HUH3650A - Method and equipment for impregnation or coating objects - Google Patents

Description

A találmány tárgyát gyógyhatású anyagok képezik, különös tekintettel a humán immunhiányos tüneteket okozó vírus (HÍV) által okozott fertőzések kezelésére. A találmány tárgyát olyan oligonukleotidok illetve oligonukleotid analógok tervezése, szintézise és alkalmazása képezi, amelyek gátolják a Hív és egyéb retrovírusok aktivitását.

A találmány szerinti módszerekkel a HÍV RNS aktivitását befolyásolni lehet. A találmány általában az antiszensz vegyületek területére vonatkozik, azaz olyan vegyületekre, amelyek képesek egy RNS nukleotid szekvenciájával specifikusan hibridizálódni. Az előnyös megvalósítási módok szerint a találmány olyan módszerekre vonatkozik, amelyekkel a betegség terápiás kezelését el lehet érni, és szabályozni lehet a gének expresszióját kísérleti rendszerekben.

Az jól ismert, hogy a test állapotát emlősökben, főleg a fertőző betegség állapotában, fehérjék befolyásolják. Az ilyen fehérjék, akár közvetlenül hatva, akár enzimatikus funkciójukon keresztül, nagymértékben hozzájárulnak emberek és állatok számos betegségéhez. A klasszikus gyógyhatású anyagok általában az ilyen fehérjékkel való kölcsönhatásra koncentrálnak, azzal az erőfeszítéssel, hogy befolyásolják betegséget okozó vagy betegséget fokozó funkciójukat. Újabban azonban olyan kísérleteket is tettek, hogy ezeknek a fehérjéknek a termelődését befolyásolják, olyan molekulákkal való kölcsönhatások révén, amelyek a szintézisüket irányítják, azaz az intracelluláris RNS-sel való kölcsönhatás révén. A fehérjék termelődésének befolyásolásától azt remélték, hogy olyan terápiás hatásokat kapnak, amelyek maximális hatással és

- 3 ( minimális mellékhatásokkal rendelkeznek. Ezeknek a terápiás megközelítéseknek általában az a célja, hogy befolyásolja, vagy más módon modulálja a nem kívánt fehérje képződéséhez vezető gén expresszióját.

Egy bizonyos mértékig elfogadott módszer a specifikus gén expressziójának gátlására az antiszensz megközelítés, ahol egy specifikus, megcélzott hírvivő RNS, mRNS szekvenciával komplementer oligonukleotid analógokat használnak. Számos kutató írt le ilyen kísérleteket. Ide tartozó összefoglaló például C.A. Stein and J.S. Cohen, Cancer Research, 48, 2659-2668 (1988); J. Walder, Genes and Development, 2, 502-504 (1988); C.J. MarcusSekura, Analytical Biochemistry, 172. 289-205 (1988) ; G. Zon, Journal of Protein Chemistry, 6, 131-145 (1987); G.Zon, Pharmaceutical Research, 5, 539-549 (1988); A.R. Van dér Krol, J.N. Mól and A.R. Stuitje, BioTechniques, 6, 958-973 (1988); és D.S. Loose-Mitchell, TIPS, 9, 45-47 (1988). Mindegyik említett összefoglalóban megtalálható az általános antiszensz elméletre és az előző technikákra vonatkozó háttér információ.

Korábban számos kutató tett kísérletet arra, hogy különböző antiszensz megközelítések útján gátolja a HIV-et. Zamecnik és munkatársai foszfodiészter oligonukleotidokat használtak, a reverz transzkriptáz primer helye ellen, valamint a donor/akceptor hely illesztése ellen irányítva [P.C. Zamecnij, J. Goodchild, Y. Taguchi, P.S. Sárin, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 83, 4143 (1986)]. Goodchild és munkatársai a transzláció iniciációjának helye ellen, a cap hely ellen, a poliadenilezési szignál ellen, az 5' ismétlődő régió ellen, valamint a gag és pol gének közötti hely ellen

irányított foszfodiészter vegyületeket készítettek [J. Goodchild, S.Agrawal, M.P. Civeira, P.S. Sárin, D.Sun, P.C. Zamecnik, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85. 5507 (1988)]. A Goodchild vizsgálatban a legnagyobb aktivitást akkor érték el, ha a poliadenilezési szignál ellen irányították a molekulákat. Agrawal és munkatársai kiterjesztették Goodchild és munkatársai vizsgálatait, oly módon hogy kémiailag módosított oligonukleotid analógokat használtak, amelyeket a cap és a donor/akceptor hely illesztése ellen irányítottak [S. Agrawal, J. Goodchild, M.P. Civeira, A.H. Thornton, P.S. Sárin, P.C Zamecnik, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 7079 (1988)]. Ezeknek egy része átfedett a HÍV TAR régiójával, de nem mutatott komoly hatást. Ezt az oligonukleotid analógot arra sem tervezték, hogy a HÍV TAR régiójával lépjen kölcsönhatásba. Agrawal és munkatársai oligonukleotid analógokat használtak, amelyeket a donor/akceptor hely illesztése ellen irányítottak a HÍV fertőzés leküzdése céljából, a fertőzés korai stádiumában levő sejtekben és a krónikusan fertőzött sejtekben [S.Agrawal, T. Ikeuchi, D.Sun, P.S. Sárin, A.Konopka, J. Maizei, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 86. 7790 (1989)].

Sárin és munkatársai is használtak kémiailag módosított oligonukleotid analógokat, a cap és a donor/akceptor illesztés helye ellen irányítva [P.S. Sárin, S.Agrawal, M.P. Civeira, J. Goodchild, T. Ikeuchi, P.C. Zamecnik, Proceedings of the ‘•ational Academy of Sciences, USA, 85 7448 (1988)]. Zaia és r.unkatársai szintén használtak oligonukleotid analógot a HÍV G'tlására, amely egy akceptor illesztési hely ellen irányult • * · · · · • · ········ ···· · ········ » • · · ♦ · · ·· · (J.A. Zaia, J.J. Rossi, G.J. Murakawa, P.A. Spallone, D.A. Stephens, B.E. Káplán, Journal of Virology, 62, 3914 (1988)], Matsukura és munkatársai olyan oligonukleotid analógokat szintetizáltak, amelyek a rév gén mRNS-ének transzlációs iniciációs pontja ellen irányultak [M.Matsukura, K.Shinozuka, G.Zon et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 7706 (1987); R.L. Letsinger, G.R. Zhang, D.K. Sun, T. Ikeuchi, P.S. Sárin, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 86 6553 (1989)]. Móri és munkatársai egy másik oligonukleotid analógot használtak ugyanazon régió ellen irányítva, mint amely ellen Matsukura irányította az oligonukleotidját [K.Mori, C. Boiziau, C. Cazeneva et al., Nucleic Acids Research, 17 8207 (1989)]. Shibara és munkatársai egy akceptor illesztési hely ellen, valamint a reverz transzkriptáz primer kötő helye ellen irányított oligonukleotid analógokat használtak [S.Shibara, S. Mukai, H.Morisava, H. Nakashima, S. Kobayashi, N. Yamamoto, Nucleic Acids Research,

17. 239 (1989)]. Letsinger és munkatársai olyan oligonukleotid analógokat szintetizáltak és teszteltek, amelyek konjugált koleszterolt tartalmaztak és egy illesztési hely ellen irányították [K. Móri, C. Boiziau, C. Cazenave et al., Nucleic Acids Research, 17., 8207 (1989)]. Stevenson és Iversen polilizint konjugáltak olyan oligonukleotid analógokhoz, amelyeket egy donor illesztési helye és a tat gén első exonjának 5’ vége ellen irányítottak [M.Stevenson, P.L. Iversen,

J.Génsebészet. Virol., 70, 2673 (1989)].

Ezek a korai kísérletek a HÍV megcélzására főleg az oligonukleotid analógban alkalmazott kémiai módosítások

- 6 természetére koncentráltak. Jóllehet mindegyik publikációban leírták, hogy valamelyes sikert értek el a vírus egyik-másik funkciójának gátlásában, mégsem találtak egy általános terápiás sémát a HÍV és más retrovírusok megcélzására. Ennek megfelelően létezik, és még a továbbiakban is létezni fog egy állandó igény az olyan oligonukleotidok és oligonukleotid analógok tervezésére és szintetizálására, amelyek alkalmasak a hatásos, terápiás antiszensz kezelésre.

Ezt a hosszú ideje fennálló igényt nem sikerült kielégíteni a korábbi, a HÍV és más retrovírusok illetve egyéb vírusok oligonukleotid terápiájára irányuló munkákkal. Mások nem tudtak olyan cél-helyeket azonosítani, amelyeken az antiszensz oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok terápiásán hatásosak, egy ésszerű felhasználási ráta mellett.

A találmány tárgya kezelési eljárást nyújtani humán megbetegedésekre, főleg a humán immunhiányos tünetegyüttest okozó vírus és más humán retrovírusok ellen.

A találmány tárgya továbbá olyan molekulák, főleg oligonukleotidok illetve oligonukleotid analógok előállítása, amelyek elrontják a mRNS szerkezetét.

A jelen találmány tárgya továbbá a gének expressziójának megváltoztatása a sejtekben.

A találmány tárgya továbbá az RNS-ek másodlagos szerkezetének befolyásolása, oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok segítségével.

Egy további tárgya a jelen találmánynak, hogy az említett befolyásolást zavart RNS szekunder struktúrák képződése révén érjük el.

• · •··· « ···»···· · • ··· · · ···

- 7 A találmány tárgya továbbá, hogy a fenti befolyásolást nukleotid triplexek kialakulása révén érjük el.

A jelen találmánynak ezek és egyéb tárgyai a leírásból lesznek nyilvánvalók.

Az antiszensz oligonukleotidok HÍV és más retrovírusok, vírusok és más fertőző ágensek elleni irányítására egy elvileg új módszert fedeztünk fel. A korábbi kísérletek, amelyek a HÍV ellen irányított antiszensz molekulákra irányultak, a munka arra irányult, hogy néhány különösen fontos fehérje szintézisét gátolják, amelyekről azt gondolták, hogy létfontosságúak a fertőzés sikere szempontjából. A jelen találmány során ugyanezt a célt (vírus gén expresszió gátlása) sikerült elérni, de nagyobb, terápiás szempontból szignifikáns aktivitást kaptunk, oly módon hogy a HIV-en vagy más retrovírus RNS-en levő bizonyos helyek ellen irányítottuk az antiszensz molekulákat. A jelen találmányban olyan RNS szerkezeteket találtunk célpontoknak, amelyeknek fontos biológiai szerepük van. Ezeket a szerkezeteket zavarjuk meg. Azt meghatároztuk, hogy ezeknek az RNS szerkezeteknek a megcélzása az oligonukleotidokkal és oligonukleotid analógokkal a kulcs a hatásos antiszensz terápiához.

A jelen találmányban gének expressziójának befolyásolására alkalmas módszert írunk le. Ez abban áll, hogy kiválaszttunk vagy azonosítunk egy olyan RNS részt, amelyet egy olyan gén kódol, amelynek részei egy másodlagos szerkezetet hoznak létre. Az RNS-t, vagy az azt tartalmazó sejteket ezután olyan oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezésbe, amely az RNS-nek legalább egy említett részéhez

képes kapcsolódni. Az az előnyös, ha az oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot ügy tervezik meg, hogy képes legyen az RNS másodlagos szerkezetének megbontására, és ezzel befolyásolja a gén expresszióját. A gén általában olyan gén, amelyről feltételezik, hogy egy szervezetben megbetegedett állapotot képes létrehozni, tipikusan vírus vagy retrovírus gén, jóllehet más fertőző szervezet is megtámadható így.

Az előnyös, ha az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg képes az RNS résznek legalább hat alegységéhez kapcsolódni. Az még előnyösebb, ha 8-50 alegységéhez képes kapcsolódni, legelőnyöseb, ha 10 vagy 20 alegységhez kapcsolódik.

Az előnyös megvalósítási módokkal összhangban, az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg képes egy duplex szerkezetet létrehozni az RNS egy részével. Egy másik módszer szerint, és bizonyos előnyös megvalósítási módok során, az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg képes az RNS kiválasztott részével triplex szerkezetet létrehozni. Jóllehet a kölcsönhatás mechanizmusa nem teljesen ismert, mégis lehetséges, hogy számos különböző módon befolyásolhatja a gén expresszióját.

Az előnyös megvalósítási módok szerint a kölcsönhatásba lépő RNS rész a Hív TAR elemének legalább egy részét tartalmazza. Más előnyös megvalósítási módok a HÍV CÁR elemével vagy gag-pol elemével való kölcsönhatáson alapulnak.

A jelen találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok szerintünk önmagukban is újszerűtek. Azaz, olyan oligonukleotidokról van szó, amelyek képesek az RNS egyes, szekunder szerkezetet létrehozó részeivel kölcsönhatásba • · * · ···· • · · · · · • · · ·· ·· «·· ···· · ···»···· · • · · · · · · ·« lépni. Az is a szándékaink közé tartozik, hogy módszereket dolgozzunk ki olyan állatok kezelésére, amelyekről feltételezhető, hogy másodlagos szerkezettel rendelkező RNS-t kódoló gén expressziójával jellemezhető betegségben szenvednek. Tehát, azokat az állatokat, amelyekről feltételezzük, hogy a betegségben szenvednek, olyan oligonukleotidokkal vagy oligonukleotid analógokkal hozzuk érintkezésbe, amelyek a betegség kialakításában szereplő RNS másodlagos szerkezetéhez kapcsolódnak. Pontosabban, a jelen találmány szerinti eljárás szerintünk hatásos emlősök, különösen ember HÍV fertőzésének kezelésében. Tehát, a HÍV TAR, CÁR vagy gag-pol elemeivel való kölcsönhatásra tervezett oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat beadjuk állatoknak, illetve főleg embereknek, akikről feltételezhető, hogy a humán immundeficiencia vírussal vannak fertőzve.

Más virális, retrovirális vagy egyéb fertőző betegségek gazdája is alanya lehet a jelen találmány szerinti kezelésnek.

Az ábrák rövid ismertetése

Az 1. ábrán a lineáris HIV-1 TAR elem szekvenciája látható. Az aláhúzott részek a feltételezett hajtű szerkezetek és kidudorodások szekvenciái, amikor az RNS hajtű szerkezetbe csavarodik. Az 1B ábrán a HIV-1 TAR elemének egy számítógéppel modellezett másodlagos szerkezete látható.

A 2. ábrán különböző oligonukleotidok és oligonukleotid analógok aktivitása látható sejttenyészet vizsgálatokban, a TAR/tat transzaktiválásra vonatkoztatva.

A 3. ábrán a 94S oligonukleotid foszforotioát aktivitása • « · ··« · * · · * * • · · · · ··· • ··«· ···· · *·· · · ··· látható sejttenyészetben a TAR/tat transzaktiválás vizsgálatban.

A 4. ábrán a 94S és 95S foszforotioátok aktivitása látható sejttenyészetben TAR/tat transzaktiválási tesztben, alacsony dózisokban.

Az 5. ábrán a HIV-1 CÁR RNS szekvencia részleges lineáris szerkezete látható, ami megfelel a 7357-7627-es nukleotidoknak.

A 6. ábrán a HIV-1 CÁR elemének számítógéppel modellezett másodlagos szerkezete látható.

A 7. ábrán a gag-pol keret eltolási régió számítógéppel modellezett másodlagos szerkezete található, valamint a keret eltolás gátlásának lehetséges mechanizmusa.

A 8. ábrán a gag-pol keret eltolással kölcsönhatásba lépő antiszensz oligonukleotid látható.

A 9. ábrán a gag-pol keret eltolással létrejövő lehetséges kölcsönhatás nukleotid triplex képződésén keresztül.

Az RNS biológiai funkcióját a szerkezete határozza meg. A mRNS-ről általában azt gondolják, hogy lineáris molekula, amely a fehérje szintézis irányításához szükséges információt a ribonukleotid szekvenciában tárolja. Az újabb vizsgálatok számos olyan másodlagos, harmadlagos szerkezetet fedeztek fel a mRNS-ben, amelyek fontosak a működéséhez [I. Tinoco, Jr., P.W. Davis, C.C. Hardin, J.D. Puglisi, G.T. Walker, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi., 52, 135 (1987)]. Az RNS-ben a másodlagos szerkezeti elemek főleg Watson-Crick típusú kölcsönhatások révén jönnek létre ugyanannak az RNS molekulának a különböző régiói között. A fontos szerkezeti elemek közé ··*· tartoznak például a molekulán belüli kétszálú régiók, hajtű szerkezetek, kidudorodások a duplex RNS-ben és a belső hurkok. A harmadlagos szerkezeti eleinek akkor képződnek, ha a másodlagos szerkezeti eleinek lépnek kölcsönhatásba egymással vagy egy egyszálú régióval, hogy egy összetettebb háromdimenziós szerkezetet hozzanak így létre.

Nagyon keveset tudunk az RNS pontos háromdimenziós szerkezetéről. Újabban azonban számos kísérleti erőfeszítés történt, amelyekkel igazolták, hogy az RNS szerkezetek, beleértve az egyszálú, másodlagos és harmadlagos szerkezeteket, fontos biológiai funkcióval rendelkeznek, amellett, hogy egyszerűen a fehérje készítéséhez szükséges információt lineáris szekvenciák formájában tárolják. Ezeknek az összefüggéseknek egy részét az alábbi publikációkban foglalták össze: I.Tinoco, Jr., P.W. Davis, C.C. Hardin, J.D. Puglisi, G.T. Walker, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi., 52, 135 (1987); O.Resnekov, M. Kessler, Y. Aloni, Journal of Biological Chemistry, 264. 9953 (1989); C. Tuerk, P.Gauss, C.Thermes et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 1364 (1988); és D.E. Larson, B.H. Sells, Mól. Cell. Biochem., 74, 5 (1987). Annak ellenére, hogy kevés pontos szerkezeti információ létezik az RNS-ről, számos kutató mérte a kötési energiát sok RNS duplex struktúrában, és sok szabályt alkottak, amelyek arra használhatók, hogy segítségükkel az RNS másodlagos szerkezetét megbecsülhessük [J.A. Jaeger, D.H. Turner, M. Zuker, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 86, 7706 (1989); D.H. Turner, N.Sugimoto, Annu. Rév. Biophys. Chem. 17, 167 (1988)]. A kísérleti adatokkal összefüggésben ezek az adatok hasznosak • «te

- 12 - ·*:· azoknak az RNS szerkezeti elemeknek az azonosításában, amelyek fontos biológiai funkcióval rendelkeznek.

Felfedezték, hogy a sejtekben szabályozni lehet az RNS aktivitását, oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok bejuttatásával, amelyek elrontják, illetve kölcsönhatásba lépnek a természetes RNS-ek másodlagos szerkezetével. Az oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok kölcsönhatásba lépnek azokkal a normális kötődésekkel, amelyek az RNS és a hozzá kötődő faktorok között alakulnak ki. Ez a módszer felhasználható betegségek, főleg HÍV és más retrovírusok által okozott fertőzések kezelésére. A jelen találmány szerint, olyan készítményeket állítunk elő, amelyek biológiai jelentőségű, meghatározó szerkezeti tulajdonságokkal rendelkező RNS molekulákhoz kötődnek. A jelen találmányban olyan oligonukleotidokat illetve oligonukleotid analógokat használunk, amelyek kötődnek ezekhez a szerkezetekhez. A jelen találmány szövegösszefüggésében az oligonukleotid jelentése különböző, egymáshoz kapcsolt, természetes bázisokból és ciklofuranozil csoportokból álló nukleotid egység, amelyet természetes foszfodiészter kötések tartanak össze. Ez a szakkifejezés vonatkozik a természetes molekulákra illetve a szintetikus molekulákra is, amelyek a természetben előforduló alegységekből jöttek létre.

Az oligonukleotid analóg szakkifejezés a jelen találmány szövegkörnyezetében olyan egységekre vonatkozik, amelyek az oligonukleotidokhoz hasonlóan működnek, de amelyekben olyan részek is vannak, amelyek nem fordulnak elő a természetben. így például az oligonukleotid analógokban lehetnek megváltoztatott cukor egységek vagy cukrok közötti kötések. Példa lehet ezekre a foszforotioát és más kéntartalmú kötés, amelyeknek használata a szakterületen jártas szakember számára ismert. Tartalmazhatnak ezen kívül megváltoztatott bázis egységeket illetve más módosításokat, amelyek a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

Bizonyos előnyös megvalósítási módok szerint az oligonukleotidoknak legalább néhány foszfodiészter kötését olyan szerkezetekkel helyettesítjük, amelyek működésükkel javítják a molekulának azt a képességét, hogy a sejtnek abba a régiójába hatoljon be, ahol a módosítandó aktivitású RNS található. Előnyös, ha az ilyen kötés ként tartalmaz. Jelenleg előnyösnek tartják, ha az ilyen helyettesítések foszforotioát kötéseket tartalmaznak. Más kötés lehet az alkil-foszfotioát kötés, Nalkil-foszforamidit kötés, foszforoditioát kötés, alkilfoszfonát kötés, valamint a rövid szénláncú alkil vagy cikloalkil szerkezetek is hasznosak lehetnek. Más előnyös megvalósítási módokkal összhangban a foszfodiészter kötéseket olyan szerkezetekkel helyettesítjük, amelyek lényegében sem nem ionosak, sem nem királisak. A szakterületen jártas szakember számára egyszerű olyan kötéseket kiválasztani, amelyek a jelen találmány gyakorlatában alkalmazhatók.

A jelen találmány néhány megvalósítási módja szerint általában előnyös, ha a kapcsoló cukor egységekben a 2' pozíciót az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg legalább néhány alegységében helyettesítjük. A 2' szubsztituensek lehetnek például 0H-, SH-, F-, -OCH3-, OCN-, 0CH_nCH3-csoportok, ahol is N értéke 1 és 20 között változik. Néhány megvalósítási mód szerint • · « · más, hasonló tulajdonságokkal rendelkező szubsztituensek is használhatók.

Az oligonukleotid analógok közé tartozhatnak olyanok is, amelyek legalább néhány módosított bázist tartalmaznak. Azaz olyan purinok és pirimidinek is használhatók, amelyek nem találhatók meg a természetes anyagban. Hasonlóképpen, a nukleotid alegység ciklofuranóz részén is végrehajthatók változtatások, egészen addig, amíg a jelen találmány lényegi részéhez ragaszkodunk.

Az ilyen analógokat legjobban azzal lehet leírni, hogy működés szempontjából felcserélhetők a természetes oligonukleotidokkal (illetve a természetes anyagok mintájára szintetizált oligonukleotidokkal), de amelyekben a természetes szerkezetektől egy vagy több helyen eltérés van. A jelen találmányban minden ilyen analógot használhatjuk, ameddig hatásosan működnek abból a szempontból, hogy a működés szempontjából lényeges másodlagos szerkezettel rendelkező RNShez kötődnek.

A jelen találmány szerinti oligonukleotidok illetve oligonukleotid analógok előnyösen 3-100 alegységből állnak. Előnyös, ha ezek az oligonukleotidok illetve oligonukleotid analógok legalább 6 alegységet tartalmaznak, de 8-50 alegység még előnyösebb, és legelőnyösebb, ha 10-20 alegységet tartalmaznak. Az nyilvánvaló, hogy alegység alatt egy bázis és cukor kombinációt értünk, amelyek megfelelő módon kötődnek a szomszédos alegységekhez, foszfodiészter vagy egyéb kötésen keresztül.

A jelen találmány szerinti oligonukleotidok és • · · oligonukleotid analógok felhasználhatók a diagnosztikában, terápiában, valamint kutatási reagensként és kitben. A gyógyászati alkalmazás során az oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot beadjuk egy állatnak, különösen embernek, főleg olyannak, aki vírus vagy retrovírus fertőzésben, például AIDS-ben szenved.

Általában előnyös, ha a terápiás hatású anyagot belsőleg alkalmazzuk, azaz szájon át, intravénásán vagy intramuszkulárisan. A beadás más formái is hasznosak lehetnek, például a transzdermális, topikális vagy intraléziós. A kúpokba való bedolgozás is hasznos lehet. A jelen találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok alkalmazása a megelőzésben is hasznos lehet. Néhány megvalósítási mód szerint a gyógyászatilag elfogadható hordozók alkalmazása is előnyös lehet. A jelen találmány szerint azok a jól használható oligonukleotidok illetve oligonukleotid analógok, amelyeket azzal az RNS szekvenciával lehet jellemezni, amelynek a másodlagos szerkezetével kell hogy kölcsönhatásba lépjen. Tehát a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, a találmány szerinti oligonukleotidokra és oligonukleotid analógokra az jellemző, hogy képesek egy olyan RNS-hez kötődni, amelynek másodlagos szerkezete van, és ez a másodlagos szerkezet egy kóros állapot okozója illetve annak létrejöttében részt vesz.

Számos olyan RNS másodlagos szerkezetet azonosítottak újabban, amelyekre a jelen találmány alkalmazása valószínűleg terápiás jelentőséggel bír. Mások is hasznosak lehetnek. Ezek közé tartoznak például a HÍV TAR szerkezetei [S.Feng, E.C.

• V ···· · ········ · • ··· · ····

Holland, Natúré, 334. 165 (1988)], beleértve az 1-59-es és 60104-es nukleotidok között kialakuló hurkokat [a nukleotidok számozása Ratner et al. szerinti: Ratner L., W. Haseltine, R. Patarca, K.J. Livak, B. Starcich, S.F. Josephs, Natúré, 313 277 (1985)]; a HÍV EGP/OMP régiói közötti határoló szakasz [S. Le, J. Chen, M.J. Braun, M.A. Gonda, J.V. Maizei, Nucleic Acids Research, 16, 5153 (1988)]; a HÍV CÁR szerkezete [E.T. Dayton, D.M. Powell, A.I. Dayton, Science, 246 1625 (1989)]; a HÍV gag és pol génjeinek kapcsolódásánál található hurok (1629-1674)]; a HÍV CRS eleme; és a humán vas-reagáló elem (IRE) [J.L. Casey, M.W. Hentze, D.M. Koeller et al., Science, 240, 924 (1988)].

Emellett léteznek olyan RNS régiók, amelyekről azt tételezik fel, hogy egyszálú területek, és amelyeket úgy azonosítottak mint fehérje kötő területeket. Az 5'-AUUUA-3' szekvenciát például úgy azonosították, mint egy olyan fehérje kötődési jelét, amely az RNS lebomlásához vezet [J.S. Malter, Science, 246, 664 (1989)]. Ennek a régiónak a szerkezete nem ismert. Ez azonban nem zárja ki annak a lehetőségét, hogy a jelen találmányban használjuk ezt a szekvenciát. További, ezidáig ismeretlen szerkezetű RNS elemek is lehetnek ennek a találmánynak a tárgyai.

A találmány kivitelezéséhez egyáltalán nem szükséges, hogy az aktuális RNS szerkezetet ismerjük, csak az szükséges, hogy egy specifikus RNS szekvenciát felismerjen egy RNS kötő elem, és ez a kölcsönhatás fontos biológiai következményekkel járjon. Ebből a szempontból a retrovírusoknak a virion képződéshez szükséges szerkezeti fehérjéi, amelyek a vírus szekvenciákat és struktúrákat felismerik, másokkal együtt • · * * · · szintén a jelen találmány tárgyait képezhetik. Az nem cél, hogy a jelen találmányt csak a jelenleg ismert szerkezetekre korlátozzuk. Bármely, fontos biológiai funkcióval rendelkező RNS struktúrához való kötődés a jelen találmány oltalmi körébe tartozik.

Ebben a leírásban számos különböző módszert ismertetünk egy RNS szerkezeti elem természetes funkciójával való interferálásra, de a szakterületen jártas szakember számára más módszerek is nyilván ismertek. A Watson-Crick féle hibridizálási szabályok és a szabadenergia becslések alkalmazásával az oligonukleotidoknak vagy oligonukleotid analógoknak a hibridizálási reakcióira, amely szekvenciákat úgy terveztünk, hogy komplementerek legyenek szekunder szerkezettel rendelkező RNS szekvenciákkal, azt találtuk, hogy az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok versengenek a belső RNS szerkezetekkel, a stabil heteroduplexek létrehozásában. A heteroduplex képződés energia gátjait úgy lehet leküzdeni, hogy olyan oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat tervezünk, amelyek sokkal stabilabb heteroduplexeket képeznek a kiválasztott RNS-sel mint a belső RNS szerkezet.

A kinetikai megfontolások, amelyek egy létező RNS duplex szál-behatolására vonatkoznak, szintén az oligonukleotidok tervezésének eszközét képezik. Lehetséges egy létező RNS másodlagos szerkezetet elrontani a behatoló szállal, ha a behatoló szálat úgy tervezzük meg, hogy legalább három, előnyösen több olyan bázist tartalmazzon, amelyek a kiválasztott RNS-nek azzal a régiójával komplementerek, amelyik nem vesz részt a bázis-párosodásban. Ez azt jelenti, hogy a behatoló szál • · · kinetikailag megveti a lábát ahhoz, hogy a heteroduplex képződés folyamatát megindítsa.

Azt is leírták, hogy a duplex RNS szerkezetet elronthatjuk azzal, ha egy harmadik szálat kapcsolunk hozzá. A heteroduplex kéződéssel ellentétben, amikor az RNS másodlagos szerkezetét egy behatoló szállal megtörjük, a háromszálas szerkezet képződése általában megőrzi a már létező RNS duplex hidrogénkötési mintázatát, de egy helikális horonyban további hidrogénkötésekkel kötődik. A háromszálas szerkezet egy olyan jelenség, amely korlátozott értelemben bizonyos ideje ismert. Az általános összefoglalók, amelyek leírják háromszálas szerkezetek képződését duplex DNS-sel: J.C. Hanvey, M.Shimizu, R.D. Wells, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 6292 (1988) Is S. Arnott, E. Selsing, Journal of Molecular Biology, 88, 509 (1974). Háromszálas szerkezetek képződését RNS homopolimerek között már korábban leírták [S.L. Broitman, D.D. Immunoglobulin, J.R. Fresco, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 5120 (1987)]. Azt azonban korábban nem írták le, hogy az RNS működését gátolni lehet oly módon hogy oligonukleotidokkal vagy oligonukleotid analógokkal kapcsolódunk duplex régiókhoz, és így hozunk létre háromszálas szerkezeteket. Ma az a vélemény, hogy az RNS másodlagos szerkezetű régióihoz való kötődés, ilyen régió például szár a szár-hurok szerkezetekben, megzavarja a kölcsönhatást a természetes RNS és azok között a faktorok között amelyek ide kötődnek, és ezáltal befolyásolják a gének expresszióját.

A jelen találmány szerint az nyilvánvaló, hogy a kötődik szakkifejezésnek, mivel az egy oligonukleotid vagy • * ♦ ··· • · · • · · · · · · «··· ···· · • · · · · oligonukleotid analóg és egy RNS rész közötti kölcsönhatásra vonatkozik, számos, rokon jelentése lehet. Tehát a jelen találmány vonatkozik arra az esetre, amikor egy oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg legalább egy alrészhez kötődik, és ezáltal egy RNS résszel másodlagos szerkezetet hoz létre. Az nyilvánvaló, hogy az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg az RNS résznek legalább egy alcsoportjához fog kötődni a WatsonCrick szabályok szerint, és így lokálisan egy heteroduplexet képez az RNS alrész és az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg között. Erről a heteroduplex képződésről az a vélemény, hogy az RNS rész másodlagos szerkezetének megváltozását eredményezi.Ennek a hatásnak a pontos mechanizmusa és eredménye nem ismert pontosan, mégis az a vélemény, hogy az RNS rész normál másodlagos szerkezete lassan megváltozik azáltal, hogy az oligonukleotid az RNS rész egy vagy több alcsoportjához kötődik. Mivel az új heteroduplex elektronikus és szférikus tényezői eltérnek a természetben előforduló RNS-től, ezáltal megzavarja annak a funkciónak a hatékonyságát és természetét, amelynek során az RNS-ről fehérje keletkezik. A keletkező detektív fehérje, illetve a fehérje hiánya úgy jelentkezik, hogy az RNS-t kódoló gén expressziója megváltozott.

A jelen találmány tárgyalja továbbá triplexek képződését másodlagos szerkezettel rendelkező RNS részekkel. Az ilyen triplexek pontos természete sem ismert, azonban az az általános vélemény, hogy az alkalmasan készített oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok így kölcsönhatásba léphetnek bizonyos körülmények között a másodlagos szerkezettel rendelkező RNS-sel. A keletkező triplex szerkezetről úgy gondolják, hogy nagyon • · · ····· • · · · ·· ·· * ·· ····· ·*·* » ·········

- 20 - .........

zavarja a fehérje transzlációját az RNS-ről, és így annak a génnek az expresszióját zavarja végső soron, amelyről az RNS származik.

A találmány szerint az nem szükséges, hogy az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg kölcsönhatása az RNS résszel vagy alrésszel - a kettő kapcsolódása - a fehérje képződésének elmaradásában vagy rossz képződésében nyilvánuljon meg. Bizonyos körülmények között lehetséges hogy bizonyos, a génsebészet expressziójában fontos szerepet játszó szabályozó · vagy egyéb funkció elrontása hatékony eszköze az expresszió befolyásolásának. Ennek egyik példája a HÍV gag-pol lókuszára vonatkozik. Azaz, az nem szükségszerű, hogy a fehérje transzlációja leálljon, vagy hibás fehérje keletkezzen.

Ehelyett inkább a gag-pol régió megzavarása révén lehetségesnek vélik, hogy a keret eltolást megzavarják, amiről úgy gondolják, hogy a HÍV organizmus számára fontos fúziós fehérjék keletkezéséhez vezet.

Röviden, bármely kölcsönhatásról vagy kapcsolódásról oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg és egy másodlagos szerkezettel rendelkező RNS között úgy gondolják, hogy képes lehet arra, hogy az RNS funkcióját megzavarja, és így befolyásolja annak a génnek az expresszióját, amely az RNS-t kódolja. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a leírtak mellett más eszközök is léteznek arra, hogy az RNS másodlagos szerkezetét elrontjuk. Az összes ilyen módszert azonban a jelen találmány oltalmi körébe tartozónak tartjuk.

Míg nagyszámú különböző oligonukleotidról és oligonukleotid analógról gondoljuk, hogy a jelen találmány • · · · ···· ···· gyakorlatában hasznos lehet, előnyösnek tartjuk, ha olyan oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat tervezünk, amelyek legalább hat helyen kapcsolódnak egy másodlagos szerkezettel rendelkező RNS részhez. Más előnyös megvalósítási módokkal összhangban előnyösnek tartjuk azokat az oligonukleotidokat, amelyek 6-30, vagy előnyösen még több, 10-20 alegységgel lépnek kölcsönhatásba. Amint azt a fentiekben tárgyaltuk, jelenleg az a véleményünk, hogy a HÍV TAR eleme egy kiváló célpontja a jelen találmány alkalmazásának. Ennek megfelelően azoknak az oligonukleotidoknak vagy oligonukleotid analógoknak a készítését tartjuk előnyösnek, amelyek a HÍV TAR régiójának egy vagy több alrészéhez kötődnek. Egy hasonló megfontolás az alapja a HÍV CÁR eleme működésének megzavarásának. Ennek megfelelően az ezzel a résszel kölcsönhatásba lépő oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok szintézise az előnyös.

Hasonló módon, a HÍV gag-pol régiójának megzavarása is előnyös lehet a jelen találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint. Ebben az esetben az várható, hogy a keret-eltolás megzavarása a gag-pol család esszenciális fehérjéinek rossz képződéséhez, vagy képződésének elmaradásához vezet.

A jelen találmány tárgyait képezik a gyógyhatású hatóanyagok is. Tehát a jelen találmány szerinti oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok beadása gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagban, igen hasznos lehet. Az a kívánatos, hogy a feltehetően másodlagos szerkezettel rendelkező RNS-t kódoló gének expressziójával jellemezhető betegségekben szenvedő állatokat kezeljük. Tehát azokat az • · · állatokat, akikről feltételezzük, hogy ilyen betegségekben szenvednek, olyan oligonukleotidokkal vagy oligonukleotid analógokkal hozzuk érintkezésbe, amelyeket úgy terveztünk, hogy az említett RNS-ek másodlagos szerkezetével lépjenek kölcsönhatásba. Ez különösen igaz az AIDS kezelésére. Ilyen esetben jelenleg az az előnyös, ha olyan oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat használunk, amelyeket a HÍV TAR, CÁR vagy gag-pol régiója ellen irányítottunk.

Általában az az előnyös, ha azoknak a betegeknek, akikről feltételezzük, hogy az előzőkben említett betegségekben szenvednek, annyit adunk be az oligonukleotidból vagy az oligonukleotid analógból, természetes formájában vagy hordozóban elkeverve, megfelelő kezelési terv szerint, hogy az illető betegség tüneteit csökkentse. Az a szakterületen jártas szakember számára köteles tudás, hogy az ilyen kezelésekhez az optimális dózist és adagolási rendet meghatározza.

1. példa: A HÍV TAR eleme

A HÍV genomon egy bonyolultan összefüggő kontroll elem csoport határozza meg, hogy a vírus replikálódik-e vagy nyugalmi állapotban marad. A HÍV genomban azonosított kilenc gén közül csak három tartozik a maghoz és a burokhoz [W.A. Haseltine, Fehérje. Wong-Staal, Scientific American, 52 (1988 október)]. A többi hat gén a virális fehérjék termelődésének szabályozásában vesznek részt. A szabályozó gének úgy működnek, hogy olyan fehérjéket termelnek, amelyek kölcsönhatásba lépnek egy másik, arra alkalmas elemmel, valahol másutt a genomon. A legfontosabb szabályozó gén, amely a replikáció kirobbanásáért felelős, a tat • · ♦ ·

- 23 - .........

(transz-aktivátor) gén. A tat gén terméke, a tat fehérje úgy működik, hogy kölcsönhatásba lép egy rövid szekvencia résszel, amelyet TAR (transz-hatású reagáló elem) néven ismerünk. A TAR szekvencia a virális hosszú terminális ismétlődő szakaszokban (LTR-ek) van kódolva, és ezért minden egyes HÍV génről készült mRNS-ben megtalálható.

A tat fehérje expressziójának az az eredménye, hogy más HÍV géneknek körülbelül ezerszeresre nő az expressziója, beleértve a tat gént magát is. Ennek az autoregulációs visszacsatoló szabályozásnak a következtében, valamint annak következtében, hogy a TAR szekvencia minden egyes HÍV transzkriptumban megtalálható, hatalmas mennyiségű virális génexpresszió indul be, amikor a tat gén aktiválódik. A tat gén és a TAR elem közötti kölcsönhatás ezért rendkívül lényeges a HÍV életciklusa szempontjából, és ennek a kölcsönhatásnak a specifikus lerombolása nagyon valószínű hogy megszakítja a vírus szaporodását.

A TAR tartalmú géneknek a tat fehérje általi transzaktiválását újabban alaposan tanulmányozták [Phillip, A. Sharp, Róbert, A. Marciniak, Cell, 59 229 (1989)]. Jóllehet még sokmindent nem ismerünk, két fontos dolog tisztázódott: az, hogy a tat megnöveli a TAR-tartalmú gének expresszióját, oly módon hogy mind a virális mRNS mennyiségét, mind a transzláció hatékonyságát megnöveli, és a TAR egy RNS struktúraként működik, nem pedig DNS struktúraként.

A szokatlan következtetés, hogy a tat megnöveli a TAR-t tartalmazó gének expresszióját, és ezt úgy teszi, hogy az RNS-en levő TAR elemekkel lép kölcsönhatásba, számos megfigyelésből β «· « . Ο Λ _ ··«· · ·*·· »··· · *1 » ··· · · ··· következik [Phillip, A. Sharp, Róbert, A. Marciniak, Cell, 59 229 (1989)]. A transz-aktiválás eléréséhez arra van szükség, hogy a TAR elem közvetlenül a transzkripció iniciációs helye után helyezkedjen el. Emellett még a TAR orientáció függő: ha fordított orientációval építjük be, akkor nem működik.

A legerősebb bizonyítékok arra, hogy a tat kölcsönhatásba lép a TAR-ral mint egy RNS szerkezettel, mutagenezis kísérletekből származnak. A TAR elem vizsgálatára tett erőfeszítéseket az a megfigyelés serkentette, hogy a HIV-1ből származó tat fehérje képes volt transz-aktiválni a HIV-2 TAR régióját tartalmazó vektorokat. A HIV-2 egy különböző vírustörzs, bár nagyon kis primer homológra van a törzsek TAR régiójában [S.Feng, E.C. Holland, Natúré, 334. 165 (1988)]. Ha azonban a HIV-1 és HIV-2 törzsekből származó TAR szekvenciákat olyan számítógépes programmal elemezzük, amely az RNS másodlagos szerkezetére képes következtetni, akkor kiderül, hogy a helyes TAR RNS szerkezet nélkülözhetetlen a tat transz-aktiváláshoz.

Mostanában fedezték fel, hogy azok a vegyületek, amelyek specifikusan kötődnek a TAR RNS szerkezethez és interféráinak a tat transz-inaktiváló hatásával, Hív fertőzés esetében terápiás hatással rendelkeznek. Véleményünk szerint az összes HÍV törzs a jelen találmány oltalmi körébe tartozik. A különböző HÍV törzsekben a TAR szekvenciák különbözőek lehetnek, amelyek ennélfogva különböző háromdimenziós szerkezeteket vehetnek fel. A jelen találmány a HÍV különböző törzseire is alkalmazható, oly módon hogy megváltoztatjuk az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg szekvenciáját, hogy komplementer legyen az egyes törzsek szekvenciájával.

• ••·

A TAR és tat funkciót oly módon tanulmányozták, hogy a géneket eltávolították a HÍV genomból, majd izoláltan tanulmányozták őket sejtvonalakban. Vektorokat készítettek, hogy vizsgálják a tat fehérje és a TAR elem közötti kölcsönhatást, a tat gén az SV40 promoterről expresszálódik. A TAR régió egy másik plazmidról expresszálódik, amely egy könnyen vizsgálható riporter génhez kötődik, a méhlepény alkalikus foszfatáz génjéhez (PAP) [P. Henthorn, P. Zervos, M. Raducha, H. Harris, T. Kadesch, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 6342 (1988)]. A sejttenyészet modellben mért enzimaktivitásról kimutatták, hogy értéke a TAR régió esszenciális elemeinek jelenlététől, valamint a tat fehérje jelenlététől függ [P.Sharp, R. Marciniak, Cell, 59, 229 (1989);

S. Feng, E.C. Holland, Natúré, 334, 165 (1988); Michael, Fehérje.Laspia, Andrew, P. Rice, Michael, B. Mathews, Cell, 59. 283 (1989) ; J.A. Garcia, D. Harrich, E. Soultanakis, F. Wu, R. Mitsuyasu, R.B. Gaynor, EMBO J., 8, 765 (1989); B. Berkhut, Cell, 89, 273 (1989)]. A vektorrendszer végeredményben rekonstruálja a tat által közvetített TAR transz-aktiválás eseményeit, ami a HIV-vel fertőzött sejtekben játszódik le.

A TAT/TAR transz-aktiválást kényelmesen vizsgálhatjuk oly módon hogy a humán placenta alkalikus foszfatáz génjét (PAP) a HIV-1 LTR szekvencia szabályozása alá helyezzük, amely fokozó, promoter és tar elemeket tartalmaz. Egy, a HIV-1 LTR-t tartalmazó plazmid, a pHIVCAT-0 [S. Feng, E.C. Holland, Natúré, 334. 165 (1988)] tartalmazza a teljes HÍV U3-at és R-t, egészen a +78-as pozícióig (ez egy Hindin hasítási hely). Ennek a plazmidnak HindlII Is AatlI restrikciós enzimek kombinációjával

- 26 - .....

való emésztése felszabadítja a CAT kazettát az SV40 szekvenciákkal együtt, amelyek az RNS processzálásáért felelősek. Egy második plazmid, a pSV2Apap tartalmazza a PAP kazettát eukarióta processzáló szignállal együtt, az SV40 promoter transzkripciós szabályozása alatt [P. Henthron, P. Zervos, M. Raducha, H. Harris, T. Kadesch, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 6342 (1988)]. A PAP kazettát és processzáló szekvenciákat Hindin és AatlI restrikciós enzimekkel emésztve hasítjuk ki. Egy új plazmidot készítünk így, a pHIVPAP-ot, azáltal, hogy a pHIVCAT-O-ból származó HIV-1 LTR szekvenciát tartalmazó HindlII/AatlI fragmentet a pSV2Apap plazmidból származó HindlII/AatlI PAP kazettával ligáljuk.

Az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok aktivitásának ellenőrzéséhez a pcDEBtat és pHlVPAP plazmidokat együtt transzfektáljuk HeLa sejtekbe kalcium-foszfát kicsapással. Az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok hatását az alábbiak szerint határozzuk meg. A transzfekció előtti napon a HeLa sejteket 1:8 arányban elosztjuk hatlukas lemezekre. Minden egyes lemezen 1 pg pHIVPAP és 12 pg pcDEBtat plazmidot precipitálunk 500 μΐ HBS-ben, 32 μΐ CaC12~vel. A CaP04 csapadékot egyformán elosztjuk a hat luk között. Az oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat hasonló módon csapjuk ki, és az ábrákon jelzett koncentrációban adjuk a lukakhoz (a lukakban 1,5 ml táptalaj van). A csapadékot 20 percig hagyjuk érintkezni a sejtekkel, majd komplett táptalajt adunk hozzá, további 4 óra hosszat inkubáljuk. A sejteket ezután 10%-os glicerin HBS-ben készült oldatával sokkoljuk. Csak a 2.

ábrára vonatkozik, hogy az oligonukleotidot újra a táptalajhoz adtuk a transzfekeiét követően, de lukanként tízszer nagyobb dózisban. 48 óra elteltével a sejteket kinyertük, és fehérje valamint PAP mérést végeztünk Henthorn és munkatársai leírása szerint [P.Henthorn, P.Zervos, M.Raducha, H.Harris, T.Kadesch, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 6342 (1988)], az alábbi módosítások alkalmazásával. A sejteket 0,5 ml TBS-ben gyűjtöttük össze, és ebből 0,1 ml-t használtunk a fehérjeméréshez. A sejtszuszpenziók megmaradt 0,4 ml-ét ülepítjük, majd 50 μΐ TBS-ben szuszpendáljuk. Az endogén foszfatázokat inaktiváljuk, oly módon hogy a sejteket 30 percig 65°C-on tartjuk. A hőstabil humán placenta alkalikus foszfatázt 0,5 ml (5 mmol/1) PNPP-nek sejtszuszpenzióhoz való hozzáadásával vizsgáljuk, majd 37’C-on inkubáljuk. Az aktivitást 30 percenként határozzuk meg, a reakcióelegyből 150 μΐ-es alikvot részeket használva, majd az abszorbanciát 405 nm-en mérjük, egy Titertek Multiscan MCC\340 ELISA leolvasóval. A PAP aktivitást az összfehérjére vonatkoztatjuk minden egyes lukban. A fehérje koncentrációját BioRad fehérje reagenssel határozzuk meg, mikoris a kinyert sejteknek az 1/5-ét 0,1 μΐ TBS-ben szuszpendáljuk, majd 30 μΐ BioRad fehérjereagenshez adjuk, 10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, és az abszorbanciát 595 nm-en mérjük, Titertek lemezleolvasót alkalmazva.

A sejteket az alábbi oligonukleotidokkal és oligonukleotid analógokkal kezeltük:

/ δ'-β¹ szekvencia

TCCCAGGC

GTCTAACCAGAGAGACCC

CAGATCTGGTCTAACCAGAGAGACCC

GCTCCCAGGCTCAGATCT

GCCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCT

GCCAGAGAGCTCCCAGGC

GCTTAAGCAGTGGGTTCCCT

CTTTATTGAGGCTTAAGCAG

KONTROLL OLIGO CGACTCCGTGCTGGCTCTGA (Random szekvencia)

A 2-4. ábrákon az oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat megszámoztuk, a számokat egy betű követi (S vagy N), ahol a foszfodiészter kötéseket tartalmazó oligonukleotidokat

N” betű követi, a csak foszforotioát kötéseket tartalmazó oligonukleotid analógokat egy S betű követi. A 2-4. ábrákon bemutatott eredmények három független kísérlet átlaga.

2. példa: A HÍV CÁR eleme

A humán immundeficienciát okozó vírus életciklusában az egyik szabályozó esemény a nagy virion struktúráiis RNS felhalmozódása, amely a rövidebb szabályozó mRNS-ek rovására akkumulálódik. A vírus lényegében ugyanazt az RNS anyagot használja az egyes fehérjék kódolására. Ha az RNS még alaposabb másodlagos változásokon esik át, akkor szabályozó fehérjék keletkeznek. Ha az RNS-ek kisebb mértékben esnek át poszttranszkripciós változásokon, akkor szerkezeti fehérjék keletkeznek [W.A. Haseltine, F. Wong-Staal, Scientific American, 52 (1988 október)]. Ezeket az eseményeket egy rév néven ismert fehérje szabályozza, amely a rév gén terméke. A rév funkciója az, hogy fokozza az RNS transzportját a sejtmagból a citoplazmába. A rév hiányában a mRNS-ek a sejtmagban maradnak,

ahol a poszttranszkripciós módosításokat végző enzimek hatásának vannak kitéve, és ezek szabályozó fehérjéket kódoló mRNS-sé alakítják őket. A rév jelenlétében a mRNS-ek a citoplazmába jutnak, kevesebb átalakítás után. A keletkező hosszabb mRNS-ek szerkezeti fehérjéket kódolnak.

A rév úgy működik, hogy egy CÁR elemként ismert RNS szerkezeti elemhez kötődik [ [E.T. Dayton, D.M. Powell, A.I.

Dayton, Science, 246 1625 (1989)]. Ezt a szerkezeti elemet rre néven ismerik (rev-reszponzív elem). A funkcionális RNS-t az env RNS-nek egy 269 bp méretű régiójában lokalizálják, amelynek a koordinátái 7358-7627 [L. Ratner, W. Haseltine, R. Patarca, K.J. Livak, B. Starcich, S.F. Josephs, Natúré, 313. 277 (1985)]. A szekvenciát az 5. ábrán mutatjuk be. Az egyszerűség kedvéért ezt a szerkezetet CÁR elemnek nevezzük. A CÁR elem másodlagos szerkezete jelenleg nem ismert pontosan. Az azonban lehetséges, hogy megjósoljuk a CÁR elem másodlagos szerkezetét, a szakterületen jártas szakember számára ismert számítógépes program alkalmazásával, ilyen például Zuker programja [M. Zuker, Science, 244. 48 (1989)]. Egy ilyen elemzésnek az eredménye látható a 6. ábrán. Minden egyes, a 6. ábrán látható hajtű hurok szerkezet rendelkezik azzal a potenciállal, hogy kölcsönhatásba lépjen a rév géntermékkel, és mindegyik alkalmas arra, kötődjön az oligonukleotidokhoz vagy oligonukleotid analógokhoz, amelyek a jelen találmány részét képezik. Az teljesen biztos, hogy a számítógép program által megjósolt, a 6. ábrán látható szerkezetek helyesek. Ez azonban nem korlátozza a jelen találmányt a CÁR elem szerkezetére. Ebben, és az összes többi esetben, ahol az aktuális RNS szerkezete bizonytalan, a • · ·

találmány szerinti eljárást úgy gyakorolhatjuk, hogy egy sorozat oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot készítünk, amelyek komplementerek a szekvenciával, és az oligonukleotidokat illetve oligonukleotid analógokat úgy tervezzük meg, hogy a fentiekben felsorolt követelményeknek eleget tegyen.

A rév géntermék normál funkciójának mérésére szolgáló vizsgálatokat a publikált eljárások alapján végezzük [E.T. Dayton, D.M. Powell, A.I. Dayton, Science, 246 1625 (1989); Dayton et al., J. Acq. Immuné Deficiency Syndromes, 1, 441 (1988)]. A különböző promoterek szabályozása alatt HÍV mRNS-t expresszáló vektorokat transzfektáljuk sejtekbe, olyan vektorokkal együtt, amelyek a rév fehérjét expresszálják. Ha a rév normálisan működik, és megkönnyíti az mRNS transzportját a citoplazmába, akkor a transzportált mRNS-ek a gag fehérjét kódolják, amit egy immunszorbens vizsgálattal lehet kimutatni. Ha oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok lépnek interferenciába ezzel a folyamattal, akkor a gag fehérje mennyiségének csökkenése mérhető. Az ezeknek a kísérleteknek a végrehajtásához szükséges reagensek a National Institute of Health-nál férhetők hozzá (Aids Research and Reference Reagent Program, 1990-es katalógus, National Institute of Allergy and Infectious Diseases).

Az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok hatását úgy határozzuk meg, hogy az anyagokat közvetlenül a transzfekciós elegyhez adjuk, illetve a vegyületeket a táptalajhoz adjuk a transzfekciót követően, különböző időpontokban és koncentrációban, majd a vizsgálatot a transzfekció után 24-48 órával hajtjuk végre. Az alábbi oligonukleotidokat és analógokat vizsgáljuk:

5'-3' szekvencia

GTGVAAATGAGTTTTCCATA

GCAACCCCAAATCCCCAGGA

GCTGTTGATCCTTTAGGTAT

CTTTCCACAGCCAGGATTCT

TGCCTGGAGCTGCTTGATGC

GCCAGACTGTGAGTTGCAAC

AGATGCTGTTGCGCCTCAAT

AGCCCTCAGCAAATTGTTCT

GCTGCTGCACTATACCAGAC

AATAATTGTCTGGCCTGTAC

CGTCAGCGTCATTGACGCTG

CGCCCATAGTGCTTCCTGCT GCTCCCAAGAACCCAAGGAA

3. Példa; A kereteltolás gátlása: a HÍV gag/pol kereteltolási régió

A HÍV és az egyéb retrovírusok olyan fehérjét szintetizálnak, amely reverz transzkriptáz aktivitással rendelkezik. Ennek neve pol, és a gag jelű szerkezeti fehérjével fúzionáltan keletkezik. A vírus kódol még egy szekvenciaspecifikus proteázt is, amely a fúziós fehérje gag és pol doménjei között hasít, és így szabadítja fel a pol fehérjét. A mai napig vizsgált összes retrovírusban a gag-pol mRNS szerkezete kizárja a mRNS közvetlen transzlációját gag-pol fúziós fehérjévé. VAgy van egy leolvasási fázisban levő terminációs kodon a mRNS gag és pol dóménje között, vagy a gag és a polilinker nincsenek a hírvivő RNS-nek ugyanabban a • · · · leolvasási keretében [T.Jacks/^AXÍPower, F.R. Masiarz, P.A. Luciw, P.J. Barr, H.E. Varmus, Phűire, 331, 280 (1988)]. A HÍV esetében a pol leolvasási kereU^í-l-es pozícióban van a gag-hoz viszonyítva. Ahhoz, hogy a fúziós fehérjét expresszáljón, a riboszóma eltolja a leolvasási *k«retet” a mRNS gag és pol régiói között, és a pol leolvasásfe&eretében folytatja a transzlációt, amíg teljesen kész nincsen a fúziós fehérje.

A HIV-nél és egyéb retrovíiftisoknál a kereteltolás pontjához közel megvan a lehetősége annak, hogy lényeges RNS másodlagos szerkezet alakuljon ki. A HIV-l-nek számítógéppel szimulált szerkezete látható a 7. ábrán. Az RNS másodlagos szerkezetének kialakulási lehetősége számos virális gag-pol fúzióban megvan, a riboszómális kereteltolás helyéhez közel [T. Jacks, K. Townsley, H.E. Varmus, J. Májőrs, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 4298 (1987); T.Jacks, M.D. Power, F.R. Masiarz, P.A. Luciw, P.J. Barr, H.E. Varmus, Natúré, 331. 280 (1988); I. Brierley, P. Digard, S.C. Inglis, Cell, 57., 537 (1989)]. Azt mostanában fedezték fel, hogy ha antiszensz oligonukleotidokkal vagy oligonukleotid analógokkal támadják meg a HÍV gag és pol génje közötti részt, akkor ez hatékonyan szabályozza a gag-pol fúziós fehérje képződését. A

7. ábrán látható az adott példában fontos mRNS régió, beleértve a szár-hurok szerkezetet is, közel a kereteltolás helyéhez, valamint a gag-pol fúziós fehérjéknek a kereteltolás helyéhez közeli részre megjósolt aminosav sorrendje. A 8. ábrán két jellegzetes antiszensz oligonukleotid oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg szekvenciája látható, amelyektől az várható, hogy befolyásolják a riboszómális kereteltolást • · · valamint a megcélzott mRNS transzlációját. aláobi módszerek bármelyikével hozzákötődve ehhez a helyhez.- etséges hogy megzavarjuk a gén expressziójának normális - -rét, és ennek eredményeképpen gátoljuk a vírust.

Azt mostanában fedezték fel, hogy azo u vegyületek, amelyek specifikusan kapcsolódnak a gag-pol kér .'••.eltolási régióhoz és interferálnak a transzlációval és/ví y a kereteltolással, várhatóan terápiás hatással rei ielkeznek a retrovírus fertőzés esetében. Szándékunk szerint minden olyan retrovírus, amelyik a gag-pol kapcsolódásnál másodlagos RNS szerkezettel rendelkezik, a találmány oltalmi körébe tartozik. A találmány szerinti eljárás a retrovírusok különböző törzseire vagy típusaira is alkalmazható, ha az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg szekvenciáját úgy változtatjuk meg, hogy komplementer legyen az alternatív retrovírus törzzsel vagy típussal. A sejteket az alábbi oligonukleotidokkal vagy oligonukleotid analógokkal kezeltük:

5’-3' szekvencia

TAGGAAGGCCAGATCTTCCCT

AAGAAAATTCCCTGGCCTTCCCTTGTAGGAAGGCCAG

TGCTCTGAAGAAAATTCCCT

TCTGAATAAAATTCCCTGGC

GAAGAAAATTCCCTGGCCTT

CTGGCCTTCCCTTGTAGGAA

GCCTTCCCTTGTAGGAAGGC

TTCCCTTGTAGGAAGGCCAG

CCTTGTAGGAAGGCCAGATC • · ·· « · • · · · ?nthc.t

- ra) . í7OS •x.ul

TGTAGGAAGGCCAGATCTTC

Azt is leírták, hogy a gag-pol RNS szerkezet elr ;ó, ha egy harmadik szálat hozunk létre mellette (lásd 9. á:o \ heteroduplex képződéssel ellentétben, ahol az RNS másodlatszerkezetét egy behatoló lánc töri meg, a három lánc kiala isa általában megőrzi a létező RNS duplex hidrogén-kötési mintázatát, de egy helikális horonyban kapcsolódik további hidrogénkötések kialakulásával. Az alábbi szekvenciájú oligonukleotidokat vizsgáljuk:

S'-S¹ szekvencia

CCCTTCCXXTT

CCTTCCXXT

GGGAAGGXXAG

GGAAGGXXA ahol X jelentése bármely olyan heterociklusos bázis, amely hidrogénkötés akceptort tartalmaz. A transzláció és riboszóma mentes eltolást már korábban leírták [T.Jacks, M.D. Power, F.R. Masiarz, P.A. Luciw, P.J. Barr, H.E. Varmus, Natúré, 331. 280 (1988)]. A vizsgálatot a leírás szerint végezzük, a fenti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok hozzáadásával.

Claims (31)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás egy gén expressziójának befolyásolására, azzal jellemezve, hogy a gén által kódolt RNS-nek kiválasztjuk egy részét, az említett RNS rész másodlagos szerkezetet kialakító alcsoportokkal rendelkezik; és az említett RNS-t olyan oligonukleotidokkal vagy oligonukleotid analógokkal hozzuk érintkezésbe, amelyek az RNS résznek legalább egy alcsoportjával képesek kapcsolódni.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kapcsolódás elrontja az RNS rész másodlagos szerkezetét, és ezzel létrehozza az említett befolyásolást.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gén expressziója feltételezhetően kóros állapothoz vezet egy szervezetben.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett másodlagos szerkezet egy hurok.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gén egy vírus vagy retrovírus génje.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg az említett alcsoportnak legalább 6 alegységéhez képes kapcsolódni.

7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, ··«· hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg az említett alcsoportnak 10-20 alegységéhez képes kapcsolódni.

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg az említett alcsoportnak 8-50 alegységéhez képes kapcsolódni.

9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg egy duplex szerkezetet hoz létre az említett alcsoporttal.

10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg valamint az említett kiválasztott RNS rész triplex szerkezetet hoz létre.

11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kapcsolódás megváltoztatja a riboszómális kereteltolódást.

12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett RNS részt legalább részben a HÍV TAR eleme kódolja.

13. Az 1.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett RNS részt legalább részben a HÍV CÁR eleme kódolja.

14. Az 1.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett RNS részt legalább részben a HÍV gag-pol eleme kódolja.

15. Egy oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy képes egy másodlagos szerkezet létrehozására alkalmas RNS-hez kötődni.

16. A 15. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy legalább 6 alegységből áll.

17. A 15. igénypont szerinti oligonukleotid vagy ·· ·«··» ·· · ···· · ···· ···· · • ·»· * · ··· oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy legalább 8-50 alegységből áll.

18. A 15. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy legalább 10-50 alégységből áll.

19. A 15. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy képes duplex szerkezetet létrehozni az említett alrésszel.

20. A 15. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy képes triplex szerkezetet létrehozni az említett másodlagos szerkezettel.

21. A 15. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy egy gyógyászatilag elfogadható hordozóban van.

22. Eljárás olyan állatok kezelésére, amelyekről feltételezhető, hogy másodlagos szerkezettel rendelkező RNS-t kódoló gén expressziójával jellemezhető betegségben szenvednek, azzal jellemezve, hogy az állatot olyan oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezésbe, amely képes az említett másodlagos szerkezethez, illetve annak bármely alrészéhez kapcsolódni.

23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kapcsolódás elrontja az RNS rész másodlagos szerkezetét, és ezzel fejti ki az említett befolyásoló hatást.

24. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gén egy vírus vagy retrovírus.

25. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg az említett alrésznek legalább 6 alegységéhez képes kötődni.

26. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg az említett alcsoportnak 8-50 alegységéhez képes kötődni.

27. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg az említett alcsoportnak 10-20 alegységéhez képes kötődni.

28. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg az említett alrésszel duplex szerkezetet hoz létre.

29. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg és az említett RNS triplex szerkezetet képez.

30. Eljárás olyan állat kezelésére, amelyről feltételezhető, hogy HÍV fertőzésben szenved, azzal jellemezve, hogy az állatnak olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot adunk be, amely képes specifikusan hibridizálódni a TAR, CÁR vagy gag-pol elem által kódolt RNS másodlagos szerkezetével vagy bármely alrészével.

31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett állat egy ember.