HU228765B1

HU228765B1 - Eljárás ösztrogének kinyerésére kancavizeletbõl

Info

Publication number: HU228765B1
Application number: HU9903670A
Authority: HU
Inventors: Heinz-Helmer Dr Rasche; Ivan Ban; Friedrich Borchers; Henning Heinemann
Original assignee: Abbott Products Gmbh
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2013-05-28
Also published as: DE19681616D2; PL185920B1; IL128671A0; SK281367B6; EP0927040A1; EP0927040B1; ATE264110T1; NO990953D0; NO990953L; HUP9903670A3; IL128671A; CA2263904C; CZ298762B6; NO318378B1; HUP9903670A2; DE59610986D1; AU722084B2; PT927040E; CA2263904A1; AU6985696A

Description

Találmányunk tárgya konjugált ösztrogének természetes keverékének kinyerése vemhes kancák vizeletéből.

A g yó g y á s za t b an a z őst t r o g é n e ke t h o r monh,e 1 y e 11 e s 1 késre használják. Az ösztrogénkeverékeket különösen nőknél a változás éveiben természetes vagy mesterséges menopausa után fellepő panaszok kezelésére és megelőzésére alkalmazzák. Ennek során a konjugált ösztrogének vemhes kancák vizeletében jelenlevő természetes keverékei különösen hatékonynak és jól elviselhetönek bizonyultak.

A veiahes kancák vizeletének ('^fpregnant mares urine”; a továbbiakban oldott szervesanyagtartalma természetesen tág határokon beiül ingadozhat és általában a 40-90 g szárazanyag/!iter tartományba esik. A EMU szárazanyagtartalmában karbamid és egyéb szokásos karbamidtartamanyagok mellett a szárazanyagra vonatkoztatva kb.

2-5 tömeg % mennyiségben fenol os komponensek is jelen vannak. S fenolos komponensek közé tartoznak a krezolok és a HPMF néven ismert dihidro-3,4-bisz[(3-'hidroxi~fenil}-metil*-2(3H)furanon. Ezek a vegyüietek szabad vagy konjugált formában lehetnek jelen. A. PMÜ ösztrogének természetes keverékét tartalaazza,, amely messzemenően ko.nj.ugált formában (pl. kénsavfélészter-nátriumsó; a továbbiakban ^!’szulfátső^H) alakjában van jelen. A konjugált ösztrogéntartsiom tösztrogénszulfátra számítva) 0,3-1 tömeg % {száraz anyagra vonatkoztatva),

A konjugált ősztrogéneket tartalmazó extrákturnékat PMU-bol általában poláros, vízzel nem vagy csak kis mértékben elegyedő szerves oldószerekkel {pl. etil-acetát, n-butanol vagy oikiohexanol) nyerik ki. A. fenti folyadék-folyadék extrakciőknái azonban számos probléma jelentbezik (pl. erős habképződés, üledékképződés, emulzíöképzödés és rossz fázisszétválás). Általában több extrakciós lépésre van szükség, amely veszteségeket okos és az ösztrogéntartalom csupán részben történő kinyerését teszi lehetővé.

Kismennyíségű vizelet- és plazma folyadékok feldolgozása esetér· az ösztrogének gázkromatográfiával történő analitikai meghatározására Heikkinnen et al., [Ciin. Chem. 27/7, 1186-1189 (1981)] és von Shackleton et ai. [Clinica Chímica Acta 107 231-243 (198C)} az ösztrogének szilárdfázisu extrakciöját javasolta. Az eljárás elvégzésére oktadecílszilán-maradékokat tartalmazó szilanizált kova savgélt {Sep~Pak.^R, Cie-hüvely; gyártó cég 'Waters Áss. Inc. Mi'iford, MA USA) magukbanfoglalő hüvelyeket alkalmaznak·. Az eijárás során az ösztrogénekef a hüvelyből metanollal eluáiják. Az ösztrogéntartalmü eiuátumban levő egyéb anyagokról azonban semmilyen adatot sem közölnek.

Találmányunk célkitűzése műszaki eljárás kidolgozása konjugált ösztrogének természetes keverékének PMü-ből történő kinyerésére, a szokásos folyadék-folyadék extrakciós eljárások ismert hátrányainak kiküszöbölésével. Találmányunk célkitűzése a fenti módon fenolos· vizelettarfcamanyagokban elszegényített, messzemenően HPMF-mentes termék előállítása.

A fenti célkitűzést a találmányunk tárgyát képező eljárás segítségével oldjuk meg.

A találmányunk tárgyát képező eljárás segítségével hid.ro f obi zá.lt kovasavgélen végzett szíiárdfázisú extrakodóval fenolon vizelettartamanyagokban elszegényített, messzemenően HPMF-mentes, azonban a PMU természetes

ö a z t r o génanyag t a.r ta Írná t g yako r 1 a ti iag tel jes mé r t é. Rben tartalmazó keveréket nyerünk. A találmány szerinti eljárással kapott fenti termék a PMU konjugált ösztrogénjelnek természetes keverékét/ mint hatóanyagkomponenseket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására szolgál.

Találmányunk tárgya eljárás konjugált ösztrogének fenolos vizelettartamanyagokhan elszegényített természetes keverékének kinyerésére vemhes kancák vizeletéből, azzal jellemezve, hogy

a)

b) egy vízeletfolyaöékot, éspedig nyálka- és szilárdanyagoktól megszabadított vizeletet, e vizelet betöményitett koncentrátumát vagy e vizelet uitraszűrésssl kapott betöményített maradékát (vizelet retentáturö valamely vízoldható bázisnak legalább 12-es pH értékre történő beállításához elegendő mennyiségével kezeljük, majd a bázissal kezelt vizelet folyadék pH-értekét megfelelő mennyiségű vizes sav-oldat hozzáadásával 5 és 8,5 közötti tartományra állítjuk be;

a bázissal előkezelt, 5 és 8,5 közötti pH értékre beállított vizeletfolyadékot a konjugált ösztrogéneknek a vizeletfolyadékban levő keveréke adszorpciójához elegendő mennyiségű. hiőrorobizáit kovasavgéllel hozzuk érintkezésbe és a konjugált ö s zt ro gének keveré kéve1 töltött hídrót ob i zá11 kovasavgélt a maradék vizeietfolyadéktói elválasztjuk;

* « « * . φ < * ♦ κ;

c) a konjugált ösztrogének keverékével töltött hidrofobizált kovasavgélt 5 és 7' közötti pH tartományra - előnyösen 5 pH értékre ~ beállított vizes pufferoidattai mossuk;

d) a mosott hidrofobizált kovasavgélt a konjugált

Ösztrogének adszorheált keverékének des zorpcíój ához elegendő mennyiségű. eluá.ló£.olya.d.ékk.a'i,· éspedig viz és valamely vízzel elegyedő szerves oldószer, nevezetesen valamely vízzel elegyedő éter, kis szématomszámű alkanol vagy kis S2énatomszámű alifás keton elegyével hozzuk érintkezésbe és a konjugált ősztrögének természetes keverékét tartalmazó eluátumot a hidrofobizált kovasavgéltől elválasztjuk és adott esetben bepároljuk.

A találmányunk szerinti eljárásnál PMV-t önmagában,

PMÜ bepárlás-ával nyert koncentrátumot vagy PMU-ból membránsz.ö.résse.1 kapott maradékot (retentátuzü alkalmazhatunk. Az összegyűjtött vizeletet először önmagában ismert módon a nyálka- és szílárdanyagoktól megszabadítjuk. A szilárd- és nyálkaanyagokát célszerűen ülepedni hagyjuk, majd önmagukban ismert szétválasztási műveletekkel (pl. dekantálás, szeparálás és/vagy szűrés} elválasztjuk. így pl. a PMU-t önmagában ismert elválasztó berendezésen (pl. szeparátor, szűrőberendezés vagy ülepítő) vezethetjük, át. Elválasztó berendezésként pl. homokágy vagy kereskedelmi forgalomban levő szeparátorok, (pl. fúvókén vagy kamrás szeparátorok) alkalmazhatok. Kívánt esetben mikroszűrőberendezést vagy uitraszűrőberendezést is alkalmazhatunk.

amelynek a felhasználásakor egyidejűleg a szűrt PMU-t messzemenően csíra- és vírusmentes!tjük.

A vizelethez kívánt esetben tartósítószereket,· germicídeket, baktericideket és/vagy anthelmintikumokat adhatunk .

Amennyiben PMd helyett betömény.ítet t PMd-maradékot .(retentátum) alkalmazunk, ezt az anyagot a PMU~hól önmagában ismert membránszűréssei nyerhetjük. A reténtátűm szilárdanyagtartalma és összetétele a felhasznált PMü-töl és a membrán-szűrésnél alkalmazott membrántői (pi. pórusnagyság), valamint a szűrés körülményeitől függően változhat. így pi. nanosz őr ©membrán, felhasználása esetén a PMd-maradókban az ösztrogéntartalom közel veszteségmentes koncentrálását érjük el és egyidejűleg a kismolekulatömegű PMU-tartamanyagok 50 tömeg S-íg terjedő részét eltávolítjuk.

A találmányunk szerinti eljárásnál olyan PMü-maradéfcot alkalmazhatunk, amelyet kb. 1:10·, például kb. 1:7 arányig betöményítünk és amelynek a térfogata az eredeti PMU-térfogat kb. egytizede, például kb. egyhetede,.

A találmányunk szerinti eljárás a) lépesénél a viselet folyadékhoz a pH legalább 12-re, előnyösen 13 és 14 közötti értékre történő beállításához elegendő mennyiségű vízoldhatő bázist adunk. Vizuidható bázisként inért, a vízeletfoiyadékban oldható, olyan szervetlen vagy szerves bázisok alkalmazhatők, amelyek a pH legalább· 12 értékre történő beállításához elegendő erösségűek. Alkálifém-hidroxidokat vagy alkáli földf .-ém-hidroxidokat (különösen nátrium-hidroxidotj vagy szerves bázisokat (pl. kvátérnér kis szénatomszámű alkil-ammónium-hidroxidok) alkalmazna7 tünk. A bázist előnyösen legalább 20 tömeg %, előnyösen 40-60 tömeg % bázistartalraű vizes oldat formájában adhatjuk hozzá. Különösen előnyösen 45-55 %-os vizes nátriumhidroxid-pldatot alkalmazhatunk. Az alkálikus előkezelésnél a vízeletfolyadék pH-ját legalább 12 értékre - pl.. 12-14 tartományra, előnyösen kb. 13-ra - állítjuk be és ezt a lúgos pH érteket a vizelettartamanyagokban levő laktoncsoportok hasításához elegendő ideig fenntartjuk; a lúgos előkezelés időtartama általában 0,5-2 óra. A kezelés körülményeit oly .módon keli megválasztanunk, hogy a konjugáit ösztrogének ne károsodjanak. Ennek megfelelően a kezelést szobahőmérsékleten végezzük el és a hozzáadott bázis mennyiségét a kívánt 12-14 pH érték beállításához szükségesre korlátozzuk. A 12-14 pH-tartomány beállításához szükséges bázismennyiség a felhasznált FMU összetételétől függően változhat, így pl. 5ö ο~os nátrium— hiöroziő-oidat felhasználása esetén lö liter őMU-ra vonatkoztatva általában kb. 10C-700 mi 50 %-os nátriumhidroxid-oldat elegendő. Ezután a viseletfolyadék pH-ját vizes savoldat hozzáadásával 5-8,5, előnyösen 7-8,5, különösen előnyösen 8-8,5 értékre állítjuk be. Savként a vizeletfolyadékban oldható, inért, szervetlen vagy szerves savak alkalmazhatók (pl. sósav, kénsav, foszforsav,

111. kis szénatomszámú karbonsavak, sünt pl. ecetsav). Tömény vizes sósavoldat alkalmazása különösen előnyösnek bizonyult. A fenti pH-tartomány beállításához szükséges savmexnzyiség az alkalmazott Ö5U összetételétől és a iugosításhoz felhasznált házismennyiségtői függően változhat. Tömény sósavoldat felhasználása esetén a kívánt pH érték 1 liter PMU-ra vonatkoztatva. kb. 25-100 g tömény sósavoldat hozzáadásával állítható be.

A találmány szerinti eljárás b): lépésénél hidrofobizált kovasavgyantaként önmagukban ismert fordított fázisú kovasavgyanták (rövidítve RP-kovasavgyanták) alkalmazhatok. Ezek hidroföb funkcionális csoportokat , Illetve iigandokat tartalmazó kémiailag módosított kovasavgélek. E célra pl. hídrofób funkcionális csoport kén t η - o k t a de c 1 i - d Íme 11.1 - s z 11 i 1 - ο x 1 -, η ~ o k111~ dimetil-szilí1-oxi- vagy dimetíl-hidroxi-szí111-oxi-maradékokat tartalmazó szüanizáit RP-kovasavgélek alkalmazhatók. igy pl. 15-500 gm közepes szemcsenagyságű sziianízált kovasavgélek alkalmazhatók. A találmányunk szerinti eljárásnál különösen előnyösen 0,05-0,3 ra tartományba eső közepes szemcsenagyságú, díxne ti 1-hidroxi-szilii-oxí-maradékokaf tartalmazó kovasavgélt alkalmazhatunk, pl. a Merck cég fcovasavgél βθ/dimetíl-ssíIánszármazék” elnevezésű termékét.

Találmányunk szerint a konjugált ösztrogéneket a hidrofobizált kovasavgélen oly módon adszorbeáljuk, hogy az adott esetben betöményitett PMU-t vagy refcentátumót a. hidrofobizált kovasavgéliei érintkezésbe hozzuk. Ennek során az a) eljáráslépés szerint előkezelt vizelet folyadékot a kovasavgélt tartalmazó reaktorba bevezetjük és az ösztrogéntartalom adszorpciójához elegendő ideig a kovasavgéliei érintkeztetjűk. A konjugált ösztrogéneknek a hidroföb kovasavgélen történő adszorpciója után a konjógáit ösztrogének keverékével töltött kovasavgélt a maradék vízeletfolyadáktől önmagában ismert módon elválaszthat jók. A vizeletfolyadéköt a kovasavgélt tartalmazó oszlopon célszerűen olyan átfolyási sebességgel vezetjük át, amely az ösztrogéntartslem adszorpciójához szükséges érintkezési időnek megfelel. így pl. 5-20 térfogatrész PMU/1 térfogatrész kovassvgél/őra. átfolyásnak megfelelő átfolyási sebességet alkalmazhatunk. Az adszorpciót előnyösen szobahőmérsékleten végezhetjük el. A vizeletfolyadék reaktoron történő átfolyási sebességét célszerűen, oly módon szabályozhatjuk, hogy az eljárást túlnyomás alatt vagy csökkentett nyomáson végezzük el. A felhasználandó hidrofobizált kovasavgél mennyisége a felhasznált kovasavgéi jellegétől és az aj eijárásiépésnél előkezelt vízeletfolyadék sziiárdanyagtgartaimátői függően változhat. Előkezelt PHU felhasználása esetén 1 térfogatrész hidrofobizált kovasavgélre 80 térfogatrészig terjedő mennyiségű előkezelt FMü-t tölthetünk anélkül, hogy az elfolyó vizeletfolyadékban észlelhető mennyiségű ösztrogén kimutatható lenne. Előkezelt PMÜ-koncentrátnm vagy PAü~retentátum felhasználása esetén, a hidrof obi zált kovasavgéi terhelhetőségi kapacitása természetesen a betöményítés mértékében csökken. így pl, 1 térfogatrész hidrofobizált kovasavgélre 30-80, előnyösen 40-50 térfogatrész PMU-nak megfelelő mennyiségű vizeietfolvadék tölthető.

A c) eljáráslépésnél a konjugált ösztrogének keverékével töltött hidrofobizált kovasavgéit 5-7, előnyösen kb. 5 pH értékre beállított vizes pufferoidattai mossuk, Mosófolvadékként előnyösen kb. pH 5 értékre beállított vizes ecetsav/acetát pof férőidétől alkalma zhatunk. E célra előnyösen 0,1-1 mólos, különösen előnyösen 0,1-0,2 mólos ecetsav/acetát pufferoldatok szolgálhatnak. A mosőfo-

♦ ♦ *

Ivadék rfiennyiségét oly módon választjuk meg, hogy a mosófolyadék a fenolos vizeiettartamanyagokat a konjugált ösztrogének észlelhető kimosása nélkül messzemenően eltávolítsa. így pl, célszerűen 1 ágytérfogat hidrofofoizált kovasavgélre vonatkoztatva 8-15, előnyösen S-lö agytérfogat mosófolyadékot alkalmazhatunk. Az eljárás során a mosőfolyadékot célszerűen 5-20 térfogatrész mosófolyadék/1 térfogatrész kovasavgél/óra átfolyási sebességgel vezethet jük át a hldrofóhazáit kovasavgélt tartalmazó reaktoron. .

A találmányunk szerinti d) eljárásnál a konjugált ösztrogének keverékével töltött, mosott oszlopot valamely eiuáiószernek a konjugált ösztrogének keverékének elválásához elegendő mennyiségével kezeljük, és ily módon a PMü konjugált ösztrogénjeinek természetes keverékét tartalmazó eluátumot nyerünk. Találmányunk szerint eluáiószerként víz és valamely vízzel elegyedő éter; kis szénátomszárná alkanol és/vagy kis szénatomszámú alifás keton elegyét alkalmazzuk.

Az eluálofoiyadék éter-komponensként vízzel elegyedő gyűrűs étereket (pl, tetrahidrofurán vagy dioxán· vagy vízzel elegyedő nyiltlánoű étereket [pl. etiiengliko1/dÍmet ίIéte r {monog1lm) dietiléngiikol-dlmetil-éter (diglimj vagy etoxí-etoxí-etanol (cáréitól)] alkalmazhatunk. Kis szénatomszámű alkanolként vízzel elegyedő 1-4, előnyösen 1-3 szénatomos alkanolok (különösen etanol. vagy ízopropanol) használhatók. Kis szénatomszámú alifás ketonként vízzel elegyedő 3-5 szénatomos ketonok alkalmazhatók, különösen acetou, Különösen előnyösen használhatunk szerves oldószerként etanolt tartalmazó eluálő fo11 lyadékokat. A víztartalmú elváló folyadékban a vízzel elegyedő szerves oldószer és· a víz térfogataránya 40:60 - 20:80, előnyösen kb. 30:70 lehet. Az eluálószert 1 agytérfogat hidrofobizált kovasavgéire vonatkoztatva kb. 3-5 agytérfogat mennyiségben. alkalmazhatjuk. Az elváló folyadékot az ösztrogén-keverékkei töltött hidrofobizált kovasavgéire tartalmazó reaktoron célszerűen olyan átfolyási sebességgel vezethetjük át, amely a konjugált öosztrogének keveréke tökéletes eluáláshoz szükséges érintkezési időnek megfelel. Tetrahidrofurán és/vagy etanol és víz 30:7-0- térfogatarányű keverékének elegyének felhasználása esetén az átfolyási sebesség 5-20 térfogatrész eluálószer/1 térfooatresz kovasavgél/őra. Az értékig terjedő túlnyomás eluátumot több frakcióban

zerűen oly módon szabal	yozhat-
>bb túlnyomás alatt	(pl.	0,2 bar
s alatt) végezzük	el	és az
bán fogjuk fel.	Az	eo vés
ősztrogéntartalmát !	es a	fenoios
krezoiok és 'HPMF)	menn	yiségét

önmagában ismert módon nagy teljesítőképességű folyadékkromatográfíával {high performance ligáid chromatograp-hy; ^!’HELC”) határozhatjuk meg.

A.z eluálásnál kezdetben gyengénsárga~szIntelen, gyakorlatilag ősztrogénmentes előfrakciöt kapunk; ennek mennyisége kb. 1 agytérfogatnak felel meg. A konjugált ösztrogének fő mennyisége (pl. a kiindulási EMU~ban levő konjugált ösztrogének 80-99 %-a) az ezután levett söfétsárga-barna színű fő elnátumfrakciokban van jelen; a fő eluátumfrakciök mennyisége általában 1--2 agytérfogat. Az ezután levett utófrakciók általában csupán nvomnvi mennyiségű konjugált ösztrogéneket tartalmaznak. Amennyiben azonban szárazanyagra vonatkoztatva több mint 10 tömeg % konjugált .ösztrogéneket és kevesebb mint ö, 6 tömeg I .krezolokat és HPMF~t (szárazanyagra vonatkoztatva) tartalmazó ntófrakcíókat nyerünk, úgy ezeket a frakciókat tovább feldolgozás. céljából az öS2trogénbe.n dús főeluátummal egyesítjük.

A kovasavgéltől a fentiekben leírt módon elválasztott főeiuátum konjugált ösztrogéneknek a FMU-ban eredetileg jelenlevő természetes keveréke mellett a FMU~ban eredetileg jelenlevő fenolos viselettartamanyagokat csupán nagyon csekély mennyiségben tartalmaz. A kapott eluátum konjugált ösztrogének természetes keverékét tartalmazó gyógyászati készítmények előállításánál kiindulási anyagként alkalmazható. Az oluátumot a szerves oldószerek messzemenő eltávolítása és galeníkus továbbfeldolgozásra alkalmas fconcentrátum készítése céljából kívánt esetben önmagában ismert módon tovább betöményithetjók. Kívánt esetben poriaszfcvaszárí tással. eluáiószermentes szilárdsnyagkeverék állítható elő. A konjugált ösztrogének természetes keverékének szilárd gyógyszerkészítmények előállítására történő felhasználása esetén, célszerűen járhatunk el oly módon, hogy a konjugált ösztrogéneket tartalmazó eluátumhoz a betöményités vagy poriasztvaszáritás előtt szilárd hordozóanyagot keverünk és ílymodon konjugált ösztrogéneket és hordozóanyagot tartalmazó szilárd anyagkeveréket nyerünk. Az ösztrogénkeverékafc tartalmazó eiuátumot és az abból előállított koncentrátumot vagy porlasztvaszáritott szilárd terméket önmagában ismert módon szilárd vagy folyékony galenikas készítményekké (pl. tabletták, drazsék, kapszulák vagy emulziók) dolgozhatjuk fel. A galenikus készítményeket önmagukban ismert módszerekkel állíthatjuk elő. A galenikus készítmények előállításához szokásos szilárd vagy folyékony hordozóanyagokat (pl. keményítő, cellulóz, tejcukor, talkum. vagy folyékony paraffinok} és/vagy szokásos gyógyászati segédanyagokat (pi. tabíettaszétesést elősegítő anyagok, oldásközvetítő anyagok vagy tartósítószerek) alkalmazhatok. Ennek során, a konjugáit Ösztrogéneket tartalmazó terméket a gyógyászati hordozóanyagokkal és segédanyagokkal önmagában ismert módon őszszekeverjük és a keveréket megfelelő adagolási, formává alakítjuk.

Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük, anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk.

1-5. példa

Általános eljárás fenol, tartalmú vizelettartamanyagoktöi MsszeEiesően megszabadított/ a PMU-ban levő konjugáit ösztrogének természetes keverékét, tartalmazó extráktűm előállítására PMU-ből.

A) előkezelése liter, 5 cm magasságú homogágyon vagy mikroszűrőberendezésen átszűrt PMU-t ía szárazanyagtartalmat (S2A) és a HPhC segítségével meghatározott ösztronszulfátső-, krezol- és HPMF-tartalmat a példák után közölt Táblázatban tüntetjük fel) erős keverés közben 50 %-os vizes nátrium-hidroxid-oldat (sűrűség 20 X~on 1,52 g/mi) hozzáadásával pH~13 értékre állítunk be. A nátrium-hidroxid-oidat hozzáadott mennyiségét a Táblázatban tüntetjük fel. Az elegyet szobahőmérsékleten X órán át keverjük, majd a lúgos vizelet.folyadék pH-ját tömény vizes sósavoldat (kfc. 35 %-os) hozzáadásával « és 8,5 közötti értékre állítjuk be.

P!

PMV ősztrogéntartárnának adszorpciója RP kovasavgélex cm magasságú és 5 cm. átmérőjű oszlopra 100 g (kb. 193 ml térfogat ~ 1 agytérfogat} RP-kovasavgé'it töltünk [”kovasavgél 60/dimetil—szilán-származék”? gyártó cég Merck; rendelési szám 7719; szemcsenagyság 63-200 pm] . Az oszlopot előbb 0,5 liter vízzel, majd 0,25 liter metanollal, végül ismét 0,5 liter vízzel mossuk.

*: *

Az. A) lépés szerint előkezelt vízeletfolyadékot 0,2 bar túlnyoráás-on és 60 isl/perc átfolyási sebességgel vezetjük át az oszlopon. A P®J ős ztrogént artalma. teljes mértékben sz ily módon töltött 'RP-kovasavgél-oszlopon adszorbeáiőöík. Az oszlopról távozó vizeletfolyadék ösztronszulfátsó-tartalmát HPLC segítségével vizsgáljuk. Azt találtuk, hogy az oszlopról távozó vizeletfolyadék gyakorlatilag ösztrogénektői mentes. Az oszlopról távozó vizeletfolyadékot elöntjük.

C) Töltött RP-kovasavgél-oszlop mosása

A töltött RP~kovasavgéi~oszlopoi 2 liter (kb. 10 ágytárfogat) 0,15 mólos ecetsav/nátrlum-acetát pufferoldattal mossuk, A pufferoidstot oly módon készítjük el, hogy 0,15 mólos vizes ecetsav-oidathoz pH 5 érték eléréséig szilárd nátrium-acetátot (kb. 107 g> adunk. Az oszlopról távozó mosófolyadék ösztronszulfátső-, krezol- és KPMF-tartalmát HRLC segítségével vizsgáljuk, A.z oszlopról távozói mosófolyadék a kiindulási PMü ösztrogéntartalm.ának kevesebb mint 5 %-át tartalmazza.

D) A. mosott RP-kovasavgél-oszlopon levő konjugáit ösztrogének deszorpoióda és ösztrogénanyagokban dús eloatum.fr a kólói elválasztása liter eiuálófolyadékot (a példák után levő Táblázatban megadott összetételű viz/oldószer-elegy] 0,2 bar túlnyomáson és kb, 50 ml/perc átfolyási sebességgel vezetünk át az oszlopon. Az oszlopról távozó eluátumot több frakcióban fogjuk fel. (Az egyes frakciók térfogata kb.

200 ml , azaz kb, 1 ágytér fogat) . Az egyes frakciók ösztronszulfátsó--, krezol- és HPMF-tartalmát HPLC segítségével vizsgáljak. Az első frakciót addig gyűjtjük, amíg az elnátum szinfc-e len-enyhén sárgaszínü. E frakció térfogata 150-200 ml. Ez a frakció ösztrogénszulfátsét csak nyomokban, tartalmas.

Amikor az eluátnm színe intenzív sötét sárga-barnáraváltozik, a következő kb, 200 ml-es frakciót összegyűjtjük. Ez a frakció az oszlopon levő konjugált ösztrogének kb, 80-98 %-át tartalmazza. A többi frakció csupán kismennyiségö ösztrogénszulfátsót tartalmaz. Ezeket a frakciókat kívánt esetben az oldószertártalom ledesztilláiása után a B) eljárás lépéshez visszavezethetj ük.

A konjugált osztrögének túlnyomó részét tartalmazó

2. frakció szárazanyagtartalmát (tömeg -%-ban} és a HPLC segítségével meghatározott ösztronszulfátsó-, krezol- és HPMF-tartalmat a példák után levő Táblázatban tüntetjük fel. Ezt a frakciót gaieníkus készítmények előállítására használhatjuk fel.

E} PP-kovasavgéloszlop regenerá1ása

Az oszlopot regenerálás céljából előbb 2 liter vízzel, majd 0,5 liter metanollal, végül ismét 2 liter vízzel mossuk. Az oszlopot ezután az eljárásnál ismét alkalmazhatjuk. Az oszlopot többször (pl. tízszer) regenerálhatjuk és ismét felhasználhatjuk.

<Ν


	10	ίΏ	¢-4	;-'s	ο
	<Ή	0?		04	X
03 X r-	X	X	>κ	:--·	0.4
Ο	ο	Ο		·χ>*

Ο ο ο CA cH Ο'? Ο 03 ϊΗ í\J <ζ> ic <Ν <\^:

Ν >

ο ^r &

« '· ο S 0 ^!>iΛ ο

Μ

Η

03	\0	35
	0·4	00
:-4	X	χ
0)	2·	ο
<Ν	04	0
χ	*>	V
	Ο	ο
04	<’4	<·<

<0

Γ-

___	...
*rö	ο	<Ν		35
ϊ~ί	04	Ή	05	X
χ			.4	00
-Ο	Ο	ο		'-Χ

			ο	<τ
ο	Ο	Ο	<0	ί»
	<λ:		ÍÖ	00
ο	0).	00
r-í	C.J

Ο'5

X στ· <*5 <\ί χθ

3?

§

Ο 03

Ο Ο 0- 00 <-s 35

Ο σ> ο<\; νο <c> rΟ Μ ·!> Ο c-ί ΓΟ ,ί3 rtj λ!

Ρ <ν £

θ'

Φ £

ti

ΧΓ

X ·?' ο;

Χ5>	ς·-·χ
03-	04	Ο
X	C3	ί-4
04	ν,	χ
r-4	Ο	Ο
	'	'
03	ο	σ'
X	X	X
03	<5.4	<ό
34	r3

á θ';

<ί

W <1

0·’	0-	νΟ
ίρ	σ'
Ρ	Ρ
<	χ <	3
ί>3	5S5	frO
35	04	04

<1 <!

SG β<

§ S « — &

>·>4 « 03 ο m ο>

Ö4 ti ti fS ο

Μ φ

£

;Ο Ο U3	β	Λί 'rö	íö •0 ti
V	-S		..x
		>s	rö
	rö	«-rö	>4
>	5>	0	ÍW
-ö	V	Ψ4	e
	0	Ό	3
•rö	«5	.'-4	P
•45	0	'ÍÖ	.«
Ν	Ν	Cí	?3
Ο	0
κ		w	RS

£0

Λί <4 «5 b5

Φ

Μ '0

Ν

Í-S

Ο rH «} β

?

'0

V}

4-3 'rö <W c»(

CO

Ν

VJ β

Ο >4

Ν ί»

Ó

I

Η rö

4-3 >4 ί-4

Μ

Μ &

* #

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. .Eljárás konjugáit ösztrogének fenolos vizelettartamanyag-okban elszegényített természetes keverékének kinyerésére vemhes kancák viseletéből, azzal jellemezve, hogy a} egy vizeletfolyadékot, éspedig nyalka- és- szilárdanyagoktól megszabadított vizeletet, e vizelet betöményitett konoentrátumát vagy e vizelet membrán szűréssel kapott betoményített maradékát (vizelet retentátumj valamely vizoldható bázisnak legalább 12-es pH értékre történő beállításához elegendő mennyiségével kezeljük, majd a bázissal kezeit vizeletfolyadék pH-értékét megfelelő mennyiségű vizes sav-oldat, hozzáadásával 5 és 8,5 közötti tartományra állítjuk be;

b) a bázissal előkezelt, 5 és 8,5 közötti pH értékre ba-álilfcptt vizeletfolyadékot a konjugáit ösztrogénőknek a vizeletfolyadékban levő keveréke adszorpciójához elegendő mennyiségű hídrofobizált kovasavgéiiel hozzak érintkezésbe és a konjugáit ösztrogének keverékével töltött hidrofobizált kovasavgélt a maradék vizeletfolyadéktól elválasztjuk;

c) a konjugáit ösztrogének keverékével töltött hidrofobizált kovasavgélt 5 és 7 közötti pH tartományra beállított vizes pufferoldattal mossuk;

d) a mosott hidrofobizált kovasavgélt a konjugáit ösztrogének adszorbeált keverékének deszorpciőjához * ♦ ί * #

« » X elegendő mennyiségű eiuáiőfc-iyadékkal, éspedig víz és valamely ví.zze-1 elegyedő szerves oIdőszer, nevezetesen valamely vízzel elegyedő éter, kis ssénatomszámű alkanol vagy kis szénatomszámú alifás keton elegyével hozzuk. érintkezésbe és a konjugáit ösztrogének természetes- keverékét tartalmazó eiuátumot a hidrofobizált tovasavgéltől elválasztjuk és adott esetben betöményItjük,
2. Az 1. igénypont, szerinti eljárás, azzal jeli e m esve, hogy az a> lépésnél a vizelet folyadékot a bázissal - előnyösen a bázis vizes oldatával összekeverjük és a vízelettariamanyagokban levő iaktoncsoportok hasításához, elegendő időn at legalább pH-d.z érteken tartjuk.
3. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j e izem e zve, hogy hidrofobizált kovas avgéI ként dióét11-hidroxi-sz i1i1-oxi-maradékokat tartalmazó szilanizált kovasavgéit alkalmazunk,
4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, a z z a .1 j e 1 1 e m e z v s, hogy a b) lépésnél 1 térfogat rész hidrofobizált kovasavgélre 30-80, előnyösen 40-50 térfogatrész vizeletnek megfelelő mennyiségű v í z eIe t fο1yadékot tőitünk,
5. Az előző igénypontok bármelyike: szerinti eljárás, aszal j e 1 1 e m e z v e, hogy a .b) lépésnél a vizeletfolyadékot 5-20 térfogatrész karbamiá/i térfogatrész hidrofobizált kovasavgél/ora átfolyásnak megfelelő átfolyási sebességgel vezetjük át a hidrofobizált kovasavgéit tartalmazó reaktoron.

£. á.z előző Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, aszal j e 1 1 e m e z v e, hogy a c) lépésnél mosóiolvadékként kb. 5 pH értékre beállított vizes ecetsav/aoetát pufferoldatot alkalmazunk.
7. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, aszal j e I 1 e st e z v e, hogy a dí lépésnél eluáló folyadékként víz és valamely vízzel elegyedő szerves oldószer elegyét alkalmazzuk, amelyben a szerves oldószer és a viz térfogataránya 20:80-40:60# előnyösen