CZ298762B6

CZ298762B6 - Postup získání estrogenů z moči klisen

Info

Publication number: CZ298762B6
Application number: CZ0059999A
Authority: CZ
Inventors: Ban@Ivan; Borchers@Friedrich; Heinemann@Henning; Rasche@Heinz-Helmer
Original assignee: Solvay Pharmaceuticals Gmbh
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2008-01-23
Also published as: DE19681616D2; PL185920B1; IL128671A0; SK281367B6; EP0927040A1; EP0927040B1; ATE264110T1; NO990953D0; NO990953L; HUP9903670A3; IL128671A; CA2263904C; NO318378B1; HUP9903670A2; DE59610986D1; AU722084B2; PT927040E; CA2263904A1; HU228765B1; AU6985696A

Abstract

Je popsán postup získání extraktu obsahujícího přirozenou směs konjugovaných estrogenů z moči klisen, a to extrakcí pevné fáze směsi konjugovaných estrogenů z moči březích klisen na RP-silikagelu.

Description

(57) Anotace:

Postup získání estrogenů z moči klisen

Oblast techniky 5

Předložený vynález se týká získání přirozené směsi konjugovaných estrogenů z moči březích klisen.

Dosavadní stav techniky

Estrogeny jsou v lékařství používány k hormonální substituční terapii (léčbě). Zejména jsou směsi estrogenů používány k léčbě a prevenci potíží vyskytujících se u žen v době přechodu (klimaktériu) po přirozené nebo umělé menopauze. Přitom se přirozené směsi konjugovaných estro15 genů, jež se vyskytují v moči březích klisen, ukázaly jako zvlášť účinné a dobře snášenlivé.

Rozpuštěný obsah pevných látek v moči březích klisen (= pregnant mares urine, v následujícím zkráceno jako „PMU“) může kolísat přirozeně v širokých rozsazích a obecně leží v rozsahu 4090 g sušiny na litr. Vedle močoviny a jiných obvyklých moč obsahujících látek jsou v obsahu pevných látek PMU obsaženy fenolické složky v množstvích cca 2-5 % hmotn., vztaženo na sušinu. Mezi těmito fenolickými složkami se nacházejí krezoly a jako HPMF známý dihydro3,4-bis[3-hydroxyfenyl)methyl]-2(3H)-furanon. Tyto látky se mohou vyskytovat ve volné nebo konjugované formě. V PMU je obsažena přirozená směs estrogenů, která dalekosáhle existuje v konjugované formě, např. jako sodná sůl poloesteru kyseliny sírové (v následujícím zkráceno jako „sulfátová sůl“. Obsah konjugovaných estrogenů (vypočtený jako sulfátová sůl estrogenů) může činit mezi 0,3 a 1 % hmotn., vztaženo na sušinu.

Obvykle jsou extrakty z PMU obsahující konjugované estrogeny získávány extrakcí pomocí polárních, s vodou nemísitelných nebo jen málo mísitelných organických rozpouštědel, jako jsou např. ethylester kyseliny octové, n-butanol nebo cyklohexanol. U takových extrakcí kapalinakapalina se však vyskytuje velký počet problémů, jako jsou silná tvorba pěny, tvorba sedimentu, tvorba emulze a špatné dělení fází. Obecně je zapotřebí více extrakčních kroků, což vede ke ztrátám a jen k částečnému získání obsahu estrogenů.

Pro úpravu malých množství močových a plazmových tekutin pro analytické určení estrogenů pomocí plynové chromatografie je Heikkinnenem et al. (Clin. Chem. 27/7, (1981), 1186-1189) a Shackletonem et al. (Clinica Chimica Acta 107(1980), 31-243) navržena extrakce estrogenů z pevné fáze pomocí kartuše se silanizovaným silikagelem obsahujícím zbytky oktadecylsilanu (Sep-Pak® C|₈-cartridge, výrobce Waters Ass. lne. Milford, MA, USA). Přitom jsou estrogeny z kartuše eluovány metanolem. Nejsou však uvedeny žádné údaje o dalších látkách obsažených v eluátu obsahujícím estrogeny.

Podstata vynálezu

Úkolem tohoto vynálezu je vyvinout technický postup k získávání přirozené směsi konjugovaných estrogenů z PMU, přičemž by se zabránilo známým nevýhodám dosud obvyklých extrakcí kapalina-kapalina, a jenž dodává produkt obohacený fenolickými, moč obsahujícími látkami a dalekosáhle zbavený HPMF.

Nyní byl nalezen postup, jímž může být v jedné extrakci pevné látky na hydrofobizovaném silikagelu získána směs obohacená fenolickými, moč obsahujícími látkami, jež je dalekosáhle zbavená HPMF, avšak prakticky úplně obsahuje přirozený obsah estrogenů v PMU, která může sloužit jako výchozí materiál pro výrobu farmaceutik obsahujících přirozenou směs konjugova55 ných estrogenů z PMU jako účinnou složku.

-1 CZ 298762 B6

Postup podle vynálezu k získávání fenolickými, moč obsahujícími látkami obohacené přirozené směsi konjugovaných estrogenů z PMU se vyznačuje tím, že

a) močová kapalina, která představuje moč zbavenou slizových a pevných látek, zúžený koncentrát této moči nebo ultrafiltraci této moči získaný zúžený močový retentát, se zpracovává s množstvím vodorozpustné zásady dostatečným k nastavení hodnoty pH minimálně na 12 a nakonec se nastaví hodnota pH se zásadou zpracované močové kapaliny přidáním dostatečného množství vodného roztoku kyseliny na hodnotu v rozsahu od 5 do 8,5,

b) předem se zásadou zpracovává, na pH 5 až 8,5 nastavená močová kapalina se kontaktuje s množstvím hydrofobizovaného silikagelu dostatečným k adsorpci směsi konjugovaných estrogenů obsažené v močové kapalině a hydrofobizovaný silikagel naložený směsí konjugovaných estrogenů se oddělí od ostatní močové kapaliny,

c) hydrofobizovaný silikagel naložený směsi konjugovaných estrogenů se promyje s vodným roztokem pufru, nastaveným na rozsah pH od 5 do 7, zejména 5,

d) promytý hydrofobizovaný silikagel se kontaktuje s množstvím eluční kapaliny, jež představuje směs z vody a s vodou mísitelného organického rozpouštědla ze skupiny s vodou mísitelných éterů, nižších alkanolů a nižších alifatických ketonů, dostatečným k desorpci adsorbované směsi konjugovaných estrogenů, a eluát obsahující přirozenou směs konjugovaných estrogenů se oddělí a popřípadě zúží od hydrofobizovaného silikagelu.

Pro daný postup podle vynálezu mohou být používány PMU jako takový, z něho zúžením získaný koncentrát nebo z něho membránovou filtrací získaný retentát. Nashromážděná moč se nejprve známým způsobem zbaví slizových a pevných látek. Jako účelné se ukazuje usazování pevných a slizových látek a tyto se pak oddělí známými dělicími způsoby, např. dekantací, separací a/nebo filtrací. Tak může být PMU např. veden přes známé dělicí zařízení, např. separátor, fil30 traění zařízení nebo sedimentační zařízení. Jako dělicí zařízení může sloužit např. pískové lože nebo mohou být použity obchodně běžné separátory, např. tryskové nebo komorové separátory. Je-li to žádoucí, mohou být použita rovněž mikrofiltrační nebo ultrafiltrační zařízení, při jejichž použití může být současně dosaženo dalekosáhlého zbavení zárodků a virů filtrovaného PMU.

V žádoucím případě mohou být k moči přidávány konzervační prostředky, dezinfekční prostředky (germicidy), baktericidy a/nebo anthelmintika.

Pokud místo PMU má být použit zkoncentrovaný PMU-retentát, může být tento získáván z PMU pomocí známé membránové filtrace. Obsah pevných látek retentátu a jeho složení se mohou měnit podle použitého PMU a membrány použité k membránové filtraci, např. podle její velikosti pórů nebo podmínek filtrace. Např. při použití nanofiltrační membrány může být dosaženo téměř bezztrátového koncentrování obsahu estrogenů v PMU-retentátu při současném odstranění až 50 % hmotn. nízkomolekulámích látek obsažených v PMU. Pro daný postup podle vynálezu mohou být použity PMU-retentáty, které byly zkoncentrovány až na poměr cca 1:10, lépe na poměr cca 1:7, ajejich objem může být zúžen až na cca 1/10, přednostně cca 1/7, původního objemu PMU.

V postupovém kroku a) se k močové kapalině přidává vodorozpustná zásada v množství dostatečném k nastavení hodnoty pH minimálně 12, zejména 13 až 14. Jako vodorozpustné zásady se hodí anorganické nebo organické, v močové tekutině rozpustné inertní zásady, které jsou dost silné, aby se dosáhlo hodnoty pH minimálně 12. Tak jsou vhodné hydroxidy alkalických kovů nebo hydroxidy kovů alkalických zemin, zejména hydroxid sodný, nebo rovněž organické zásady jako kvartémí hydroxidy amonné s nižšími alkyly. Přednostně se daná zásada přidává ve formě vodného roztoku s obsahem báze minimálně 20 % hmotn., přednostně 40 až 60 % hmotn.. Jako vhodný se ukazuje zejména 45- až 55% vodný hydroxid sodný. Při tomto alkalickém předběž-2CZ 298762 B6 ném zpracovávání se hodnota pH močové kapaliny nastaví minimálně na 12, příkladně v rozsahu 12 až 14, přednostně cca 13, a tato alkalická hodnota pH se bude udržovat po období dostatečné ke štěpení laktonových seskupení obsažených v látkách obsažených v moči, přičemž toto období může obecně činit 1/2 až 2 hodiny. Podmínky zpracování musí být voleny tak, aby konjugované estrogeny nebyly přitom napadány. Tak probíhá dané zpracování přednostně při teplotě místnosti při omezení přidání zásady na množství potřebné k dosažení žádané hodnoty pH v oblasti 12 až 14. Množství zásady potřebné k dosažení hodnoty pH v rozsahu od 12 do 14 se může měnit podle složení použité PMU. Při použití 50% louhu sodného se ukazují obecně jako dostatečná množství od cca 100 do 700 ml 50% louhu sodného vztaženo na 10 1 PMU. Nakonec se močová tekutina ío nastaví přidáním vodného roztoku kyseliny na hodnotu pH v rozsahu od 5 do 8,5, přednostně 7 až 8,5, zejména 8 až 8,5. Jako kyseliny se hodí inertní anorganické nebo organické kyseliny rozpustné v močové kapalině, jako např. kyselina solná, kyselina sírová, kyselina fosforečná nebo nižší karbonové kyseliny jako kyselina octová. Jako vhodný se ukazuje příkladně koncentrovaný vodný roztok kyseliny solné. Množství kyseliny nutné k dosažení předem uvedeného rozsahu pH se může měnit podle složení použité PMU a množství zásady použité při počátečním nastavování alkalické oblasti. Při použití koncentrovaného roztoku kyseliny solné může být žádoucí hodnota pH dosažena obecně přidáním cca 25 až 100 g koncentrovaného roztoku kyseliny solné vztaženo na 1 1 PMU.

V postupovém kroku b) použitelné hydrofobizované silikagely jsou známé silikagely s inverzní fází (=Reverse-Phase-Kieselgele, zkráceno „RP-silikagely“), tj. chemicky modifikované silikagely, jež nesou hydrofobní funkční skupiny, event. ligandy. Tak jsou vhodné např. silanizované RP-silikagely, které obsahují jako hydrofobní funkční skupiny n-oktadecyldimethylsilyloxy-, n-oktyldimethylsilyloxy- nebo dimethylhydroxysilyloxyskupiny. Vhodné jsou např. silanizované silikagely se střední velikostí zrn od 15 do 500 μιη. Jako zvlášť vhodný se ukázal silikagel obsahující dimethylhydroxylsulfyloxylové zbytky se střední velikostí zrn v rozsahu od 0,05-0,3 mm, např. silanový derivát silikagelu „Kieselgel 60/Dimethylsilanderivat“ firmy Merck.

Podle vynálezu může adsorpce konjugovaných estrogenů na hydrofobizovaném silikagelu probí30 hat kontaktováním eventuálně zkoncentrované PMU nebo jejího retentátu s hydrofobizovaným silikagelem, přičemž v postupovém kroku a) předem zpracovaná močová kapalina se zavede do reaktoru obsahujícího silikagel a v něm je udržována v kontaktu se silikagelem po dobu dostatečnou k adsorpci obsahu estrogenů. Po proběhlé adsorpci konjugovaných estrogenů na hydrofobizovaný silikagel může být silikagel napojený směsí konjugovaných estrogenů oddělen známým způsobem od ostatní močové kapaliny. Účelněji může být močová kapalina vedena sloupcem obsahujícím silikagel takovou průtokovou lychlostí, aby kontaktní doba postačovala k adsorpci obsahu estrogenů. Vhodné jsou např. průtokové rychlosti, jež odpovídají průtoku 5 až 20 objemových dílů PMU/1 objemový díl silikagelu/hodinu. Adsorpce je prováděna přednostně při teplotě místnosti. Účelné je řízení průtokové rychlosti močové tekutiny reaktorem pracemi při malém přetlaku nebo podtlaku. Množství použitého hydrofobizovaného silikagelu se může měnit podle druhu použitého silikagelu a množství obsahu pevných látek v močové kapalině předem zpracované v postupovém kroku a). Při použití předem zpracované PMU může být příkladně 1 objemový díl hydrofobizovaného silikagelu napojen až 80 objemovými díly předem zpracované PMU, aniž by byla v odtékající močové kapalině prokazatelná patrná množství estrogenů. Při použití předem zpracovaného PMU-koncentrátu nebo PMU-retentátu se kapacita napojení hydrofobizovaného silikagelu redukuje přirozeně tou měrou, v níž jsou tyto látky zkoncentrovány. Tak může být příkladně 1 objemový díl na hydrofobizovaném silikagelu napojen množstvím močové kapaliny odpovídajícím 30 až 80, přednostně 40 až 50 objemovým dílům PMU.

Hydrofobizovaný silikagel napojený směsí konjugovaných estrogenů se v postupovém kroku c) promývá vodným roztokem pufru nastaveným na oblast pH od 5 do 7, přednostně cca 5. Jako promývací kapalina se přednostně používá vodný roztok pufru složeného z kyseliny octové/octanu nastavený na pH cca 5. Vhodné jsou zejména 0,1— až lmolámí, přednostně 0,1 až 0,2molámí roztoky pufru kyselina octová/octan. Množství promývací kapaliny je voleno tak, aby postačovalo pro dalekosáhlé vymytí fenolických, v moči obsažených látek, aniž by přitom byla

-3CZ 298762 B6 vymyta za zmínku stojící množství konjugovaných estrogenů. Jako vhodné se ukazuje příkladně použití 8 až 15, zejména 9 až 10, ložných objemů promývací kapaliny na ložný objem hydrofobizovaného silikagelu. Přitom účelnější je vedení promývací kapaliny reaktorem obsahujícím hydrofobizovaný silikagel průtokovou rychlostí 5 až 20 objemových dílů prací kapaliny/1 objemový díl silikagelu/hodinu.

V postupovém kroku d) se nakonec zpracuje promytý hydrofobizovaný silikagel napojený směsí konjugovaných estrogenů s množstvím eluční kapaliny, jež je dostatečné k eluci směsi konjugovaných estrogenů, a získá se eluát obsahující přirozenou směs konjugovaných estrogenů PMU. ío Podle vynálezu používaná eluční kapalina představuje směs z vody a s vodou mísitelného éteru, nižšího alkoholu a/nebo nižšího alifatického ketonu. Jako éterické složky eluční kapaliny se hodí s vodou mísitelné cyklické étery jako tetrahydrofuran nebo dioxan, ale také s vodou mísitelné étery s otevřeným řetězcem, jako např. etylenglykoldimetyléter (=monoglym), dietylenglykoldimetyléter (=diglym) nebo etyloxyetyloxyetanol (=karbitol). Jako nižší alkoholy se hodí s vodou mísitelné alkylalkoholy s 1 - 4, přednostně 1 - 3 atomy uhlíku, zejména etanol nebo izopropanol. Jako nižší alifatické ketony se hodí s vodou mísitelné ketony s 3 - 5 uhlíkovými atomy, zejména aceton. Jako obzvlášť příznivé se ukazují eluční kapaliny, v nichž je organickým rozpouštědlem etanol. V eluční kapalině může objemový poměr s vodou mísitelného organického rozpouštědla k vodě ležet v rozsahu od 40:60 do 20:80, přednostně cca 30:70. Použité množství elučního činidla může činit cca 3 až 5 ložných objemů na ložný objem hydrofobizovaného silikagelu. Vhodněji se eluční kapalina vede reaktorem obsahujícím hydrofobizovaný silikagel napojený směsí estrogenů takovou průtokovou rychlostí, aby kontaktní doba postačovala k úplné eluci směsi konjugovaných estrogenů. Při použití směsi tetrahydrofuranu a/nebo etanolu s vodou v objemovém poměru 30:70 se hodí příkladně průtokové rychlosti od 5 do 20 objemových dílů eluční kapaliny na 1 objemový díl silikagelu za hodinu. Vhodně se průtoková rychlost reguluje prací při lehce zvýšeném tlaku, např. při přetlaku až do 0,02 MPa (0,2 bar), a eluát se jímá v několika frakcích. Obsahy jednotlivých eluátových frakcí konjugovaných estrogenů a fenolických, v moči obsažených látek, jako jsou krezoly a HPMF, mohou být určeny známým způsobem pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie (=high performance liquid chromatography, zkráceno j ako „HPLC“).

Při eluci se nejprve získá slabě zbarvená až bezbarvá, prakticky estrogeny neobsahující předkapová frakce, jejíž množství odpovídá obecně cca jednomu ložnému objemu. Hlavní množství konjugovaných estrogenů, příkladně mezi 80 a 99 % konjugovaných estrogenů existujících ve výchozí PMU (moči březích klisen), se nachází v následujících, tmavožlutě až hnědě zbarvených hlavních eluátových frakcích, jejichž množství zahrnuje obecně 1 až 2 ložné objemy. V následujících dokapových zadních frakcích jsou obecně obsaženy již jen stopy konjugovaných estrogenů. Pokud jsou získány zadní frakce, jež obsahují ještě konjugované estrogeny nad 10% hmotn., vztaženo na sušinu, a méně než 0,6 % hmotn. krezolů a HPMF, vztaženo na sušinu, mohou být tyto frakce spojeny s hlavním eluátem bohatým na estrogeny k dalšímu zpracování.

Hlavní eluát oddělený výše popsaným způsobem od silikagelu obsahuje v PMU se vyskytující přirozenou směs konjugovaných estrogenů vedle jen malého podílu původně v PMU přítomného obsahu fenolických, v moči obsažených látek. Tento eluát může sloužit jako výchozí materiál pro výrobu léčiv obsahujících přirozenou směs konjugovaných estrogenů. Je-li to žádoucí, může být eluát dále zúžen známým způsobem, aby byl získán koncentrát dalekosáhle zbavený organických rozpouštědel, jenž je vhodný pro další galenické zpracování. V žádoucím případě může být také sušením rozprašováním vyrobena směs pevných látek zbavená elučního činidla. Pokud má být přirozená směs konjugovaných estrogenů použita pro výrobu pevných léků, může být vhodné přimíchat k eluátu obsahujícímu konjugované estrogeny již před koncentrováním nebo sušením rozprašováním pevný nosič, aby se tímto způsobem získala směs pevných látek obsahující konjugované estrogeny a nosiče. Jak eluát obsahující směs estrogenů, tak z toho vyrobený koncentrát nebo rozprašováním vysušený pevný produkt mohou být známým způsobem zapracovány do pevných nebo kapalných galenických přípravků, jako např. tablet, dražé, kapslí nebo emulzí.

Tyto galenické přípravky mohou být vyráběny podle známých způsobů s použitím obvyklých

-4CZ 298762 B6 pevných nebo kapalných nosičů, jako např. škrobu, celulózy, mléčného cukru (laktózy) nebo talku (mastku) nebo kapalných parafínů a/nebo s použitím obvyklých farmaceutických pomocných látek, např. bubřidel tablet, rozpouštěcích nebo konzervačních prostředků. Tak může být produkt obsahující konjugované estrogeny smíchán známým způsobem s farmaceutickými nosiči a pomocnými prostředky a daná směs může být převedena do vhodného dávkovacího tvaru. Následující příklady mají blíže vysvětlit daný vynález, aniž by však byl omezen jeho rozsah.

Příklady provedení vynálezu

Příklady 1 - 3

Obecný pracovní předpis k získání extraktu z PMU obsahujícího přirozenou směs v PMU obsažených konjugovaných estrogenů, jež jsou dalekosáhle obohaceny fenolickými látkami obsaženými v moči.

A) Předběžné zpracování PMU

1 PMU filtrovaného přes 5 cm vysoké pískové lože nebo přes mikrofiltrační zařízení (obsah sušiny (=TS) a rovněž pomocí HPLC určené obsahy estronsulfátové soli, krezolu a HPMF viz následující tabulku příkladů) je za silného míchání nastaveno přidáním 50% vodného roztoku hydroxidu sodného (hustota při 20 °C = 1,52 g/ml) na pH 13 (přidané množství roztoku NaOH viz příkladnou tabulku) a hodinu mícháno při teplotě místnosti. Nakonec je alkalická močová kapalina nastavena přidáním koncentrovaného vodného roztoku kyseliny solné (cca 35%) na hodnotu pH od 8 do 8,5.

B) Adsorpce obsahu estrogenů PMU na RP-silikagelu

Sloupec o výšce 50 cm o průměru 5 cm je naplněn 100 g (o objemu cca 193 ml = 1 ložný objem) RP-silikagelu (= „silikagel 60/dimetylsilanderivát“ firmy Merck, obj. č. 7719, velikost zrn 63 až 200 pm). Sloupec se promyje nejprve s 0,5 1 vody, potom s 0,25 1 metanolu a ještě s 0,5 1 vody.

Močová kapalina předem zpracovaná podle A) se vede daným sloupcem přetlakem 0,02 MPa (0,2 bar) a s průtokovou rychlostí 60 ml/minutu. Obsah estrogenů v PMU je na takto napojeném sloupci RP-silikagelu úplně adsorbován. Prošlá močová kapalina je analyzována pomocí HPLC na obsah estronsulfátové soli a ukazuje se jako prakticky zbavená estrogenů. Odteklá kapalina se likviduje.

C) Promývání napojeného sloupce RP-silikagelu

Naložený sloupec RP-silikagelu je promyt 2 1 (cca 10 ložných objemů) 0,15molámího roztoku pufru kyselina octová/octan sodný. Roztok pufru se připraví, když k 0,15-molámímu vodnému roztoku kyseliny octové se přidá pevný octan sodný (cca 107 g) až k dosažení pH 5. Protékající promývací kapalina je analyzována pomocí HPLC na obsah estronsulfátové soli, krezolu a HPMF a obsahuje méně než 5 % obsahu estrogenů výchozí PMU.

D) Desorpce konjugovaných estrogenů zpromytého sloupce RP-silikagelu a oddělení frakce eluátu bohaté na estrogeny

1 eluční kapaliny (směs vody s rozpouštědlem, složení viz následující tabulka) je veden s přetlakem 0,02 MPa (0,2 bar) a s průtokovou rychlostí cca 60 ml/min daným sloupcem. Proběhlý eluát je zachycen do několika frakcí (objem zhruba po 200 ml na cca 1 ložný objem). Jednotlivé frakce jsou vyšetřeny pomocí HPLC na obsah estronsulfátové soli, krezolu a HPMF. První frakce

-5CZ 298762 B6 se shromažďuje, dokud se eluát ukazuje bezbarvý až slabě žlutý. Objem této frakce činí 150 až

200 ml. Tato frakce obsahuje jen stopy estronsulfátové soli.

Jakmile dochází ke změně barvy eluátu na intenzivní tmavožlutou až hnědou barvu, shromáždí se 5 další frakce o objemu cca 200 ml. V této frakci je obsaženo cca 80 až 98 % celkového, na daném sloupci adsorbovaného množství konjugovaných estrogenů. Zbylé frakce obsahují již jen malé množství estrogensulfátové soli. Je-li to žádoucí, mohou být tyto frakce po oddestilování daného rozpouštědla přidány ještě k postupovému kroku B). Pro 2. frakci obsahující hlavní množství konjugovaných estrogenů jsou v následující tabulce obsaženy vždy obsah sušiny (TS) v ío % hmotn. a obsahy estronsulfátové soli, krezolu a HPMF určené pomocí HPLC. Tato frakce představuje extrakt vhodný pro další galenické zpracování.

E) Regenerace sloupce RP-silikagelu

K regeneraci se daný sloupec promyje nejprve 2 1 vody, potom 0,5 1 metanolu a ještě 2 1 vody.

Potom může být sloupec použit znovu pro daný sloupec. Sloupec může být vícekrát, např. až desetkrát, regenerován a znovu používán.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Postup získání fenolickými, v moči obsaženými látkami obohacené přirozené směsi konju5 govaných estrogenů z moči březích klisen, vyznačující se tím, že se

a) močová kapalina, jež představuje moč zbavenou slizových a pevných látek, zúžený koncentrát této moči nebo membránovou filtrací této moči získaný zúžený močový retentát, zpracovává s množstvím vodorozpustné zásady dostatečným k nastavení pH 12 a nakonec se nastaví pH močové kapaliny zpracované s danou zásadou nastavuje přidáním dostatečného množství vodío ného roztoku kyseliny na hodnotu v rozsahu od 5 do 8,5,

b) se zásadou předem zpracovaná, na pH 5 až 8,5 upravená močová kapalina se kontaktuje s množstvím hydrofobizovaného silikagelu dostatečným k adsorpci v močové kapalině obsažené směsi konjugovaných estrogenů a hydrofobizovaný silikagel napojený směsí konjugovaných estrogenů se oddělí od ostatní močové kapaliny,

15 c) hydrofobizovaný silikagel napojený směsí konjugovaných estrogenů se promyje vodným roztokem pufru nastaveným na rozsah pH od 5 do 7, a

d) promytý hydrofobizovaný silikagel kontaktuje s množstvím eluční kapaliny, jež je dostatečné k desorpci adsorbované směsi konjugovaných estrogenů, přičemž tato kapalina představuje směs z vody a z organického rozpouštědla mísitelného s vodou ze skupiny s vodou mísitelných éterů,

20 nižších alkanolů a nižších alifatických ketonů a daný eluát obsahující přirozenou směs konjugovaných estrogenů se oddělí a popřípadě zúží od hydrofobizovaného silikagelu.
2. Postup podle nároku 1, vyznačující se tím, že v kroku daného postupu a) je močová kapalina smísena se zásadou, přednostně s vodným roztokem zásady, a během doby

25 dostatečné ke štěpení laktonových seskupení obsažených v moči je udržována na hodnotě pH minimálně 12.
3. Postup podle jednoho z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že jako hydrofobizovaný silikagel je použit silanizovaný silikagel nesoucí dimetylhydroxysilyloxylové

30 zbytky.
4. Postup podle jednoho z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se v postupovém kroku b) 1 objemový díl hydrofobizovaného silikagelu napojí množstvím močové kapaliny odpovídajícím 30 až 80, přednostně 40 až 50 objemovým dílům moči.
5. Postup podle jednoho z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že v kroku postupu b) se močová kapalina vede reaktorem obsahujícím hydrofobizovaný silikagel průtokovou rychlostí, jež odpovídá průtoku od 5 do 20 objemových dílů moči/1 objemový díl hydrofobizovaného silikagelu/hodinu.
6. Postup podle jednoho z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že v kroku postupu c) vodný roztok pufru použitý jako promývací kapalina je vodným roztokem pufru kyselina octová/octan, který je nastaven na pH cca 5.

45 7. Postup podle jednoho z předcházejících nároků, v y z n a č uj í c í se t í m , že v postupovém kroku d) je jako eluční kapalina použita směs z vody a s vodou mísitelného organického rozpouštědla s objemovým poměrem organického rozpouštědla k vodě v rozsahu 20:80 až 40:60, zejména 30:70.