JPH09512284A - ガラクトシルグリセライド類及びそれを含有する自然起源抽出物の化粧料、医薬更に詳細には皮膚科分野での使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも１つのガラクトシルグリセライド、更に詳細にはジガラクトシルジグリセライド又は自然抽出物の活用に係る使用に関するものであり、当該物は、ネットワークを増強することにより表皮細胞のフィブロネクチンの生成を促進し、更に詳細には皮膚老化効果の措置又は予防のために調製される組成物を形成せしめる化粧料用剤又は医療用剤としての使用に関するものである。本発明は、最も詳細には、上記組成物の抗シワ剤、増強又は治癒剤としての使用に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】ガラクトシルグリセライド類及びそれを含有する自然起源抽出物の化粧料、医薬 更に詳細には皮膚科分野での使用 本発明は、ガラクトシルグリセライド類、更に詳細にはジガラクトシルジグリ セライド類、及び、それらを含有する自然起源抽出物の化粧料、医薬及び特に皮 膚科分野での新規な使用に関する。 更に詳細には、本発明は、表皮細胞フィブロネクチンの生成の増強に適した用 剤としてのガラクトシルグリセライド類の新規な使用に関する。この新規な使用 は、その適用に、更に詳細には、その化粧料又は皮膚科への適用に認められ、更 に詳細には、皮膚強化、治療促進、シワの措置又は予防、及び、通常は、皮膚老 化効果の措置及び予防に適した組成物の調製のための適用に好適である。 イン・ビボにおいては、フィブロネクチンは２つの形態で存在する：溶解型は 、血漿及びその他の生物学的液体中に存在し、非溶解マトリックス型は、緩和結 合組織（loose commective tissues）及び種々の基本的膜（membranes）中に分 布している。フィブロネクチン類は高分子量（４５０，０００）を有し、２つの 類似するサブユニットにより構成されるグリコプロテインである。ＡＤＮｃ配列 の研究によれば、血漿及び細胞のフィブロネクチン類は、初期転写の交差重合に より単一遺伝子を起源とするものであることが証明されている。 フィブロネクチン類の構成に従う当該分子の糖部分は、種々のものを挙げるこ とができる（構成炭化水素としては、シアル酸、ヘキソース類、ヘキソースアミ ン類等である）。オリゴサッカライド鎖類は、高グリコシル化部分と他の糖類を 有しない部分とを有しつつ、当該分子中においてアシメトリックに（asymmetric ally）構成されている。フィブロネクチン類は、ポリクローナル抗体に関する通 常の免疫的性質を有している。フィブロネクチン類はまた、コラーゲン類、フィ ブリン、プロテオグリカン類、サイトスケルトン、バクテリア及び細胞表面の構 成要素とも関連している（“Fibronectin and the rolewhich it plays in cell -matrix interactions,”J．LABAT-Robert， フィブロネクチンは、選択的結合特性の複数のサイトによって複合分子構造を 有していて、“フィブロネクチン類”が絡んでいる複合生物的現象類が当該構造 により起こる(「フィブロネクチン類：複合機能的モジュールグリコプロテイン 類」Richard O Hynes and Kenneth M．Yamada‐Journal of Cell Biology 1982 ，95: 369-377)。当該構造としては、例えば、モルホロジー、サイトスケルトン 構造、腫瘍変態及び食菌作用等である。 細胞表面の結合のサイトは、フィブロネクチン分子の中央部位に位置している 。イン・ビトロ及びイン・ビボ両方の徹底的な研究によって、フィブロネクチン は、細胞の基質への接着へに対応しうるプロテインのプロトタイプであることが 判ったが、フィブロネクチン及びそのレセプターの特質は、多くの細胞の性質： ポーラリティ、移動許容性、分化の状態等をコントロールするものである（「フ ィブロネクチン及びそのレセプター」E．Ruoslahti，Ann．Rev．Biochem，1988 ，57: 375-413）。 細胞の固定の許容量は、トリペプチドによるものとすることができることが判 っている：当該トリペプチドは、Ｌ−アルギニル−グリシル−Ｌ−アスパルチル （ＲＧＤ）で、これを構成するアミノ酸のそれぞれは、リンクに寄与するもので ある（New Perspectives in Cell Adhesion RGD and integrins，E．Ruoslahti; M．Pierschbacher, Science 1987，Vol.238，p 491-497）。 フィブロネクチンのサブユニットは、細胞膜のレセプターと関連するサイト、 ＲＧＤペプチドを認識するインテグリン類（integrins）を有する（Integrins i n human cells and tumors，I．Virtanen，M． Cell Differentiation and Development，1990，32，215-228）。 組織内のすべての細胞は、表皮細胞マトリックスと関連している。上記表皮細 胞マトリックスは、繊維質状の３つの大きな蛋白質：コラーゲン、エラスチン、 及び、フィブロネクチンのような、グリコース アミノグリカンの水素化ゲルと複合している構造のグリコプロテインにより構成 されている。 表皮細胞マトリックスの高分子は、細胞の行動に対して注目すべき効果を有し 、細胞の形状、移動、メタボリズム及び分化に影響を与える。 これらの細胞マトリックス相互作用は、老化と変態病理状態との間においてこ れらの分子の機能及び構造に対する変化により修飾されうるものである。これら は、プロテオリティック（proteolytic）活性を有するフラグメントの存在によ り阻害さうる。これはフィブロネクチンによる場合であり、当該フィブロネクチ ンは炎症過程において幾つかのフラグメントに分解される。従って、上記フラグ メントはそれ自身のプロテイオリティック活性を経ることとなり、それは健全な 分子には欠けているものである（Potential proteolytic activity of fibronec tin：fibronectin laminase and its substrate specificity，I．Emod，P．Laf aye，T．Planchenault，S．Lambert-Vidman，J．M．Imhoff and V．Keil-Dlouha ，Biol．Chem．Hoppe-Seyler 1990，371，129-135）。 すべての組織及び器官の表皮細胞マトリックスの組成物は、老化機能として継 続的に変化することが判っている。組織における当該組成物は、それらの構成物 の崩壊に従ってなされる合成の速度に従うものである。細胞−マトリックス相互 作用は、これらの現象のキー・ルールを演じる化学構造上のグリコプロテイン類 に対して、結合組織の老化の間に大きな重要性を持つものであるようである。皮 膚（skin(dermis)）の老化は、フィブロブラスト類及びコラーゲンの間の結合力 の減少に関連している。老化の間、構造物の修飾は、コラーゲンＩ及びIIIの質 的及び／又は量的変化によって行われることはない。むしろ、イン・ビトロにお いて、表皮細胞繊維のフィブロネクチンは老化に伴って希薄になってゆく（Skin Aging-a study in the immunofluorescence of collagens I and III and fibr onectin，M．TH．Pieraggi，M．Julian，H．Bouissou，S．Stocker，J．A．Grim aud- Ann．Pathol．1984，4 No.3，185-194）。 しかし、老化に伴うフィブロネクチンの生合成の増加についても報告がなされ ていて（Ladislas Robert，“Aging．From the man to the cell”，1994，Beli n，Paris，p126）、多くの他の発表もあり、特にベルマード・ジャーン（Bermar d Djian“The filling of wrinkles”， S．A.，Paris，p40-41）は、表皮細胞フィブロネクチンが皮膚老化の間に希薄に なることを、明らかに示している。しかしながら、このグリコプロテインは、皮 膚においては格別多く存在しており、特に若い人の皮膚には多く存在しており、 細胞同士の接合、細胞とコラーゲンとの間の接合における基本的ルールを演じる ものであり、それにより、次に、良好な状態での表皮細胞フィブロネクチンネッ トワークが有益に起こるようになる。 ガラクトリピッド類はまた、動物と植物の両方の生きている生物の基本的構成 物の間に含有されているものである。高等生物において、それは全体として器官 の中に存在しており、主として細胞膜の構成物として存在している。植物におい て、それは更に詳細には、葉緑体外皮中に局在している。極めて多くの発表がな され、それらは、例えば以下のようである。 −“Comparative study of the immunological properties of galactosylipid and galactosylceramide included within natural membranes”，DUPOUEY P．a l.，Immunochemistry(1976)13，p289-294. −“Plant galactolipids”DOUCE R，and JOYARD J.，in“The biochemistry of plants”，Stumpf P．K．(Editor)，Academic Press，New York-USA（1980）Vo lume 4，p321-362． −“Localisation of galactolipid: galactolipid galactosyltransferase and acyltransferase in outer envelope membrane of spinach chloroplasts”，H EEMSKERK J．W．M.，et al．Biochimica et biophsica acta，(1986) 877(2)，p 281-289． −“Lipids: structure and function”，Stumpf P．K．(Editor)， (1987)vol.9，ISBN 0-12-675409.8，“The biochemistry of plants”． ガラクトリピッドは、更に詳細にはガラクトシルグリセライド類により構成さ れており、それはよく知られていて、植物、例えば穀物から抽出することができ るものである。 かくして、コムギ粉中に含有されている異種のガラクトシルグリセライド類か らクロマトグラフィにより単離するテクニックも開示されている（J．A．Prieto ，A．Ebri and C．Collar，“Optimized Separation of Nonpolar and Polar Li pid Classes from Wheat Flour by Solid-Phase Extraction“(J．Amer．Org．C hem．Soc.，（1992）69，No.4，387-391）。 同じ発表者の他の文献には、コムギ粉中に含有される主要ガラクトリピッド類 の組成と分布が開示されている（“Composition and Distribution of Individu al Molecular Species of Major Glycolipids in Wheat Flour”，J．Amer．Org ．Chem．Soc.，(1992)，69，No.10，1019-1022）。 これらの取得物、更に詳細には、ジガラクトシルジグリセライド類（ＤＧＤＧ ）は、種々の分野で使用されている。以下は特に引用されるであろう文献である 。 −PCT Application WO 88.08253． ＤＧＤＧのチョコレートの粘度を減少させ るための使用が開示されている。 −Japanese Patent Application JP-A2-0503750． 当該取得物のコムギ粉起源 の取得物の品質改善のための使用が開示されている。 −Japanese Patent Application JP-A2-0325156． 当該取得物の消毒剤として の使用が開示されている。 −European Patent Application EP-A-0249561．抗炎症剤を含有するリポソーム 及びグリコリピッド類、更に詳細にはジガラクトシルジグリセライドを含有する ガラクトリピッド類が開示されている。 −European Patent Application EP-A-0009842．ジガラクトシルジグリセライド を含有するリポソーム及びレクチン類及びその医薬の調節された徐放のための使 用が開示されている。 本出願人は、ここに、ガラクトシルグリセライド類及びそれを含有する自然起 源の抽出物、更に詳細にはそれを含有する植物抽出物は、ヒトフィブロブラスト によって、表皮細胞のフィブロネクチンの生成に効果的に作用すること、かくし て、表皮細胞フィブロネクチンネットワークを活性化することを発見した。 この発見の結果、本出願人は、ガラクトシルジグリセライド類、更に詳細には ＤＧＤＧを含有する組成物の効果のテストとチェックを行ったが、それは、結合 組織の又は皮膚の生化学的性質を強化する目的の種々の試験のためのものであり 、例えば、皮膚老化効果の措置及び／又は改善のためのものであった。 従って、本発明は、ガラクトシルグリセライド類に関するものであり、更に詳 細にはジガラクトシルジグリセライド類に関するものであり、そして更に詳細に はこれら取得物を含有する植物抽出物に関するものであり、それらは化粧料用又 は医薬用、更に詳細には皮膚科用剤のためのものであって、その目的は、表皮細 胞フィブロネクチンネットワークの高密度化である。 このような効果は、更に詳細には皮膚老化効果、そして更に詳細にはシワの外 観又は皮膚のタワミを抑制することであるが、よく知られていることは、外観変 化及び皮膚の機能的性質についての上記のすべては、主としてその一部がフィブ ロネクチンにより構成されている皮膚構成の修飾によるものであり、なかでも、 細胞とコラーゲンとの間の結合を確保するものである。 従って、本発明の主目的は、皮膚老化効果、更に詳細にはシワの外観及び皮膚 のタルミに対する措置又は予防への良好な効果を有する化粧料用又は医薬用、更 に詳細には皮膚科用組成物を提供するという技術的問題点を解決することである 。 従って、本発明は、少なくとも１つのガラクトシルジグリセライド又はこれを 含有する自然起源の抽出物の、フィブロブラストによる表皮細胞フィブロネクチ ンの形成を活性化する化粧料用剤としての使用に関するものであって、皮膚治療 の改善、皮膚又は結合組織の生物機 能的性質の強化、皮膚表面の外観の改善、更に詳細にはシワ又は皮膚維持組織の タルミのような皮膚老化効果の措置又は予防を得るものである。 従って、これらの主要特性の一つによれば、本発明は、少なくとも一つのガラ クトシルグリセライド又はこれを含有する自然起源の抽出物の、化粧料用剤とし ての使用に関するものであって、当該化粧料用剤は、皮膚治療の改善、皮膚の生 物機能的性質の強化、皮膚表面の外観の改善、又は、シワ又は皮膚維持組織の欠 損等の皮膚老化効果に対する措置又は予防に寄与するものである。皮膚の生物機 能的性質の改善は、皮膚の構造的品質の生物学的起源の改善を意味しようとする ものである。表皮細胞フィブロネクチンネットワークの強化は、コラーゲン等の 細胞内高分子と細胞との接合の改善を促すことは事実である。 従って、本発明による使用は更に詳細には皮膚強化をもたらし、そしてまた、 シワの外観の改善とシワの深さの減少をもたらす。 第一の好ましい形態においては、上記自然起源の抽出物は、植物抽出物であり 、更に詳細にはコムギ又はオオムギ等の穀物の抽出物であり、又は、ギンクゴ・ ビロバ（Ginkgo Biloba）の葉又は実の抽出物である。 本発明に使用されうるガラクトシルグリセライド類は、更に詳細にはモノガラ クトシルモノグリセライド類（ＭＧＭＧ）であり、モノガラクトシルジグリセラ イド類（ＭＧＤＧ）であり、ジガラクトシルモノグリセライド類（ＤＧＭＧ）で あり、ジガラクトシルジグリセライド類（ＤＧＤＧ）である。モノ−又はジガラ クトシルジグリセライド類は、より好ましいものである。 本発明の特に好ましい形態においては、ガラクトシルグリセライド類は、以下 の式（Ｉ）の構造を有するものである。 式中、 −Ｇａｌは、ガラクトピラノシル基、好ましくは、ベーターＤ−ガラクトピラノ シル基を表す。 −Ｒ₁は、下記の構造を有するアシル基を表す。 式中、Ｒは、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖、好ましくは直鎖状であり、９ 〜２９の炭素数を有するものを表す。 −Ｒ₂は、水素原子、又は、下記の構造のＲ₁と同一又は異なって、アシル基を表 す。 式中、Ｒは、前記と同じ。 −Ａは、下記を表す。： −単結合、又は、 −アルファ−又はベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル基、又は、 −多くの糖類、好ましくは、アルファ−及びベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル 、アルファ−Ｄ−グルコピラノシル、及び、アルファ−Ｄ−及びアルファ−Ｌ− マノピラノシルからなる群より選択された２つ又は３つの糖類により構成された 鎖。 本発明の今一つの好ましい形態においては、ガラクトシルグリセライドは、上 記式（Ｉ）の構造のモノ−又はジガラクトシルジグリセライド（それぞれＭＧＤ Ｇ及びＤＧＤＧ）であって、式中、 −Ｇａｌ、Ｒ₁及びＲ₂は前記と同じで、Ｒ₂はアシル基を表す場合を除くもので あり、 −Ａは、単結合、又は、アルファ−又はベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル基を表 すものである。 好ましくは、上記ガラクトシルジグリセライドは、ジガラクトシルジグリセラ イド（ＤＧＤＧ）−、即ち、Ａがアルファ−又はベータ−Ｄ−ガラクトピラノシ ル基を表す取得物から選択されるものである。 特に好ましくは、より有利な形態のそれぞれのために、ガラクトシ ルグリセライド類は、以下のものから選択されうる。 −Ｒ₁は、下記の構造を有するアシル基を表す。 式中、Ｒは、炭素数１５、１７又は１９の直鎖状脂肪族炭化水素鎖であって、 飽和されているか又は１〜５個の二重結合で構成され、７位、１０位、及び／又 は、１３位は炭素数１６のアシル基のために、９位、１２位、及び／又は、１５ 位は炭素数１８のアシル基のために、そして、５位、８位、１０位、１４位、及 び／又は、１７位は炭素数２０のアシル基のためにあるものである。 −Ｒ₂は、水素原子、又は、下記の構造のＲ₁と同一又は異なって、アシル基を表 す。 式中、Ｒは、前記と同じ。 上記形態の今一つによれば、本発明はまた、化粧料用措置方法、更に詳細には 表皮細胞フィブロネクチンのフィブロブラストによる皮膚の生物機能的性質の強 化に関連するものであり、皮膚強化又は皮膚表面の改善又はシワの外観等の皮膚 老化効果の措置又は予防のためのものであり、皮膚の部位への局所的投与に係る 少なくとも一つのガラクトシルグリセライド又はこれを含有する植物抽出物を含 有する組成物に関するものである。 上記化粧方法の効果的投与方法によれば、好ましくは、ガラクトシルグリセラ イドは、上記式（Ｉ）の構造を有するガラクトシルグリセライド類から選択され うるものであり、好ましい取得物は、上記に記載された構造を有するものである 。 そして更に詳細には、ジガラクトシルジグリセライド類が選択されうる。 これらのジガラクトシルジグリセライド類は、多くの文献に開示されていて、 更に詳細には、ここに引例として記載されている以下の文 献である。US Patent 4,377,567、又は、D．V．Myhre，Canadian Journal of Ch emistry（1968）46，3071-3077。 ガラクトシルグリセライド類は、合成により又は動物組織、更に詳細には脳又 は脊椎骨髄からの、又は、植物、更に詳細には穀物類からの、文献記載の公知の 方法による抽出により取得することができる。 これについては、D．V．Myhre(1968)の上記文献、また、以下の文献に記載さ れている。J．A．Prieto et al．（J．Amer．Org．Chem．Soc．（1992）69，（4 ）387-391）、G．G．Shipley et al．（Biochimica et biophysica acta（1973 ）311，531-544），P．Dupouey et al．（Immunochemistry（1976）13，289-294 ），Haru Kameyama et al．（J．Amer．Oil Chem．Soc．（1979）56，549-51） 。これらの文献は引例としてここに記載される。特にガラクトシルグリセライド 類として、更に詳細にはＭＧＤＧ又はＤＧＤＧはまた、市販され入手可能で、SI GMA．Chem．Co.(Saint-Louis; Mo，USAから入手できる。 本発明の効果を得ることができるガラクトシルグリセライド類を含有する自然 起源の抽出物は、当業者によく知られた抽出手順によって取得することができる 。ここに用いる抽出溶媒は、好ましくは、アルコール、エーテル又はハロゲン化 炭化水素等の極性溶媒がよい。これらのものとしては、例えば、メタノール、エ タノール、イソプロパノール、エチルエーテル又はクロロホルム等を挙げること ができる。 本発明のいま一つの形態においては、上記ガラクトシルグリセライド類及び更 に詳細にはジガラクトシルジグリセライド類並びにそれらを含有する自然抽出物 は、表皮細胞フィブロネクチンの合成を強化するのに適した医薬用更に詳細には 皮膚科用組成物における活性剤として使用されることができる。 本発明の他の形態は、少なくとも１つのガラクトシルグリセライド又はこれを 含有する自然起源の抽出物の活性部分の使用であって、関連組織、更に詳細には 皮膚中における表皮細胞フィブロネクチンネットワークの強化における分化に関 連する変異病理の措置又は予防、皮膚の生化学的特性の改善、老化更に詳細には 皮膚老化効果の措置又は 予防、治癒促進、又は、皮膚強化獲得、に適した、医薬用更に詳細には皮膚科用 組成物のための使用に関する。 本発明は、特に詳細には、少なくとも１つのガラクトシルグリセライドの活性 部分の使用に関し、例えば上述したようなものであり、更に詳細にはジガラクト シルジグリセライドを、上記した用途のための組成物の調製のために用いること に関する。 ガラクトシルグリセライド類は、好ましくは、前記式（Ｉ）の群の中から選択 され、更に詳細には前述したもの中から選択される。 上記本発明のいま一つの形態においては、上記活性部分は、上記したような動 物又は植物起源の自然抽出物である。より好ましくは、植物抽出物であり、更に 詳細にはコムギ又はオオムギ等の穀物類の抽出物、ギンクゴ・ビロバ（Ginkgo B iloba）の葉又は実の抽出物であろう。 本出願人が行った試験によれば、ガラクトシルグリセライド類の効果が認めら れ、特に、表皮細胞フィブロネクチンの合成に対するジガラクトシルジグリセラ イドの効果が認められたが、当該フィブロネクチンネットワークは、これらの生 成物により増幅されうるものである。この知見に基づいて、本出願人は、結合組 織中、更に詳細には皮膚維持組織中での表皮細胞フィブロネクチンネットワーク の濃度を増加させうる作用を有する本発明の組成物の使用に至ったものである。 従って、本発明の組成物は、特に、皮膚強化、治癒過程の改善又は促進、シワ の外観の予防又はその措置、並びに通常は皮膚老化効果の措置又は予防に適した ものである。 従ってまた、本発明の組成物は、更に詳細にはシワの深さの減少、更に詳細に は顔及び首におけるシワの深さの減少に使用しうるものである。 これらはまた、改善される皮膚の生物機能的特性を可能とし、老化効果、更に 詳細には皮膚の老化効果の措置又は予防、同時に治癒促進又は皮膚強化獲得をも 改善する。 上述の形態のそれぞれにおいては、好ましくは、ガラクトシルグリ セライドの濃度は、これらを含有する組成物全体の０．００１〜１０重量％で用 いられうる。 この濃度は好ましくは、これらを含有する組成物全体の０．０１〜５重量％が 良い。 特に好ましい使用形態は、少なくとも１つのガラクトシルグリセライドを含有 する植物抽出物から調製されるものであり、更に詳細にはコムギ又はオオムギ等 の穀物類である。これらの取得物は、市販されている。市販取得物の例としては 、ＤＧＤＧ及びＭＧＤＧを含有する市販品は以下から入手可能である。SIGMA Ch emical Company（Saint-Louis，Mo，USA）。 本発明の基本構造においては、上述の形態のそれぞれに従って、ガラクトシル グリセライド類特に、モノ−又はジガラクトシルジグリセライド類又はこれらを 含有する植物抽出物は、公知の方法により投与され、表皮細胞フィブロネクチン の合成を活性化する。通常、最も単純な方法によれば、当該投与は局所投与であ り、それは、更に詳細には、特に顔又は首におけるシワの外観の措置又は予防の ため、又は、皮膚強化のため、皮膚維持組織の生物機能的特性の復元又は復活を 目的とするときである。 従って、本発明の組成物は、当業者によく知られたテクニックに従って構成さ れるであろうし、居所投与の適切な方法は、例えば、クリーム、ミルク又はロー ションの形であり、ゲル又はポマードの形状であってもなくてもよい。 本発明の好ましい形態においては、ガラクトシルグリセライド又はそれを含有 する抽出物は、化粧料的に又は医薬的に更に詳細には皮膚科的に許容しうる賦形 剤、基剤又は支持体の中に含有される。当該支持体は、当業者間に公知であり、 化粧料組成物又は医薬組成物更に詳細には以下に開示する通常の範囲内の皮膚科 用組成物の例からも同様のことが言える。 本発明の他の目的、形態、有利性は、以下の詳細な記述から明らかにされ、多 くの事例がすべてイラストレーションによって開示される が、本発明の範囲を限定するものではない。 図１〜４は、実施例１の全体の形であって、それぞれ下記するものに基づく表 皮細胞フィブロネクチンネットワークのフルオレッセンスマイクロスコープ試験 で得られた写真のコピーである。 −図１：２０歳のヒトから得られたコントロール細胞； −図２：ＤＧＤＧで処理した図１と同じ細胞； −図３：４６歳のヒトから得られたコントロール細胞； −図４：ＤＧＤＧで処理した図３と同じ細胞； 実施例中における「％」は、特に断りのないかぎり、重量％を意味する。抽出 物の量は、乾燥重量から求められるものである。実施例 実施例１：ＤＧＤＧ存在下における表皮細胞フィブロネクチンの合成の増加の実 験 Ａ−実験方法 フィブロネクチンの免疫学的操作は、抗体とその抗原との選択的結合という一 般的方法による通常の実験であった。その手法は、間接イミュノ−ラベリング法 により実行された。 まず最初の段階で、ウサギ起源の抗フィブロネクチン抗体が細胞層と結合され るために用いられた。 第二段階で、当該選択的抗体の抗原への結合により形成された複合体に、フル オロクロムとカップリングされたウサギＩｇＧｓと結合されたグロブリンを添加 され、この場合、Ｒはフィコエリスリンを表すこととなる。 Ｂ−使用物 抗体は以下のものであった： １．ヒト抗フィブロネクチン用のウサギ抗体（BTI Ref．BT441 P） ２．フィコエリスリンでラベルされたウサギ（Ｇ＋Ｌ）抗イミュノグロブリン 用のヒツジ抗体Ｆ（ａｂ′）２（TAGO ref 4920） ・培養 使用された細胞は、ヒト健康成人からの腹腔又は乳房の生検により得られたフ ィブロブラストであった。 この細胞は、ガラスストリップに蒔かれ、散布後２４時間メディウムはＤＧＤ Ｇの存在下又は不存在下に置かれた。初期培養メディウムは、ＭＥＭ＋１０％ウ シ胎児血清（ＦＣＳ）であった。処理段階の間は、このメディウムは、ＭＥＭ＋ ２．５％ウシ胎児血清の状態にあった。ＤＧＤＧはＤＭＳＯに溶解させ、最終濃 度７５０μｇ／ｍｌで培養に使用された。 培養実施手順は以下のとおりであった： Ｏｎ Ｄａｙ Ｄ＝０：ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ血清での散布 Ｏｎ Ｄａｙ Ｄ＋２：ＭＥＭ＋２．５％ＦＣＳ血清での７５０μｇ／ｍｌＤＧ ＤＧ措置 Ｏｎ Ｄａｙ Ｄ＋４：同じ措置 Ｏｎ Ｄａｙ Ｄ＋６：同じ措置 Ｏｎ Ｄａｙ Ｄ＋８：細胞の固定化 ・固定化 ストリップのＰＢＳ緩衝液による洗浄が行われた後、細胞はパラホルムアルデ ヒド（ＰＢＳ中、３．７％）中で４℃で２０分間処理して固定化した。 ・免疫学的反応 ＰＢＳリン酸緩衝液により２度洗浄されたストリップはその後、ＰＡＢ緩衝液 （０．２％ウシアルブミン血清（ＢＡＳ）が添加されたＰＢＳ）中に入れ、抗フ ィブロネクチン抗体（ＰＡＢ中で１／２５０に希釈されたもの）が、４℃、６０ 分間で細胞結合に供された。 この操作の後、緩衝液（ＰＡＢ）中に移されて、同じ緩衝液中において１５分 間で２回浸された。 第二の反応は、フルオレッセント配合体（ＰＡＢで１／５００に希釈されたも の）を添加され、室温で４５分間で実行された。細胞はその後再びＰＢＳで洗浄 された。 ・測定 それぞれのストリップはその後乾燥され、プレート（ＰＢＳ中３３％のグリセ ロール含有メディウムを塗布）上に載せられた。 測定は、フルオレッセンスマイクロスコープ（OLYMPUS BH2）を使用して実行 された。 ・結果 この方法は種々の年齢（１７、２０、４６及び４７歳）のヒトからのフィブロ ブラストに適用され、移植数（３〜８継代）の増加を伴うものであった。 ２０歳のヒトに関する図１及び図２の実験、４６歳のヒトに関する図３及び図 ４の実験は、表皮細胞フィブロネクチンネットワークの外観が、ＤＧＤＧの存在 により極めて変化していることを示していた。それは、基質の存在下において増 幅され、繊維への分布及びその構成は異なっていた。 −コントロール細胞（図１及び図２）における表皮細胞フィブロネクチンのイミ ュノフルオレッセンスの検出により、各局所で局在するフィラメントの会合の存 在が明らかになったが、細胞の縦軸と相互の平行性に適合していた。 繊維は明瞭に適応していた。当該細胞内の繊維の凝集は、妨害分離明瞭繊維の 存在により明瞭になっていた。 −ＤＧＤＧ処理（図２及び図４）は、極めて高いフィラメント深さを示していた 。 −繊維は相互に関連していて、織りまぜられていた。それらはあたかも渦巻のよ うに見え、細胞外郭は識別できなかった。 −繊維は、それぞれ“レース”又は“糸カセ”状のクロス−ネット中に重ねられ ているように見えた。 若い検体（１７〜２０歳の年齢）起源の培養中のフィブロネクチンは、年上検 体（４６〜４７歳の年齢）の場合に比較してより崩れた繊維形状のように見えた 。 この実験により、ＤＧＤＧは、検体の年齢が何であっても、表皮細胞フィブロ ネクチンのフィブロブラストによる明瞭な増加をもたらすことが判った。 状況は、４６歳の検体において、基本的ネットワークが同様であるという事実 から、より注目に値するようであった（写真参照）。 もし細胞がＤＧＤＧの存在下に極めて早く培養された場合には（ガラスストリ ップ上に散布される前において）、結果は異なり、フィラメントの濃度は、３継 続処理後と同じように見えた。実施例２：フィブロブラストの接合能力の増加へのジガラクトシルジグリセライ ドの活性の実験 この実験の目的は、ＤＧＤＧ処理通常人フィブロブラストの接合能力の刺激を 証明することであった。 このため、培養中上記細胞のプラスチック支持体への接合速度が測定された。 通常人フィブロブラストの培養物が、上記実施例１と同様にして得られ、７５ ｍｌフラスコ中で実行された。細胞は通常の方法で１０％ウシ胎児血清添加ＭＥ Ｍメディウム中で培養され、ＤＧＤＧ（SIGMA）が７５０μｇ／ｍｌの濃度で添 加された。培養は１週間継続され、その間、同じＤＧＤＧ濃度によりそれぞれの 時間に培養メディウムは２回更新された。 そして、細胞表層はリン酸ＰＢＳ緩衝液により洗浄され、ＥＤＴＡ（エチレン ジアミンテトラアセティックアシッド）の２ｍＭ溶液の30分間の添加により分別 された。 遠心分離後、細胞は通常メディウム（１０％ウシ胎児血清添加ＭＥ Ｍ）中に再懸濁された。 フィブロブラストの接合能力測定のため、メディウム（約３ｍｌ）中へ懸濁さ れた３×１０⁵個の細胞は、径が６０ｍｍのプラスチック培養ボックス中に入れ られた。当該ボックス内への添加がなされた後、１５、２０及び３５分において 、表面浮遊物質のすべてを除去して、ＺＭ ＣＯＵＬＴＲＯＮＩＣＳ細胞カウン ターにより、支持体ボックスの壁に接合して残っている細胞数を計測することに より、懸濁液中の残存細胞数を測定した。それぞれ３回の計測を行った。ＤＧＤ Ｇを含有しない培養メディウムを除く同じ条件下での１週間の培養による同じ起 源の対応するコンロールフィブロブラストと比較することにより、結果を求めた 。壁に接合している細胞の％は、時間係数としてコントロール試験と比較するこ とにより計算された。結果は以下の表１に示した。 この結果から、ＤＧＤＧがフィブロブラストの接合メカニズムに極めて重要な 能動的役割を演じていることが極めて明白である。この測定は、表皮細胞フィブ ロネクチンネットワークの増加に関する実施例１の測定と同じ示唆をもたらして おり、フィブロネクチンがコラーゲンのようなプロテイン及び皮膚の細胞同士と の接合に関与しているという公知事実と合致している。実施例３：生成物の治癒効果 コラーゲン２重量％とＤＧＤＧ１重量％を含有する安定な分散液を 作成した。 ホモジナイズした後、サイズが２０ｎｍ以下のリポソームで分散液を観察した 。 分散液は、Carbopol 940の０．２重量％を添加してゲル化して防腐剤を添加し た。実施例４：生成物の抗シワ効果 以下を含有する安定な乳化液を作成した。 ・ＤＧＤＧの２重量％ ・カプリリック−カプリック トリグリセライド（Miglyol 812）の１８重量 ％ ・水８０％＋通常の防腐剤 以下の手法により実施した。 ＤＧＤＧは油中に溶解し、全体を７５℃に加温した。別に、防腐剤含有水を７ ５℃に加温した。油層に水の一部を入れてゆき、すべてを水層の残部に７５℃で マグネチックスターラーにより加えていった。乳化液は、マグネチックスターラ ーで回転しながら８０℃に加温し、そして、Ultra-Turaxを用いて１１０００ｒ ｐｍで５分間ホモジナイズした。その後氷水浴中に入れて急冷して構造固化した 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/78 9159−4Ｃ Ａ６１Ｋ 35/78 Ｕ 9159−4Ｃ Ｃ (72)発明者 レードヂニアック ジェラール フランス国 サンシール アン ヴァル 45590 20 アレー ド ロルム

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 少なくとも１つのガラクトシルグリセライド又はこれを含有する自然起源 の抽出物の使用であって、皮膚治療の改善、皮膚の生物化学的特性の強化、皮膚 の表面の外観の改善、シワ等の皮膚老化効果の措置及び予防、又は、皮膚の維持 組織の緩和に役立つ化粧料用剤としての使用。 ２． 前記化粧料用剤は、皮膚強化、シワの外観の改善、又は、その深さの緩和 を得るのに適したものである請求の範囲第１項記載の使用。 ３． 前記自然起源の抽出物は、植物抽出物、更に詳細にはコムギ、オオムギ等 の穀物抽出物、又は、ギンクゴ・ビロバ（Ginkgo Biloba）の葉又は実である請 求の範囲第１項又は第２項記載の使用。 ４． 前記植物抽出物は、極性溶媒を用いる抽出により得られるものである請求 の範囲第３項記載の使用。 ５． 前記極性溶媒は、アルコール、更に詳細にはメタノール、エタノール又は イソプロパノール、エーテル、更に詳細にはエチルエーテル、又は、ハロゲン化 炭化水素、更に詳細にはクロロホルムである請求の範囲第４項記載の使用。 ６． 前記ガラクトシルグリセライドは、下記式（Ｉ）の構造を有するものであ る請求の範囲第１〜６項のいずれか記載の使用。 式中、 −Ｇａｌは、ガラクトピラノシル基、好ましくは、ベータ−Ｄ−ガラ クトピラノシル基を表す。 −Ｒ₁は、下記の構造を有するアシル基を表す。 式中、Ｒは、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖、好ましくは直鎖状であり、９ 〜２９の炭素数を有するものを表す。 −Ｒ₂は、水素原子、又は、下記の構造のＲ₁と同一又は異なって、アシル基を表 す。 式中、Ｒは、前記と同じ。 −Ａは、下記を表す。： −単結合、又は、 −アルファ−又はベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル基、又は、 −多くの糖類、好ましくは、アルファー及びベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル 、アルファ−Ｄ−グルコピラノシル、及び、アルファ−Ｄ−及びアルファ−Ｌ− マノピラノシルからなる群より選択された２つ又は３つの糖類により構成された 鎖 ７． 前記ガラクトシルグリセライドは、式（Ｉ）の構造を有するモノガラクト シルジグリセライド（ＭＧＤＧ）、又は、ジガラクトシルジグリセライド（ＤＧ ＤＧ）である請求の範囲第６項記載の使用。 −式中、 −Ｇａｌは、ガラクトピラノシル基、好ましくは、ベータ−Ｄ−ガラクトピラノ シル基を表す。 −Ｒ₁は、下記の構造を有するアシル基を表す。 式中、Ｒは、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖、好ましくは直鎖状であり、９ 〜２９の炭素数を有するものを表す。 −Ｒ₂は、下記の構造のＲ₁と同一又は異なって、アシル基を表す。 式中、Ｒは、前記と同じ。 −Ａは、下記を表す。： −単結合、又は、 −アルファ−又はベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル基。 ８． 前記ジガラクトシルグリセライドは、式（Ｉ）の構造を有するジガラクト シルジグリセライド（ＤＧＤＧ）である請求の範囲第７項記載の使用。 式中、 −Ｇａｌは、ガラクトピラノシル基、好ましくは、ベータ−Ｄ−ガラクトピラノ シル基を表す。 −Ｒ₁は、下記の構造を有するアシル基を表す。 式中、Ｒは、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖、好ましくは直鎖状であり、９ 〜２９の炭素数を有するものを表す。 −Ｒ₂は、下記の構造のＲ₁と同一又は異なって、アシル基を表す。 式中、Ｒは、前記と同じ。 −Ａは、アルファ−又はベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル基を表す。 ９． 前記ガラクトシルグリセライドは、請求の範囲７記載の式（Ｉ）の構造に 相当するものである請求の範囲第６〜８項のいずれか記載の使用。 式中、 −Ｒ₁は、下記の構造を有するアシル基を表す。 式中、Ｒは、炭素数１５、１７又は１９の直鎖状脂肪族炭化水素鎖であって、 飽和されているか又は１〜５個の二重結合で構成され、７位、１０位、及び／又 は、１３位は炭素数１６のアシル基のために、９位、１２位、及び／又は、１５ 位は炭素数１８のアシル基のために、そして、５位、８位、１０位、１４位、及 び／又は、１７位は炭素数２０のアシル基のためにあるものである。 −Ｒ₂は、水素原子、又は、下記の構造のＲ₁と同一又は異なって、アシル基を表 す。 式中、Ｒは、前記と同じ。 １０．前記ガラクトシルグリセライド又はこれを含有する自然起源の抽出物は、 組成物全体量に対して０．００１〜１０重量％の濃度で、好ましくは、０．０１ 〜５重量％の濃度で組成物中に存在するものである請求の範囲第１〜９項のいず れか記載の使用。 １１．少なくとも１つのガラクトシルグリセライド又はこれを含有する自然起源 の抽出物の活性部分の使用であって、関連組織、更に詳細には皮膚中における表 皮細胞フィブロネクチンネットワークの強化における分化に関連する変異病理の 措置又は予防、皮膚の生化学的特性の改善、老化更に詳細には皮膚老化効果の措 置又は予防、治癒促進、又は、皮膚強化獲得、に適した、医薬更に詳細には皮膚 科用組成物のための使用。 １２．前記自然起源の抽出物は、植物抽出物更に詳細にはコムギ又はオオムギ等 の穀物抽出物、又は、ギンクゴ・ビロバ（Ginkgo Biloba）の葉又は実である請 求の範囲第１１項記載の使用。 １３．前記植物抽出物は、極性溶媒を用いた抽出により得られるものである請求 の範囲第１２項記載の使用。 １４．前記極性溶媒は、アルコール、更に詳細にはメタノール、エタノール又は イソプロパノール、エーテル、更に詳細にはエチルエーテル、又は、ハロゲン化 炭化水素、更に詳細にはクロロホルムである請求の範囲第１３項記載の使用。 １５．前記ガラクトシルグリセライドは、下記式（Ｉ）の構造を有するガラクト シルジグリセライドである請求の範囲第１１〜１４項のいずれか記載の使用。 式中、 −Ｇａｌは、ガラクトピラノシル基、好ましくは、ベータ−Ｄ−ガラクトピラノ シル基を表す。 −Ｒ₁は、下記の構造を有するアシル基を表す。 式中、Ｒは、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖、好ましくは直鎖状であり、９ 〜２９の炭素数を有するものを表す。 −Ｒ₂は、水素原子、又は、下記の構造のＲ₁と同一又は異なって、アシル基を表 す。 式中、Ｒは、前記と同じ。 −Ａは、下記を表す。： −単結合、又は、 −アルファ−又はベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル基、又は、 −多くの糖類、好ましくは、アルファ−及びベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル 、アルファ−Ｄ−グルコピラノシル、及び、アルファ−Ｄ−及びアルファ−Ｌ− マノピラノシルからなる群より選択された２つ又は３つの糖類により構成された 鎖。 １６．前記ガラクトシルグリセライドは、式（Ｉ）の構造を有するモノガラクト シルジグリセライド（ＭＧＤＧ）、又は、ジガラクトシルジグリセライド（ＤＧ ＤＧ）である請求の範囲第１５項記載の使用。 −式中、 −Ｇａｌは、ガラクトピラノシル基、好ましくは、ベータ−Ｄ−ガラクトピラノ シル基を表す。 −Ｒ₁は、下記の構造を有するアシル基を表す。 式中、Ｒは、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖、好ましくは直鎖状であり、９ 〜２９の炭素数を有するものを表す。 −Ｒ₂は、下記の構造のＲ₁と同一又は異なって、アシル基を表す。 式中、Ｒは、前記と同じ。 −Ａは、下記を表す。： −単結合、又は、 −アルファ−又はベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル基。 １７．前記ジガラクトシルグリセライドは、式（Ｉ）の構造を有するジガラクト シルジグリセライド（ＤＧＤＧ）である請求の範囲第１６項記載の使用。 式中、 −Ｇａｌは、ガラクトピラノシル基、好ましくは、ベータ−Ｄ−ガラ クトピラノシル基を表す。 −Ｒ₁は、下記の構造を有するアシル基を表す。 式中、Ｒは、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖、好ましくは直鎖状であり、９ 〜２９の炭素数を有するものを表す。 −Ｒ₂は、下記の構造のＲ₁と同一又は異なって、アシル基を表す。 式中、Ｒは、前記と同じ。 −Ａは、アルファ−又はベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル基を表す。 １８．前記ガラクトシルグリセライドは、請求の範囲７記載の式（Ｉ）の構造に 相当するものである請求の範囲第１５〜１８項のいずれか記載の使用。 式中、 −Ｒ₁は、下記の構造を有するアシル基を表す。 式中、Ｒは、炭素数１５、１７又は１９の直鎖状脂肪族炭化水素鎖であって、 飽和されているか又は１〜５個の二重結合で構成され、７位、１０位、及び／又 は、１３位は炭素数１６のアシル基のために、９位、１２位、及び／又は、１５ 位は炭素数１８のアシル基のために、そして、５位、８位、１０位、１４位、及 び／又は、１７位は炭素数２０のアシル基のためにあるものである。 −Ｒ₂は、水素原子、又は、下記の構造のＲ₁と同一又は異なって、アシル基を表 す。 式中、Ｒは、前記と同じ。 １９．前記組成物中におけるガラクトリピッド濃度は、組成物全体量に対して０ ．００１〜１０重量％の濃度で、好ましくは、０．０１〜５重量％の濃度である 請求の範囲第１１〜１８項のいずれか記載の使用。 ２０．前記組成物は、局所投与で、更に詳細にはゲル状又はポマード状であって もなくてもよい、クリーム、ミルク、ローションの形態で、化粧料用又は医薬用 に許容しうる賦形剤、基剤又は支持体の存在のもとに、特別に調製されたもので ある請求の範囲第１１〜１９項のいずれか記載の使用。