PL185920B1 - Sposób otrzymywania estrogenów z moczu klaczySposób otrzymywania estrogenów z moczu klaczy - Google Patents

Abstract

1. Sposób otrzym yw ania naturalnej m ieszaniny sprzezonych estrogenów ze zm niejszona zawar- toscia fenolow ych substancji zaw artych w m oczu, z m oczu zrebnych klaczy, za pom oca ekstrakcji w fazie stalej obejmujacej adsorpcje estrogenów na zelu krzem ionkow ym , m ycie obciazonego zelu krzem ionkow ego i eluow anie estrogenów z zelu krzem ionkow ego, znamienny tym, ze a) ciecz z moczu, która stanowi m ocz uwolniony ze sluzu i substancji stalych, zatezony koncen- trat m oczu lub otrzym any przez ultrafiltracje tego m oczu zatezony przesacz, obrabia sie rozpuszczalna w wodzie zasada w ilosci wystarczajacej do nastawienia pH na wartosc przynajm niej 12 i na koniec nastawia sie pH cieczy z m oczu obrobionej zasada przez dodawanie wystarczajacej ilosci wodnego roztworu kwasu na wartosc od 5 do 8,5; b) ciecz z m oczu obrobiona zasada i o pH nastawionym na wartosc 5 do 8,5 kontaktuje sie z h y - drofobizowanym zelem krzem ionkow ym w ilosci wystarczajacej do adsorbcji m ieszaniny sprzezonych estrogenów zawartych w cieczy z m oczu i oddziela sie hydrofobizowany zel krzem ionkow y, nasycony m ieszanina sprzezonych estrogenów od pozostalej cieczy z moczu; c) hydrofobizowany zel krzem ionkow y, nasycony m ieszanina sprzezonych estrogenów, m yje sie w odnym roztw orem buforow ym nastaw io n y m na pH w zak resie 5 do 7, w szczególnosci 5, d) w ym yty hydrofobizow any zel krzem ionkow y kontaktuje sie z ciecza eluujaca w ilosci w y- starczajacej do desorbcji zaadsorbow anej m ieszaniny sprzezonych estrogenów , stanow iaca m ieszani- ne wody i m ieszajacego sie z w oda organicznego rozpuszczalnika z grupy m ieszajacych sie z w oda eterów , nizszych alkanoli i nizszych alifatycznych ketonów i oddziela sie od hydrofobizow anego zelu krzem ionkow ego eluat, zaw ierajacy naturalna m ieszanine sprzezonych estrogenów i ew entualnie za- teza sie go. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest otrzymywanie naturalnych mieszanin sprzęzonych estrogenów z moczu źrebnych klaczy.

Estrogeny stosowane są w medycynie do wspomagającego leczenia hormonami. W szczególności, mieszaniny estrogenów stosowane są w leczeniu i profilaktyce dolegliwości okresu

185 920 przekwitania występujących u kobiet po naturalnej lub sztucznej menopauzie. Tu jako wyjątkowo skuteczne i dobrze tolerowane okazały się naturalne mieszaniny sprzężonych estrogenów, znajdujących się w moczu źrebnych klaczy.

Rozpuszczona zawartość substancji stałych w moczu źrebnych klaczy (=pregnant mares urine, następnie w skrócie określanego jako „PMU”) może oczywiście wahać się w szerokich granicach i na ogół leży w zakresie od 40 - 90 g suchej substancji na btr. Obok mocznika i pozostałych substancji zwykle znajdujących się w moczu, w substancji stałej PMU zawarte są fenolowe części składowe w ilości ok. 2-5% w przeliczeniu na suchą substancję. Pod tymi fenolowymi składnikami kryją się krezole i dihydro-3,4-bis[(3-hydroksy-fenylo)metylo]-2(3H)-furanon znany jako HPMF. Mogą one znajdować się wpostaci wolnej lub sprzężonej. W PMU zawarta jest naturalna mieszanina estrogenów, które występują wpostaci w dużym stopniu sprzężonej, np. jako sól sodowa półestru kwasu siarkowego (dalej w skrócie określana jako „sól siarczanowa”). Zawartość sprzężonych estrogenów (obliczana jako sól siarczanowa estrogenów) może wynosić między 0,3 a 1% wag. w przeliczeniu na suchą substancję.

Zwykle ekstrakty z PMU, zawierające sprzężone estrogeny uzyskuje się przez ekstrakcję polarnym, organicznym rozpuszczalnikiem, nie mieszającym się lub tylko niewiele mieszającym się z wodą takim, jak przykładowo octan etylu, n-butanol lub cykloheksanol. Przy tego rodzaju ekstrakcjach ciecz-ciecz występują liczne problemy takie, jak silne tworzenie się piany, rozwarstwianie, tworzenie emulsji i złe rozdzielanie się faz. Potrzebne jest ogólnie wiele etapów ekstrakcji, co prowadzi do strat i tylko częściowego odzysku zawartości estrogenów.

W celu oczyszczenia małych ilości cieczy w postaci moczu i osocza, do anabtycznego oznaczania estrogenów metodą chromatografii gazowej, Heikkinen i in. (Clin.Chem 27/7, (1981), str. 1186-1189) i Shackleton i in. (Clinica Chimica Acta, 107 (1980) str. 231-243) proponowali ekstrakcję estrogenów w fazie stałej za pomocą nabojów workowych z silanizowanym żelem krzemionkowym, zawierającym reszty oktadecylosilanowe (Sep-Pak® C_I8-cartridge, wytwórca Waters Ass. Inc., Milford, Ma, Stany Zjednoczone). Sposób opisany w w/w publikacji Heikkinneua i innych dotyczy czysto analitycznego sposobu, będącego szybką i skuteczną metodą ekstracji dla izolacji z biologicznych cieczy jak ludzki mocz i plasma wszystkich estrogenów, tzn. od słabo polarnych niesprzęzonych estrogenów aż do silnie polarnych wielokrotnie sprzężonych estrogenów.

Ilość ekstrahowanych estrogenów określona jest metodą chromatografii gazowej i metodą spektroskopii masowej. Opisany sposób obejmuje następujące etapy postępowania:

1) Nastawienie wartości pH próbki moczu na wartość pH = 3,

2) Napełnienie tak przygotowaną próbką moczu, nabojów korkowych z silanizowanym żelem krzemionkowym, zawierającym reszty oktadecylosilanowe,

3) Mycie obciążonej kolumny wodnym roztworem buforu o pH = 3,

4) Eluowanie estrogenów metanolem.

Również sposób postępowania opisany przez Shackletona i innych służy tylko i wyłącznie szybkiej i ilościowej ekstrakcji wolnych i sprzężonych steroidów dla dalszych analitycznych określeń.

Silanizowany zel krzemionkowy (Sep-Pak® C₁₆-kartusche) obciążony steroidami przemywa się wodą.

Estrogeny eluuje się z nabojów metanolem. Nie podano jednak żadnych danych na temat dalszych substancji zawartych w eluacie zawierającym estrogeny.

Celem niniejszego wynalazku było opracowanie technicznego sposobu otrzymywania naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z PMU, z uniknięciem wcześniej znanych, zwykłych wad ekstrakcji ciecz-ciecz, który dostarczyłby produktu zubożonego w fenolowe substancje z moczu i w dużym stopniu uwolnionego od HPMF.

Obecnie znaleziony został sposób, w którym na drodze ekstrakcji w fazie stałej na hydro fobizowanym zelu krzemionkowym można uzyskać zubożoną w fenolowe substancje z moczu i w dużym stopniu uwolnioną od HPMF, mieszaninę zawierającą jednak praktycznie całą ilość zawartości naturalnych estrogenów z PMU, która może służyć jako surowiec do wytwarzania leków, zawierających naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów z PMU, jako substancję czynną.

185 920

Sposób otrzymywania naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z PMU, o zubożonej zawartości substancji fenolowych zawartych w moczu według wynalazku, znamienny jest tym, że

a) ciecz z moczu, którą stanowi mocz uwolniony ze śluzu i substancji stałych, zatężony koncentrat moczu lub zatężony przesącz otrzymany przez ułtrafiltrację tego moczu, obrabia się rozpuszczalną w wodzie zasadą w ilości wystarczającej do nastawienia pH przynajmniej 12 a następnie nastawia się pH cieczy z moczu obrobionej zasadą przez dodawanie wystarczającej ilości wodnego roztworu kwasu na wartość od 5 do 8,5;

b) ciecz z moczu obrobioną zasadą i z nastawionym pH na wartość 5 do 8,5 kontaktuje się z hydrofobizowanym żelem krzemionkowym, w ilości wystarczającej do adsorbcji mieszaniny sprzężonych estrogenów zawartych w cieczy z moczu i oddziela się hydrofobizowany żel krzemionkowy, nasycony mieszaniną sprzężonych estrogenów od pozostałej cieczy z moczu,

c) hydrofobizowany żel krzemionkowy nasycony mieszaniną sprzężonych estrogenów myje się wodnym roztworem buforowym nastawionym na pH w zakresie 5 do 7, w szczególności 5,

d) wymyty hydrofobizowany żel krzemionkowy kontaktuje się z cieczą eluującą, w ilości wystarczającej do desorbcji zaadsorbowanej mieszaniny sprzężonych estrogenów, stanowiącą mieszaninę wody i mieszającego się z wodą organicznego rozpuszczalnika z grupy mieszających się z wodą eterów, niższych alkanoli i niższych alifatycznych ketonów i oddziela się od hydrofobizowanego żelu krzemionkowego eluat, zawierający naturalną mieszaninę sprzęzonych estrogenów i ewentualnie zatęza się go.

Do wykorzystania w sposobie według wynalazku może służyć sam PMU jako taki, koncentrat uzyskany przez zatęzanie lub pozostałość z filtracji membranowej. Zebrany mocz uwalnia się najpierw w znany sposób od śluzu i substancji stałych. Celowo pozostawia się do osadzenia się śluzu i substancji stałych i oddziela się je znanymi metodami rozdzielania, przykładowo przez dekantację, wirowanie i/lub odsączenie. Tak więc można przepuścić PMU przykładowo przez znane jako takie, urządzenie do oddzielania np. wirówkę, urządzenie do filtrowania lub urządzenie do sedymentacji. Jako urządzenie do oddzielania może służyć np. złoze piaskowe, lub tez można zastosować handlowe urządzenia do rozdzielania, np. separatory dyszowe lub komorowe. O ile jest to pożądane może być zastosowane także urządzenie do mikrofiltracji lub do ultrafiltracji, przy zastosowaniu którego równocześnie można uzyskać daleko idące oddzielenie zarazków i wirusów z filtrowanego PMU.

O ile jesi to ządanż można do mocou dodać środki ronserwnjące, środki rarodnikobójcze, środki bakteriobójcze i/lub środki przeciwczerwiowe.

Jeśli zamiast PMU stosuje się zatężoną pozostałość PMU z ultrafiltracji, można ją uzyskać z PMU znanymi metodami filtracji membranowej. Zawartość substancji stałej pozostałości i jej skład może zmieniać się w zależności od wprowadzonego PMU i membrany stosowanej do filtracji membranowej, przykładowo wielkości jej porów, jak też warunków filtracji. Przykładowo przy zastosowaniu membrany do nanofiltracji można uzyskać w pozostałości zawartość estrogenów prawie bez strat, przy równoczesnym usunięciu z PMU do 50% wag. zawartości nisOocząsteczOowych substancji. W przypadku sposobu według wynalazku można stosować pozostałości PMU, które zatęzone zostały w stosunku do około 1:10, przykładowo w stosunku około 1 : 7, a zatem ich objętość zatęzona została do około 1/10, przykładowo około 1/7 pierwotnej objętości PMU.

W etapie a) do cieczy z moczu dodaje się zasadę rozpusz-czalną w wodzie w ilości wystarczającej do nastawienia pH na wartość przynajmniej 12, w szczególności 13 do 14. Jako zasady rozpuszczalne w wodzie nadają się obojętne chemicznie, rozpuszczalne w cieczy z moczu, zasady organiczne lub nieorganiczne, o wystarczającej mocy, aby uzyskać wartość pH przynajmniej 12. Nadają się więc wodorotlenki metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych, w szczególności wodorotlenek sodu, lub także zasady organiczne takie, jak czwartorzędowe wodorotlenki alkiloammoniowe. Zasadę dodaje się korzystnie w postaci wodnego roztworu, o zawartości zasady przynajmniej 20% wag., korzystnie 4θ do 60% wag.. Jako celowy okazał się w szczególności 45 do 55% wodny roztwór ługu sodowego. Podczas tej wstępnej obróbki alkaliami wartość pH cieczy z moczu nastawia się na przynajmniej 12, przykładowo w zakresie 12 do 14, korzystnie

185 920 jest do pożądane można wytworzyć mieszaninę substancji stałych bez rozpuszczalnika na drodze suszenia rozbryzgowego. Jeśli naturalna mieszanina sprzężonych estrogenów powinna być stosowana do wytwarzania leków o postaci stałej, może być celowe dodanie stałego nośnika do eluatu zawierającego skoniugowane estrogeny jeszcze przed zatężaniem lub suszeniem rozbryzgowym, dla otrzymania w ten sposób mieszaniny w postaci stałej, zawierającej skoniugowane estrogeny i nośnik. Zarówno eluat, zawierający mieszaninę estrogenów, jak tez wytworzony z niego koncentrat lub produkt stały suszony rozbryzgowo można przetworzyć w znany sposób w stałe lub ciekłe preparaty galenowe takie, jak przykładowo tabletki, drażetki, kapsułki lub emulsje. Te preparaty galenowe mogą być wytwarzane znanymi metodami, z zastosowaniem zwykłych stałych lub ciekłych materiałów nośnikowych takich, jak np. skrobia, celuloza, cukier mlekowy lub talk czy ciekła parafina i/lub z zastosowaniem zwykłych farmaceutycznych środków pomocniczych, przykładowo substancji rozsadzających tabletki, środków solubizujących lub konserwujących. Tak więc można produkt, zawierający skoniugowane estrogeny, zmieszać w zwykły sposób z farmaceutycznymi nośnikami i środkami pomocniczymi i mieszaninę przetworzyć w odpowiednią postać dozowania leku.

Następujące przykłady powinny bliżej objaśnić wynalazek, nie ograniczając jego zakresu.

Przy kłady I-V

Ogólny sposób postępowania przy uzyskiwaniu z PMU ekstraktu naturalnej mieszaniny zawartych w PMU sprzężonych estrogenów z dalece idącym zubożeniem w fenolowe substancje znajdujące się w moczu.

A) Obróbka wstępna PMU l PMU przefiltrowanego przez złoże piaskowe o wysokości 5 cm lub przez urządzenie do mikrofiltracji (o zawartości substancji stałej (= TS) oraz zawartości soli siarczanowej estrogenów, krezolu i HPMF określonych metodą HPLC, podanych dalej w tabeli) poddaje się, silnie mieszając, nastawianiu pH na wartość 13 przez dodawanie 50% wodnego roztworu wodorotlenku sodowego (gęstość w20°C = 1,52 g/ml), (dodana ilość roztworu NaOH patrz tabela) i miesza się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie nastawia się wartość pH alkalicznej cieczy z moczu na wartość 8 do 8,5, dodając roztwór stężonego kwasu solnego (ok. 35%).

B) Adsorbcja zawartości estrogenów z PMU na żelu krzemionkowym RP

Kolumnę o wysokości 50 cm i średnicy około 5 cm napełnia się 100 g (objętość = 193 ml = 1 objętość złoża) żelu krzemionkowego RP (=„Kieselgel 60/ dimethylsilnderivat” firmy Merck, nr katalog. 7719, uziarnienie 63 do 200 pm). Kolumnę przemywa się najpierw 0,5 l wody, następnie 0,25 l metanolu i jeszcze raz 0,5 l wody. Ciecz z moczu obrobioną, według A) przepuszcza się przez kolumnę pod zwiększonym ciśnieniem, z nadciśnieniem 0,2 bara (0,2 · 10⁵Pa) i z szybkością 60 ml/minutę. Zawartość estrogenów z PMU jest całkowicie zaadsorbowana na tak załadowanej kolumnie z żelu krzemionkowego RP. Odciekającą ciecz z moczu bada się na zawartość soli siarczanowej estrogenów metodą HPLC i okazuje się ona praktycznie wolna od estrogenów. Odciek odrzuca się.

C) Mycie kolumny z wysyconym żelem krzemionkowym RP

Kolumnę z wysyconym żelem krzemionkowym myje się 2 l (około 10 objętości złoża) 0,15 molowego roztworu buforowego kwas octowy/octan sodu. Roztwór buforowy sporządza się dodając do 0,15 molowego roztworu kwasu octowego stały octan sodowy (ok. 107 g) do uzyskania pH 5. Odciekającą ciecz myjącą poddaje się analizie metodą HPLC na zawartość soli siarczanowej estrogenów, krezolu i HPMF i zawiera ona poniżej 5% zawartości estrogenów wyjściowego PMU.

D) Desorbcja sprzężonych estrogenów z wymytej kolumny z żelem krzemionkowym

RP i oddzielenie frakcji bogatej w estrogeny l cieczy eluującej (mieszanina woda/rozpuszczalnik o składzie podanym dalej w tabeli) przepuszcza się przez kolumnę z zastosowaniem nadciśnienia 0,2 bara (0,2 · 10⁵Pa) i przy szybkości przepływu cieczy przez kolumnę około 60 ml/min. Odciekający eluat zbiera się w wiele frakcji (objętość każdej frakcji około 200 ml s około 1 objętości złoża). Dla poszczególnych frakcji bada się metodą HPLC zawartość soli siarczanowej estrogenów, krezolu i HPMF. Pierwszą frakcję zbiera się tak długo, jak długo eluat pozostaje bezbarwny i aż do lekko żółtego.

185 920 około 13, i tę alkaliczną wartość pH utrzymuje się przez czas wystarczający do oddzielenia ugrupowań laktonowych, zawartych w substancjach w moczu, który może wynosić na ogół 1/2 do 2 godzin. Warunki obróbki muszą być dobrane tak, aby nie naruszone zostały przy tym sprzężone estrogeny. Tak więc obróbka przebiega korzystnie w temperaturze pokojowej z ograniczeniem dodatku zasady do ilości potrzebnej do uzyskania pożądanego pH w zakresie 12 do 14. Ilości zasady potrzebne do uzyskania pH w zakresie 12 do 14 mogą się zmieniać w zależności od składu zastosowanego PMU. Przy zastosowaniu 50% ługu sodowego okazały się wystarczające ilości od około 100 do 700 ml 50% ługu sodowego w przeliczeniu na 10 l PMU. Następnie wartość pH cieczy z moczu nastawia się w zakresie 5 do 8,5, korzystnie 7 do 8,5, w szczególności 8 do 8,5, przez dodatek wodnego roztworu kwasu. Jako kwasy nadają się obojętne chemicznie, organiczne lub nieorganiczne, rozpuszczalne w cieczy z moczu kwasy takie, jak przykładowo kwas solny, kwas siarkowy, kwas fosforowy lub niższe kwasy karboksylowe, jak kwas octowy. Jako celowy okazał się przykładowo stężony roztwór wodny kwasu solnego. Ilości kwasu potrzebne do uzyskania pH w wyżej podanym zakresie mogą się zmieniać w zależności od składu zastosowanego PMU i ilości zasady dodanej do nastawienia alkalicznego zakresu. Przy zastosowaniu stężonego kwasu solnego pożądaną wartość pH można uzyskać przez dodanie około 25 do 100 g stężonego kwasu solnego w przeliczeniu na 11 PMU.

Stosowane w etapie b) hydrofobizowane żele krzemionkowe stanowią znane żele do pracy z odwróconą fazą (= żele krzemionkowe „reverse-phase”, w skrócie żele krzemionkowe RP); są to żele krzemionkowe modyfikowane chemicznie, zawierające hydrofobowe funkcjonalne grupy lub ligandy. Tak więc odpowiednie są przykładowo silanizowane żele krzemionkowe RP, zawierające jako hydrofobowe grupy funkcjonalne reszty n-oktadecylodimetylosililoksylowe, n-oktylodimetylosililoksylowe lub dimetylohydroksysililoksylowe. Odpowiednie są np. silanizowane żele krzemionkowe o średnich wymiarach cząstek od 15 do 500 pm. Jako szczególnie celowy okazał się żel krzemionkowy zawierający resztę dimetylohydroksysililoksylow'ą, o średnich wymiarach cząstek w zakresie 0,05 - 0,3 mm, przykładowo „Kieselgel 60/ Dimethylsilanderivat” firmy Merck.

Według wynalazku można prowadzić adsorbcję sprzężonych estrogenów na hydrofobizowanym żelu krzemionkowym przez kontaktowanie ewentualnie zatężonego PMU lub jego pozostałości po filtracji na hydrofobizowanym żelu krzemionkowym, na drodze wprowadzania cieczy z moczu obrobionej w etapie a) do reaktora zawierającego żel krzemionkowy i utrzymywania jej w kontakcie z żelem przez czas wystarczający do adsorbcji zawartości estrogenów. Po zakończeniu adsorbcji sprzężonych estrogenów na hydrofobizowanym żelu krzemionkowym można żel krzemionkowy nasycony mieszaniną sprzężonych estrogenów oddzielić w znany sposób od pozostałej cieczy z moczu. Celowo można przepuszczać ciecz z moczu przez kolumnę zawierającą żel krzemionkowy z taką szybkością, żeby czas kontaktu wystarczał do adsorbcji zawartości estrogenów. Odpowiednie są przykładowo szybkości odpowiadające przepływowi 5 do 20 części objętościowych PMU na 1 część objętościową żelu krzemionkowego na godzinę. Adsorbcję prowadzi się korzystnie w temperaturze pokojowej. Celowo można sterować szybkością przepływu cieczy z moczu przez reaktor pracując pod niewiele zwiększonym lub zmniejszonym ciśnieniem. Ilości zastosowanego hydrofobizowanego żelu krzemionkowego mogą zmieniać się w zależności od typu zastosowanego żelu krzemionkowego i ilości zawartości substancji stałych w cieczy z moczu obrobionej według punktu a). Przy zastosowaniu wstępnie obrobionego PMU można nasycić przykładowo jedną część objętościową hydrofobizowanego żelu krzemionkowego ilością do 80 części objętościowych obrobionego PMU, bez wystąpienia znaczniejszych ilości estrogenów w odpływającej cieczy z moczu. Przy zastosowaniu obrobionego koncentratu PMU lub pozostałości PMU z filtracji obciążalność hydrofobizowanego żelu krzemionkowego zmniejsza się naturalnie w takim stopniu, w jakim są one zatężone. Tak więc, przykładowo, 1 część objętościową hydrofobizowanego żelu krzemionkowego można nasycić cieczą z moczu odpowiadającą 30 do 80, korzystnie 40 do 50 części objętościowych PMU.

Hydrofobizowany żel krzemionkowy nasycony mieszaniną sprzężonych estrogenów myje się w etapie c) wodnym roztworem buforowym nastawionym na pH w zakresie od 5 do 7, korzystnie około 5. Jako ciecz myjącą stosuje się korzystnie roztwór buforowy kwas octowy/octan

185 920 o pH nastawionym na około 5. Nadają się szczególnie 0,1 do 1 molowe, korzystnie 0,1 do 0,2 molowe roztwory buforowe kwas octowy/octany. Ilości cieczy myjącej wybiera się tak, aby wystarczyły one na daleko idące wymycie fenolowych substancji zawartych w moczu, bez wymycia przy tym wraz z nimi znaczniejszych ilości sprzężonych estrogenów. Jako celowe okazało się przykładowo zastosowanie cieczy myjącej w ilości 8 do 15, w szczególności 9 do 10 objętości złoża na objętość złoża hydrofobizowanego żelu krzemionkowego. Przepuszcza się tu celowo ciecz myjącą przez reaktor zawierający hydrofobizowany żel krzemionkowy z szybkością przepływu od 5 do 20 części objętościowych cieczy myjącej na 1 część objętościową żelu krzemionkowego na godzinę.

Następnie w etapie d), wymyty hydrofobizowany żel krzemionkowy, wysycony mieszaniną sprzężonych estrogenów obrabia się cieczą eluującą w ilości wystarczającej do wymycia mieszaniny sprzężonych estrogenów i uzyskuje się eluat zawierający naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów z PMU. Ciecz eluująca stosowana według wynalazku stanowi mieszaninę wody i mieszającego się z wodą eteru, niższego alkanolu i/lub niższego alifatycznego ketonu. Jako eterowy składnik cieczy eluującej nadają się mieszające się z wodą etery cykliczne takie, jak tetrahydrofuran lub dioksan jak też etery o otwartym łańcuchu, mieszające się z wodą takie, jak przykładowo eter dimetylowy glikolu etylenowego (=Monoglyme), eter dimetylowy glikolu dietylenowego (=Diglyme) lub etyloksyetyloksyetanol (=Carbitol). Jako niższe alkanole nadają się mieszające się z wodą alkohole alkilowe o 1-4, korzystnie 1-3 atomach węgla, korzystnie etanol lub izopropanol. Jako niższe ketony alifatyczne nadają się ketony mieszające się z wodą o 3-5 atomach węgla, w szczególności aceton. Jako szczególnie korzystne okazały się ciecze eluujące, w których organiczny rozpuszczalnik stanowi etanol. Stosunek objętościowy rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą do wody w cieczy eluującej może wynosić w zakresie od 40 : 60 do 20 : 80, korzystnie około 30 : 70. Zastosowane ilości środka eluującego mogą wynosić około 3 do 5 objętości złoża na objętość złoza hydrofobowego żelu krzemionkowego. Celowo przepuszcza się ciecz eluującą przez reaktor zawierający żel krzemionkowy wysycony mieszaniną estrogenów z taką szybkością przepływu, aby czas kontaktu wystarczył do pełnego wymycia mieszaniny sprzężonych estrogenów Przy zastosowaniu mieszaniny tetrahydrofuranu i/lub etanolu z wodą o stosunku objętościowym 30 . 70 odpowiednie są szybkości przepływu cieczy eluującej od 5 do 20 części objętościowych cieczy eluującej na 1 część objętościową żelu krzemionkowego na godzinę. Celowo reguluje się szybkość przepływu pracując przy lekko podwyższonym ciśnieniu, np. przy nadciśnieniu do 0,2 bara (0,2 · 10⁵Pa), a eluat odbiera się w postaci wielu frakcji. Zawartość sprzęzonych estrogenów i fenolowych substancji zawartych w moczu, jak krezole i HPMF w poszczególnych frakcjach może być oznaczona w znany sposób na drodze wysokosprawnej chromatografii cieczowej (= high performance liquid chromatography, w skrócie „HPLC”).

Podczas elucji otrzymuje się najpierw słabo zabarwioną. do bezbarwnej, praktycznie nie zawierającą estrogenów frakcję przedgonu, której ilość odpowiada ogólnie ok. jednej objętości złoza. Główna ilość sprzężonych estrogenów, przykładowo między 80 a 99% sprzężonych estrogenów istniejących w wyjściowym PMU znajduje się w dalszej, ciemnożółto-brązowo zabarwionej frakcji głównej eluatu, której ilość obejmuje ogólnie 1 do 2 objętości złoża. W dalszych frakcjach pogonu zawarte są w zasadzie tylko ślady sprzęzonych estrogenów. O ile otnymuje się frakcje pogonu, które zawierają jsszcze sprzężone esbogeny w llości powyżej 10% w przeliczeniu na suchą substancję i mniej niż 0,6% krezoli i HPMF w przeliczeniu na suchą substancję, do dalszej przeróbki można je tez poddać oczyszczeniu wraz z głównym eluatem.

Główny eluat, oddzielony od żelu krzemionkowego w powyżej opisany sposób, zawiera występującą w PMU naturalną mieszaninę sprzęzonych estrogenów obok niewielkich tylko ilości pierwotnie znajdującej się w PMU zawartości fenolowych substancji zawartych w moczu Ten eluat może służyć jako surowiec wyjściowy do wytwarzania leków, zawierających naturalną mieszaninę sprzęzonych estrogenów. O ile jest to pożądane eluat ten można w znany sposób dalej zatęzyć, w celu otrzymania zatężonego koncentratu, nadającego się do dalszej obróbki galenowej, uwolnionego w dużym stopniu od organicznego rozpuszczalnika. O ile

185 920

Objętość tej frakcji wynosi 150 do 200 ml. Ta frakcja zawiera tylko ślady soli siarczanowej estrogenów. Gdy tylko nastąpi zmiana barwy eluatu w intensywnie ciemnożółtą do brązowej, zbiera się następną frakcję około 200 ml. W tej frakcji zawarte jest około 80 do 98% zadsorbowanej w kolumnie łącznej ilości soli siarczanowej estrogenów. Pozostałe frakcje zawierają tylko niewielkie ilości soli siarczanowej estrogenów. Mogą one być o ile jest pożądane po oddestylowaniu zawartości rozpuszczalnika jeszcze raz poddane etapowi B).

Dla drugiej frakcji, zawierającej główną ilość skoniugowanych estrogenów podane są w tabeli, oznaczane kazdorazowo zawartości substancji stałej w % (TS) i określone metodą HPLC zawartości soli siarczanowej estrogenów, krezolu i HPMF. Ta frakcja stanowi ekstrakt nadający się do dalszej obróbki galenowej.

E) Regeneracja kolumny żelu krzemionkowego RP

W celu regeneracji, kolumnę myje się najpierw 2 litrami wody, następnie 0,5 1 metanolu i jeszcze raz 2 1 wody. Kolumna może następnie znów być zastosowana w sposobie. Kolumnę można regenerować wielokrotnie, np. do 10 razy i ponownie użytkować.

185 920

185 920

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów ze zmniejszoną zawartością fenolowych substancji zawartych w moczu, z moczu źrebnych klaczy, za pomocą ekstrakcji w fazie stałej obejmującej adsorpcję estrogenów na żelu krzemionkowym, mycie obciążonego żelu krzemionkowego i eluowanie estrogenów z żelu krzemionkowego, znamienny tym, że

   a) ciecz z moczu, którą stanowi mocz uwolniony ze śluzu i substancji stałych, zatężony koncentrat moczu lub otrzymany przez ultrafiltrację tego moczu zatężony przesącz, obrabia się rozpuszczalną w wodzie zasadą w ilości wystarczającej do nastawienia pH na wartość przynajmniej 12 i na koniec nastawia się pH cieczy z moczu obrobionej zasadą przez dodawanie wystarczającej ilości wodnego roztworu kwasu na wartość od 5 do 8,5;

   b) ciecz z moczu obrobioną zasadą i o pH nastawionym na wartość 5 do 8,5 kontaktuje się z hydrofobizowanym żelem krzemionkowym w ilości wystarczającej do adsorbcji mieszaniny sprzęzonych estrogenów zawartych w cieczy z moczu i oddziela się hydrofobizowany żel krzemionkowy, nasycony mieszaniną sprzężonych estrogenów od pozostałej cieczy z moczu;

   c) hydrofobizowany zel krzemionkowy, nasycony mieszaniną sprzężonych estrogenów, myje się wodnym roztworem buforowym nastawionym na pH w zakresie 5 do 7, w szczególności 5;

   d) wymyty hydrofobizowany żel krzemionkowy kontaktuje się z cieczą eluującą w ilości wystarczającej do desorbcji zaadsorbowanej mieszaniny sprzężonych estrogenów, stanowiącą mieszaninę wody i mieszającego się z wodą organicznego rozpuszczalnika z grupy mieszających się z wodą eterów, niższych alkanoli i niższych alifatycznych ketonów i oddziela się od hydrofobizowanego żelu krzemionkowego eluat, zawierający naturalną mieszaninę sprzęzonych estrogenów i ewentualnie zatęża się go.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) ciecz z moczu miesza się z zasada, korzystnie z wodnym roztworem zasady i utrzymuje przy pH przynajmniej 12 przez czas wystarczający do oddzielenia ugrupowań laktonowych z substancji zawartych w moczu.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako żel hydrofobizowany stosuje się silanizowany żel, zawierający reszty dimetylohydroksysililoksylowe.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w etapie b) 1 część objętościową hydrofobizowanego zelu krzemionkowego wysyca się cieczą z moczu, odpowiadającą 30 do 80, korzystnie 40 do 50 części objętościowych moczu.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w etapie b) przez reaktor zawierający hydrofobizowany zel krzemionkowy przepuszcza się ciecz z moczu z szybkością przepływu, która odpowiada przepływowi 5 do 20 części objętościowych moczu/l części objętościowych hydrofobizowanego żelu krzemionkowego/godzinę.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako stosowaną w etapie c) ciecz myjącą stanowiącą wodny roztwór buforowy, wprowadza się wodny roztwór buforowy kwas octowy/octan o pH około 5.
7. 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosowaną w etapie d) jako ciecz eluującą stanowi mieszanina wody i mieszającego się z wodą organicznego rozpuszczalnika o stosunku objętościowym organicznego rozpuszczalnika do wody w zakresie 20 : 80 do 40 : 60, w szczególności 30 : 70.