０の方法。
12. 【請求項１２】 該宿主細胞が大腸菌である請求項１０
    の方法。
13. 【請求項１３】 セファロスポリンＰＮＢエステルまた
    は１−カルバセファロスポリンＰＮＢエステルからｐ-
    ニトロベンジル基を除去する方法であって、該エステル
    を請求項１０、請求項１１または請求項１２の方法で調
    製されるＰＮＢエステラーゼと反応させることからなる
    方法。