HU227935B1 - Use of strontium salts for the production of pharmaceutical compositions intended for the treatment of arthrosis - Google Patents

Description

STRONCWMSÓK ALKALMAZÁSA ÍZÜLETI SÁNTALMAK KEZELÉSÉRE ALKALMAS GYÓGYSZERKÉSZÍTMÉNYEK ELŐÁLLÍTÁSÁRA

A találmány stroneíonssofc alkalmazására vonatkozik izületi bániaknak kezelésére alkalmas gvógyszerkészitarények előállításához.

A stroncúsmsök terápiás alkalmazását számos közlemény és szabadalom ismerteti. így például az US 4,152,431 számú Irat gyulladások kezelésére alkalmas áíkúlifémsókat ismertet. A WO 94/09798 számú Irat bőrbetegségek kezelésére alkalmas íém~szulíát komplexeket ismertet O, Svsasson és nunAstársai; Acüt Paiát. ..Mferoőiof .btmtrso?. ÓteW.., Seei, A, 93. 115-120 (19S5) szénát a stroncium fontos--szerepet játszik az angolkór egyes változataiban.

Azt találtuk, hogy a shoncíum szervetlen vagy -szerves só formájában értékes formakolégiai tulajdonsagokkal rendeikexik, és előnyőseit alkabasashaté Izületi bántaimak (arthrosis) kezelésére és megelőzésére,

A technika állását öluszöélja M. Neuma; Ars. Med, 32(24), 2113-2118 (1977),

Azt találtak közelebbről, hogy a stronciumsők 'tornáit porc-sejtekben stimulállak a proteoglikánok és a 11 típusú kollagén szintézisét.

Ezek a molekulák képezik az extraesllulárís porcos- mátrix két tő komponensét. A rostos kollagén hálózatba beépült nagymennyiségű proteoglikm biztosítja a szövetek mechanikai. tuiajdortságaií:»

Mivel a proteoglikánok szintézise és kiválasztása az életkor előrehaladtával csökken, a- stronctamsók fontos szerepet tölthetnek be az Izületi bániaknak megelőzésében és kezelésében. A -stroncitansók különösei; előnyösen alkalmazhatók a betegség kezdeti fázisában bekövetkező helyreállítási folyamatokban,

A találmány tárgya tehát szerves- savak kétértékű stmnciu-nmal képzett sóinak alkalmazása izületi bánik stroncium sóvá alakításához szerves savként előnyösen alkalmazható a horkősav, ahnasav, mafeiiísav, malonsav, fomársav, giükonsav, oxálsav, tejsav, szukciusav,. metáu-ssnlfonsav, etán-szulfonsav, kámforsav és citromsav, valamint a 2-[N^:,N-di(karboxi~metíi)-aminoj-3-ciano-4-ksrboxi-metü-ííofoa-5-karboasav.

A találmány értelmében alkalmazható stroncinmsó a .?.-p9_?N-di(karboxí.-metil)-amiiso)-3-cíano-4-karbo>d-metil-tiofén-5-karbonsav^áistronciumsó.

A találmány értelmében stoaciumsőkéni alkalmaztató a 2-[N,íi-di(kaxboxi-j»t0}-am£ao]-3-Ciano-4-karboxj-metil-tjoíén~5-karhonsav-distroneinmsö az EP 0,415,850 számú iratból ismert, és csontritkulás gátló Íratással retxielkezík, és felhasználható a bőr és érrendszer öregedésének kezelésére, valamint máj betegségek és fogbetegségek kezelésére.

Az izületi bániaknak az ízületi porcok roncsolásával kezdődnek.

Normál korülméayek között a porc megújulása nagyon lassú folyamat, és a folyamai egyik része a porcsejtek felszívódása, amit közvetlenül kompenzál ugyanilyenpomsejtek képződésének íáz-rsa.

Patológiás körülmények között a porc megújulása felgyorsul, ami korai porcbelyreálirt-bi reakciót eredményez, és ezt a sejtes roncsolódás és a poré legyengülése követ. .A helyreállítási reakció a porcsejtek sarjas szaporodásának erednaénye. és a perc mátrix komponensének fokozott szintéziséből ered (D. Harsemstn és munkatársai; Y Esg. J. Afed., 320(20). 1322-1330 (1989))..

85850-4192 SL/kov * * « * ♦ «

Ez a hímieosztatikns reakció sem megfelelő, és szisstsínikus hormonoktól és növekedési faktoroktól függ, amelyek kiválasztása viszont az életkör elörebnladtávai csökken. A porc felszívódását enzimek és a környező szövetek által termelt szabad gyökök, valamint, és elsősorban maguk a poresejsék szabályozzák.

Jelentős- szerepe van -ezért az olyan gyógyszerkészítményeknek, amelyek képesek beavatkozni a porcsejtek metsboiízmusába, mind a porc képződése, mind a porc felszívódása oldaláról.

Ezeket a gyógyszerkészítményeket adagolásra alkalmas fontsában állítjuk elő, ahol az adagolás történhet orálissá,, parenterálisan, trauszkntárj, nazálisán, rekís&an vagy per lingnálisan. Baaek megfelelően, a készítmény formája lehet ínjektáfenió oklat, tahiéba, szublinguális tabletta, zselatin kapszula, kapszula, pasztilla, szuppozáióríum, krém, kenőcs, és bőrön alkalmazható gél,

Á stronciurasó mellet; a találmány szerinti gyógyszerkészlmieny egy vagy több hordozóanyagot vagy segédanyagot tartalmazhat, amely lehet higitószeg esósztatószer, kötőanyag, szétesést elősegítő szer, ahssorheas, színezék és édesítőszer.

Az ilyen segédanyagokra példaként emliiheíők a következő komponensek·.

* «íjíífezóö.eyogijs·: láktóz, dexrröz, szacharóz, mamiitól, ssorbitol, cellulóz és glicerin;

* ízdrrís&bzerak: szilícmm-díoxid, tálkám, sztearro-sav, ennek nrignézinm- ós kafeiumsója, valamin; polietilén-gííkol;

* édídangííg: alaíninimn-szilikát, magnézium-szihkát, keményítő, zselatin, tragakaht, metil-cellulóz, náfriusnkajboxi-nreiü-cellnlóz és polivinil-pírrobdön;

*· szétmórí eákmghö «systgt agai, alginsav és tiáirium-séja, valamint pezsgő keverék.

.A hatékony dózis a kezelt beteg nmnétőí, korától es testtömegétől, a kezdés mödíáíól, a betegség fajiájától és mértékétől függ. Értéke általában napi 25 mg és 3 g közötti, előnyösen 1ÖÖ mg és 2 g közötti a sttonemmra számolva.

A találmányt közelebbről sz alábbi példákkal mutálj ükbe.

.FafgtgWdgtgf rfe.sgdöwá

A találmány szerinti strotrcmmsók hatása a poresejjtek metaboílzmnsára A) ófmrds.

a) Ífi®feOSS§h^teS^«S:

A pomsejteket a fenotípns megőrzéséhez rövid időn keresztül tenyésztjük, Ennél a módszernél a humán test térdéből közvetlenül a halál után eltávolítjuk a porcot. A meszes réteg elkerülésével kivágjuk a felületi és középső rétegeket. A porcot kis darabokra vágjuk, majd enzimmel emésztjük. A porc feagmenseket egymás után hiahuwdázzah ptonázzal és kollagenázzal kezeljük. A porcdarabkákat először Dulbeceo szerint módosítóit Eagle közegben. (DMEM, 1CN Biomedícal) oldott ő,S mg/ml brahaorudázzal kezeljük 3 g porc/l ö m; enzim oldat mennyiségben, 3ö percen keresztül 3? °C hőmérsékleten és állandó kevertetés (2ÖÖ íordtdat/perc) mellett.

Ezután a porc feagmenseket DMEM közegben felvett 1 mg/mí pronáz oldalba helyezzük 3 g porc/iO ml enzim oldat memryiségbert, és 1 órást keresztül 3?'^eCltóttós-ékfeíenödaibáíj:uk.

A porc feagmenseket végül 1 iömsg% Ulírosser <3 adalékanyagot (Gibeo, Gaad, Belgium) tartalmazó ·· 3 DMEM közegben felvett í mg.hnl knílagenáz oldatban inkuháljuk, .3 g porc/ÍÖ «ú enzim oldat mennyíségbea, 2Ö órán kérésztől, 37 ®C hőmérsékleten és állandó kevertetés (2ÖÖ fordnlat/perc) melled. Á sejteket ezután .nylos-szövetea {pőkisánnérő 25 um) szűrjük, háromszor mossak, megszámoljuk (állag seltssám l-$xő sejttm! a vizsgálat színijétől függően), majd megfelelő sejtközegben újra szrsszpendáljuk. A sejteket a kapott szuszpenzióba» íartjnfe fem forgó kévetőben (100 fordnlat/perc) végzett állandó kevertetés és 95 % levegő -f- 5 % széndmxlá összetételit atmoszféra mellett A sejteket és a fe.lüiászőt ceutrifugslássul (1000 fordniabperc, 5 pere) elválasztja. A sejteket ngregáljuk, és a felülúszót -2Ö “C hőmérsékleten tároljak,

h) A poteselttemőgzej kezelése

A porcsejteket (± 1,5 & ÍÖ^fe sejhml) 24,_: 48 és 7.2 órán kérésztől tenyésztjük önmagában vagy a vizsgálandó stroneiumsó jelenlétében. A stroncínmsó koncentrációja IS'⁴ mól/i, 5 >:. íö“* mól/i és 10' mó.1/1. Mindenegyes koncentrációt és a megfelelő kontrolt három párhuzamosba» vizsgálónk. .A vizsgált minták ±1-3,5 x 3Ö^& porcsejtet tartalmaznak. A. vizsgálatokat két külön donratól származó pereseiteken kétszer ismételjük. A proteoglikánok és 11 íipnsá kollagén nseanyisegéí a felölúszóbau és a sejtes fázisban mérjük.

•e) Vizsgákparaméterek h Aoomyi^OŐés^mméterei

A tenyésztést 1 tömeg% ITS-t adalékanyaggal és 50 ng/ml sszkorbálíal kiegészített DMEM közegben végezzük. Az ITS* adalékanyag összetétele: 6,25 pg/ori inzalin, 625 gg/rnl transzferin, 6,25 ug/ml szeléninm, 1,25 mg/ml borjttszérum albnotin és 535 pg lisolsav. A proteoglikánokat és a II típusó kollagént közvetlenül a proteáz inhibitorokkal kiegészifetí fehílúszóhan mérjük. .Á. mérés előtt a sejíagregátumokni ultrahangos disszociálással (3 pulzus lö másodpercen keresztül) homogenizáljuk a proteáz inhibitorokat tartalmazó PBS közegben. A vizsgálatok során proteáz inhibitorként 0.1 máid 3-amino-hexánsavat, 0,05 mól/1 henzsnndinhidrokloddot, 5 x I0^s nróhl tripszin inhibitort, 0,01 nról/1 EDTA-t ás 6,7 χ 10'' mól/1 nátrium-mttidet használunk.

* A proteoglikánok rodteimmtmolegiar (Rí A) vizsgálata

A teoyészközegbe (CM) felszabadult es a porcsejt agregátumhan (CÁ) található proteoglikánokat P. Gysenés P. Franchimont: 3. í?mii«o«.wy, 5, 221-243 (19S4) szerint mérjük. Az elvégzett R1A vizsgálat analitikai érzékenysége 0,6 ng mérőcsövenkésí.

A változás vizsgálatok közötti és vizsgálaton belüli, koefficiense kisebb, mint 10 %, illetve .20 % a görbe lineáris szakasza menten. Az antitestek csak a fehérjemag antigén determinánsára vonatkoznak. A CM-ben es a C'A-baa mért proteoglikánok összege megfelel a molekula össz termelésének.

* Szulfátoxoit gllkóz-amlno-gttkánok szbfezsse

Ezzel a módszerrel szulfetozoö proteoglikánok termelését vizsgáljak ^?sSO₄ beépítésével. A stroneiumséval kezelt porcsejteket Ka₂ ³‘'SGh jelenlétében tenyésztjük 24 órán keresztül. A sejteket centrifugáíássai elválasztjuk és leőbli'tjűk. A fenyészkozeghen és a sejtekben található gukóz-anrhto-glikáookai: proteáz inhibitorok jelenlétében exlraháljuk.. A 24 órás tenyészídő alatt előállított szálfáiosott glikóz-amino-glikánok mennyiségét a radioaktivitás mérésével határozzuk meg. Az exttaktamok Ezikokénnaí szerkezetét Sepharose CL 2B tölteten végzett krornatografálással vizsgáljuk

Claims (2)

1. * Η típusú Imllagőts radíoímmíusológíai (RÍA) vizsgálata

   A tenyészkőzegbe fetebadalt és a sejtes fázisba» iaUlh&tő II típusú kollagén mennyiségét RJA módszerrel mérjük Y. Henrotín és munkatársi; J. ImnxtxGitssay, Η, 555-57B (199Ö) szerint A kimutatási határ

   3 ngűnérőesó. A változás vizsgálatok közötti és vizsgálaton belüli koefficiense S %, illetve 15 %. Az antitestek az ép molekula hélikns részére vonatkoznak.

   2. teefefeivóöáMjiaraméíer^

   A tenyésztést 1 tömeg?» TS+ adalékanyaggal és 50 pg/ml aszkorháttaí kiegészített DMEM közegben végezzük, A TS-r adalékanyag összetétele; 625 pgónl transzfer!», 6,25 pg/mí szz-lénhun, 1,25 mg/ml borjúszéram albumin és 535 pg linolsav. A proteoglikánokaí és· a 11 típusú kollagént közvetlenül mérjük a proteáz inhibitorokkal kiegészített felülúszóhan, A mérés élőit a sejíagrsgáínmoi ultrahangos disszoclátással (

   3 pulzus 10 másodpercen keresztül) hornogetüzáljuk a proteáz inhibitorokat tartalmazó FBS közegben.

   * A sztremelízín aktivitás mérése

   A kazein bomlásának aktivitását tehéntejből nyert jelölt rezornfln-kazem íBoehringer Maunbesm) segítségével mérjük, Ebben a vizsgálatban a látens szömnshzinf 2 mmól/i ΑΡΜΑ (para^amíno-fenil-lúgany-acetát: Slgma ehetnie, Deinsenhofen, Németország) hozzáadásával akhváljnk. A porcsejtek kondicionált közegét

   4 órán keresztül 37 hőmérsékleten inkofeáljsk, Az aktivált tenyésskőzeget 20 ug jelöli rezenrím-kszein jelenlétében 18 órán kérésziül és 37 fo hőmérsékleten 0,02 mohi kalcunn-klorídot tartalmazó bírált puffer oldatban (0,2 múld írisz-HÖ, pH ~ 7,S) inkubáljuk, Az inkubálás után az enzim reakciót 1 ,ő tőn)eg% teíkíór-ecetsav hozzáadásával megállítjuk, A mintát 15 percen keresztül 7ÖÖÖ g érteken eestnfegáljuk. ilyen körülmények között a hasltallan kazein teljes egészében kicsapódik, és a hasított kazein több mint 95 '%-baa a feMlőszóimt marad, A mesést fluoreszcencia alapján végezzük. A gerjesztési hulfáthhössz 574 ntn, és az emissziós hullámhosss: 584· a.

   A standard görbe felvételéhez az inkubálási növekvő mennyiségű, tisztítói? sztromdrzinneí végezzük. Ezzel párhuzamosan az úikabálás előtt hozzáadott 1Ö mosóid EDTÁ-t tartalmazó mintákat kezesünk hasonló módon, és így kontrol értékei kapunk, amit levonunk az aktív közeggel kapott értékből. A kontrol érték sose haladja meg az aktív közeg fluoreszcenciájának 5 %-át. Az egyes méréseket két párhuzamosban végezzük.

   B) ^í&léSkíÉ

   Az ereduíéuyeket a tenyészkőzegbe szabadult és a sejtes fázisban található proieogíikánok és H típusú kollagén 1 pg DNS-re vottoíkoziaiott arányában fejezzük ki. Meghatározzuk az átlagértéket és a ± standard deviációt, Ás egyes csoportok összehasonlítását nem párosított Stitosní léié teszttel végezzük, ahol a kapott eltérések statisztikailag szlgoiirkáusak p < Ö.ÖS értéknél.

   A következő eredmények különböző koncentrációkban alkalusazott á-jjN.N-dii'karboxi-mcíílj-amiuoj-a-eta5io-4~feífhos.t-metÍl-tiolén-5-karbousav-disironclu5nsó listását mutatják a proieogíikánok ossz termelésére (teuyészkozeg + sejtfázis} 24, 48 és 72 órás tenyésztés ntán.

   * X ·ί 4 * * Λ ♦ » 9 9 X „ « V ♦ * X «* »«« x « » « ». ₊ < X * * .„«*<>»» *Χ 9 *

   Tenyésztési idő j Koncentráció (mól/l) i eg-fig DNS* i Studeat-féle teszt** Ö (kontrol) 1 83,4 * 4,1 i 24 óra I ^lö' | 9,8 ± 3,5 ί NS 5x11T^! 8,5 ±3,4 | NS j io·’ 1 89,7 ± 4,1 1 NS 5 0 (kontrol) 104 ± 7,65 1 48 óra 1 in⁴ 1 Ilid 15,4 I NS ] 5xi0'⁴ 1 123 ± 3,6 | p<0,ÖS ] íc·-⁵ | 136* 12,8 p<0,9S | 0 (kontrol) 120x8,5 1 72 óra i 155x2,51 p<Ö,Ö5 j SxííH 173 ± 3 p<9,05 1 1 176 ± 11,3 I P«M)5

   *·. áílsg X standard deviáció ·**: NS - nem szigejdkásss * Sznlfáínzott glihóz-nndno-glikátsok termelése

   Az ensánsenyek igazolják, a 2-[N,N-di(karbox!-metjl)-asi!noj-3-cíaíto-4-karbnxi-;netil~tioíen~5”karbonsav-dtsóeneiurnsó (A vegyület) proteoglikánok szintézisére gyakorolt hatását, valamint azt a tényt», hogy a stroaeinm-kteid ugyanilyen hatással rendelkezik, Az eredmények arra etatek, hogy a streacium stimulálja a humán pereseteknél a porc-képződést Az eredményeket 24 órás tenyésztés tea kaptuk.

   Hntenyag/koaeeniráctő j c.p.sn./10^!> sejt 1 Studeat-féle teszt kontrol 43 871 ± 1124 A vegyület?' 1Ö'·’ móll J $2 005 x 983 J p<0,05 j SrClXsiO'fetfeVl 1 52 839x489 i p<G,05

   A kétféle sírooehmasóval, és elsősorban az Á vegySleUel kapod kromatográfiás profil nagyobb móltömegő glikóz-ajnino-glikúnok szintézisére tel. A kapod proteogiikánok reáhőateg eloszlását százalékban kifejezve az alábbi íáfelázat -aatatjo.

   ' Kd«U3 | 0,í3<Kd<8»7 Kis mőltómeg Kd>0,7 27 | 42 30 Á vegynlet/lÖ'^s mól/í 68 ί 19 13 SrClj/2slO'^s srsélZl 36 | 36 28

   $ . * Λ _Φ φ , ♦ · <-ν * . .. .* » X V- < *Α .-· V .

   * Λ. Κ típosó kollagén radioinímníielogiai (RIA) vizsgálata

   A. kővetkező embnények igaso'ják. hogy az Λ vegyiket különböző koncentrációban befolyásolja a H típusú ksllagen termelését, arait a 24,48 és 72 órás tenyésztés «ián a tenysszkőzegbe felszabadult kollagén menyayisége alapján mérünk.

   Tenyésztési idő Koncentráció (mői/1) Bg/£«g»NS* Stadeot-féle teszt** 0 {kürtiről} 4,8 ± 0,2 - 24 óra í 1Ö’⁴ 5 ±0,2 NS 5xiÖ'⁴ 5,3 ±0,3 NS 1Ö'³ 5,1 ± 0,4 NS 0 {koníroí} 6,1 ± 0,5 - 48 éra 10⁴ 6,6 ± 0,3 NS 5:x Hl⁴ 7,2 ±0,5 NS IÖ'³ 8,6 ±0,2 p«O,ÖS 0 (kontrol) 6,4 ±0,25 - 172 óra W⁴ 5,9 ± 0,8 NS 5xl0'⁴ 7,4 ± 0,3 p<0,05 | 10'³ i 8,5 ±0,4 p<Ö,Ö5

   *: átlag..!· standard deviáció **'. MS — sem-szignifikáns

   2, Porcfelszívétíásl paraméterek * A sztrmnebzin aktivitás vizsgálata

   A kővetkező eredmények igazolják a 2-[N,N-<ii(karb<íS5-rnet!l)-aíníHo]-3-cmans-4-karbexi-metil-tioférí-é'karbousav-tíssttOncnnosó hatását a szlromelizin tennelésére 24, 4S és 72 órás tenyésztés után.

   Tenyésztési idő j Koncentráció (móléi) ng/pgDMS* Student-féle teszt** ί 0 {kontroli | 0,69 ±0,02; - J 24 óra 1 W⁴ | 0,73 + 0,072 NS I 5x1 Q¹ i 0,72 ±0,026 NS 1 ^R;'^:s | 0,75 ±0,026 NS i 0 (kontrol) 1,43 ±0,025 - | 48 óra | 10'⁴ 1 1,45 ±0,077 NS 1 5χΙ(Γ | 1,48 ±0,07; NS ur | 1,51 + 0,010 NS 1 | 0 (kontrol) | 1,79 + 0,065 -

   & <« * ·: *·*·' '

   72 óm lö'⁴ 1,87 ±0.025 | NS I SxlÖ·⁴ 1,78 + 0,15 | NS ΚΓ 2,65 ±0,10 t p<0,05

   átlag + si&odard deviáció **; NS ~ nem szignifikáas

   50ö mg 2-|N,N-<MOa^3ú-«tól>a«3Í»]-3<iwM4s^xMnetíM}öfea-5-kaibo®»av-djsöwcÍ83Eösá({, vagyis 1 70 rag strQscjumot tartalmazó ubldíát állítunk dő a kévetkezó összetétellel: 2^_sN-4í(kart)ö30^netí.l)rafXHK©3-3-ciaao-4-kartx>si-raeÖ-

   -tíoféH-5-kad>of!sav.djsöroócÍ!misó 500 g Búzakeményrto 1000 g I.akiőz 860 g Magnézium-sztearát 50 g Szilídmmáio síd 26 g Hii-lfoxi-propiTcdiulöz 56 g.

   SZABáDÁIMÍ IGÉNYPONT
2. 2-fN\N-di(:karboxí-met!l)-an3inol”5-i?«í»o-4-karfeoxj-metii-íioféti-5-karfeo»sav distemeiartrsójáíiafc alkat raazáss- ízületi btoaíraak kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógy'szerkészüméríyek: előállítására.

   A meghatalmazott:

   XAd í'; T , Λ

   MaííadaíM és Jogi Iroda Pp

   Scímher László szabadalmi ügyvivő