HUT53933A - Process for producing new cyclodextrine glycosyl transferases - Google Patents

Description

A ciklodextrinek 1-4 kötésekkel kapcsolódó alfa-D-glüko'piranoz egységekből felépülő ciklikus vegyületek. A legfontosabbak közülük a 6, 7 és 8 glükóz-egységet tartalmazó, gyűrű alakú ciklodextrinek (ezeket rendre alfa-, béta- és gamma-ciklodextrinnek nevezik), amelyek sokoldalú felhasználhatóságukkal tűnnek ki a más gyűrűméretű ciklodextrinek közül. Jó felhasználhatóságuk oka az, hogy képesek reverzibilisen inkluziós komplexek (klatrátok) képezésére számos más tipusu vegyülettel.

• · ·

Inkluziós komplexről akkor beszélünk, ha egy molekulának mint a ciklodexgrineknek - olyan belső ürege van, amelybe más molekulák bejuthatnak és ott gyenge kölcsönhatások (pl. van dér Walls erők) által megkötődnek. A van dér Walls erők rövid távolságon érvényesülő kölcsönhatások, amelyek elég erősek egy határozott szerkezetű, általában szilárd halmazállapotú komplex létrehozásához, de elég gyengék, hogy lehetővé tegyék a komplex gyors disszociációját.az alkotó molekulákra.

A ciklodextrinek fánk alakú molekulák, amelyek belső üregének méretét és alakját a gyűrűt alkotó glükóz-egységek száma szabja meg. Az alfa-ciklodextrin ürege csaknem henger alakú, kb. 0,7 p mély és 0,5 jum átmérőjű. A béta- és gamma-ciklodextrinek ürege ugyanilyen mély, de átmérőjük 0,7, illetve 0,9 μπι. A ciklodextrinek vizben jól oldódnak, mert a gyűrű külső oldalán számos hidroxil-csoport található. Az üreg belseje azonban hidrofób jellegű, igy a ciklodextrinek megköthetik a vizben oldott szerves vegyületeket, ha molekuláik mérete megfelelő és kellően hidrofób jellegűek.

A ciklodextrinek komplexképző tulajdonsága számos gyakorlati felhasználásuk alapja. Példaként említhetjük különböző izés aroma-anyagok ciklodextrinekkel történő kapszulázását, ami lehetővé teszi hosszú időn át való tárolásukat és az ételek elkészítésekor való felhasználásukat. Fordított esetben a ciklodextrinek alkalmasak lehetnek a nemkívánatos iz- és szaganyagok ételekből való eltávolítására. Használják a ciklodextri• · ······ · ·· ··· · ···· ·« neket ételek tartósítására, igy az oxidációtól, a fény okozta bomlástól vagy a hőbomlástól való megvédésére is. A ciklodextrinek gyakorlati alkalmazásait Szejtli J. közleménye foglalja össze {Starch,34. 379-385 /1982/ ).

A ciklodextrinek használatának széles körű elterjedését viszonylag magas áruk akadályozza, aminek a jelenlegi gyártási eljárások korlátái az oka. A ciklodextrineket aránylag alacsony kitermeléssel (jellemzően 50 % alatt, általában 25-35%) lehet előállítani a keményítő átalakításával. További hozamcsökkentő körülmény, hogy az átalakítást a kiinduási anyag hig oldatában lehet csak elvégezni, amiből a ciklodextrinek nehezen nyerhetők ki.

A ciklodextrinek előállítását mikroorganizmusokból nyert ciklodextrin-glikozil-transzferáz enzimmel végzik. Az ismert enzimtermelő mikroorganizmusok hátrányos tulajdonságai késztettek minket megfelelőbbek keresésére. A használhatóság feltételének az enzim termelésével összefüggő gyakorlati tényezőket, mint pl. a költséget vagy az egyszerű előállithatóságot tekintettük. Egyebek között ilyen a mikroorganizmus gyors tenyészthetősége egyszerű táptalajokon. Másik fontos követelmény, hogy az enzim termelése extracellulárisan és széles pH-intervallumban történjen, azaz a termelés csak kevéssé függjön a körülmények változásaitól. Lényeges az is, hogy az enzim kinyerése és tisztítása könnyen megoldható legyen.

A ciklodextrin-glikozil-transzferáz enzimmel szemben is számos követelmény támasztható. Kívánatos, hogy az enzim szé les pH-tartományban legyen működőképes, de az optimális pH-tartománya legyen inkább szűk. Legyen könnyen tisztítható és lehetőleg ne legyen aktivitás-veszteség a tisztítás során. A felezési ideje 40°C hőmérsékleten több hét legyen, különösen immobilizálás esetén. További követelmény, hogy ne csak oldatban, hanem megfelelő hordozóra rögzítve (immobilizálva) is használható legyen, azaz könnyen lehessen rögzíteni és ne igényeljen koenzimet vagy fémiont aktivitásának kifejtéséhez.

Kutatásaink eredményeként számos, ciklodextrin-glikozil-transzferáz aktivitást mutató baktériumot izoláltunk talajból, amelyeket részletesen megvizsgáltunk. Az izolátumok között három olyant találtunk, amelyek ciklodextrin-glikozil-transzferáza több szempontból egyedülálló tulajdonságokat mutat.

A találmány tárgya olyan uj ciklodextrin-glikozil-transzferáz előállításra, amely széles pH-tartományban magas aktivitással rendelkezik, egyszerűs és veszteség nélkül tisztítható, könnyen immobilizálható, aktivitásához nem igényel koenzimet vagy fémiont, és felezési ideje 40°C hőmérsékleten több hét. A találmány szerinti eljárás termékei azok a ciklodextrin-glikozil-treanszferáz enzimek, amelyeket az NRRL B-18373, az NRRL B-18374 és az NRRL B-18375 jelzésű baktérium-törzsek termelnek. A fenti jelzések a Northern Régiónál Research Center of U.S. Department of Agriculture (Peoria, Illinois, Egyesült Államok) mikroorganizmus-gyűjteményében 1988. junius 7-én letétbe helyezett tenyészetek nyilvántartási számai.

A találmány tárgya tehát uj ciklodextrin-glikozil-transzferázok előállítása, amelyek számos fontos tulajdonságukban különböznek az ismert ciklodextrin-glikozil-transzferázoktól. Ezeket az enzimeket három, korábban ismeretlen, talajból izolált baktérium-törzs termeli, bár lehetséges, hogy ugyanilyen «vagy hasonló enzimeket más mikroorganizmusok is termelhetnek. Kijelenthetjük, hogy a találmány szerint előállított ciklodextrin-glikozil-transzferázoknak számos olyan, korábban említett előnyös tulajdonságuk van, amely alkalmazásukat előnyössé teszi az ismert ciklodextrin-glikozil-transzferázokkal szemben.

A következőkben a megnevezett mikroorganizmusokkal a ciklodextrin-glikozil-transzf eráz előállítását mutatjuk be. Az adott mikroorganizmus-törzset az alábbi összetételű táptalajban tenyésztjük:

4	mmol	magnézium-szulfát
0,03	mmol	mangán-szulfát
6,8	mmol	nátrium-klorid
5,4	mmol	kálium-klorid
14,6	mmol	dikálium-hidrogén-foszfát
1,6	mmol	citrát-só
1	mmol	kalcium-klorid
10	mmol	ammónium-k1orid
0,06	mmol	ammónium-szulfát
0,06	mmol	vas(II)-szulfát
1	v%	keményítő
0,01	Ö. Ό	élesztőkivonat

• · · · · • ··· · « · · • ····· · ·

A tenyésztést szokványos, 12 1-es fermentorban végezzük, amit 5% inokulummal (egy éjszakán át 30°C-on inkubálva) oltunk

Λ be és 30^uC-on, teljes levegőztetéssel működtetünk. A tenyészetből kétóránként veszünk mintát a szaporodás, a kémhatás és a ciklodextrin-glikozil-transzferáz aktivitás meghatározására; ez utóbbit a ΚΙ-módszerrel mérjük (kálium-jodid). A ciklodextrin-glikozil-transzferáz aktivitás mérése során a tenyészetet magát tekintettük enzimnek. A tenyésztés későbbi szakaszában (kb.

óra után) a mintákat centrifugálással sejtmentesitettük és a felüluszóból végeztük az aktivitás mérését. A tenyésztést akkor fejeztük be, ha az enzim-aktivitás 4 órán át állandó maradt vagy csökkent. Az alább leirt tisztítási eljárást alkalmazva a fermentléből jellemző módon az összes aktivitás mintegy 50 %-át lehet kinyerni, mig a specifikus aktivitás (egyés/mg fehérje) 128.000-ről 580.000-re emelkedett az első lépéstől (a sejtmentes fermentlé 0,2 /i-os szűrésétől) a teljesen megtisztított enzimig.

Az aktivitás mérése a következőképpen történik. A szubsztrát 0,2 %-os keményítő-oldat, amely 5 mmol kalcium-kloridot és 100 mmol imidazolt is tartalmaz (pH ) 7,0) . 300 /11 fenti szubsztráthoz 10 jul enzimet adunk, a reakcióelegyet 10 percen át 40°C-on inkubáljuk. A reakciót 4/θ ml 0,2 N sósavval leállítjuk, majd 0,5 ml reagenst (0,20 % kálium-jodidot és 0,02 % jódot tartalmazó oldatot) adunk hozzá. A kontrol esetében a szubsztráthoz előbb a sósavat, azután az enzimet adagoltuk. Az aktivitás számításához a • · • · · · ·

Ext^ - Ext aktivitás (egység/ml) = ----------- x 100

0,01 x Ext, k képletet használjuk, ahol Ext^ és Ext_r a kontrol és a reakcióelegy 700 nm-nél mért extinkciója. A mérés 1250 és 5000 egység/ml értékhatárok között ad pontos eredményt.

Mivel mindhárom törzs ciklodextrin-glikozil-transzferáza extracelluláris enzim, a kinyerést megkönnyíti a baktériumok eltávolítása centrifugálással. A további műveleteket 4°C-on végezzük. A sejtmentes felüluszóhoz folyamatos keverés közben 200 g/1 ammónium-szulfátot adagolunk, majd 50 g/1 granulált oldhatatlan keményítőt. Az elegyet további egy órán át keverjük, majd a keményítőt szűréssel kinyerjük és levegőn megszáritjuk. A száraz terméket újra felszuszpendáljuk egy, a kívánt enzim-koncentrációtól függő mennyiségű oldatban, amely 10 mmol dikálium-hidrogén-foszfátot, 3 mól nátrium-kloridőt és 0,1 mól maltózt tartalmaz (pH = 7,5). Egy órás, szobahőmérsékleten való keverés után a keményítőt szűréssel eltávolítjuk, amit addig ismételünk, amig az oldat könnyen át nem folyik a 0,2 yumes szűrőn. Az igy nyert oldatot nagy térfogatú, 5 mmol glicint és 5 mmol kalcium-kloridot tartalmazó )pH = 7,0) oldattal szemben dializáljuk. A termék az a tisztított enzim, amit a legtöbb vizsgálatban használtunk.

A molekulatömeg meghatározása

A molekulatömeg meghatározásához az enzimet a következő módon tisztítjuk meg. A fermentlevet egy éjszakán át 4°C-on ülepedni hagyjuk, majd a zavaros felüluszót 2 um-es membránszűrőn megszűrjük. Ezzel a módszerrel elkerülhető, hogy az en • · • · · · · zimben sejtek illetve más enzimek is legyenek. A következő lépésben az oldatot olyan membránszűrőn szűrjük, amely

10.000 dalton molekulatömegig átengedi a fehérjéket, igy az eredeti térfogat egytizedére koncentrált, csak 10.000 daltonnái nagyobb molekulatömegű fehérjéket tartalmazó oldatot nyerünk. A továbbiakban a korábban leirt tisztítási eljárást követjük azzal a módosítással, hogy a keményítőt 100 g/1 koncent rált oldat mennyiségben használjuk és a kivonási lépést háromszor ismételjük meg. A kiszűrt keményítőt egyesitjük, az enzim leoldását a lehető legkisebb térfogatú oldattal végezzük el és addig ismételjük, amig az újabb oldatok aktivitást mutatnak. A magas aktivitású frakciókat egyesítjük, dializáljuk és vagy közvetlenül használjuk a mérésekhez, vagy liofilizálással és ujraoldással tovább koncentráljuk.

A molekulatömeg meghatározása U.K. Laemmli módszerével történt (Natúré, 222, 680 /1979/). Az uj ciklodextrin-glikozil-transzferázok mellett meghatároztuk a Bacillus circulans 170, 430 és 860 jelzésű törzsei által termelt és hasonló módon tisztított enzimeinek, valamint a Bacillus macerans enzimének (nyers preparátum, Amano-gyártmány) molekulatömegét is. Az összes mintát egy térfogatrészben adjuk 9 térfogatrész pufferhez és 10% nátrium-dodecil-szulfonátot tartalmazó poliakrilamid-gélen elektroforézist végzünk. A futtatás után a gélt Coomassie-kékkel megfestjük, a felesleges festéket 7 % jégecetet tartalmazó 30 %-os metilalkohollal kimossuk. Az enzimek molekulatömegét az ismert molekulatömegű referencia• ·

-fehérjék helyzetéhez viszonyítva határozzuk meg.

Az izoelektromos pont meghatározása

A molekulatömeg meghatározásához készített mintákkal azonos módon tisztított mintákat helyeztünk kereskedelemben kapható (LKB Pharmacia) izoelektromos fókuszáló gélekre (pH 3,5-9,5). A futtatást az anódról 1 mólos foszforsavval, a kátédról 1 mólos nátrium-hidroxiddal végeztük, a kezdő feszültség 520, a végső 1520 V volt, az áramerősség 60 mA-től 6,5 mA-ig változott. A futtatás után a gélek pH-ja 3,8-8,1 volt. A géleket 4 % szulfoszalicilsavat és 12,5 % triklórecetsavat tartalmazó 30 %-os metilalkoholban fixáltuk, majd 0,04 % Coomassie-kéket, 0,5 % rézszulfátot és 10 % ecetsavat tartalmazó 27 %-os etilalkoholban festettük meg.

A pH-optimum mérése

Az optimális pH-tartomány meghatározásához az enzimek aktivitását a szokványos reakcióelegyben mértük (2 % maltrin 150, 5 mmol kalcium-klorid) és a különböző pH-kat citromsav, glicin és imidazol pufferekkel állítottuk be. A reakciókhoz 1 ml szubsztrátot használtunk és 3 órán át inkubáltuk 40°C-on. Ezután a mintákat zárt fecskendőkben (a práolgás okozta veszteség elkerülésére) 2 percre felforraltuk és lehűtöttük. A visszamaradt keményítőt feleslegben adott alfa-amiláz enzimmel elbontottuk (30-60 perc inkubálás 60°C-on). A mintákat ezután fagyasztva tároltuk a nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatig, amivel az alfa-, béta- és gamma-ciklodextrin mennyiségét határoztuk meg.

• · · * • ·

A béta-ciklodextrin termelés mérése 2 % maltrin 150 szubsztrátot és 5 mmol kalcium-kloridot tartalmazó, 5 mmol imidazollal pH = 7,0-re beállított és 10 % etilalkoholt is tartalmazó reakcióelégyben, 40°C-on történt.

Az uj ciklodextrin-glikozil-transzferázok számos előnyös tulajdonságát az 1. táblázat foglalja össze. Ismert, hogy a ciklodextrin-glikozil-transzferázoknak legalább két alaptípusa létezik: az egyik főleg alfa-, a másik főleg béta-ciklodextrint termel, legalábbis a reakció kezdeti szakaszában (H. Bender, Advances in Biotechnological Processes 6., 37.0., Alán R. Liss Inc., 1986). A táblázatból látható, hogy a Bacillus macerans és az NRRL B-18375 törzs enzimei az első alaptípushoz, míg a Bacillus circulans, az NRRL B-18373 és B-18374 törzsek enzimei a második alaptípushoz tartoznak. A kétféle enzimek molekulatömege 65.000 és 73.000 dalton. Az első típusba tartozók izoelektormos pontja 8,5 körül van, míg a másodikba tartozóké mind az előbbiektől, mind egymástól különbözik.

• · • ·

w tí cd r-í ü

•rí O •rí

U cd PQ

?l	m		un *	in
m	co	··	kD	CM
\D				Λ	*>
		CM		00	00
		··		1	1
		co			σ>
				Λ	Λ
				in	<r

CM r* co co T

4J

Cd N '03

U O

O

	t—	CM	-j·
	00	··	•		cn		m
+ 1	Λ	σ>		o>	1					•
co	kO	··	+1	1	m		CM		cd	r*
		m	co		CM		CM		1	II
		*♦	*·	Λ	r»					tű
		CM	r-	kO	m				m	04
									r*	Λ
									•	o
									r-l	o
		•							r—1	o
			CM						•rí	<r
CO,	m	V	•	vD	• co				Λ	*»
+1	*>	··	+1	*	Λ				o	t—1
m	co	un	m	r*	00		r-«		o	o
		·*	Λ	1	1		v—			x
		4—	\O	m	X				6	o
		··			*·				2	44
		V—		m	<r				B	t—1
									•rí	cd
									X	i—l
									cd	♦rí
									S	XJ
				X	44					Φ
				3	0				cd
				4J	XJ					$>«
		*-		rH	r-4				w
		•		'cd	'cd				'cd	o
	X>	V		öO	00				4J
+ 1	*	KO	w	cn		σκ		•rí
in	00	··		N	M		r-	cd	>	Λ
κο		m	ζ	• rí	•r4			•r-)	•rí	o
		λ		>	>			1	XJ	m
				e	e			K		τ-
		··				04	cd
				ω	φ					ο
				0	0			w	N	•rí
								'cd	cd	μ
/—s	Z—N							XJ		XJ
c	l-l Ό						•rí	i—í	r*í
o	04	cd				1		>	O
XJ		rO				o		•rí	X
r-4		ö	z“\			r4		XJ	cd
cd	4J	'cd	u			.hi		44
T)	c	μ	0			• rl	ω	cd	#»	CM
44	O	cd cg	o			O	'0)	Pn
	cu	E	<r	X	X	1		ω		··
Ö0		44 §		o	in	cd	<1>	•rí		XJ
ω	0) cd	cd	σ>	r«.	XJ	E	rH	§	'cd
2	g	C öO	tű			'Φ	μ	'cg	O	μ
6	S	•rí ··	CU	•\		X	Φ		XJ	μ
:o	o	μι cd		Λ!			XJ	•rí	μι	N
XJ	μι	4J 4J	«	O		ω		X	cd	cn
cd	4-1	X 'Φ	•rí	M		•rí	o	S	XJ	X)
r-4	44	Φ X	i—1	'3		1—I	0	e	1	5
□	Φ	T5 ..	'Cd	JJ		'cd	•rl		tű	N
44	«Μ	O Cd		ni			μ	cd	04	ω
Φ	d)	«-4 <Xí	•r4	3S		•rí	XJ
i4	0	44 M	4J			jg
£	N	•rí Gj	04	PS		Φ	•	•	•
5Ű	1—1		o	CX		s	nj	cd	X	u

arány a maximális béta-ciklodextrin termelés körülményei között, 40 C

Claims (3)

1. Eljárás ciklodextrin-glikozil-transzferáz előállítására, amely (1) 73 kilodalton molekulatömegei, izoelektromos pontja

   6.8, maximális enzimatikus aktivitását 40°C-on körülbelül 7,8 pH-n fejti ki, mig körülbelül 90%-os aktivitású 6,4-9,0 pH tartományban, 75%-os aktivitású 5,25-9,0 pH tartományban, alfa, béta és gamma ciklodextrin körülbelül 2,5:9:1 arányú elegyét képezi, szokásos körülmények között a béta-ciklodextrin konverziója 22,5%;
2. (2) 73 kilodalton molekulatömegü, izoelektromos pontja

   7.8, maximális enzimatikus aktivitását 40°C-on körülbelül

   7,2 pH-η fejti ki, mig körülbelül 90 %-os aktivitású

   5,7-7,7 pH tartományban, 75%-os aktivitású 4,8-8,2 pH tartományban, alfa, béta és gamma ciklodextrin körülbelül 3:12:1 arányú elegyét képezi, szokásos körülmények között a béta-ciklodextrin konverziója 23%;
3. (3) 65 kilodalton molekulatömegü, izoelektromos pontja 8,5, maximális enzimatikus aktivitását 40°C-on körülbelül 6,5 pH-n fejti ki, mig körülbelül 90%-os aktivitású 5,5-7,6 pH tartományban,, 75%-os aktivitású 4,6-8,3 pH tartományban, alfa, béta és gamma ciklodextrin körülbelül 1:1,5: 0,1 arányú elegyét képezi, szokásos körülmények között a béta-ciklodextrin konverziója 17%, azzal jellemezve, hogy az NRRL B-18373, NRRL B-18374, illetve • V

   NRRL B-18375 törzset tápközegben tenyésztjük és a kapott ciklodextrin-glikozil-transzferázt elkülönítjük.